Atividade Antifúngica do Ácido Maléico Sobre Candida Spp Envolvidas com Infecções da Cavidade Bucal

Atividade Antifúngica do Ácido Maléico Sobre

Candida

Spp

Envolvidas com Infecções da Cavidade Bucal

Antifungal Activity of Maleic Acid against

Candida

spp Associated with Oral

Infections

Ana Carolina Loureiro Gama MOTA1, Edeltrudes de Oliveira LIMA2, Ricardo Dias de CASTRO3, André Ulisses Dantas BATISTA4

Objetivo: Determinar in vitro a atividade antifúngica do ácido maléico, contido nos vinagres de maçã, através do estabelecimento da sua Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM).

Metodologia: Trata-se de uma pesquisa laboratorial, experimental e que apresenta uma abordagem indutiva e observação direta intensiva. Utilizou-se vinagre de maçã Minhoto® _{com concentração inicial de ácido}

maléico de 4%. Foram testadas nos ensaios oitos cepas do gênero Candida, sendo cinco de Candida albicans e três de Candida tropicalis. A determinação da CIM foi feita pela técnica da microdiluição em Caldo Sabourand Dextrose, e, seqüencialmente, a CFM foi determinada, utilizando-se os princípios da mesma técnica.

Resultados: Foi observada CIM do vinagre de maçã de 2.500 µg/mL para todas as cepas ensaiadas. Em relação à CFM, Candida tropicalis ATCC 13803 foi sensível a uma concentração de 10000 µg/mL, enquanto que Candida tropicalis 33 e Candida albicans LM 615 a 5000 µg/mL. Para as demais cepas foi observada CFM de 2.500 µg/mL. A nistatina apresentou CIM de 3,125 µg/mL para as oito cepas teste e valores de CFM variando entre 3,125 µg/mL e 12,5 µg/mL.

Conclusão: Tendo em vista os resultados obtidos, o vinagre de maçã apresenta-se como agente fungicida e fungistático, o que nos fornece indicativos para avaliação deste quando em contato com bases de próteses dentárias e combate a infecções micóticas que acometem a cavidade bucal, havendo, ainda, a necessidade de realização de ensaios diversos a respeito do comportamento do vinagre de maçã em contato com o meio bucal e os materiais constituintes das próteses, a fim determinar a correta forma de utilização do mesmo para que se possa obter excelência de resultados.

Candida; Vinagre; Desinfecção.

Objective: To determine in vitro the antifungal activity of maleic acid contained in apple vinegars by the establishment of its minimal inhibitory concentration (MIC) and minimal fungicidal concentration (MFC).

Method: This investigation was a laboratory, experimental research with an inductive approach and intensive direct observation. A commercial apple vinegar (Minhoto®_{) containing maleic acid with initial}

concentration of 4% was used. Eight Candida strains were tested in the assays, being five Candida albicans and three Candida tropicalis. The MIC was determined by the microdiluition technique in Sabourand Dextrose broth, and, sequentially, the MFC was determined, using the principles of the same technique.

Results: The MIC of apple vinegar was 2,500 µg/mL for all strains. Regarding MFC, Candida tropicalis ATCC 13803 was sensitive to a concentration of 10,000 µg/mL, while Candida tropicalis 33 and Candida albicans LM were sensitive to concentrations from 615 to 5,000 µg/mL. For the other strains, a MFC of 2,500 µg/mL was obtained. Nystatin presented MIC of 3,125 µg/mL for the eight test strains and MFC values ranging from 3,125 µg/mL to 12.5 µg/mL. Conclusion: Considering the obtained results, apple vinegar presents fungicidal and fungistatic actions, which provide evidence for evaluation of this agent when in contact with denture bases, and treats oral mycotic infections. However, several assays are needed to investigate the behavior of apple vinegar in contact with the oral cavity and the denture base materials in order to determine its correct mode of use to obtain excellence in the outcomes.

Candida; Vinegar; Disinfection.

DOI: 10.4034/PBOCI.2012.123.09 ISSN - 1519-0501

1

Professora Adjunta do Centro Universitário de João Pessoa (UNIPE), João Pessoa/PB, Brasil.

2

Professora Associada do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), João Pessoa/PB, Brasil.

3

Professor Adjunto do Departamento de Clínica e Odontologia Social da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), João Pessoa/PB, Brasil.

