Estudo genético e fenotípico dos operões fsr e gelE-sprE em diferentes espécies de Enterococcus

Faculdade de Medicina de Lisboa

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Neuza dos Prazeres Lima Teixeira

Mestrado em Microbiologia Clínica

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Esta dissertação foi aprovada pela Comissão Coordenadora do Conselho

Científico da Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa de 14 de

Outubro de 2008.

II

Universidade de Lisboa

Faculdade de Medicina de Lisboa

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Neuza dos Prazeres Lima Teixeira

Mestrado em Microbiologia Clínica

Dissertação orientada pela Doutora Maria de Fátima Silva Lopes

Agradecimentos V

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Ao ITQB e IBET, instituições que me acolheram e me permitiram realizar este trabalho. À Faculdade de Medicina por me ter permitido frequentar este mestrado e ao.meu co-orientador Mário Ramirez pela gentileza de me ter aceite e auxiliado na dissertação.

À minha orientadora Fátima Lopes, por me ter aceite orientar este trabalho e por ter acreditado em mim desde o primeiro momento, pelas oportunidades para crescer no mundo científico, pela força incondicional e, claro, pela amizade sincera e carinho que sempre me deu.

Ao meu orientador Paulo Marujo por me ter ajudado em todas as fases do meu projecto de mestrado, por me ter ensinado tudo o que sei sobre RNA e por me ter ajudado a compreender a Biologia Molecular, pelo tempo que passou comigo a discutir resultados, pela sincera amizade, força e, claro, pela paciência que sempre demonstrou.

À minha colega e amiga Teresa pela força, pelos bons momentos dentro e fora do laboratório e pela ajuda na microbiologia. À minha colega Tânia pela ajuda que me deu desde os primeiros dias no laboratório, pela força, amizade e alegria. Ao meu colega Tiago pelos bons momentos de “partilha de secretária e bancada” e aos meus restantes colegas de laboratório: Martas, Renata, Daniela e Doudou, pela força e boa disposição. À Doutora Teresa Crespo pela oportunidade de bolsa que me deu. À Paula pela força, amizade, alegria e ajuda no laboratório.

VI Aos meus pais, pelo carinho e apoio incondicional em toda a minha formação académica e profissional. À minha irmã Susana, ao Nuno e ao Afonso pela força, alegria e partilha de momentos únicos.

Ao Ricardo pelo seu grande amor, pela paciência nos dias de maior stress, pela ajuda na escrita da dissertação, pelo ombro amigo, pelo sorriso e alegria que sempre me deu.

Às minhas grandes amigas Margarida e Cláudia por estarem sempre lá quando precisei de um ombro amigo.

Aos meus amigos David, Carina e Rita pelo apoio e força nos momentos bons e maus da elaboração desta dissertação.

A todos os restantes familiares, amigos e colegas que ao longo deste tempo me deram uma palavra de apoio!

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Resumo

VII

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Enterococcus spp. são bactérias Gram-positivas presentes em diversos ambientes e que tem emergido como causadores de infecções nosocomiais graves. Têm sido identificados em diferentes espécies genes envolvidos na sua virulência, entre eles os operões fsr e gelE-sprE. A expressão do operão gelE-sprE é regulada pelo operão fsr via “quorum sensing” envolvendo o péptido GBAP. Recentes estudos mostraram a existência de estirpes com todos os genes destes operões mas sem a capacidade de degradar a gelatina em meio sólido (teste da gelatinase). O objectivo deste trabalho foi o estudo desta incongruência.

A presença dos genes dos referidos operões e a actividade da gelatinase foram estudados em E. faecalis (LN68, LN66, QSE125 e QA29b), E. durans (QN8, QSE15 e LSE4) e E. faecium (QSE32). Apesar de todas as estirpes apresentarem todos os genes dos operões somente duas estirpes, QSE32 e QA29b, apresentaram fenótipo gelatinase positivo. Os operões fsr e gelE-sprE foram sequênciados nas estirpes QSE32 e LN68 e as sequências comparadas com a sequência da estirpe V583. Identificaram-se diferentes mutações, destacando-se na estirpe QSE32 uma mutação que conduz à produção de GBAP com uma estrutura diferente e, na estirpe LN68, uma mutação responsável pela síntese da histidina cinase FsrC truncada afectando o domínio HAtpase.

O possível efeito das mutações encontradas foi também analisado sobre o processamento dos transcritos primários produzidos por estes operões nas estirpes QSE32 e LN68. Os resultados preliminares obtidos parecem indicar um processamento dos transcritos fsrA e fsrBDC nas estirpes QSE32 e LN68 distinto do observado na estirpe V583.

A virulência das estirpes E. faecalis LN68 e QA29b, E. durans LSE4 e E. faecium QSE32, foi estudada nos modelos C. elegans e G. mellonella, verificando-se que as espécies

VIII E. faecium e E. durans são menos virulentas que E. faecalis e não foi encontrada correlação entre a virulência e o fenótipo gelatinase.

Resumo

IX

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Enterococcus spp. are Gram Positive bacteria found in diverse environments and which have emerged as the cause of serious nosocomial infections. Genes involved in its virulence, in particular fsr and gelE-sprE operons, have been detected in different species. The expression of gelE-sprE operon is regulated by the fsr operon in a quorum sensing way involving the GBAP peptide. Recent studies have shown the existence of strains with all genes of those operons, but without the ability to degradate gelatinase in solid medium (gelatinase test). The objective of this work was the study of this incongruity.

The presence of the genes of those operons and the gelatinase activity were screened in E. faecalis (LN68, LN66, QSE125 and QA29b), E. durans (QN8, QSE15 and LSE4) and E. faecium (QSE32) strains. All strains had all genes, but only two, QSE32 and QA29b were, able to degrade gelatinase. The fsr and gelE-sprE operons were sequenced in the strains QSE32 and LN68 and compared with the sequence of E. faecalis V583 strain. Different mutations were identified, of which we highlight, in QSE32 strain, one mutation leading to the production of GBAP with a different structure and, in LN68 strain, one responsible for a truncated histidine kinase FsrC affecting the HAtpase domain.

The possible effects of the mutations were also analyzed on the processing of the primary transcripts produced by those operons from QSE32 and LN68 strains. Preliminary results suggest that the processing of fsrA and fsrBDC transcripts in these strains is distinct of that of V583 strain.

The virulence of E. faecalis LN68 and QA29b, E. durans LSE4 and E. faecium QSE32 strains was studied in C.elegans and G. mellonella animal models. The species

X E. faecium and E. durans were less virulent than E. faecalis and no correlation between the gelatinase phenotype and virulence was found in these species.

Lista de Siglas e Abreviaturas

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agr – accessory gene regulator AIP – autoinducer peptide AIs - autoinducers

BHI – brain heart infusion

C. elegans- Caenorhabditis elegans

D.O.P. – denominação de origem protegida

DSMZ – Deutsch Sammlung von Mikroorganism and Zellkulturen DNA - deoxyribonucleic acid

DNTPs – deoxyribonucleotide trisphosphate E. durans – Enterococcus durans

E. faecalis – Enterococcus faecalis E. faecium – Enterococcus faecium E. coli - Escherichia coli

EUA – Estados Unidos da América fsr – E. faecalis regulator

G. mellonella – Galleria mellonella

GBAP – gelatinase biosyntheses activating pheromone GelE - gelatinase

h - horas

IBET – Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica INRA - l´institut National de la Recherche Agronomique ITQB – Instituto de Tecnologia Quimica e Biológica

