UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA NUTRIÇÃO
TAINÁ GOMES DINIZ
INFLUÊNCIA DO NÍVEL DE ATIVIDADE FÍSICA E ESTADO NUTRICIONAL NO PERFIL DE METILAÇÃO DO GENE MTHFR EM
PACIENTES DIABÉTICOS
JOÃO PESSOA-PB
2020
TAINÁ GOMES DINIZ
INFLUÊNCIA DO NÍVEL DE ATIVIDADE FÍSICA E ESTADO NUTRICIONAL NO PERFIL DE METILAÇÃO DO GENE MTHFR EM
PACIENTES DIABÉTICOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Nutrição, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba em cumprimento aos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências da Nutrição.
ORIENTADORES: Profª. Drª. Darlene Camati Persuhn COORIENTADOR: Prof. Dr. Alexandre Sérgio Silva
JOÃO PESSOA
2020
TAINÁ GOMES DINIZ
INFLUÊNCIA DO NÍVEL DE ATIVIDADE FÍSICA E ESTADO NUTRICIONAL NO PERFIL DE METILAÇÃO DO GENE MTHFR EM
PACIENTES DIABÉTICOS
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Nutrição, Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal da Paraíba como pré-requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências da Nutrição.
Dissertação aprovada em 20/ 02 / 2020.
BANCA EXAMINADORA
Profª. Drª. Darlene Camati Persuhn ORIENTADORA TITULAR
(DN/CCS/PPGCN/UFPB)
Prof. Dr. Alexandre Sérgio Silva COORIENTADOR ( DN/CCS/PPGCN/UFPB )
Prof. Dr. Rodrigo Pinheiro, de Toledo Vianna Examinador interno- Titular
( DN/CCS/PPGCN/UFPB )
Profª. Drª. Maria da Conceição Rodrigues Gonçalves Examinador Interno- Suplente
(DN/CCS/PPGCN/UFPB)
Prof. Drª Cristina Wide Pissetti.
Examinador externo- Suplente (DOG/CCM/UFPB)
JOÃO PESSOA
2020
Dedico este trabalho a meu Deus e à minha mãe santíssima,
por permitir que meu sonho se tornasse real.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus por me proporcionar viver todos os meus sonhos, a minha mãe do céu que sem ela eu não sou completa, a eles todo o meu amor e gratidão.
Agradeço imensamente as duas principais pessoas que se fazem presente em minha vida e que são meu porto seguro, minha base e a eles todo o meu amor, que não medem esforços para me ver feliz, que cuidaram, que amaram, que respeitaram, que me deram a vida, meu pai Valter e minha mãe Bete. Eu sem vocês não sou nada!
Agradeço também a meu namorado Bruno por toda compreensão, amor, cuidado e companheirismo nos momentos mais difíceis. A meus amigos, Rúbia, Larissa, Maria Paula, Bruno, Lizandro, Marilia e Vanessa que dividiram comigo cada momento dessa caminhada.
Minha família que se alegrou com minha conquista, principalmente a minha avó Elza que mesmo distante se faz presente, a minha prima Clara que estava presente fisicamente no dia em que soube que tinha conseguido entrar no mestrado, minha prima Marina, que sempre me escutou e sempre me incentivou.
As minhas meninas que dividi os momentos no laboratório Herlany, Mylenne, Ana Luiza e Carol... Carol, não tenho palavras para externar minha eterna gratidão, eu agradeço cada momento, cada ligação, cada aprendizado, meu porto seguro nessa caminhada, estendo também esses agradecimentos a Mussara, a Raquel que são pessoas maravilhosas e que quero sempre por perto.
A professora Maria José, que me ajudou e confiou em mim, ao professor Alexandre que tenho muita admiração, que sei que posso contar.
E por último, mas não menos importante, a professora Darlene minha orientadora, que me deu a oportunidade e me ajudou a crescer tanto profissionalmente, quanto estudante, quanto pessoa, minha eterna gratidão a tudo que me foi proporcionado.
Agradeço também ao Hospital Universitário Lauro Wanderley da Universidade
Federal da Paraíba e a todos os participantes do estudo, a instituições de apoio financeiro,
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, Brasil), a
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Brasília, Brasil) e a
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Paraíba (FAPESQ, Paraíba, Brasil).
RESUMO
Estudos epidemiológicos apontam relação entre nível de atividade física e homocisteína, um preditor independente e precoce de doenças cardiometabólicas. Níveis de homocisteína por sua vez sofrem influência da atividade de MTHFR cuja expressão é regulada por metilação. O diabetes é uma doença crônica na qual a atividade física é altamente recomendada no sentido de controle e prevenção de complicações, uma vez que o exercício físico regular melhora o controle da glicose no sangue, pode impedir ou atrasar o aparecimento de diabetes mellitus tipo 2 e permite uma utilização melhor e mais eficaz da glicose, reduzindo a resistência à insulina. Há evidencias de uma relação entre o perfil hipermetilado do promotor de MTHFR e a ocorrência de retinopatia diabética em portadores de diabetes tipo 2. Sabe-se que o perfil de metilação gênica é um mecanismo de controle de expressão que pode ser modificado por diversos fatores incluindo atividade física. Contudo a relação entre a atividade física e o perfil de metilação nesse gene ainda não foi investigada. Teve-se então como objetivo avaliar a influência do nível de atividade física e estado nutricional no perfil de metilação do gene MTHFR em pacientes com diabetes mellitus tipo 2. O estudo constituiu com 111 pacientes, com idade média de 58,2±9,4 anos, sendo 43 homens e 68 mulheres diagnosticados com diabetes mellitus há 7,0±2,3 anos, responderam a um questionário sociodemografico de saúde (tabagismo, etilismo e diabetes na família) e o International Physical Activity Questionnaire.
