UNIVERSIDADE FERDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
RENAN DA SILVA SANTOS
DESENVOLVIMENTO DE LINHAGENS GENETICAMENTE MODIFICADAS POR CRISPR/CAS9 NA IDENTIFICAÇÃO DE MOLÉCULAS ALVOS PARA GENES c-Myc,
Trp53 e H19
FORTALEZA
DESENVOLVIMENTO DE LINHAGENS GENETICAMENTE MODIFICADAS POR CRISPR/CAS9 NA IDENTIFICAÇÃO DE MOLÉCULAS ALVOS PARA GENES c-Myc,
Trp53 e H19
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial a obtenção do título de Mestre em Farmacologia. Área de conhecimento: Ciências Biológicas II
Orientadora: Prof. Dra. Cláudia do Ó Pessoa.
DESENVOLVIMENTO DE LINHAGENS GENETICAMENTE MODIFICADAS POR CRISPR/CAS9 NA IDENTIFICAÇÃO DE MOLÉCULAS ALVOS PARA GENES c-Myc,
Trp53 e H19
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial a obtenção do título de Mestre em Farmacologia. Área de conhecimento: Ciências Biológicas II
Aprovada em: ___/___/______.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Prof. Dra. Cláudia do Ó Pessoa (Orientador)
Universidade Federal do Ceará (UFC) _______________________________________
Dra. Cristiana Libardi Miranda Furtado Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Prof. Dr. Kaio César Simiano Tavares
Agradeço a minha orientadora, Professora Cláudia Pessoa, pela incrível experiência. Serei sempre muito grato à oportunidade de crescimento profissional e pessoal dada pela senhora. Muito obrigado.
À minha excelentíssima coorientadora, que me fez entender que a pesquisa básica é tão importante como qualquer outra parte da ciência. Me fez enxergar que a genética é brilhante e que a apigenética pode ser o caminho para um caminho de muito futuro. Te admiro profundamente como pesquisadora, professora e, principalmente, pessoa.
Ao professor Kaio Tavares, por ser um dos maiores exemplos que já conheci do que é ser docente. Por coordenar um grupo grande, tão jovem e tão promissor. Por confiar em mim e me ensinar biologia molecular. Todos os ensinamentos estarão sempre guardados.
Aos meus queridos amigos que fiz durante o mestrado. Muito obrigado pela força e parceria ao longo desses dois anos. Especialmente a Erlânia e Jéssica, amigas de seleção, as almas mais bondosas que conheci até hoje.
Aos meus amigos do Loe, que sempre torceram por mim e desde a iniciação científica me ensinaram muito. Tenho muita admiração por cada um de vocês, sem citar nomes, mas cada um sabe o quanto representa para mim.
Ao meu guru espiritual, Gabriel, pelo supor e ajuda sempre que precisei! Te adoro, você sabe.
Aos meus amados amigos do LBMD, todos, muito obrigado. Os dias com vocês sempre foram leves. ICs e Pós, todos são geniais! Especialmente a jovem Louhanna, que muito me ajudou e incentivou, amiga, muito obrigado! E à melhor técnica de laboratório do mundo, Joyce. Adoro vocês duas, vocês sabem!
O câncer é uma doença de aspectos genéticos e epigenéticos heterogêneos. Sabendo da demanda por tratamentos mais específicos aos subtipos moleculares, diferentes ferramentas para identificação de alvos de agentes anticancer são requeridos. A descoberta de tecnologias de edição de genoma alavancaram diferentes linhas de pesquisas, mais recentemente o sistema CRISPR/Cas9 tem facilitado ainda mais a manipulação genética. A utilização da plataforma CRISPR/Cas9 para a geração de modelos in vitro que facilitem a identificação de moléculas e seus respectivos alvos pode representar um importante passo no tratamento do câncer. Neste trabalho, objetivou-se desenvolver linhagens celulares murinas geneticamente modificadas. As edições compreendem: mutação pontual T58A no gene c-Myc; nocaute de Trp53 e H19. Os genes foram avaliados através do banco de dados do Genbank e as sequências mais apropriadas foram utilizadas para os desenhos do guias de RNA pela plataforma CRISPR design. Utilizou-se o vetor px458 que a presenta em sua constituição os componentes para a maquinaria do CRISPR/Cas9, sendo este digerido inicialmente pela enzima BbsI. Com a ligação dos gRNAs em seus respectivos vetores (px458-c-Myc, px458-Trp53, px458Up-H19, px458Down-H19), os mesmo foram transformados e clonados em bactérias competentes TOP10 (E. coli). Após a clonagem, os vetores foram transfectados nas linhagens não tumorais murinas C2C12 e o DNA genômico foi extraído. A região de edição foi amplificada para finalmente ter sua validação confirmada pelo ensaio enzimático de reconhecimento de erros de pareamento pela enzima endonuclease T7. O resultado dos padrões de bandas observados em gel de agarose frutos da digestão com T7 validaram a capacidade de edição dos quatro vetores desenvolvidos. Por motivos de melhores resultados, a linhagem com deleção de H19 foi selecionada para dar continuidade ao trabalho. Células C2C12 foram novamente transfectadas com os vetores px458Up-H19 e px458Down-H19, onde de 76 colônias com crescimento monogênico, apenas uma apresentou deleção confirmada por sequenciamento. A amplificação da região bem como o sequenciamento do produto apontam para uma edição monoalélica.