XII kb – kilo pares de base

LN – leite de niza

LN66 – E. faecalis LN66 LN68 – E. faecalis LN68 LSE – leite da serra da estrela LSE4 – E. durans LSE4 MDR - Multi-Drug Resistance min - minutos

mRNA – RNA mensageiro

NCBI - National Center for Biotechnology Information nt - nucleótidos

pb – pares de base

PCR – polimerase chain reaction QA – queijo de Azeitão

QA29b – E. faecalis QA29b QN – queijo de Niza

QN8 – E. durans QN8 QS – quorum sensing

QSE – queijo da serra da estrela QSE15 – E. durans QSE15 QSE32 – E. faecium QSE32 QSE125 – E. faecalis QSE125 S. aureus – Staphylococcus aureus

Lista de Siglas e Abreviaturas

XIII SD – shine dalgarno

SprE – serine protease sRNA – small RNA

TM –temperatura de melting tRNA – RNA de tranferência

VRE – vancomycin resistance Enterococci V583 – E. faecalis V583

RHK – receptor histidine kinase RNA – Ribonucleic Acid RR – response regulator

XIV

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Quadro 1 – Estirpes usadas neste estudo. Identificação, espécie e origem alimentar das estirpes utilizadas. .. 21 

Quadro 2 – “Primers” utilizados, sequências e temperaturas de “melting” (TM). ... 24 

Quadro 3 – Programa padrão utilizado nos PCRs utilizados. ... 25 

Quadro 5 – Tipos de Mutações Génicas. Apresentação dos três tipos de mutações genicas e respectivas

sub-categorias 38_{. ... 39} 

Quadro 6 – Classificação dos aminoácidos. A classificação dos aminoácidos divide-se em quatro grupos:

apolares, polares neutros, polares básicos e polares ácidos. Este quadro foi efectuado com base de Griffiths et

al.38 ... 40 

Quadro 7 – Mutações identificadas nos operões fsr e gelE-sprE na estirpe E. faecium QSE32. Identificação

das mutações nos operões fsr e gele-sprE da estirpe QSE32, respectiva posição na cadeia 3´-5´ (cadeia -), zona do operão (gene afectado), mudança de nucleótido e aminoácido e respectivo tipo de mutação. (*) Indica que são

mutações dentro da zona intergénica e por isso não têm classificação de mutações de substituição. ... 43 

Quadro 7 – (continuação) ... 44 

Quadro 8 – Mutações observadas nos operões fsr e gelE-sprE na estirpe E. faecalis LN68. Identificação das

mutações nos operões fsr e gelE-sprE da estirpe Ln68, respectiva posição na cadeia 3´-5´ (cadeia -), zona do operão (gene afectado), mudança de nucleótido e aminoácido (com a comparação do V583), e respectivo tipo de mutação. (*) Indica que são mutações dentro da zona intergénica e por isso não têm classificação de mutações de

substituição. ... 47 

Índice de Figuras

XV

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Figura 1 – Esquema comparativo de QS em bactérias Gram positivas (A) e negativas (B). (A) A ligação de

um péptido (assinalado a verde) a um receptor da histidina cinase (RHKs) (assinalada a vermelho) activa as fosforilações ou desfosforilações, e, por sua vez, activa a resposta reguladora (RR), resultando no controlo da expressão de um ou mais genes. (B) Pequenas moléculas (“homoserine lactones”) (assinaladas a azul) difundem-se do meio extra para o intracelular ligando-difundem-se ao regulador (R), estabilizando-o e dedifundem-sencadeando a expressão

dos genes respectivos 70_{. ... 10} 

Figura 2 – Esquema do funcionamento do sistema de QS agr em Sthaphylococcus sp. Este esquema foi

adaptado de Kong et al. (2006). A proteína AgrB localizada na membrana está envolvida na maturação e exportação do péptido AIP. Quando se atinge uma determinada concentração de células e consequentemente de AIP, este péptido liga-se à proteína AgrC que promove a fosforilação do AgrA, que por sua vez activa os

promotores P2 e P3, originando os transcritos RNAII e RNAIII 63_{. ... 11} 

Figura 3 – Organização geenómica dos operões fsr e gelE-sprE em E. faecalis. Apresentação dos genes fsrA

e fsrB/fsrD/fsrC e gelE/sprE, respectivos promotores Pe, Pb e Pa, e tamanho. Os genes dos operões fsr e

gelE-sprE encontram-se na cadeia 3´-5´.Os “harpins” localizados a jusante do gene fsrA, fsrB/fsrD/fsrC e gelE/gelE-sprE

representam os terminadores transcripcionais ( ). ... 12 

Figura 4 - Esquema representativo do mecanismo proposto para a activação transcricional do operão fsr e respectivo efeito na síntese de gelatinase e protease sérica em E. faecalis. Este esquema é adaptado (com

actualizações) de Gilmore, et al. (2002). Neste modelo, a GBAP é sintetizada sob a forma de uma molécula precursora (GBAP* vermelha) através do fsrD, e processada pela proteína FsrB originando a GBAP madura (GBAP verde). Esta, ao ser secretada para o meio extracelular e depois de atingir uma determinada concentração, interage com a histidina cinase (FsrC), que fosforila o regulador (FsrA) que por sua vez regula os promotores Pb

e Pe. Gilmore et al. (2002) propõe a existência de uma molécula X para a regulação dos promotores Pb e Pe 34_.

... 13 

Figura 5 – Estrutura da GBAP (“Gelatinase Biosynthesis Activating Pheromone”) 82_{. ... 13} 

Figura 6 - Esquema dos operões fsr e gelE-sprE em E. faecalis. Identificação das zonas amplificadas por cada

par de “primer”. A azul está representada a zona de amplificação dos “primers” fsrA5EcoRI´e fsrA3PstI´ (1153 pb); a verde para os primers fsrB5´EcoRI e fsrB3´PstI (976 pb); a laranja para os “primers” fsrC5´EcoRI e fsrC3´PstI (1573 pb); a rosa para os primers gelE5´EcoRI e gelE3´PstI (1868 pb); a cinzenta sprE5´EcoRI e sprE3´PstI (1065 pb). Os promotores transcripcionais estão identificados por Pa, Pb e Pe. Os “harpins”

XVI

localizados a jusante do gene fsrA, fsrB/fsrD/fsrC e gelE/sprE representam os terminadores transcripcionais ( ).

... 23 

Figura 7 – Esquema representativo da síntese dos RNAs in vitro. A - Síntese dos RNAs controlos in vitro.

Foram utilizados os pares de primers rfsrD/T7mfsrD e fsrB/T7mfsrB para a amplificação de fragmentos de DNA para os genes fsrD e fsrB, respectivamente. A extensão T7 foi adicionada na extremidade 5´ do primer da cadeia codificante para os genes fsrB e fsrD (cadeia negativa) para que o RNA produzido seja igual aos RNAs da estirpe V583. B – Síntese das sondas radioactivas. Foram utilizados os pares de primers T7fsrD/mfsrD, T7fsrB/mfsrB e T7fsrA/mfsrA para a amplificação de fragmentos de DNA para os genes fsrD, fsrB e fsrA, respectivamente. Estes amplicons foram amplificados com a extensão correspondente ao promotor da RNA polimerase T7 na extremidade 5´ (extensão a vermelho) do primer da cadeia complementar da cadeia codificante

dos genes estudados. ... 31 

Figura 8 – Esquema do ciclo de vida de C. elegans. O ciclo de vida de C. elegans é constituído por 4 estadios

de larvas – L1, L2, L3 e L4 até chegar a fase adulta. Em condições de ausência de alimento, este nemátodo entra no estadio “dauer larva” conseguindo sobreviver a condições adversas durante vários meses. Quando as

condições se tornam favoráveis, a larva sai deste estadio e entra no L4 49_{. ... 32} 

Figura 9 – Identificação das mutações identificadas nas zonas intergénicas dos genes fsrA, fsrB- fsrD- fsrC e gelE-sprE da estirpe QSE32. Sequências intergénicas dos operões fsr e gelE-sprE com identificação das

zonas reguladoras (sublinhados a verde), mutações (vermelho) e respectivas posições apresentadas no quadro 7 e