Foram coletados dados antropométricos e sangue venoso para avaliação do perfil bioquímico (glicemia, hemoglobina glicada, colesterol total, HDL, LDL e triglicerídeo) e extração do DNA para determinação do estado de metilação do gene MTHFR, analisado pelo método de MSP. Com isso, foi encontrada prevalência de 18,01% (n=20) de diabéticos insuficientemente ativos, para 81,98% (n=91) de ativos. A análise do perfil de metilação mostrou uma distribuição de 40,5% (n=45) apresentavam perfil metilado e 59,5% (n=66) estavam parcialmente metilado para o gene MTHFR, com p=0,012. O teste de qui-quadrado revelou uma distribuição significativamente maior de sujeitos parcialmente metilados no grupo dos insuficientemente ativos 85%; (n=17) contra 15% (n=3) de metilados. Em relação ao estado nutricional e metilação do gene não foram encontradas associações significativas. Segundo o teste de regressão logística também não foram significativos os dados do perfil glicêmico, lipídico e características de saúde dos pacientes em relação ao gene, apenas o nível de atividade física apresentou significância. Conclui-se que diabéticos insuficientemente ativos apresentam maior tendência ao perfil parcialmente metilado sendo a atividade física um fator independente para a determinação do perfil de metilação do gene MTHFR.
Palavras-chave: Atividade física. Metilação do DNA. Diabetes. MTHFR.
ABSTRACT
Epidemiological studies show a relationship between the level of physical activity and homocysteine, an independent and early predictor of cardiometabolic diseases. Homocysteine levels in turn affect the activity of MTHFR whose expression is regulated by methylation.
Diabetes is a chronic disease in which physical activity is highly recommended without control and prevention of complications, since physical exercise regularly improves blood glucose control, can prevent or delay the onset of type 2 diabetes mellitus and allows for a better and more effective use of glucose, use of insulin resistance. There is evidence of a relationship between the hypermethylated profile of the MTHFR promoter and the occurrence of diabetic retinopathy in patients with type 2 diabetes. It is known that the gene methylation profile is a mechanism of expression control that can be modified by several factors including physical activity.physics. However, a relationship between physical activity and methylation profile in this gene has not yet been investigated. The objective was to evaluate the influence of the level of physical activity and nutritional status on the methylation profile of the MTHFR gene in patients with type 2 diabetes mellitus. The study consisted of 111 patients, with an average age of 58.2 ± 9.4 years, 43 men and 68 women diagnosed with diabetes mellitus 7.0 ± 2.3 years ago, answered a sociodemographic health questionnaire (smoking, alcoholism and diabetes in the family) and the International Physical Activity Questionnaire.
Anthropometric data and venous blood were collected to assess the biochemical profile (glycemia, glycated hemoglobin, total cholesterol, HDL, LDL and triglyceride) and DNA extraction to determine the methylation status of the MTHFR gene, analyzed by the MSP method. Thus, a prevalence of 18.01% (n = 20) of insufficiently active diabetics was found, for 81.98% (n = 91) of active ones. The analysis of the methylation profile showed a distribution of 40.5% (n = 45) with a methylated profile and 59.5% (n = 66) were partially methylated for the MTHFR gene, with p = 0.012. The chi-square test revealed a significantly greater distribution of subjects partially methylated in the group of insufficiently active 85%;
(n = 17) against 15% (n = 3) of methylates. Regarding the nutritional status and methylation of the gene, no significant associations were found. According to the logistic regression test, data on the glycemic, lipid and health characteristics of patients in relation to the gene were also not significant, only the level of physical activity showed significance. It is concluded that insufficiently active diabetics have a greater tendency to the partially methylated profile, with physical activity being an independent factor for determining the methylation profile of the MTHFR gene.
Keywords: Physical activity. DNA methylation. Diabetes. MTHFR.
