Foram utilizadas distribuição por frequências para as variáveis categóricas, assim como a estatística descritiva (média, Desvio padrão) para as variáveis contínuas. O teste qui quadrado foi utilizado para testar a relação entre o perfil de metilação, como variável dependente e o nível de atividade física como variável independente, depois foi feito uma regressão logística binária. Onde a variável dependente continuou sendo o perfil de metilação e as variáveis independentes foram o perfil glicêmico e lipídico, sexo, tabagismo, etilismo, DM na família, excesso de peso e circunferência abdominal. As análises estatísticas foram realizadas através do SPSS versão 24.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA) e adotou-se o p < 0,05. 30 REFERÊNCIAS ADA-AMERICAN DIABETES ASSOCIATION. Classification and diagnosis of diabetes. Standards of medical care in diabetes 2015. Diabetes Care, v. 38, supl. 1, p. S11-S24, 2017. ADA- AMERICAN DIABETES ASSOCIATION. 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Global report on diabetes. Geneva: World Health Organization. 2019. Disponível em: < https://www.who.int/publications-detail/classification-of-diabetes-mellitus> Acesso em: 27 de Janeiro de 2020. YANG, X. H., CAO, R. F., YU, Y., SUI, M., ZHANG, T., XU, J. Y., WANG, X. M. A study on the correlation between MTHFR promoter methylation and diabetic nephropathy. Am J 35 ARTIGO Submetido a revista Journal of Physical Activity & Health como requisito para obtenção do título de mestre. 36 INFLUÊNCIA DO NÍVEL DE ATIVIDADE FÍSICA NO PERFIL DE METILAÇÃO DO GENE MTHFR EM PACIENTES DIABÉTICOS Tainá Gomes Diniza, Alexandre Sérgio Silvab, Mayara Karla dos Santos Nunesc, Mateus Duarte Ribeirod, Darlene Camati Persuhnl. aPost-Graduation Program in Nutrition Science, Federal University of Paraiba, Joao Pessoa, Brazil. Email: tainagdiniz@gmail.com ORCID: 0000-0002-2211-1858. bDepartment of Physical Education, Federal University of Paraiba (UFPB), Joao Pessoa/PB, Brazil. E-mail: alexandresergiosilva@yahoo.com.br ORCID: 0000-0003-3576-9023. cPost-Graduation Program in Cellular and Molecular Biology, Federal University of Paraiba, Joao Pessoa, Brazil. Email: mayarakarlasn@hotmail.com ORCID: 0000-0001-9835-5050 dPost-Graduate Program in Physical Education, Federal University of Paraiba, Joao Pessoa, Brazil. E-mail:mateus.duarte@hotmail.com ORCID: 0000-0003-1071-5264 lDepartment of Molecular Biology and Post-Graduation Program in Nutrition Science, Federal University of Paraiba, Joao Pessoa, Brazil. Email: darlenecp@hotmail.com ORCID: 0000-0001-5291-5454 *Corresponding Author: Dra. Darlene Camati Persuhn Federal University of Paraiba Department of Molecular Biology João Pessoa-PB Brazil CEP 58051-900 37 Influência do nível de atividade física e estado nutricional no perfil de metilação do gene MTHFR em pacientes diabéticos Resumo Introdução: Estudos epidemiológicos apontam relação entre nível de atividade física e homocisteína. Níveis de homocisteína sofrem influência da atividade da enzima MTHFR cuja expressão é regulada por metilação, contudo a relação entre o perfil de metilação nesse gene e atividade física ainda não foi investigada. Objetivo: avaliar a influência do nível de atividade física e estado nutricional no perfil de metilação do gene MTHFR em pacientes com diabetes mellitus tipo 2. Metodologia: 111 pacientes, com idade média de 58,2±9,4 anos, sendo 43 homens e 68 mulheres diagnosticados com diabetes mellitus há 7,0±2,3 anos, responderam ao International Physical Activity Questionnaire (IPAC), e foram submetidos à coleta sanguínea para análises bioquímicas, extração de DNA e determinação do perfil de metilação do gene MTHFR pela técnica de MSP. Resultado: Foi encontrada prevalência de 18,01% (n=20) de diabéticos insuficientemente ativos, para 81,98% (n=91) de ativos. Notou-se