Anexo 1 (números a preto). ... 42 

Figura 10 – Identificação das mutações identificadas nas zonas intergénicas dos genes fsrA, fsrB- fsrD- fsrC e gelE-sprE da estirpe LN68. Sequências intergénicas dos operões fsr e gelE-sprE com identificação das

zonas reguladoras (sublinhado verde), mutações (vermelho) e posições apresentadas no quadro 7 e no Anexo

1(números a preto). ... 46 

Figura 11 – Sequência das proteínas FsrA das estirpes V583, LN68 e QSE32. Alinhamento da sequência das

proteínas FsrA da estirpe controlo V583 e das estudadas LN68 e QSE32 - e alterações de aminoácidos que foram

identificados. O Alinhamento completo encontra-se no Anexo 2.1. ... 50 

Figura 12 – Domínios putativos da proteína FsrA. Esquema representativo dos domínios da FsrA das estirpes

LN68 e QSE32, constituído por um REC (“Signal receiver domain”), LytTR (“LytTr DNA-binding domain”) e

Índice de Figuras

XVII Figura 13 – Sequências das proteínas FsrB das estirpes V583, LN68 e QSE32. Alinhamento das sequências

das proteínas FsrB da estirpe controlo V583 e das estudadas LN68 e QSE32 - e alterações de aminoácidos que

foram identificados. O alinhamento completo encontra-se no Anexo 2.2. ... 52 

Figura 14 – Domínio putativo da proteína FsrB. Esquema representativo do domínio da proteína FsrB

identificado nas estirpes LN68 e QSE32, constituído por um domínio AgrB (“Accessory gene regulator B”) 47_{. 52} 

Figura 15 - Sequência das proteínas FsrD das estirpes V583, LN68 e QSE32. Alinhamento das sequências

das proteínas FsrD das estirpes estudadas e controlo – e alterações de aminoácidos que foram identificadas. Esta sequência encontra-se entre o aminoácido 190 e aminoácido 243 da proteína FsrB. O quadrado preto identifica a

sequência da GBAP madura. A identificação do codão de iniciação foi efectuada conforme a literatura 84_{. ... 53} 

Figura 16 – Sequência das proteínas FsrC das estirpes V583, LN68 e QSE32. Alinhamento das sequências

das proteínas FsrC da estirpe controlo V583 e das estudadas LN68 e QSE32 – alterações de aminoácidos que foram identificados. O quadro preto identifica a mutação sem sentido. O alinhamento completo encontra-se no

Anexo 2.3. ... 54 

Figura 17 – Domínios putativos da proteína FsrC de E. faecalis V583. Esquema representativo dos domínios

de FsrC de E. faecalis, constituído por um domínio envolvendo HATPase_c (“Histidine kinase”) e 7tm_4

(envolvido no mecanismo de transmissão de sinal)47_{. ... 55} 

Figura 18 - Sequências das gelatinases das estirpes V583, LN68 e QSE32. Alinhamento das sequências das

proteínas gelatinases da estirpe controlo V583 e das estudadas LN68 e QSE32. O alinhamento completo

encontra-se no Anexo 2.4. ... 56 

Figura 19 – Domínios putativos da gelatinase. Esquema representativo dos domínios da gelatinase das estirpes

LN68 e QSE32, constituído por um FTP (“Fungalysin/Thermolysin Propetide Motif”), Peptidase_M4 (“Termolysin metallopeptidase”), Peptidase_M4_C (“Termolysin metallopeptidase”) e LasB (“Zinc

Metalloprotease”)47_{. ... 57} 

Figura 20 – Sequências de aminoácidos das zonas conservadas do centro activo das gelatinases das estirpes V583, LN68 e QSE32. Alinhamento das zonas conservadas do centro activo das gelatinases em que se

mantém inalterados. O quadro preto identifica o domíno conservado. O alinhamento completo encontra-se no

XVIII Figura 21 - Sequência das proteases séricas das estirpes V583, LN68 e QSE32. Alinhamento das sequências

das proteases séricas da estirpe controlo V583 e das estudadas LN68 e QSE32 – alterações de aminoácidos que

foram identificadas. O alinhamento completo encontra-se no Anexo 2.5. ... 58 

Figura 22 – Domínios putativos da protease sérica. Esquema representativo do domínio COG3591 da

protease sérica das estirpes LN68 e QSE32 47_{. ... 58} 

Figura 23 – Sequências nucleótidicas da zona da mutação sem sentido encontrada na estirpe LN68, das estirpes V583, QSE32, LN68, LN66, QN8, QSE125 e QSE15. Alinhamento das sequências das estirpes em

estudo, na zona da mutação sem sentido (nucleótido nº. 3004) identificada na estirpe LN68. O alinhamento

completo também se encontra no Anexo 1.2. ... 59 

Figura 24 – Curvas de crescimento das estirpes E. faecalis V583, E. faecalis LN68 e E. faecium QSE32.

Leitura da Absorvância (600nm) ao longo do tempo (min). ... 63 

Figura 25- Curvas de crescimento das estirpes E. faecalis LN68, E. faecium QSE32 e E. faecalis V583 (A1, A2 e A3) e respectivos RNAs extraídos (B1, B2 e B3). A1- Curva de crescimento da estirpe LN68 A2- Curva

de crescimento da estirpe QSE32. A3- Curva de crescimento da estirpe V583. B1 – Imagem da migração do RNA total da estirpe LN68.B2 – Imagem da migração do RNA total da estirpe QSE32. B3 – Imagem da migração do RNA total da estirpe V583. Os pontos em que se extraíram RNA encontram-se identificados a laranja nos gráficos A1, A2 e A3 e identificados pelos números: 1 (meio da fase exponencial), 2 (final da fase exponencial), 3 (final da fase exponencial), 4 (início da fase estacionária) e 5 (fase estacionária). As imagens dos géis apresentadas (B1, B2 e B3) são o resultado da migração de 2,5 µg de RNA num gel 0,8% de agarose por electroforese. Os RNAs ribossomais (23S, 16S e 5S) estão identificados. A quantidade de RNA obtida

correspondente ao ponto 1 da estirpe V583 não foi suficiente para migrar num gel de agarose. ... 64 

Figura 26- Identificação das sondas fsrD, fsrB e RNAs controlo in vitro fsrB e fsrD num excerto do operão fsr. A sonda fsrD, assinalada a vermelho, foi construída com os primers T7fsrD(1) e mfsrD e tem um tamanho

de 193 nt. A sonda fsrB (laranja) foi construída com os primers T7fsrB e mfsrB e tem um tamanho de 537 nt. O

fsrB in vitro (RNA controlo), representado com setas verdes, foi construído com os primers T7mfsrB e fsrB e

têm um tamanho de 707 nt. O fsrD in vitro (RNA controlo), assinalado a azul, foi construído com os primers

T7mfsrD e rfsrD e têm um tamanho de 182 nt. ... 65 

Figura 27- Curva de crescimento da estirpe E. faecalis V583 (A3) e respectiva análise por Northern-blot do trasncrito fsrD (C3) utilizando a sonda fsrD. A3- Curva de crescimento da estirpe V583. C3 – Imagem do

Índice de Figuras

XIX

de 6% e o xileno cianol migrou 14 cm. M1 corresponde ao marcador pUC Mix Marker 8 (Fermentas); M2 ao marcador pBR322-MspI digest (Biolabs). Os controlos estão identificados como fsrB e fsrD, que correspondem aos RNAs fsrD e fsrB sintetizados in vitro. As setas a vermelho identificam os transcritos fsrB-fsrD (739 nt) e

fsrD (174 nt). Os pontos 1, 2, 3, 4 e 5 assinalados no gráfico A3 correspondem aos pontos 1, 2, 3, 4 e 5 da

imagem C3. Estes representam as zonas da curva de crescimento em que foi extraído RNA total. ... 65 