4

Professor Adjunto do Departamento de Odontologia Restauradora da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), João Pessoa/PB, Brasil.

RESUMO

ABSTRACT

DESCRITORES

KEY-WORDS

357

Frequentemente relatada como a infecção oportunista mais prevalente em pacientes usuários de próteses, a estomatite protética ou candidose atrófica crônica, corresponde ao conjunto de alterações que ocorrem na mucosa de suporte das próteses dentárias. Caracterizada por hiperemia, edema e congestão com inflamação moderada ou intensa e pelo aspecto avermelhado e brilhante da mucosa palatina, a estomatite protética está associada ao uso contínuo de próteses totais ou removíveis mal adaptadas que causam traumatismo crônico de baixa intensidade1-8.

De etiologia multifatorial, a infecção é antes de tudo relacionada à contaminação da superfície interna da prótese por Candida spp que pode iniciar, manter e exacerbar a alteração, muito embora, a presença do fungo per si não seja capaz de induzir o desenvolvimento de estomatite protética. Há sempre a necessidade de um fator iatrogênico associado, que provocará a quebra do equilíbrio comensal existente entre o fungo e o hospedeiro, que pode ser a má adaptação, ou, principalmente, a higienização precária1,3,6,9.

A micose é mais prevalente em mulheres, entre os 20 e 39 anos. Clinicamente é representada pela presença de áreas eritematosas de contornos bem delimitados, pontos ou áreas focais avermelhados, que surgem nos locais de contato entre a prótese e a mucosa da cavidade bucal, podendo causar, nas superfícies onde se desenvolve, alterações de textura1,2,6,8,10. A maioria dos pacientes não apresenta sintomatologia, mas o tratamento é sempre necessário, envolvendo a orientação da higiene das próteses e da cavidade bucal, a remoção do fator irritante, o uso de antifúngicos e a confecção de uma nova prótese2,10.

Apenas 30% dos usuários de próteses removíveis fazem uso de algum tipo de solução para higienização bucal e/ou de suas próteses, muito embora o uso de métodos químicos tenha se mostrado mais eficaz do que a própria escovação no combate à estomatite protética11.

Reconhecido pela medicina popular como potente agente antimicrobiano, o vinagre vêm sendo alvo de investigações a fim de obter reconhecimento científico quanto as suas propriedades medicinais7.

O vinagre é o produto obtido exclusivamente da fermentação acética do vinho. Os outros vinagres, denominados fermentados acéticos, são elaborados a partir de mostos açucarados, que primeiro foram submetidos à fermentação alcoólica e depois ao processo de acetificação. O vinagre de vinho genuíno deve conter ácido tartárico, compostos fenólicos, relação sódio/potássio elevada, teor de prolina, metanol e de poliálcoois, proporcionais aos encontrados no vinho, além de acetoína12.

Os vinagres produzidos com a utilização de frutos são mais nutritivos porque contêm em sua composição vitaminas, ácidos orgânicos, proteínas e aminoácidos originalmente presentes nas frutas.

Também são mais agradáveis ao paladar por serem menos ácidos e conterem mais substâncias orgânicas13. Quando o vinagre é produzido a partir do vinho de um fruto ele se torna de melhor qualidade, mais apreciável e nutritivo do que comparado aquele produzido a partir do etanol, pois de certa forma ele possui as mesmas características do fruto14.

O vinagre de maçã, também conhecido como vinagre de sidra, é obtido através da fermentação do suco da maçã inteira, obtendo uma coloração amarelo-dourada devido aos taninos e, contem os mesmos compostos químicos presentes na maçã, como aminoácidos essenciais, vitaminas e minerais, sendo considerado até mesmo um remédio, prometendo prolongar a vida e a juventude, desde que ingerido diariamente14. Ele é composto principalmente por ácido maléico, e contém, entre outros compostos químicos, pectina e betacaroteno, capazes de atacar os radicais livres que interferem na imunidade do corpo humano. O ácido maléico é um importante elemento que apresenta propriedades terapêuticas15-17.