LISTA DE FIGURAS
Fig. 1 Resumo do metabolismo da homocisteína e folato ... 20
LISTA DE TABELAS
TABELAS DA DISSERTAÇÃO
TABELAS DO ARTIGO
Tabela 1. Distribuição das características de saúde de pacientes diabéticos em função do Nível de Atividade Física (NAF) ... 41 Tabela 2. Perfil de metilação segundo Nível de Atividade Física (NAF), índice de massa
corpórea (IMC) e circunferência abdominal (C. ABD) ... 42 Tabela 3. Regressão Logística/ Perfil de metilação do gene metiltetrahidrofolato MTHFR …. 43 Tabela 1. Combinação das medidas de circunferência abdominal e índice de massa corpórea
(IMC) para avaliar obesidade e risco para diabetes e doença
cardiovascular... 22
Tabela 2. Interpretação e diagnóstico nutricional para adultos e idosos ... 26
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO…... 15
2 REFERENCIAL TEÓRIO………. 17
2.1 Diabetes Mellitus... 17
2.2 Epigenética... 18
2.3 Metilação: um mecanismo epigénetico ………..……… 18
2.4 Gene MTHFR ………. 19
2.5 Atividade física e diabetes... 20
2.6 Classificação do estado nutricional... 21
3 METODOLOGIA... 23
3.1 Desenho do estudo... 23
3.2 Amostra... 23
3.3 Aspectos éticos... 23
3.4 Nível de atividade física ... 24
3.5 Variáveis antropométricas ... 24
3.5.1 Peso e altura... 25
3.5.2 Circunferência abdominal... 25
3.5.3 Índice de Massa Corporal (IMC) ... 25
3.6 Coleta de amostras biológicas e determinação bioquímica ... 26
3.7 Isolamento de DNA de leucócitos ... 27
3.7.1 PCR especifico para metilação (MSP) ... 28
4 TRATAMENTO ESTATÍSTICO... 29
REFERÊNCIAS... 30
ARTIGO... 35
ANEXOS... 50
ANEXO A - termo de consentimento livre e esclarecido... 51
ANEXO B- instrumento de coleta de dados... 54
ANEXO C- questionário internacional de atividade física... 55
APÊNDICES... 59
APÊNCICE A: parecer consubstanciado do CEP HULW... 60
15 1 INTRODUÇÃO
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (2018) a diabetes mellitus é uma doença metabólica com características de hiperglicemia resultante de falha da secreção ou ação da insulina ou a junção das duas falhas pela célula β do pâncreas. A longo prazo o diabetes está associado a complicações crônicas, especialmente dos olhos, rins, nervos, coração e vasos sanguíneos. Dados mais recentes da OMS (2019) mostram que a glicemia alta causa quase 4 milhões de mortes a cada ano, aumentando os riscos de doenças cardiovasculares e outras patologias.
A doença pode ser classificada em diabetes mellitus tipo 1 (DM1) que é caracterizada pela falha na produção da insulina pela célula beta do pâncreas e diabetes mellitus tipo 2 (DM2) que é caracterizada pela diminuição da função das células beta e resposta inadequada da insulina. Além desses que respondem por mais de 95% dos casos de diabetes no mundo, pode-se incluir ainda, a diabetes gestacional, tolerância a glicose prejudicada, glicemia em jejum alterada e diabetes secundária a outras condições clínicas (ADA, 2018).
A biologia molecular é uma área de estudos que investiga marcadores genéticos que podem trazer indicativos precoces de danos à saúde. A epigenética, é uma subdivisão da biologia molecular que reúne um grupo de mecanismos moleculares que afetam a expressão gênica sem influenciar na sequência. Incluem metilação de DNA, modificação de histonas e micro RNAs que apresentam características de herdabilidade, plasticidade e reversibilidade (REMELY et al., 2015; HARVEY, 2018). A relação da epigenética com a expressão gênica é interessante pois pode modular a doenças determinadas por mecanismos moleculares como canceres, obesidade, diabetes em indivíduos adultos, por exposições ambientais, como dieta, fatores químicos e físicos. A caracterização de moduladores epigenéticos podem levar a marcadores de diagnóstico, prognóstico e acompanhamento de intervenções em condições clínicas diversas (LANGEVIN; KELSEY, 2013). O principal mecanismo epigenético e o mais estudado é a metilação do DNA, que basicamente é a modificação química, quando um grupo metil se liga a citosina, porém sem mudar a sequência do DNA original. É essencial para vários processos de desenvolvimento através da regulação da expressão do gene, imprinting genômico e herança epigenética (SCHUBELER, 2015).
O gene MTHFR codifica a enzima metileno tetrahidrofolato redutase, responsável pela
formação do metiltetra-hidrofolato, gerando, assim, a forma de folato necessária para a
remetilação da homocisteína a metionina (GOYETTE et al., 1994). Polimorfismos de
nucleotídeo único (SNPs) tem se mostrado associados a DM2 e suas complicações micro e
16 macro vasculares (BEZERRA et al., 2019, MENG et al., 2019). Também já foi demonstrada a relação entre a hipermetilação do promotor de MTHFR e o aumento do risco de RD em pacientes com 5 a 10 anos de diagnósticos de diabetes tipo 2 (NUNES et al., 2017). Há evidências que mostram associação entre os níveis de homocisteína circulantes e o padrão de atividade física do indivíduo (DEMINICE et al., 2019). Conhecendo a importância da enzima MTHFR no metabolismo de homocisteína, e a possível relação entre o padrão de metilação do gene na ocorrência de complicações em diabetes fica claro o interesse de investigar se existe influência da atividade física sobre o padrão de metilação de MTHFR.
Neste estudo nós levantamos a hipótese de que o nível de atividade física de diabéticos
influência o padrão de metilação do gene MTHFR. Sendo assim, o objetivo desde estudo foi
avaliar se o nível de atividade física e o estado nutricional influenciam o perfil de metilação
do gene MTHFR em pacientes com diabetes mellitus tipo 2.
17 2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Diabetes mellitus
Desde 1980 a prevalência da diabetes quase dobrou passando de 4,7% para 8,5% na população adulta. Nos últimos 10 anos, a prevalência de diabetes vem aumentando em países de baixa e média renda. O diabetes causou 1,5 milhões de mortes em 2012. A glicose no sangue acima do ideal causou 2,2 milhões de mortes, aumentando os riscos de doenças cardiovasculares e outras patologias (WHO, 2018). A diabetes é uma patologia epidemiologica, relacionada ao rápido aumento da obesidade e inatividade física (INTERNATIONAL DIABETES FEDERATION, 2017).