que 40,5% (n=45) apresentavam perfil metilado e 59,5% (n=66) estavam parcialmente metilado. O teste de qui-quadrado revelou uma distribuição significativamente maior de sujeitos parcialmente metilados no grupo dos insuficientemente ativos 85%; (n=17) contra 15% (n=3) de metilados. Conclusão: Conclui-se que diabéticos insuficientemente ativos apresentam predisposição para maior tendência de expressão do gene que codifica a enzima MTHFR. Palavras-chave: Atividade física. Metilação do DNA. Diabetes. MTHFR. INTRODUÇÃO As pesquisas na área da epidemiologia da atividade física das últimas décadas revelaram que existe evidente associação negativa entre nível de atividade física e surgimento de diversas enfermidades crônicas como hipertensão arterial [1], câncer [2] e o diabetes mellitus [3]. De acordo com a OMS, a obesidade é o maior problema de saúde e junto com a diabetes, aumentam em 7 vezes o risco de mortalidade dos indivíduos. Como o diabetes está associado com a obesidade essa relação hoje é chamada de “diabesidade” [4]. Porém sabe-se que a obesidade é o principal fator de risco para várias doenças não transmissíveis, como doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2, hipertensão, doença coronariana ou certos tipos de câncer. Em relação a diabetes, sobrepeso e obesidade são responsáveis por 44% dos casos. Em 2016, mais de 1,9 bilhão de adultos, com 18 anos ou mais, estavam acima do peso. Destes, mais de 650 milhões eram obesos [5]. O gene MTHFR codifica uma enzima responsável pela responsável pela conversão do metilenotetrahidrofolato em metiltetrahidrofolato (MTHF). A atividade do produto gênico pode ser influenciada por polimorfismos de nucleotídeo únicos que estão relacionadas com o 38 risco dos indivíduos desenvolverem diabetes [6,7] e suas principais complicações crônicas [8,9]. Há evidências de que a expressão do gene MTHFR sofre influência do padrão de metilação do seu promotor [10]. Sendo assim, a detecção do padrão de metilação deste gene pode indicar aspectos metabólicos dos pacientes. Sabendo-se que o meio ambiente regula a expressão gênica, e que as pessoas com maiores níveis de atividade física estão mais protegidas tanto contra o diabetes quanto contra seus desfechos nos órgãos alvo [11], neste estudo nós levantamos a hipótese de que o nível de atividade física de diabéticos está envolvido na modulação do perfil de metilação do gene MTHFR. Sendo assim, o objetivo desde estudo foi avaliar se o nível de atividade física e o estado nutricional influenciam o perfil de metilação do gene MTHFR em pacientes com diabetes mellitus tipo 2. METODOLOGIA Participantes Foi constituída uma amostragem do tipo não probabilística de 111 pacientes que buscavam atendimento nos ambulatórios de endocrinologia, oftalmologia e nefrologia do Hospital Universitário Lauro Wanderley da Universidade Federal da Paraíba (HULW/UFPB) entre os períodos de novembro de 2015 a novembro de 2016. Considerando o universo de diabéticos, este tamanho amostral foi representativo desta população para um nível de confiança de 95% e margem de erro de 9,3%. Os participantes foram de ambos os sexos, sendo 43 homens e 68 mulheres, idade média de 58,2±9,4 anos com diagnóstico de diabetes mellitus a cerca de 7,0±2,3 anos, com ou sem complicações microvasculares. Esta pesquisa foi previamente submetida ao comitê de ética e pesquisa do HULW/UFPB, sendo aprovada com protocolo n° 1.335.108/2015. Todos os procedimentos éticos seguiram a resolução 466/2012 do Conselho Nacional de Saúde e a Declaração Internacional de Helsinki de 1975. Todos os voluntários receberam esclarecimentos acerca dos procedimentos que seriam realizados, logo após, assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). 