Figura 28- Transcritos esperados (A) e observados (B) na estirpe controlo V583. A- Esquema representativo

dos genes fsrB, fsrD e fsrC do operão fsr e respectivos transcritos esperados. O transcrito putativo fsrB-fsrD-fsrC corresponde a um valor aproximado de 2080 nt; o transcrito putativo fsrB-fsrD corresponde a um valor aproximado de 740 nt e o transcrito putativo fsrD aproximadamente 174 nt. Estes tamanhos moleculares foram medidos a partir de SD (Shine-Dalgarno) até ao codão de terminação. B – Parte da imagem do gel de acrilamida da figura 27 com a identificação dos transcritos obtidos (quadrado e seta vermelha). O transcrito fsrB-fsrD e o transcrito fsrD identificados em B têm um tamanho molecular aproximado aos transcritos esperados

apresentados em A. SD” – Shine-Dalgarno putativa. A SD e a SD” têm como base a literatura 84, 94_{. ... 66} 

Figura 29- Curva de crescimento da estirpe E. faecium QSE32 (C2) e respectiva análise por Northern-blot do transcrito fsrD (C2) utilizando a sonda fsrD. A2- Curva de crescimento da estirpe QSE32. C2 – Imagem

do Northern-blot obtido com a sonda fsrD para a estirpe QSE32. O Northern-blot foi efectuado num gel de acrilamida de 6% e o xileno cianol migrou 19 cm. M2 - ao marcador pBR322 MspI digest (Biolabs). O controlo identificado como fsrD corresponde ao RNA fsrD sintetizado in vitro.Os pontos 1, 2, 3, 4 e 5 assinalados no gráfico A2 correspondem aos pontos 1, 2, 3, 4 e 5 da imagem C2. Estes representam as zonas da curva de

crescimento em que foi extraído RNA total. ... 67 

Figura 30- Análise por Northern-blot do transcrito fsrB nas estirpes E. faecalis V583, E. faecalis LN68 e E. faecium QSE32 utilizando a sonda fsrB. Os pontos 1, 2, 3 4 e 5 de cada uma estirpe (figura 25) estão

apresentados como V1,V2, V3 e V4 para V583, L1, L2, L3, L4 e L5 para LN68 e Q1, Q2, Q3, Q4 e Q5 para QSE32. A V2, L2 e Q3 sublinhadas são amostras em que foram migrados 10 µg de RNA total, enquanto as restantes têm 5 µg. A aplicação de diferentes quantidades de RNA foi importante, pois com a utilização do dobro de RNA total poderia vir a se detectar RNA pouco abundantes e por sua vez, importantes para o funcionamento dos operões fsr e gelE-sprE. O Northern-blot foi efectuado num gel de acrilamida de 5% e o xileno cianol migrou 38 cm. M1 corresponde ao marcador pUC Mix Marker 8 (Fermentas); M2 ao marcador pBR322 -MspI digest (Biolabs). O controlo RNA está identificado como fsrB.. A seta a vermelho indica o possível transcrito

fsrB. ... 68 

Figura 31- Análise por Northern-blot do transcrito fsrA nas estirpes estirpes E. faecalis V583, E. faecalis LN68 e E. faecium QSE32 utilizando a sonda fsrA. Os pontos 1, 2, 3 4 e 5 de cada uma estirpe (figura 25)

XX

para QSE32. O Northern-blot foi efectuado num gel de acrilamida de 5% e o xileno cianol migrou 30 cm. M1 corresponde ao marcador pUC Mix Marker 8 (Fermentas); M2 ao marcador pBR322 MspI digest (Biolabs). As

setas a vermelho indicam os possíveis transcritos fsrA. ... 69 

Figura 32 – Estudo da virulência de diferentes estirpes de Enterococcus em C. elegans. Percentagem de

sobrevivência de C. elegans (%) ao longo do tempo (horas) que esteve em contacto com as estirpes E. faecalis OG1RF (estirpe controlo), E. faecalis LN68 (gráfico 1), E. durans LSE4 (gráfico 2), E. faecalis QA29B (gráfico

3) e E. faecium QSE32 (gráfico 4). ... 72 

Figura 33 – Estudo da virulência de diferentes estirpes de Enterococcus em G. mellonella. Percentagem de

sobrevivência da G. mellonella ao longo tempo (horas) para a estirpe controlo OG1RF e as estirpes E. faecalis LN68 (gráfico nº.5), E. durans LSE4 (gráfico nº.6), E. faecalis QA29B (gráfico nº.7) e E. faecium QSE32

(gráfico nº.8). ... 73 

Figura 34 – Estruturas intramenbranares das histidinas cinases FsrC das estirpes E. faecalis V583 e E. faecalis LN68. Estas estruturas foram construídas através do programa de previsão de estruturas membranares

SOSUI 1.11 43_{. 34A Estrutura membranar da proteína FsrC da estirpe V583. Esta proteína é constituída por sete}

hélices das quais uma é uma hélice secundária. Nesta estão identificadas as mutações encontradas na estirpe LN68. As mutações identificadas na estirpe LN68 estão numeradas (1, 2, 3, 4, 5 e 6) e assinaladas com um círculo vermelho. O início e final do domínio HAtpase está assinalado com as letras A e B, e supostamente inicia-se na Isoleucina e acaba na Arginina. 34B Estrutura intramembranar da proteína FsrC da estirpe LN68. Esta proteína é constituída por sete hélices primárias. Nesta estão identificadas as mutações encontradas na

Índice Geral XXI

Índice Geral

1.2 Características do género Enterococcus ... 3 

1.3 Patogenese em Enterococcus ... 5 

1.3.1 Resistência a antibióticos ... 6 

1.3.2 Virulência de Enterococcus ... 8 

1.3.2.1 Sistema QS em E. faecalis - fsr ... 12 

1.3.2.1.1 Proteinase Sérica, Gelatinase e Sistema fsr ... 14 

1.3.2.2 Sistema fsr e virulência em modelos animais – C.elegans e G. mellonella ... 17 

1.4 Objectivos do estudo ... 18 

C CAAPPÍÍTTUULLOO22..MMAATTEERRIIAAIISSEEMMÉÉTTOODDOOSS........................................................................................................................................................................220 0 2.1 Material biológico ... 21 

2.1.1 Descrição dos isolados ... 21 

2.1.2 Conservação e crescimento... 21 

2.1.3 Teste da actividade de gelatinase ... 22 

2.2 Análise de DNA ... 22 

2.2.1 Extracção de DNA cromossómico ... 22 

XXII

2.2.3 Electroforese em gel de agarose ... 25 

2.2.4 Purificação dos produtos de PCR e sequênciação ... 26 

2.3 Análise de RNA ... 26 

2.3.1 Extracção de RNA ao longo da curva de crescimento ... 26 

2.3.2 Análise dos RNAs extraídos ... 28 

2.3.2.1 Separação dos RNAs em gel desnaturante de acrilamida e transferência por membrana (Northern-blot) .... 28 

2.3.2.2 Hibridação ... 29 

2.3.2 Síntese de moléculas de RNA ... 30 

2.4 Análise da virulência de enterococos ... 31 

2.4.1 Testes de virulência de Enterococcus utilizando o nemátodo C. elegans ... 31 

2.4.2 Testes de virulência de Enterococcus utilizando o nematodo G. mellonella ... 33 

2.4.3 Análise estatística ... 33  C CAAPPIITTUULLOO33..DDEESSCCRRIIÇÇÃÃOODDAASSEESSTTIIRRPPEESSEESSTTUUDDAADDAASS,,CCOONNFFIIRRMMAAÇÇÃÃOODDOOGGEENNÓÓTTIIPPOOffssrr//ggeellEE- -s spprrEEEEFFEENNÓÓTTIIPPOOGGEELLAATTIINNAASSEE................................................................................................................................................................................................334 4 3.1 Objectivos do estudo ... 35  3.2 Resultados e Discussão ... 36  C CAAPPIITTUULLOO44..SSEEQQUUÊÊNNCCIIAAÇÇÃÃOODDOOSSOOPPEERRÕÕEESSffssrrEEggeellEE--sspprrEE..................................................................................................337 7 4.1 Objectivos do estudo ... 38  4.2 Resultados e discussão... 39 