Diabetes mellitus é uma doença metabólica com características de hiperglicemia resultante de falha da secreção ou ação da insulina ou a junção das duas falhas pela célula β do pâncreas. A longo prazo o diabetes está associado a complicações crônicas, especialmente dos olhos, rins, nervos, coração e vasos sanguíneos (ADA, 2018; WESSLING et al., 2017). O diagnóstico de diabetes é estabelecido com taxas de glicose plasmática maiores que 126mg/dl em jejum; e a hemoglobina glicada (HbA1c) maior que 7% (ADA, 2017). Todos os tipos de diabetes podem levar a várias complicações como ataque cardíaco, derrame, amputação da perna, insuficiência renal (nefropatia diabética), perda da visão (RD), além de danos nos nervos, podendo levar também a morte prematuramente (WHO, 2018).
São tipos mais comuns de diabetes:
Diabetes Mellitus tipo 1: Conhecida também como insulino dependente e doença que se inicia na infância. Caracterizada pela falha na produção da insulina pela célula β do pâncreas.
Pacientes com esse tipo diabetes dependem diariamente da insulina para controlar a quantidade de glicose no sangue. A causa da DM1 ainda é desconhecida, os sintomas incluem micção e sede excessiva, fome constante, perda de peso, alteração na visão e fadiga ( ADA , 2018).
Diabetes Mellitus tipo 2: Conhecida por acometer pacientes na fase adulta, é o responsável
pela grande maioria de pessoas com diabetes no mundo. Os sintomas são parecidos com os do
DM1, porém menos frequentes ( ADA , 2018). O diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é resultante
por fatores genéticos e metabólicos (GBD, 2015; INTERNATIONAL DIABETES
FEDERATION, 2017) de estilo de vida, particularmente o excesso de comida e inatividade
18 física, sendo os principais determinantes do DM2. A significativa redução na função das células beta já está presente no momento do diagnóstico do DM2, e declina continuamente, independentemente do tratamento. Sendo a resistência à insulina uma característica comum do DM2, porém é improvável que essa característica cause a doença a menos que a perda progressiva da função das células beta se desenvolva ( ADA , 2018).
2.2 Epigenética
A epigenética é uma parte do estudo da biologia molecular, em especifico, estudo sobre as alterações do fenótipo, regulando a expressão gênica e não alterando a sequência do DNA. São mecanismos epigenéticos: metilação do DNA, modificação de histonas, modelação de cromatina e micro RNAs (REMELY et al., 2015; HARVEY, 2018).
A epigenética está intimamente ligada com o desenvolvimento de doenças como também relacionada a saúde, pois é um mecanismo reversível (MOORE-MORRIS et al., 2018; CAVALLI; OUVIDO, 2019), por isso podem explicar o estilo de vida com os fatores para desenvolver doenças, sendo então um potencial alvo terapêutico nas doenças (REMELY et al., 2015).
A expressão genica regulada por mecanismos epigenéticos pode ser alterada, modificando e modulando a suscetibilidade a doenças como canceres, obesidade, diabetes em indivíduos adultos, por exposições ambientais, dieta, fatores químicos e físicos. Sendo assim, e epigenética tem o potencial de ligar o meio ambiente à expressão gênica e consequentemente aos diferentes fenótipos (JIRTLE; SKINNER 2007). Desta forma, a identificação e caracterização de moduladores epigenéticos podem levar ao reconhecimento de importantes fatores de prevenção e/ou tratamento das doenças (CAVALLI; OUVIDO, 2019).
2.3 Metilação: um mecanismo epigenético.
O mecanismo epigenético mais estudado é a metilação do DNA (SCHUBELER,
2015). Metilação é a modificação química onde o grupo metil é ligado ao resíduo de citosina,
seguido por uma guanina, denominado dinucleótidos CpG, ocorre por meio da transferência
de S-adenosilmetionina (SAM) em citosina por DNA metiltransferases (DNMTs). Estes
dinucleótidos CpG são sítios potencias de metilação, e aparecem esparsos ou agrupados em
regiões chamadas de Ilhas CpG (correspondem a regiões genômicas com mais de 500 pares
19 de bases de comprimento e com um grande número de dinucleotídeos GC) pelos genomas eucariotos. Isso sem mudar a sequencia original do DNA. É essencial para vários processos de desenvolvimento através da regulação da expressão do gene, imprinting genômico e herança epigenética (LI; BEARD; JAE, 1993, FOURNIER et al., 2002). As ilhas CpG promovem efeito de silenciamento transcricional da expressão gênica, por ser catalisada por enzimas (DNA-metil-transferases) que também regulam as funções das proteínas e no metabolismo de RNAs (ILLINGWORTH et al., 2008 ; AUCLAIR; WEBER, 2012).
A metilação do DNA é uma modificação epigenética relativamente estável que pode regular e estabilizar os padrões de expressão gênica e, portanto, estabelecer a identidade celular (KIM, 2019). Pode-se encontrar três tipos de perfil de metilação: o metilado, o parcialmente metilado e o não metilado.