Considerando-se carência de publicações a respeito da utilização de ácido maléico no combate a lesões de estomatite protética, o objetivo desse trabalho foi, partindo-se de uma solução comercial de vinagre de maçã, com concentração de ácido maléico de 4%, avaliá-lo, in vitro, como solução química fungicida e fungistática, através da determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM), proporcionando a elucidação de bases que possibilitem a indicação do vinagre de maçã como alternativa terapêutica para o tratamento de estomatite protética por Candida spp.

Os ensaios microbiológicos foram realizados no Laboratório de Micologia, do Departamento de Ciências Farmacêuticas, do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba. Foram utilizadas oito cepas de Candida spp. disponibilizadas pelo Laboratório de Micologia: C. tropicalis ATCC 13803, C. tropicalis, 33,

C.tropicalis, LM 708, C albicans LM 21, C. albicans MI 03, C. albicans LM 615, C. albicans 13, C. albicans ATCC

76485.

Realizou-se a subcultura dos organismos em tubos contendo ágar Sabourand Dextrose (ASD - DIFCO®), executando duas passagens para assegurar pureza e viabilidade. As colônias foram suspensas em 5 mL de solução salina estéril 0,145 mol/L e a suspensão resultante foi colocada em agitador Vortéx durante 15 segundos. A densidade celular foi ajustada com espectrofotômetro, acrescentando-se solução salina suficiente para obter a transmitância equivalente de uma solução padrão à escala 0,5 de McFarland em comprimento de onda de 530 nm. Esse procedimento forneceu uma suspensão padrão de levedura contendo 106 unidades formadoras de colônia (UFC) por mL17-19.

INTRODUÇÃO

Utilizou-se vinagre de maçã MINHOTO®, Lote L321B, fabricado e distribuído pelas Indústrias Reunidas Raymundo da Fonte S.A, Paulista, Pernambuco, Brasil, que possui em sua composição concentração de ácido maléico de 4%.

A determinação da CIM do ácido maléico foi realizada através da técnica da microdiluição20. Inicialmente, foram distribuídos 100µL de caldo Sabourand dextrose duplamente concentrado nos orifícios das placas de microdiluição contendo 96 poços (INLAB, Lote 4.193). Em seguida foram distribuídos 100 µL do ácido maléico, a uma concentração inicial de 40.000 µg/mL, que foi diluída seriadamente, a partir da retirada de uma alíquota de 100 µL da cavidade mais concentrada para a cavidade sucessora. Nos orifícios de cada coluna foram dispensadas alíquotas de 10 µL do inóculo correspondente a cada cepa ensaiada.

Paralelamente, foi realizado controle da viabilidade dos microorganismos utilizando-se nistatina, antifúngico padrão.

Os ensaios foram realizados em duplicata incubados a 35ºC durante 24-48 horas. A leitura para determinação da CIM do ácido maléico sobre as cepas de leveduras foi feita a partir do método visual. Levou-se em consideração a formação ou não de aglomerados de células (“botão”) no fundo da cavidade da placa. Dessa forma, considerou-se como CIM, a menor concentração do produto em teste capaz de produzir inibição visível sobre o crescimento das cepas de leveduras utilizadas nos ensaios microbiológicos21.

Para confirmação da presença de microrganismos viáveis nas concentrações não inibitórias utilizou-se o corante TCT (2,3,5, cloreto de trifenil tetrazólio) no volume de 10µL, que reflete a atividade das enzimas desidrogenazes, envolvidas no processo de respiração celular, tornando possível a distinção das amostras vivas, coradas em vermelho, daquelas mortas, que mantêm a cor21,22.

Após determinação da CIM, foi determinada a CFM. Concentrações correspondentes à CIM, CIM x 2 e CIM x 4, bem como os controles positivos, foram transferidas para placas de microdiluição contendo 100 µL de caldo Sabourand dextrose. O ensaio foi incubado a 35º C por 24/48 horas. A CFM foi determinada pelo método visual. Levou-se em consideração a formação ou não de aglomerados de células (“botão”) no fundo da cavidade da placa. Dessa forma, considerou-se como CFM, a menor concentração do produto em teste capaz de produzir inibição visível sobre o crescimento das cepas de leveduras utilizadas nos ensaios microbiológicos. Os dados foram analisados de forma descritiva.

Observou-se que 100% das cepas testadas foram inibidas utilizando-se concentração de 2500µg/mL,

considerada a CIM para o ácido maléico (Quadro 1).