39 Inicialmente, os pacientes responderam dois questionários, o primeiro para coleta de variáveis relacionadas ao perfil sociodemográfico, antropométricos e dados clínicos e o segundo para quantificação do nível de atividade física. Em seguida, foi realizado coleta sanguínea para determinação do perfil de metilação em leucócitos. Perfil sociodemográfico Foram coletados dados relacionados, características relacionadas ao sexo, idade, fatores de risco (tabagismo e etilismo), histórico de doenças (tempo do diagnóstico do DM, histórico do DM na família, e complicações do DM). Por fim foram realizadas medidas da de estatura, peso. Perfil Antropométrico Para aferir o peso foi utilizada uma balança eletrônica com capacidade para até 150 kg e sensibilidade de 100g (Filizola®). Os indivíduos foram pesados com roupas leves, descalços, com postura ereta, pés paralelos e inteiramente apoiados na plataforma da balança e com braços ao longo do corpo [12]. A estatura foi aferida utilizando o estadiômetro acoplado à balança que é constituído de um tubo de aço com régua de alumínio anodizado, medindo de 97 cm à 192 cm com divisões de 0,5 cm. Os indivíduos estavam com postura ereta, pés juntos e calcanhares encostados na parede. O ápice da orelha e o canto externo do olho ficaram em linha paralela ao chão, formando um ângulo de 90º com a barra do estadiômetro, assim, a barra horizontal do estadiômetro era abaixada e apoiada na cabeça, permitindo a leitura em centímetros [12]. Para aferição da circunferência abdominal os pacientes deveriam estar com as pernas levemente separadas e a fita métrica inelástica passava na linha da cicatriz umbilical para o diagnóstico do resultado o valor de referência para homens é de 102 cm e para mulheres caucasianas 88 cm [13]. O Índice de Massa Corporal foi calculado dividindo-se o peso (em kg), pela altura (em metros), ao quadrado. Os valores obtidos serão categorizados em baixo peso, eutrofia, sobrepeso ou obesidade para indivíduos adultos e magreza, eutrofia e excesso de peso para indivíduos idosos de acordo com os pontos de corte da Organização Mundial de Saúde [5]. Nível de atividade Física Para quantificação do nível de atividade física (NAF) dos pacientes, foi utilizado o IPAQ em sua versão longa [14], permitindo com isso gerar uma estimativa do tempo semanal 40 dos pacientes gasto na realização de atividades físicas em diferentes intensidades (vigorosas ou moderadas), em diferentes atividades cotidianas como: trabalho, transporte, tarefas domesticas e lazer, assim como a estimativa do tempo gasto em atividades na posição sentada. O IPAQ foi aplicado individualmente por um pesquisador devidamente treinado. Segundo a OMS [5] para ser classificado como ativo, são necessários pelo menos 150 minutos de atividades física leve ou moderada por semana ou então, pelo menos 75 minutos de atividade física intensa por semana. Divididos então em dois grupos, os ativos e os insuficientemente ativos (INSUF) segundo a nomenclatura do IPAQ. Coleta de amostras biológicas Foi realizado coleta de sangue em todos os voluntários, após jejum de 12 horas. Para as análises bioquímicas, o sangue foi coletado por meio de punção venosa em 3 tubos estéreis diferentes: tubo 1 (com anticoagulante EDTA K3), tubo 2 (com anticoagulante fluoreto de sódio) e tubo 3 (com ativador de coágulo). Todas as amostras dos tubos 2 e 3 foram imediatamente centrifugadas para obtenção de plasma e soro respectivamente e submetidas à analise em período inferior à 2 horas após a coleta. Determinações bioquímicas Para as determinações bioquímicas: glicemia, colesterol total, HDL e triglicerídeos foi utilizado o método enzimático, hemoglobina glicada foi usada a técnica de imunoturbidimetria. Todas os testes foram realizados em analisador automatizado (LabMax 240, Labtest, Lagoa Santa, MG, Brasil) utilizando kit padronizado e seguindo as orientações recomendadas pelo fabricante (Labtest, Lagoa Santa, MG, Brasil). A concentração de LDL foi determinada pela fórmula de Friedewald, onde: [LDL] = [colesterol total] - [HDL] – [triglicerídeos ÷ 5]. [15]. Foi usado como ponte de corte para colesterol total <200mg/dl, LDL<100mg/dl, HDL>60mg/dl, triglicerídeos<150mg/dl [16], glicemia <126mg/dl e hemoglobina glicada 7%[17]. E para o diagnóstico de dislipidemia, utilizamos os níveis aumentados de colesterol total, LDL e triglicerídeos e níveis diminuídos de HDL. 41 Análise do perfil de metilação Foram coletados aproximadamente 4 ml de sangue através de punção venosa em tubos estéreis contendo 7,2 mg de K3 EDTA, em seguida as amostras foram armazenadas em um freezer a -20°C por um período de 15 dias até a extração. A extração de DNA foi feita pela técnica de salting out. As amostras de sangue foram diluídas em uma primeira solução de lise, contendo 10 mM Tris-HCl pH 8, 5 mM EDTA, 0,3 M sacarose, Triton-X-100 1% afim de lisar as hemácias deixando, no entanto, os leucócitos íntegros. Em seguida seguiu-se a centrifugação à 3.200 rpm para descarte do sobrenadante. Esse processo foi repetido por 3 vezes no intuito de obter um precipitado de leucócitos livre de resquícios de hemoglobina. O precipitado foi então ressuspendido em uma segunda solução de lise contendo 10 mM Tris-HCl pH 8, 0,5% dodecil sulfato de sódio (SDS), 5 mM EDTA, 0,2 μg de proteinase K (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e incubado a 55ºC em banho-maria. Após 7 horas de incubação foi adicionado 500 μl de uma solução aquosa de 1 mM EDTA e 7,5 M acetato de amônio. A mistura foi centrifugada por 10 min a 14.000g a 4ºC e 700 μl do sobrenadante foi transferido para novo tubo onde foi realizada a precipitação do DNA com 540 μl de isopropanol. Logo em seguida o precipitado de DNA foi lavado com 70% etanol, centrifugado (12.000 g por 5min), seco e ressuspendido em tampão Tris-EDTA pH 8,0 [18]. PCR específico para metilação O DNA de leucócitos, previamente extraído, foi convertido (500 ng) pelo bissulfito de sódio, cujo princípio da técnica está em transformar citosina não metilada em uracila sem provocar alteração em citosina metilada 24 a partir do Kit EZ DNA Methylation™ (ZymoResearch), de acordo com as instruções do fabricante. Para cada reação de PCR específica para metilação foi utilizado 100ng de DNA transformado com bissulfito, 0,7μL (7 μM) de cada iniciador específico para alvos metilados (sense: 5’-tagatttaggtacgtgaagtagggtagac-3 e anti-sense: 5’- gaaaaactaataaaaaaccgacgaa-3’) e não metilados (sense: 5’- tttaggtatgtgaagtagggtagatgt-3’ e anti-sense: 5’-caaaaaactaataaaaaaccaacaaa-3’) com 180pb como previamente descrito e 1 x Go Taq Hot Start Green Master Mix (Promega Corporations, Madison, WI, USA) numa reação final de 25μL, com temperatura de anelamento de 58º C por 40 segundos e 40 ciclos. Como controle foi utilizado DNA metilado e não metilado (Cells-to-CpG™ Methylated & Unmethylatedg 42 DNA Control Kit, Life Technologies) que foram modificados, como anteriormente citado, e amplificados por PCR, como controle das reações com os iniciadores para a condição metilada e não metilada respectivamente. As amostras de PCR amplificadas foram carregadas (7μl) em géis de agarose 3% com gel red e submetidas a eletroforese. As bandas de DNA foram visualizadas em transluminador de luz ultravioleta. Análise Estatística Foram utilizadas distribuição por frequências para as variáveis categóricas, assim como a estatística descritiva (média, Desvio padrão) para as variáveis contínuas. O teste qui quadrado foi utilizado para testar a relação entre o perfil de metilação e o nível de atividade física, juntamente com uma regressão logística binária. As análises estatísticas foram No documento UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA NUTRIÇÃO TAINÁ GOMES DINIZ (páginas 27-62)