2.4 Gene MTHFR
O grupo metil usado para metilação do DNA pode ser doado pelas reações do ciclo da homocisteína (Figura 1), que é um aminoácido não-codificante de proteína e é gerado a partir do metabolismo da metionina, que pode ser metilado sob influência da enzima 5,10- metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) (ENGBERSEN et al, 1995). A MTHFR catalisa a redução de 5,10- metilenotetrahidrofolato para 5-metiltetrahidrofolato, um processo de transferência de um grupo metilo da cobalamina para o grupo metionina (GOYETTE et al., 1994).
O ciclo do folato (Figura 1), tem sua importância em transportar o carbono, a MTHFR é uma enzima central existem relações já constatadas entre polimorfismos e o perfil de metilação do gene da MTHFR com o risco para o desenvolvimento de câncer e de doenças vasculares (LIEW, GUPTA, 2015; LIN et al., 2016; COPPEDÉ et al., 2019). Sobre a metilação do gene MTHFR foi relacionado a hipermetilação com o aumento da gravidade da diabetes e o aparecimento de suas complicações (YANG et al., 2016; BEZERRA et al., 2019).
Canceres (DONG et al., 2018; CHEN et al., 2019) e doenças coronarianas (LIN et al., 2016),
também foram relacionados com a metilação do gene MTHFR.
20 Fig. 1.Resumo do ciclo da homocisteína e do folato (SAM= S-adenilmetionina, MTs= metiltransferases, SAH= S-adenosilhomocisteína, MS= metionina sintase, B12= cobalamina, CH3= radical metil, THF=
tetrahidrofolato, MTHFR= metilenotetrahidrofolatoredutase. FONTE: adaptado de SCHALINSKE e SMAZAL, 2012.
2.5 Atividade física e diabetes
O termo atividade física definido pela OMS (2018) se dá em qualquer movimento corporal produzido pelos músculos esqueléticos que requer gasto de energia incluindo atividades de lazer, exercício/ treinamento físico, esportes, atividade no trabalho ou em casa e transporte ativo na vida cotidiana na forma de caminhada e/ou ciclismo. A OMS (2018) também classifica como ativo, indivíduos que executam pelo menos 150 minutos de atividades física leve ou moderada por semana ou então, pelo menos 75 minutos de atividade física intensa por semana. Contudo, mais benefícios à saúde são alcançados se a dose for superior à dose mais baixa recomendada. Com isso, foi criado um questionário, o International Physical Activity Questionnaire (IPAC) que avalia o nível de atividade física dos indivíduos (CRAIG et al., 2003).
Por proporcionar qualidade de vida, as diretrizes de tratamento baseadas em evidências para doenças crônicas não transmissíveis recomendam atividade física para melhorar o fisiológico, cognitivo, emocional, social e psicossocial, alteram as crenças em saúde, aumentam a aceitação de doenças crônicas e redução da incapacidade (SBC, 2019;
SIEDLER et al., 2020).
21 Dentre as doenças crônicas não transmissíveis, a atividade física é essencial na redução da morbimortalidade associada ao DM e na manutenção da qualidade de vida desempenhando um papel importante no gerenciamento da patologia. Por reduzir a hiperglicemia em pacientes com DM, melhora a sensibilidade dos músculos esqueléticos à insulina, o que pode resultar na redução da ingestão de medicamentos (JARVIE et al., 2019).
Além disso, a atividade física moderada e vigorosa contribui para a redução de peso, melhora da aptidão cardiovascular e acima de todo o bem-estar emocional dos pacientes com diabetes mellitus (AUNE et al., 2015).
O exercício físico além de melhorar os níveis de glicose no sangue, pode impedir ou atrasar o DM2 e permite uma utilização melhor e mais eficaz da glicose, reduzindo a resistência à insulina. Além disso, afeta lipídios no sangue, pressão arterial, fatores de risco cardiovascular, mortalidade e qualidade de vida de maneira positiva. Em contrapartida a inatividade física pode levar/ piorar as complicações do diabetes (MARTÌNEZ et al., 2018).
2.6 Classificação do estado nutricional
A avaliação antropométrica é um método baseado na medição da composição corporal global. Tem como vantagens que baixo custo, simplicidade de realização, facilidade de aplicação e padronização, além de ser minimamente invasiva. É aplicável em todas as fases da vida e permite a classificação segundo o seu estado nutricional. (SISVAN, 2011).
O estado nutricional classifica os indivíduos de acordo com seu peso e altura segundo a World Health Organization – WHO, desde o ano de 1995 até os dias atuais, recomenda a utilização do Índice de Massa Corporal (IMC) para o diagnóstico do estado nutricional. O estado nutricional está intimamente ligado a doenças crônicas não transmissíveis (CLEMENTE; GALLO; GIORGINI, 2018; LAJEUNESSE-TREMPE et al., 2019).
Como pontos de corte do IMC, acima de 25 kg/m
2e 29 kg/m
2para o diagnóstico de sobrepeso e obesidade, respectivamente. Já para idosos esta classificação é alterada de valor,
≤ 22 kg/m
2para baixo peso e > 27 kg/m
2para sobrepeso (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2000).
Com a finalidade de verificar complicações metabólicas associadas à obesidade e
eventos cardiovasculares a circunferência abdominal é recomendada segundo a Federação
Internacional de Diabetes (2019), neste sentido a OMS, estabelece como ponto de corte para
22 risco cardiovascular aumentado a medida de circunferência abdominal igual ou superior a 94cm em homens e 80cm em mulheres caucasianas.