IDENTIFICATION OF TARGET MOLECULES FOR GENES C-MYC, TRP53 AND H19
Cancer is a disease of heterogeneous genetic and epigenetic aspects. Knowing the demand for more specific treatments to the molecular subtypes, different tools for identifying targets of anticancer agents are required. The discovery of genome-editing technologies has leveraged different lines of research, most recently the CRISPR/Cas9 system has further facilitated genetic manipulation. The use of the CRISPR/Cas9 platform for the generation of in vitro models that could facilitate the identification of molecules and their respective targets can represent an important step in the treatment of cancer. In this work, we aimed to develop genetically modified murine cell lines. The editions comprise: T58A point mutation in the c-Myc gene; Trp53 knockout; deletion of the H19 promoter. Genes were evaluated through the Genbank database and the most appropriate sequences were used for RNA guide designs by the CRISPR design platform. We used the vector px458 that presents in its constitution the components for the machinery of CRISPR / Cas9, which was digested initially by the enzyme BbsI. Upon binding of the gRNAs in their respective vectors (px458-c-Myc, px458-Trp53, px458Up-H19, px458Down-H19), they were transformed and cloned into TOP10 competent bacteria (E. coli). After cloning, vectors were transfected into murine C2C12 non-tumor lines and plasmid DNA was extracted. The editing region was amplified to finally have its validation confirmed by the enzymatic matching recognition assay of the T7 endonuclease enzyme. The results of the bands patterns observed in agarose gel obtained of the T7 digestion validate the editing ability of the four vectors developed. For reasons of results, the H19 deletion lineage was selected to continue the work. Of 76 colonies newly transfected with wings px458Up-H19, px458Down-H19, a deletion confirmed by sequencing.
Figura 1. Principais alterações de uma célula tumoral...16
Figura 2. Vias de reparo de quebra de dupla fita de DNA...24
Figura 3. Deleção através da quebra de dupla fita de DNA...25
Figura 4. Representação dos componentes e do funcionamento do sistema CRISPR/Cas9 sobre o DNA alvo...27
Figura 5. Delineamento experimental do trabalho para construção e validação dos vetores...32
Figura 6. Mapa do vetor px458...35
Figura 7. Posição de gRNAs e iniciadores nos genes de estudo...44
Figura 8. Gel da reação de digestão do vetor px458...46
Figura 9. Géis de eletroforese dos PCRs de colônia...47
Figura 10. Géis de eletroforese de extração de DNA plasmidial de colônias positivas pelo PCR de colônia...48
Figura 11. Transfecção dos vetores px458-c-Myc; px458-Trp53; px458-H19 em mioblastos murinos C2C12...49
Figura 12. Reação de PCR para amplificação de regiões de edição...50
Figura 13. Géis de eletroforese do tratamento com Endonuclease T7...51
Figura 14. Transfecção simultânea com vetores px458-H19 upstream e downstream e PCR de colônias isoladas...52
Figura 15. Esquema representativo da região de deleção no promotor sequenciado de H19...53
Tabela 1. gRNAs desenhados para cada gene...36
Tabela 2. Lista de iniciadores para PCR de colônia...37
Tabela 3. Iniciadores para amplificação da região-alvo...39
ABC – ATP-binding cassette