Quadro 1. CIM do ácido maléico e nistatina frente a cepas de Candida ensaiadas pela microdiluição.

Cepas Ácido maléico

CIM (µg/mL) Nistatina CIM (µg/mL) C. tropicalis ATCC 13803 2500 3,125 C. tropicalis 33 2500 3,125 C. tropicalis LM 708 2500 3,125 C. albicans LM 21 2500 3,125 C. albicans MI03 2500 3,125 C. albicans LM 615 2500 3,125 C. albicans 13 2500 3,125 C. albicans ATCC 76485 2500 3,125

Dentre as cepas teste, cinco (63.5%), C.

tropicallis LM 708, C. albicans LM 21, C. albicans MI 03, C. albicans 13 e C. albicans ATCC 76485, não apresentaram

crescimento microbiano durante a obtenção da CFM, determinada como sendo de 2500 µg/mL, concentração equivalente a encontrada durante a determinação da CIM. Duas cepas (25%), C. albicans LM 615 e C. tropicalis

33 apresentaram CFM da ordem de 5000 µg/mL. Uma cepa (11,5%), C. tropicalis ATCC 13803, apresentou CFM

de 10000 µg/mL e, foi classificada como a mais resistente à ação fungicida do ácido maléico (Quadro 2).

Com relação à nistatina 100% das cepas foram inibidas utilizando-se concentração de 3,125µg/mL, valor este utilizado como controle na realização dos testes para determinação da CIM e CFM do ácido maléico (Quadro 1).

Durante a realização dos testes para determinação da CFM da nistatina, três cepas (37,5%), C.

tropicalis 33, C. tropicalis LM 708 e C. albicans 13

apresentaram CFM de 3,125µg/mL. Duas cepas (25%), C

.albicans LM 21e C. albicans ATCC 76485 apresentaram

CFM de 6,25µg/mL. Três cepas (37,5%), C. tropicalis ATCC 13803, C. albicans MI 03, e C. albicans LM 615 apresentaram CFM de 12,5µg/mL, sendo classificadas como as três cepas mais resistentes à ação fungicida do ácido maléico (Quadro 2).

Quadro 2. CFM do ácido maléico e nistatina frente a cepas de Candida ensaiadas pela microdiluição

Cepas Ácido maléico

CFM (µg/mL) Nistatina CFM(µg/mL) C. tropicalis ATCC 13803 10000 12,5 C. tropicalis 33 5000 3,125 C. tropicalis LM 708 2500 3,125 C. albicans LM 21 2500 6,25 C. albicans MI03 2500 12,5 C. albicans LM 615 5000 12,5 C. albicans 13 2500 3,125 C. albicans ATCC 76485 2500 6,25

A atividade antibacteriana comprovada do vinagre de maçã23-26 nos motivou a investigar o potencial

RESULTADOS

DISCUSSÃO

359

Pesq Bras Odontoped Clin Integr, João Pessoa, 12(3):357-61, jul./set., 2012

antifúngico do mesmo através da determinação da CIM e CFM em relação ao gênero Candida.

Em se tratando do gênero Candida, a diferença entre a atividade antifúngica (CFM) e fungistática (CIM) é espécie dependente27, sendo a atividade fungicida clinicamente mais importante do que a fungistática, principalmente em pacientes HIV positivos, uma vez que, o uso profilático de drogas fungistáticas é associado ao aumento da frequência de iniciação do processo de resistência à doença pelo isolado clínico28.

O teste de microdiluição preconizado por Eloff (1998) é um método barato que proporciona reprodutibilidade de resultados, requer uma concentração pequena dos microrganismos, pode ser utilizado com um número grande de amostras, não exige elevada habilidade intelectual e requer pouco tempo para obtenção de resultados, sendo a metodologia aqui adotada para determinação da CIM e CFM do vinagre de maçã e da nistatina20.

Muito embora o objetivo do tratamento antimicótico seja reduzir o crescimento dos microrganismos a níveis que possam ser controlados pelas defesas naturais do organismo1, o controle das lesões de estomatite protética é dificultado pelo fato de que as infecções fungicas são geralmente crônicas e requerem tratamentos repetidos ou contínuos. Tais tratamentos exigem a utilização de antifúngicos tópicos ou sistêmicos e a incorporação de bochechos antissépticos à rotina de higienização do paciente1,2,5.