A Tabela 1, como proposto pela World Health Organization (1995), resume a avaliação de risco com essas medidas associadas.
Tabela1. Combinação das medidas de circunferência abdominal e IMC para avaliar obesidade e risco para diabetes e doença cardiovascular.
Circunferência Abdominal (cm) Risco de complicações metabólicas IMC (kg/m
2) Homem: 94-102 102+
Mulher: 80-88 88+
Baixo peso <18,5 - -
Eutrofia 18,5-24,9 - Aumentado
Sobrepeso 25-29,9 Aumentado Alto
Obesidade ≥30 Alto Muito alto
Fonte: WHO, 1995.
23 3 ABORDAGEM METODOLÓGICA
3.1 Desenho do estudo
A presente dissertação trata de um estudo transversal de base epidemiológica, vinculado a um estudo maior, intitulado: “Análise dos diabéticos usuários do SUS atendidos em serviço de referência de João Pessoa”, com dados coletados entre agosto de 2013 e dezembro de 2016, que incluía originalmente indicadores clínicos, laboratoriais, sócio- demográficos, educacionais e genéticos relacionados às complicações crônicas.
3.2 Amostra
Foi constituída uma amostragem do tipo não probabilística de 111 pacientes que buscavam atendimento nos serviços de endocrinologia, oftalmologia e nefrologia do Hospital Universitário Lauro Wanderley da Universidade Federal da Paraíba (HULW/UFPB).
Considerando o universo de diabéticos, este tamanho amostral foi representativo desta população para um nível de confiança de 95% e margem de erro de 9,3%. Os participantes foram de ambos os sexos, sendo 43 homens e 68 mulheres, destes 78 eram adultos e 33 idosos, com idade média de 58,2±9,4 anos com diagnóstico de diabetes mellitus a cerca de 7,0±2,3 anos, com ou sem complicações microvasculares, sobre adoção dos seguintes critérios, baseados no prazo em que as complicações microvasculares geralmente se manifestam: ter entre 5 e 10 anos de diagnóstico médico de DM2 e ter idade partir dos 40 anos. E como critério de exclusão ter um tempo menor a 5 anos e superior a 10 anos de diagnóstico, indivíduos que desistiram da pesquisa ou que a amostra de DNA foi insuficiente.
3.3 Aspectos éticos
O projeto original foi aprovado pela Comissão de Ética para Pesquisas em Humanos
do Hospital Universitário Lauro Wanderley (protocolo: 796.459/14, ANEXO) e os
procedimentos realizados estavam de acordo com os padrões éticos exigidos pela instituição,
24 sob a Resoluçãon°466/12 Conselho Nacional de Saúde/Ministério da Saúde. Todas as informações dos participantes foram coletadas no próprio Hospital. Esclarecidos quanto aos objetivos propostos pelo estudo, os indivíduos que deram seu consentimento preencheram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (ANEXOA), assegurados de que seus dados jamais seriam expostos separadamente, ou de forma que o indivíduo pudesse ser identificado.
3.4 Nível de atividade física
Para quantificação do nível de atividade física (NAF) dos pacientes, foi utilizado o IPAQ em sua versão longa (CRAIG et al., 2003), permitindo com isso gerar uma estimativa do tempo semanal dos pacientes gasto na realização de atividades físicas em diferentes intensidades (vigorosas ou moderadas), em diferentes atividades cotidianas como: trabalho, transporte, tarefas domesticas e lazer, assim como a estimativa do tempo gasto em atividades na posição sentada.
Os critérios de classificação do IPAQ, foram utilizados para a divisão dos grupos no presente estudo. Os participantes foram classificados em três categorias: a) moderadamente ativos – aqueles que realizaram 5 ou mais sessões na semana de quaisquer combinações de caminhada, atividades de intensidade moderada ou vigorosa, acumulando um mínimo de 600 METs minutos na semana; b) muito ativos – os que realizaram 7 ou mais sessões na semana, de quaisquer combinações dessas atividades, acumulando um mínimo de 3.000 METs, minutos na semana e c) insuficientemente ativos – os não classificados em nenhuma das duas categorias supramencionadas. Os participantes classificados como “moderadamente ativos” e
“muito ativos” foram agrupados em uma única categoria, denominada “suficientemente ativos” que, ao lado dos “insuficientemente ativos”, se constituíram nas duas categorias consideradas no estudo (CRAIG et al., 2003). O IPAQ foi aplicado individualmente por um pesquisador devidamente treinado.
3.5 Variáveis antropométricas
As variáveis antropométricas foram coletadas através de instrumentos adequados
(balança, estadiometro e fita métrica inelástica) pela equipe de pesquisadores. Após
consentimento, o paciente foi entrevistado para identificação da região de residência, UF de
nascimento, idade (anos), sexo, assim como para as variáveis antropométricas.
25 3.5.1 Peso e Altura
Para aferição de peso e altura, segundo as recomendações da World Health Organization (1995), inicialmente verificou-se se a balança estava calibrada (a agulha do braço e o fiel devem estar na mesma linha horizontal), em seguida a balança era travada e só então o indivíduo era convidado a subir no equipamento. Tomou-se a medida do indivíduo quando este encontrava-se em pé, posicionado de costas para o estadiometro, sem dobrar os joelhos (KAC; SICHIERI; GIGANTE,2007). A leitura foi realizada três vezes para obtenção da média. Os participantes do estudo foram orientados a retirar os calçados, chapéus, bonés e as mulheres para que estivessem com os cabelos soltos, evitando o aumento incorreto da altura.