4.2.1 – Identificação das mutações encontradas na estirpe E. faecium QSE32 ... 41 

4.2.2 – Identificação das mutações encontradas na estirpe E. faecalis LN68 ... 45 

4.2.3 Análise do efeito das mutações identificadas nas proteínas dos operões fsr e gelE-sprE ... 49 

4.2.3.1 Proteína FsrA (Regulador) ... 49 

4.2.3.2 Proteína FsrB e FsrD (GBAP) ... 51 

4.2.3.3 Proteína FsrC (Histidina Cinase) ... 54 

4.2.3.4 Gelatinase ... 55 

Índice Geral

XXIII 4.2.3.6 Análise da mutação encontrada no gene fsrC da estirpe E. faecalis LN68 em outras estirpes com fenótipo gelatinase negativo ... 59  C CAAPPIITTUULLOO55..AANNÁÁLLIISSEEDDOOSSTTRRAANNSSCCRRIITTOOSSDDOOSSOOPPEERRÕÕEESSffssrrEE ggeellEE--sspprrEE............................................................661 1 5.1 Objectivos do estudo ... 62  5.2 Resultados e discussão... 63  C CAAPPIITTUULLOO66..EESSTTUUDDOODDAAVVIIRRUULLÊÊNNCCIIAAEEMMMMOODDEELLOOSSAANNIIMMAAIISS––CC..eelleeggaannssEEGG..mmeelllloonneellllaa770 0 6.1 Objectivos do estudo ... 71  6.2 Resultados e Discussão ... 72  B BIIBBLLIIOOGGRRAAFFIIAA..................................................................................................................................................................................................................................................881 1 A ANNEEXXOOSS........................................................................................................................................................................................................................................................................996 6 Anexo 1. Alinhamento de DNA. Alinhamento dos operões fsr e gelE-sprEdas estirpes E.faecalis LN68 e E. faecium QSE32 com a estirpe controlo E.faecalis V583. ... 97  Anexo 2. Alinhamento de proteínas. Alinhamento das proteínas dos operões fsr e gelE-sprE das estirpes E. faecalis LN68 e E. faecium QSE32 com a estirpe controlo E. faecalis V583. ... 115 

Anexo 2.1 Proteinas FsrA, Regulador. ... 116 

Anexo 2.2 Proteinas FsrB (incluindo a FsrD), “Accessory gene regulator B”. ... 117 

Anexo 2.3 Proteinas FsrC, Histidina Cinase. ... 118 

Anexo 2.4 Proteinas Gelatinase. ... 120 

Anexo 2.5 Proteinas Protease sérica. ... 122 

Anexo 3. Análise da mutação encontrada no gene fsrC na estirpe E. faecalis LN68 nas estirpes E. faecalis LN66, E. durans QN8, E. durans QSE125 e E. faecalis QSE15. ... 123 

1

C

C

1

1

.

.

I

I

G

G

O

O

1.1 Historial

1.2 Características do género Enterococcus

1.3 Patogenese em Enterococcus

1.3.1 Resistência a antibióticos 1.3.2 Virulência de Enterococcus 1.3.2.1 Sistema QS em E. faecalis - fsr

1.3.2.1.1 Proteinase Serínica, Gelatinase e Sistema fsr

1.3.2.2 Sistema fsr e virulência em modelos animais – C.elegans e G. mellonella

Capítulo 1. Introdução Geral e Objectivos

2

C

C

1

1

.

.

I

I

G

G

O

O

1.1 Historial

O nome “entérocoque” foi utilizado pela primeira vez por Thiercelin em 1899 para nomear uma nova espécie de diplococcus gram-positivos encontrados no tracto intestinal humano 117. No mesmo ano, MacCallum e Hastings descreveram um caso de endocardite provocado por um microrganismo a que chamaram Micrococcus zymogenes 71. Posteriormente, foi sugerido que esse microrganismo fosse um enterococo hemolítico. Em 1906, Andrewes e Horder chamaram-lhe Streptococcus faecalis (faecalis devido a ter sido isolado das fezes) 2. Durante a década seguinte, vários autores analisaram isolados de S. faecalis, e em 1919 Orla-Jensen e colaboradores descreveram as espécies S. glycerinaceus e S. faecium como sendo filogeneticamente próximas de S. faecalis 91.

Sherman, em 1937, desenvolveu um esquema de classificação no qual os streptococos eram divididos em quatro grupos: “enterococos”, “lácticos”, “viridans” e “piogénicos” 106. Aproximadamente quatro décadas depois da designação da espécie Streptococcus faecalis, Kalina propôs a sua substituição por Enterococcus faecalis, bem como a da espécie

S. faecium, proposta por Orla-Jensen em 1919, para Enterococcus faecium 58. O género Streptococcus manteve-se para designar um grupo distinto de bactérias. Somente em 1984, Schleifer e Kilpper-Balz utilizando técnicas moleculares de hibridação DNA-DNA e DNA-rRNA, demonstraram que as espécies S. faecalis e S. faecium pertenciam a um género distinto do género Streptococcus 101 e foram incluídas neste género cerca de vinte espécies 101. Actualmente o género Enterococcus inclui 38 espécies, nomeadamente, E. avium, E. asini, E. aquimarinus, E. cecorum, E. canis, E. columbae, E. caccae, E. canintestini,

3 E. casseliflavus, E. durans, E. díspar, E. devriesei, E. flavescens, E. gallinarum, E. gilvus, E. hirae, E. haemoperoxidus, E. hermanniensis, E. italicus, E. mundtii, E. moraviensis, E. malodoratus, E. faecalis, E. faecium, E. pallens, E. phoeniculicola, E. porcinus, E. pseudoavium, E. raffinosus, E. ratti, E. solitarius, E. sacharolyticus, E. sulfureus, E. silesiacus, E. saccharominimus, E. seriolicida, E. termitis e E. villorum 45.

1.2 Características do género Enterococcus

Os enterococcus são bactérias lácticas Gram-positivas, com forma circular (cocos) que se podem apresentar isolados, aos pares ou em pequenas cadeias. São anaeróbios facultativos e a sua temperatura óptima de crescimento situa-se entre os 35 e os 37ºC, podendo também crescer entre os 10 e os 45ºC. Os enterococos crescem em meios com elevada concentração salina, tais como, 6,5 % de NaCl, com elevados valores de pH, tais como, pH 9,6, e hidrolizam a esculina em presença de 40% de sais biliares 25, 79. Alguns são móveis e poucos produzem pigmentos. No que respeita à reacção catalase são negativos, embora alguns possuam pseudocatalases 25, 79. Exceptuando E. faecalis, todas as outras espécies possuem paredes celulares com o mesmo tipo de peptidoglicano, com lisina-asparagina. São quimiotróficos e quase todas as espécies são homofermentativas, sendo o ácido láctico o produto final da via glicolítica. A maioria das espécies produz um antigénio específico, o ácido teicóico, associado á parede celular, que é identificado como antigénio do grupo D dos Streptococcus 25, 79.