Dentre os pacientes que têm acesso à utilização de agentes antifúngicos, seu uso tornou-se indiscriminado, fazendo com que as colônias de fungos se tornassem cada vez mais resistentes às drogas comercialmente disponíveis e de difícil tratamento, o que leva à necessidade do desenvolvimento de novas substâncias que possam ser utilizadas com esta finalidade23.

O vinagre de maçã vem sendo estudado em outras áreas da odontologia como agente sanitizante24-26, mas não havia registros literários da determinação da CIM e CFM com finalidade de teste desta substância como agente antifúngico. Assim, informações a respeito da atividade antifúngica desse produto fornecerão indicativos para avaliação do mesmo sobre os demais componentes da microbiota oral e sobre materiais constituintes de próteses dentárias.

Testado como agente antibacteriano na sanificação da alface, o vinagre de maçã foi comparado aos vinagres de álcool, de vinho tinto, de vinho branco e ao hipoclorito de sódio, apresentando, dentre os vinagres, os melhores resultados no combate à coliformes fecais e ao vibrião do cólera e atuação similar à do hipoclorito de sódio24,25.

Pesquisas que apontam a utilização do vinagre de maçã como auxiliar químico na desinfecção de canais radiculares encontraram resultados positivos, apresentando o vinagre de maçã princípios de ação e eficácia semelhantes ao EDTA26.

Os resultados por nós obtidos apontam o vinagre de maçã como solução fungicida quando utilizado à concentração de 2500 µg/mL, correspondente a 0,25%, partindo-se de uma solução com concentração inicial de 4% de ácido maléico, e fungistática na concentração de 10000 µg/mL, correspondente a 2% de ácido maléico.

Devido à facilidade de obtenção do produto, ao seu baixo custo e facilidade de diluição, os resultados encontrados são promissores em relação à utilização desta substância no combate a infecções por estomatite protética e estão de acordo com aqueles encontrados quando o ácido maléico foi testado como solução bactericida24-26.

Considerando-se a concentração de ácido maléico (4%) usualmente utilizada nos vinagres comercializados no Brasil (12-14), propomos a utilização de solução ácido maléico à 2% como fungicida e solução à 0,25% como fungistática.

Com relação à nistatina, 100% das cepas testadas apresentaram CIM de 3,125 µg/mL, resultados condizentes com a literatura que aponta como CIM para nistatina valores entre 4-8 µg/mL29,30.

Muito embora tenhamos obtido bons resultados na obtenção da CIM e CFM do vinagre de maçã esses são ainda insuficientes para afirmar a aplicabilidade da do mesmo como agente antifúngico. Para tanto, faz-se necessário a realização de testes complementares que avaliem a ação do ácido maléico sobre os componentes constituintes das próteses removíveis, assim como de ensaios que simulem a cinética microbiana dos fungos em contato com a substância em teste. Potencial de inibição de aderência à resina acrílica componente da base das próteses removíveis, também merece ser investigado.

A diversidade de variáveis impostas pelo meio bucal torna imperativa a realização de ensaios clínicos a respeito da utilização do ácido maléico no tratamento de infecções fungicas, antes de afirmarmos a viabilidade de utilização do mesmo como solução fungicida e/ou fungistática. Os resultados aqui apresentados representam o primeiro passo na elucidação das possibilidades de aplicação do ácido maléico como agente antifúngico auxiliar na terapêutica de infecções micóticas que acometem a cavidade bucal.

Diante dos dados expostos, conclui-se que o vinagre de maçã apresenta propriedades fungistática e fungicida contra cepas de Candida spp. Existe a necessidade da realização de outros ensaios laboratoriais que venham elucidar o comportamento químico da substância com relação ao tempo e forma de utilização. Testes referentes a possíveis alterações que o vinagre de maçã possa causar na superfície das próteses removíveis

são imperativos, uma vez que o contato com essas superfícies pode causar danos ao material e trauma à mucosa de suporte.

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REFERÊNCIAS

Ana Carolina Loureiro Gama Mota Av. Sapé, 701 - Apt. 1303 - Bairro Manaíra João Pessoa - Paraíba - Brasil

CEP: 38.038-381 Tel.: (83) 9104.2465

E-mail: anacarolinaloureiro@hotmail.com.

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