Para a mensuração do peso, foi utilizada uma balança eletrônica com capacidade para até 150 kg e sensibilidade de 100g (Filizola®), com capacidade de até 150 Kg e precisão de 100 g. Para o registro da altura (cm) foi mensurada com um estadiometro já acoplado a balança.
3.5.2 Circunferência Abdominal
A circunferência abdominal foi analisada segundo pontos de corte da World Health Organization (1995) para avaliar risco metabólico associado à adiposidade abdominal. A mensuração foi realizada em triplicáta, utilizando-se a média entre os valores obtidos, com o auxílio de uma fita métrica inextensível da marca Sanny®, com escala de 0-200cm e resolução de 0,1cm. Para a medição foi estabelecido o recomendado pela World Health Organization (1995) e Ross et al. (2008), no qual o adulto ficou em posição ereta, com os pés juntos, os braços descontraídos ao lado do corpo, e após expiração, com o abdomêm relaxado, a fita colocada na região abdominal, sem compressão dos tecidos. A obesidade central foi definida como uma C. ABD >102cm para os homens e > 88cm para as mulheres.
3.5.3 Índice de Massa Corporal (IMC)
O outro indicador utilizado para avaliar o estado nutricional dos indivíduos foi o
Índice de Massa Corporal (IMC) segundo classificação da World Health Organization –
26 (1995) para adultos. Calculado a partir da fórmula peso (em Kg) dividido por altura ao quadrado (dada em metros).
Para determinação da prevalência de sobrepeso e obesidade nos indivíduos foram utilizados os seguintes indicadores:
Tabela 2. Interpretação e diagnóstico nutricional para adultos e idosos Adultos - 20 a 59 anos
Aferições:
- Peso Atual; - Altura Atual
Interpretações:
VALORES CRÍTICOS DIAGNÓSTICO NUTRICIONAL
< 18,5kg/m² DESNUTRIÇÃO
≥18,5 e < 25 kg/m² IMC ADEQUADO OU EUTRÓFICO
≥25 e < 30 kg/m² SOBREPESO
≥ 30kg/m² OBESIDADE
Idosos – á partir de 60 anos
< 22kg/m² BAIXO PESO
≥22 e < 27 kg/m² IMC ADEQUADO OU EUTRÓFICO
≥27< 30 kg/m² SOBREPESO
≥ 30kg/m² OBESIDADE
Fonte: World Health Organization (1995)
3.6 Coleta de amostras biológicas e determinação bioquímica.
A coleta de sangue para obtenção de leucócitos foi realizada através de punção venosa seguindo a Resolução da ANVISA - RDC N° 34, de 11 de junho de 2014, que dispõe sobre as boas práticas no ciclo do sangue. Todas as amostras dos tubos foram imediatamente centrifugadas para obtenção de plasma e soro respectivamente e submetidas a analise em período inferior a 2 horas após a coleta. Alíquotas de soro e plasma foram armazenadas sob - 80°C para análises posteriores.
O sangue foi coletado por meio de punção venosa em 3 tubos estéreis diferentes, no tubo
1 (com anticoagulante EDTA K3) para de 4 ml de amostra, tubo 2 (com anticoagulante
fluoreto de sódio) para 4 ml de amostra e o tubo 3 (com ativador de coágulo) para 6 ml de
amostra. Todas as análises bioquímicas foram processadas no Laboratório de Estudos do
Treinamento Físico Aplicado ao Desempenho e Saúde (LETFADS) do Departamento de
Educação Física da UFPB. Todas as amostras coletadas nos tubos 2 e 3 foram imediatamente
27 centrifugadas para que obtivesse plasma e soro respectivamente, em seguida foram submetidas a analise em período inferior a 2 horas após a coleta. Alíquotas de soro e plasma foram ainda armazenadas sob -80°C para análises posteriores.
Uma quantidade de 10 μl do sangue total obtido com o tubo 1 foi usada para determinação da HbA1c. Para este sim foi utilizada a técnica de imunoturbidimetria em analisador automatizado (LabMax 240, Labtest, Lagoa Santa, MG, Brasil) com período inferior à 2 horas após a coleta, utilizando kit padronizado e seguindo as orientações do fabricante (Labtest, Lagoa Santa, MG, Brasil).
Uma alíquota do plasma obtida do tubo 2 (250 μl) foi usada para determinação de glicose plasmática (método glicose oxidase) em analisador automatizado utilizando kit comercial (Labtest, Lagoa Santa, MG, Brasil).
Na alíquota de soro obtida do tubo 3 (250 μl) foram feitas dosagens de HDL (método ultracentrifugação-detergente seletivo) colesterol total e triglicerídeos (método enzimático- Trinder) em analisador automatizado, utilizando kit comercial de acordo com as orientações recomendadas pelo fabricante (Labtest, Lagoa Santa, MG, Brasil).
Concentração de colesterol LDL foi determinada pela fórmula de Friedewald onde:
[LDL]=[colesterol total]-[HDL]-[triglicerídios/5]. Para isto, 250 µl de plasma foi adicionado a KCl e incubado em banho-maria a 37°C por 60 minutos. Em seguida, a mistura foi precipitada com ácido perclórico a 35 % e centrifugado a 14000 rpm por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi transferido para novos microtubos, adicionado 400 µl de ácido tiobarbitúrico a 0,6 % e incubado a 95 – 100° C por 30minutos. Após o resfriamento, o material foi lido em espectrofotômetro a um comprimento de onda de 532 nm.