A identificação do género Enterococcus através de testes fisiológicos foi sempre difícil devido à sua considerável diversidade fenotípica 90. Por outro lado, a sua identificação por testes convencionais requer tempos de incubação longos 90. Os métodos de identificação

Capítulo 1.Introdução Geral e Objectivos

4 genotípica, utilizando os genes dos RNAs ribossomais 16 e 23S, são mais exactos pois permitem a identificação do género, mas, por sua vez, não permitem diferenciar espécies (por exemplo, E. gallinarium e E. casseliflavus apresentam 99,8% de homologia no gene do RNA ribossomal 16S) 1, 90. Neste contexto, métodos alternativos têm sido desenvolvidos, tais como, a amplificação de genes específicos, como por exemplo ddl (gene que codifica para a proteína D-alanina-D-alanina ligase), genes do operão van (genes relacionados com a resistência à vancomicina), sodA (gene que codifica a proteína superóxido dismutase dependente do manganês) 20, 52, 60, 81, 100. Existem igualmente testes disponíveis comercialmente, como por exemplo, o API 20S, API Rapid ID 32, Vitek system, MicroScan gram positive identificacion panel, Crystal gram positive e Crystal Rapid gram positive kits 19, 25.

Os enterococos crescem em ambientes muito distintos, tais como, solo, alimentos, águas, areias, animais e humanos. Nos humanos, tal como nos animais, existem nos tractos gastrointestinais e genitourinário 25. A espécie E. faecalis é a mais frequentemente isolada do tracto gastrointestinal humano, seguida de E. faecium 25, 35. Este género de bactérias pode ser encontrado no leite e nos queijos, pois, como referido anteriormente, têm a capacidade de sobreviver em meios com características físico-químicas muito distintas, tais como, valores de pH, temperatura e salinidade extremos 27, 29, 35_{. A sua presença nos queijos tradicionais poderá} ser positiva, segundo alguns autores, pois parecem ter um papel importante na maturação dos mesmos - podendo isto estar relacionado com uma das suas características essenciais, a sua capacidade de hidrolisar os triglicéridos do leite libertando ácidos gordos voláteis. Os enterococos, também têm a capacidade de produzir enzimas proteolíticas endo e exocelulares, importantes no desenvolvimento do sabor e aroma 27, 35, 90_{.Adicionalmente, espécies como E.} faecalis e E. faecium produzem uma variedade de bacteriocinas que poderão ser usadas para combater outras espécies bacterianas como por exemplo Listeria monocytogenes,

5 Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens e Vibrio cholerae 27, 35_{. Estas espécies de enterococos também parecem ser importantes no processamento das}

carnes, nomeadamente chouriços e salsichas 29. Todavia, a presença destas bactérias durante a maturação de alimentos poderá ter aspectos negativos, como por exemplo, poderem produzir aminas biogénicas. Esta característica já foi detectada em algumas espécies de Enterococcus encontrados em queijos e chouriços fermentados90.

Devido à sua natureza comensal, os enterococos também são utilizados na produção de produtos probióticos para humanos e animais 27, 29, 114. Estes podem ser usados na produção de iogurtes, leites fermentados e não fermentados e produtos farmacêuticas, podendo apresentar aspectos benéficos para a saúde humana 27. Como evidenciado por tudo o que foi dito, existe controvérsia acerca da sua utilização na maturação dos alimentos. A sua capacidade de transferirem resistências microbianas e factores de virulência para outras espécies bacterianas existentes no homem é um dos factores mais preponderantes na argumentação contra a presença destas bactérias nos alimentos 28.

1.3 Patogenese em Enterococcus

Os Enterococcus têm emergido como causa de um número crescente de infecções

nosocomiais graves, incluindo bacteremia, infecções intrabdominais, endocardites, infecções do sistema nervoso central e do tracto urinário 27, 116. Estas bactérias, são nos Estados Unidos da América a terceira causa nosocomial de bacteremias, e, na Europa, a quarta causa nosocomial 46, 120_.

Apesar de várias espécies de Enterococcus terem sido identificadas como causadoras de infecções humanas, existem duas espécies que prevalecem nas infecções, nomeadamente

Capítulo 1.Introdução Geral e Objectivos

6 E. faecalis e E. faecium 11, 96. Entre estas, E. faecalis é a espécie predominante, sendo responsável por 85 a 90% das infecções clínicas, enquanto que E. faecium é apenas responsável por 5 a 10 % 11, 90, 96. Estudos recentes têm demonstrado que as infecções provocadas por E. faecium têm vindo a aumentar e que esse aumento está relacionado com a acumulação de resistências a antibióticos nesta espécie 7, 11, 118. As espécies E. gallinarum, E. casseliflavus, E. durans, E. avium e E. raffinosis, têm também sido encontradas, mas são apenas responsáveis por 5% dos casos identificados 74, 90_{. Todavia, as estirpes de enterococos} isoladas do meio clínico têm sido maioritariamente de indivíduos internados em unidades de cuidados intensivos, no fim de doença prolongada ou com sistema imunitário debilitado, pelo que são designados por patogénicos oportunistas 90. Assim, os enterococos, por serem patogénicos nosocomiais, têm um impacto directo e significante na economia, devido a implicarem o prolongamento das estadias hospitalares e a requerem tratamentos terapêuticos adicionais 119.

1.3.1 Resistência a antibióticos

O aparecimento de resistências a antibióticos é uma consequência do uso clínico de drogas antimicrobianas. Inicialmente, este problema foi resolvido através da descoberta de novas classes de antibióticos, como os aminoglicósidos, macrólidos e glicopéptidos, bem como pela modificação química de antimicrobianos previamente existentes. Contudo, parece não haver certezas de que o desenvolvimento de novos fármacos antibacterianos acompanhe a capacidade das bactérias desenvolverem resistência a um determinado composto 36_.

Entre os mecanismos de resistência conhecidos, contam-se a inactivação enzimática do antibiótico (exemplo, as β-lactamases), eliminação dos locais de entrada de antibióticos

7 (exemplo, as proteínas de ligação à penicilina), modificação do alvo (exemplo, mutações que conduzam a uma alteração da sequência de aminoácidos) e mecanismos de exportação de antibióticos antes de estes encontrarem o seu alvo 13.

O uso de antibióticos promoveu a colonização e infecção por enterococos com resistências variadas, MDR (“Multi-Drug Resistance”). A razão para a emergência da MDR em enterococos deve-se à resistência intrínseca a vários agentes antimicrobianos e à resistência adquirida através da aquisição de genes de resistência associados a elementos móveis, como por exemplo, plasmídeos e transposões 79. Relativamente ao primeiro ponto, existem algumas bactérias que devido a não terem o local alvo para o antibiótico ou a este não conseguir chegar ao seu local alvo, estas adquirem resistência, como por exemplo, os antibióticos β-lactâmicos e cefaloesporinas 36. No que se refere à resistência adquirida existe o exemplo da tetraciclina, cloranfenicol, aminoglicósidos e glicopéptidos 79_.

No entanto, nos enterococos a fonte de resistência a antibióticos não se confina aos meios hospitalares. A própria comunidade consumidora de antibióticos, as águas de esgotos, a utilização de antibióticos na agricultura, tanto como promotores de crescimento como no tratamento de animais, constituirem fontes e reservatórios de genes de resistência a antibióticos 15, 67_{. Pelo seu impacto clínico, a resistência a antibióticos de E. faecalis e} E. faecium tem sido mais estudada. As suas características genéticas conferem tolerância a baixas concentrações de várias classes de antibióticos, incluindo amininoglicosídeos, beta-lactâmicos (terceira geração das cefalosporinas) e quinolonas 90. Em particular, estirpes clínicas de E. faecium são resistentes a altas concentrações de penicilina 57. Adicionalmente tem sido demonstrado que E. faecium pode também adquirir determinantes genéticos que conferem resistência a várias classes de antibióticos, nomeadamente a glicopéptidos (vancomicina e teicoplanina), e produzem efeitos sinergéticos com beta-lactâmicos e

Capítulo 1.Introdução Geral e Objectivos

8 aminoglicosídeos 22. Ao longo dos anos, utilizou-se gentamicina para o tratamento de endocardites, mas, com o aumento de resistência a este antibiótico, começou-se a utilizar a vancomicina 97.

A resistência dos Enterococcus aos antibióticos da classe dos glicopétidos deve-se à síntese de precursores modificados da parede celular que apresentam uma afinidade diminuída para a vancomicina e teicoplanina. A alteração do precursor do peptidoglicano de D-Ala-D-Ala para D-Ala-D-Lac (D-alanina-D-lactato) não parece ter qualquer efeito sobre a rigidez dos peptidoglicanos ou na sua capacidade para formar ligações cruzadas, mas diminui a afinidade da vancomicina 4, 16. Durante a última década houve um aumento da resistência à vancomicina em enterococos (“vancomycin-resistant enterococci” (VRE)) constituindo uma das maiores preocupações 97. Este antibiótico tem sido utilizado como último recurso no combate a casos de resistências múltiplas observadas em enterococos 10, 51_.

A estirpe E. faecalis V583 foi isolada pela primeira vez nos EUA como VRE. Esta estirpe tem sido caracterizada e é a única estirpe totalmente sequênciada 44. Neste momento a sequênciação do genoma de E. faecium D.O. encontra-se no final das anotações e a sequência do genoma de E. faecalis OG1RF acabou de ser publicada, mas não está ainda disponível 44.

1.3.2 Virulência de Enterococcus

A associação entre Enterococcus e virulência está inteiramente relacionada com a identificação destas bactérias 71. Em 1899, MacCallum e Hastings descreveram um caso fatal de endocardite no Hospital Johns Hopkins causado pelo organismo Micrococcus zymogenes. Neste caso, a bactéria expressava actividade hemolítica e actividade gelatinase 71. Desde então a virulência destas bactérias tem sido alvo de numerosos estudos. Alguns destes estudos têm

9 sido efectuados no sentido de identificação de genes com uma função na virulência de enterococos, nomeados por factores de virulência. Têm sido identificados factores de virulência relacionados com a aderência às células dos hospedeiros, a matrizes de proteínas extracelulares, a resistência a macrófagos, a deterioração das células e tecidos e à evasão ao sistema imunitário 34, 115. Uma questão interessante relacionada com a identificação de genes envolvidos na virulência de Enterococcus prende-se com a observação de que alguns desses genes estarem disseminados tanto em estirpes de origem clínica como alimentar 28, 65, 102_.

Embora tenham sido identificados diversos genes envolvidos na virulência de Enterococcus, a regulação da sua expressão tem sido pouco estudada. Existem dois estudos que mostram variações nos níveis dos transcritos correspondentes a diversos factores de virulência, variações que dependem do ponto da curva de crescimento, do ambiente e da origem do isolado 42, 105_.

Nos últimos anos tem sido demonstrado que as células bacterianas regulam também a expressão dos seus genes como resultado da sua interacção com outras células bacterianas da mesma espécie ou de espécies distintas (quase como um organismo multicelular). Este mecanismo é denominado de “Quorum Sensing” (QS). Assim, as bactérias controlam a expressão génica em resposta à densidade celular 5, 73, 113_{. Estes sistemas QS têm sido} encontrados tanto em bactérias Gram-positivas como em Gram-negativas.

Os mecanismos de QS são caracterizados pela libertação pelas células de pequenas moléculas que actuam como um sinal químico, designadas por “autoinducers” (AIs) 63. Estas moléculas ao acumularem-se no meio extracelular e quando o “quórum” é atingido, as células respondem com uma série de mecanismos que passam normalmente pela activação transcricional de um conjunto de genes, incluindo genes envolvidos na virulência 30, 63.

Capítulo 1.Introdução Geral e Objectivos

10 Entre as bactérias Gram-negativas, Vibrio harveyi tem sido extensivamente usado como organismo modelo no estudo de mecanismos de “quorum sensing”. Estas bactérias possuem dois sistemas de QS que controlam a expressão da bioluminescência (lux) (dependente da densidade celular) 113. Estes são caracterizados pela produção e libertação de uma molécula sinal (AI), “homoserine lactones”, que é acumulada no meio extracelular até a densidade celular atingir um determinado valor 41, 113.

Em bactérias Gram-positivas têm sido caracterizados sistemas de QS em que os péptidos (AI) apresentam diferentes estruturas 41. Estes sistemas de QS, ao contrário dos encontrados em bactérias Gram-negativas, normalmente, ligam os AIs a uma proteína localizada na membrana que faz parte de um sistema de dois componentes 70. Esta, por sua vez, activa uma resposta intracelular envolvendo uma cascata de fosforilações e/ou desfosforilações, cuja resposta final é a expressão de um gene regulador que controla a expressão de um ou mais genes (figura 1)70.

Figura 1 – Esquema comparativo de QS em bactérias Gram positivas (A) e negativas (B). (A) A ligação de um péptido (assinalado a verde) a um receptor da histidina cinase (RHKs) (assinalada a vermelho) activa as fosforilações ou desfosforilações, e, por sua vez, activa a resposta reguladora (RR), resultando no controlo da expressão de um ou mais genes. (B) Pequenas moléculas (“homoserine lactones”) (assinaladas a azul) difundem-se do meio extra para o intracelular ligando-se ao regulador (R), estabilizando-o e desencadeando a expressão dos genes respectivos 70_.

11 Um exemplo de QS bem caracterizado em bactérias Gram-positivas é o sistema agr (“accessory gene regulator”) em Staphylococcus aureus. Este sistema é composto por quatro genes estruturais, designados por agrA-D 33, 88. AgrB é uma proteína membranar envolvida no processamento do pró-peptido AgrD (que codifica o AIP - autoinducer peptide), resultando na excreção de AIP maduro de aproximadamente 8 resíduos de aminoácidos (figura 2) 33, 55, 56, 70, 99, 121_{. A proteína AgrC é uma histidina cinase que, ao ligar-se ao AIP, fosforila o regulador}

transcricional AgrA, o qual vai activar os promotores P2 e P3 originando os transcritos RNAII e RNAIII, respectivamente 62, 66 (figura 2). O transcrito RNAIII é um RNA regulador, podendo também codificar uma delta toxina (gene hld) (figura 2). A concentracção de delta toxina é elevada no final da fase exponencial e a sua síntese é controlada positivamente pelo sistema agr e pela extremidade 5´ do RNAIII 54, 78, 89. Diversos estudos têm demonstrado que o sistema agr está envolvido na formação de biofilmes e virulência em Staphyolococcus sp 63_.

Figura 2 – Esquema do funcionamento do sistema de QS agr em Sthaphylococcus sp. Este esquema foi adaptado de Kong et al. (2006). A proteína AgrB localizada na membrana está envolvida na maturação e exportação do péptido AIP. Quando se atinge uma determinada concentração de células e consequentemente de AIP, este péptido liga-se à proteína AgrC que promove a fosforilação do AgrA, que por sua vez activa os promotores P2 e P3, originando os transcritos RNAII e RNAIII 63_.

Capítulo 1.Introdução Geral e Objectivos

12 O RNAIII é um RNA regulador de 514 nucleótidos cuja estrutura secundária é constituída por 14 domínios 6 _{e está envolvido na regulação da expressão de vários genes,} inclusivé genes envolvidos na virulência de S. aureus 8, 32, 50.

1.3.2.1 Sistema QS em E. faecalis - fsr

Em 2000, Qin et al. identificou um sistema de QS em E. faecalis OG1RF homólogo ao sistema agr descrito anteriormente, que designou por fsr (E. faecalis regulator) 95. Este sistema é constituído por 4 genes, nomeadamente fsrA, fsrB, fsrD e fsrC, localizados a montante dos genes gelE e sprE, que codificam duas proteases extracelulares(figura 3)84, 95, 94. O gene fsrA transcrito a partir do promotor Pa, codifica o regulador que vai actuar nos promotores Pb (responsável pela transcrição dos genes fsrB, fsrD e fsrC) e Pe (responsável pela transcrição dos genes gelE e sprE) (figura 3) 95, 94. O gene fsrB codifica a proteína FsrB, possivelmente envolvida no processamento da proteína FsrD (codificada pelo gene fsrD) também denominada por GBAP (“Gelatinase Biosynthesis Activating Pheromone”) 84, 95, 94. O gene fsrC codifica uma histidina cinase transmembranar, que ao ligar-se à GBAP extracelular, fosforila a proteína FsrA, tendo sido sugerido que esta activação se efectue através de uma molécula intermediária ainda não identificada (molécula X da figura 4) os promotores Pb e Pe (figura 4) 34, 95, 94.