3.7 Isolamento do DNA de leucócitos
As amostras foram diluídas em uma primeira solução de lise, contendo 10 mM Tris-
HCl pH 8,5 1 mM EDTA, 0,3 M sacarose, Triton-X-100-1% afim de lisar as hemácias
deixando, no entanto os leucócitos íntegros. Em seguida foram submetidas a centrifugação a
3.200 rpm para descarte do sobrenadante. Esse processo foi repetido por 3 vezes no intuito de
obter um precipitado de leucócitos livre de resquícios de hemoglobina. O precipitado foi
então ressuspenso em solução de lise contendo 10 mM Tris-HClpH 8,5% dodecil sulfato de
sódio (SDS), 5 mM EDTA, 0,2 μg de proteinase K (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e
28 incubado a 55ºC em banho-maria. Após 7 horas de incubação foi adicionado 500 μl de uma solução aquosa de 1mM EDTA e 7,5 M acetato de amônio.
A mistura foi centrifugada por 10 min a 14.000g a 4ºC e 700 μl do sobrenadante foi transferido para novo tubo onde foi realizada precipitação do DNA com 540 μl de isopropanol. A seguir o precipitado de DNA foi lavado com 70% etanol, centrifugado (12.000 g por 5min), seco e ressuspenso em tampão Tris 10mM e EDTA 1mM pH 8,0. (Descrito e adaptado de MILLER; DYKES; POLESKY, 1988). As amostras foram mantidas a -20°C até as análises de metilação de DNA.
3.7.1 PCR especifico para metilação (MSP)
O DNA de leucócitos, previamente extraído, foi convertido (500 ng) pelo bissulfito de sódio, cujo princípio da técnica está em transformar citosina não metilada em uracila sem provocar alteração em citosina metilada
24a partir do Kit EZ DNA Methylation™
(ZymoResearch), de acordo com as instruções do fabricante.
Para cada reação de PCR específica para metilação foi utilizado 100ng de DNA
transformado com bissulfito, 0,7μL (7 μM) de cada iniciador específico para alvos metilados
(sense: 5’-tagatttaggtacgtgaagtagggtagac-3 e anti-sense: 5’- gaaaaactaataaaaaaccgacgaa-3’) e
não metilados (sense: 5’- tttaggtatgtgaagtagggtagatgt-3’ e anti-sense: 5’-
caaaaaactaataaaaaaccaacaaa-3’) com 180pb como previamente descrito [25] e 1 x Go Taq Hot
Start Green Master Mix (Promega Corporations, Madison, WI, USA) numa reação final de
25μL, com temperatura de anelamento de 58º C por 40 segundos e 40 ciclos. Como controle
foi utilizado DNA metilado e não metilado (Cells-to-CpG™ Methylated & Unmethylatedg
DNA Control Kit, Life Technologies) que foram modificados, como anteriormente citado, e
amplificados por PCR, como controle das reações com os iniciadores para a condição
metilada e não metilada respectivamente. As amostras de PCR amplificadas foram carregadas
(7μl) em géis de agarose 3% com gel red e submetidas a eletroforese. As bandas de DNA
foram visualizadas em transluminador de luz ultravioleta.
29 4 TRATAMENTO ESTATÍSTICO
Foram utilizadas distribuição por frequências para as variáveis categóricas, assim como a estatística descritiva (média, Desvio padrão) para as variáveis contínuas. O teste qui quadrado foi utilizado para testar a relação entre o perfil de metilação, como variável dependente e o nível de atividade física como variável independente, depois foi feito uma regressão logística binária. Onde a variável dependente continuou sendo o perfil de metilação e as variáveis independentes foram o perfil glicêmico e lipídico, sexo, tabagismo, etilismo, DM na família, excesso de peso e circunferência abdominal. As análises estatísticas foram realizadas através do SPSS versão 24.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA) e adotou-se o p <
0,05.
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35 ARTIGO
Submetido a revista Journal of Physical Activity & Health como requisito para obtenção do
título de mestre.
36 INFLUÊNCIA DO NÍVEL DE ATIVIDADE FÍSICA NO PERFIL DE METILAÇÃO
DO GENE MTHFR EM PACIENTES DIABÉTICOS
Tainá Gomes Diniz
a, Alexandre Sérgio Silva
b, Mayara Karla dos Santos Nunes
c, Mateus Duarte Ribeiro
d, Darlene Camati Persuhn
l.
a
Post-Graduation Program in Nutrition Science, Federal University of Paraiba, Joao Pessoa, Brazil. Email: tainagdiniz@gmail.com
ORCID: 0000-0002-2211-1858.
b
Department of Physical Education, Federal University of Paraiba (UFPB), Joao Pessoa/PB, Brazil. E-mail: alexandresergiosilva@yahoo.com.br
ORCID: 0000-0003-3576-9023.
c
Post-Graduation Program in Cellular and Molecular Biology, Federal University of Paraiba, Joao Pessoa, Brazil. Email: mayarakarlasn@hotmail.com
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Post-Graduate Program in Physical Education, Federal University of Paraiba, Joao Pessoa, Brazil. E-mail: mateus.duarte@hotmail.com
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l