Figura 3 – Organização geenómica dos operões fsr e gelE-sprE em E. faecalis. Apresentação dos genes fsrA e fsrB/fsrD/fsrC e gelE/sprE, respectivos promotores Pe, Pb e Pa, e tamanho. Os genes dos operões fsr e gelE-sprE encontram-se na cadeia 3´-5´.Os “harpins” localizados a jusante do gene fsrA, fsrB/fsrD/fsrC e gelE/sprE representam os terminadores transcripcionais ( ).

13 Figura 4- Esquema representativo do mecanismo proposto para a activação transcricional do operão fsr e respectivo efeito na síntese de gelatinase e protease sérica em E. faecalis. Este esquema é adaptado (com actualizações) de Gilmore, et al. (2002). Neste modelo, a GBAP é sintetizada sob a forma de uma molécula precursora (GBAP* vermelha) através do fsrD, e processada pela proteína FsrB originando a GBAP madura (GBAP verde). Esta, ao ser secretada para o meio extracelular e depois de atingir uma determinada concentração, interage com a histidina cinase (FsrC), que fosforila o regulador (FsrA) que por sua vez regula os promotores Pb e Pe. Gilmore

et al. (2002) propõe a existência de uma molécula X para a regulação dos promotores Pb e Pe 34.

A GBAP é um péptido de 11 resíduos de aminoácidos com um anel lactona entre o grupo α-carboxil da metionina C-terminal e o grupo hidroxil da serina localizada na terceira posição 83 (figura 5). A sequência de resíduos de aminoácidos corresponde à extremidade C-terminal da proteína FsrB 82.

Capítulo 1.Introdução Geral e Objectivos

14 Em 2006, Nakayama et al. identificaram o gene fsrD que codifica o pró-pétido GBAP´, o qual tem 53 resíduos de aminoácidos (ver GBAP´ da figura 5)84_{. Em analogia com} o sistema agr em que a AgrB está envolvida no processamento e transporte da AgrD, a GBAP´ poderá ser processada pela proteína FsrB, resultando na GBAP madura 84 (figura 5). Após este processamento, a GBAP é transportada para fora da célula, através de um mecanismo desconhecido. Esta acumula-se no meio extracelular até atingir uma determinada concentração máxima (final da fase estacionária) o que desencadeia a activação transcricional dos operões fsrB-fsrD-fsrC e gelE-sprE através do sistema de dois componentes FsrC/FsrA (figura 4). Nakayama et al. mediram a actividade da GBAP e da gelatinase ao longo da curva de crescimento e observaram que ambas tinham o seu máximo no início da fase estacionária 82_{. Recentemente a GBAP têm vindo a ser alvo de estudo para o desenvolvimento de um novo}

antibiótico de forma a atenuar a virulência associada a E. faecalis 86_.

1.3.2.1.1 Proteinase Sérica, Gelatinase e Sistema fsr

Tal como o sistema agr de S. aureus, o sistema fsr está relacionado com a virulência de E. faecalis. Estão identificados dois genes que são regulados por este sistema, nomeadamente o gelE (gelatinase) e sprE (protease sérica). Estas duas proteases tem sido alvo de diversos estudos, no entanto, a gelatinase tem sido mais intensamente estudada.

A protease sérica tem uma similaridade elevada com as glutamil-endopeptidases de Staphylococcus, no entanto, não foi ainda caracterizada e purificada 61. Estudos efectuados indicam que esta protease tem a mesma importância na formação de biofilmes que a gelatinase 61, 76.

15 A gelatinase foi referenciada pela primeira vez em 1975 por Gold et al. que sugeriram a existência de uma protease em E. faecalis OG1-10 responsável pela hidrólise da gelatina oral humana, sugerindo que se tratava de um factor de virulência 37. Esta proteína é uma endopeptidase extracelular (metaloendopeptidase II, proteinase microbial, EC 3.4.24.4) capaz de hidrolisar numerosos substratos, incluindo a gelatina, colagénio, caseína, hemoglobina e outros pequenos péptidos bioactivos 72. A gelatinase produzida pela estirpe E. faecalis OG1-10 (isolado de via oral humana) foi isolada e caracterizada por Makinen et al., em 1989 72. Posteriormente o gene que codifica esta enzima foi identificado e a sua sequência determinada 111. Estudos recentes indicaram que esta proteína é produzida em estirpes clínicas de enterococos 110. Mutantes de gelatinase demonstraram que esta proteína tem uma forte influência na virulência em modelos de peritonites, endocardites, endoftalmites e na formação de biofilmes 23, 39, 64, 76, 109, 110_{. Por outro lado, estudos realizados em estirpes} com origens distintas indicam que a presença dos genes fsr e da gelatinase não são necessários para o organismo provocar infecção, mas por sua vez, em modelos animais aumentam a severidade da doença 98.

Numerosos estudos têm demonstrado que em organismos patogénicos a produção de biofilmes é regulada por sistemas de QS, incluindo o sistema fsr em E. faecalis 39, 76, 93_{. Os} biofilmes são uma população de células ligadas irreversivelmente a superfícies bióticas ou abióticas, encerradas numa matriz hidratada de substâncias exopoliméricas, proteínas, polissacarídeos e ácidos nucleicos 12. O seu estudo em enterococos é importante porque tem sido observado um aumento da resistência a antibióticos por parte destas bactérias quando associadas em biofilmes 75_{. Adicionalmente, a aderência e a formação de biofilmes de} E. faecalis e E. faecium em diferentes biomateriais, tem vindo a demonstrar uma capacidade de estes organismos aderirem a vários materiais médicos, facilitando a infecção 75.

Capítulo 1.Introdução Geral e Objectivos

16 Recentemente, foi demonstrado que estirpes deficientes nas proteínas gelatinase e protease sérica apresentavam uma diminuição na capacidade de produção de biofilmes 76, 95, 109_{. Adicionalmente, outros estudos mostraram que a complementação de uma estirpe mutante}

fsrB e com fenótipo gelatinase negativo, com os genes fsrABC e fsrABC/gelE/sprE resulta na produção de gelatinase e na formação de biofilmes 39.

Estudos epidemiológicos efectuados em estirpes clínicas de E. faecalis indicam que não existe relação entre a formação de biofilmes e a gelatinase, ao contrário do que os resultados de manipulação genética indicam 75, 77.

Estudos efectuados em E. faecalis OG1RF têm demonstrado a importância do sistema fsrABC e gelatinase na virulência em diferentes modelos animais 9, 92. Em modelos de endoflalmites de coelhos e em Caenorhabditis elegans, foi demonstrado que mutantes dos genes fsrB e fsrC tem virulência mais atenuada que estirpes mutantes gelE-sprE, indicando a possibilidade de o sistema fsr poder regular outros genes envolvidos na virulência de Enterococcus 23, 80, 108. De facto, a análise transcricional comparativa entre a estirpe E. faecalis OG1RF e a estirpe isogénica com delecção no gene fsrB indicou que o sistema fsrABC regula, quer positiva quer negativamente, a expressão de vários genes entre o fim da fase exponencial e o início da fase estacionária 9_.

Recentemente, infecções provocadas por E. faecalis em Galleria mellonella demonstraram que a gelatinase produz efeitos virulentos no sistema de defesa de G. mellonella e no sistema complementar inerente ao soro humano, ao contrário da protease sérica que não produz qualquer efeito contra o sistema imunitário do insecto ou no soro humano 92_.