ATCC – Coleção de Cultura Celular Americana BCRJ – Banco de Células do Rio de Janeiro Cas9 – Proteína nove associada ao CRISPR CNV – Variação do Número de Cópia
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats) – Repetições Palindrômicas Pequenas Regularmente Espaçadas e Agrupadas
crRNAs (Crispr-derived RNA) – CRISPR RNAs
c-Myc – Oncogene mielocitomatose
DMEM – Meio de Eagle modificado de Dulbecco EMC – Quebra Enzimática de Erros de Pareamento gRNA – Guia de RNA
H19 – Transcrito Maternalmente Expresso HbA – Hemoglobina Adulta
HDR – Reparo Dirigido por Homologia IGF2 – Fator de Crescimento Tipo Insulina 2 INCA – Instituto Nacional do Câncer
Indels – Inserções e/ou Deleções LB – Meio Luriana-Bertani
LBur – Linfoma de Burkitt
NHE – Elementos Hipersensíveis a Nuclease OMS – Organização Mundial da Saúde
PAM – Motivo Adjacente ao Protoespaçador PBS – Solução de Tampão Fosfato
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase Rb – Retinoblastoma
RPMI – Roswell Parrk Memorial Instituto Meio SBF – Soro Bovino Fetal
SNPs – Polimorfismo de Nucleotídeo Único tracrRNA – crRNA transativador
1.Introdução. ... 15
1.1 Câncer. ... 15
1.2 Modelos in vitro. ... 17
1.3 Vias tumorigênicas. ... 18
1.3.1 MYC proto-oncogene, C-MYC. ... 19
1.3.2 Fator de transcrição p53, TP53. ... 20
1.3.3. Transcrito de expressão materna, H19. ... 21
1.4 Edição gênica. ... 22
1.4.1 Mecanismos de edição. ... 22
1.4.2 Repetições Palindrômicas Pequenas Regularmente Espaçadas e Agrupadas - CRISPR ... 25
1.4.2.1. Erros de edição – Off-targets ... 28
1.4.2.2 Validação da edição ... 28
2. Justificafica e relevância. ... 30
3. Objetivos. ... 31
3.1 Objetivo geral ... 31
3.2 Objetivos específicos ... 31
4. Materiais e métodos ... 32
4.1 Delineamento experimental. ... 32
4.2 Desenho in silico de gRNAs para os genes c-Myc, Trp53 e H19. ... 33
4.3 Montagem Molecular do Sistema CRISPR/Cas9. ... 34
4.3.1 Digestão do vetor px458. ... 34
4.3.2 Reação de anelamento dos gRNAs. ... 35
4.3.3 Reação de ligação dos gRNAs anelados ao plasmídeo px458. ... 36
4.4 Transformação química em bactérias com o sistema CRISPR/Cas9 ... 36
4.5 PCR de colônias ... 36
4.6 Preparação de inóculo e crescimento de clones positivos ... 37
4.7 Extração de DNA plasmidial ... 37
4.10 PCR para amplificação da região-alvo ... 39
4.11 Ensaio da Endonuclease T7 ... 40
4.12 Isolamento de células para formação de colônias com deleção da região promotora de H19. ... 40
4.13 Identificação de colônias com deleção da região promotora de H19. ... 41
4.14 Sequenciamento de DNA de colônias de H19. ... 42
4.15 Linhagem celular. ... 42
5. Resultados. ... 43
5.1 Desenho in silico de gRNAs para os genes c-Myc, Trp53 e H19. ... 43
5.2 Digestão do vetor px458 ... 45
5.3 PCR de colônia ... 46
5.4 Extração de DNA plasmidial ... 47
5.5 Transfecção em células muninas C2C12... 48
5.6 Amplificação da região de edição ... 49
5.7 Ensaio da Endonuclease T7 ... 50
5.8 Isolamento de colônias transfectadas com os vetores px458-H19 upstream e downstream. ... 51
5.9 Sequenciamento de DNA de colônia de H19. ... 53
6. Discussão ... 54
7. Conclusão ... 65
1.Introdução.
1.1 Câncer.
O câncer é uma doença complexa, heterogênea, multifatorial e uma das principais causas de morte em todo o mundo (LOUZADA et al., 2012). A existência de vários tipos de tumores com características histopatológicas diferentes, a ampla variedade de alterações genéticas e epigenéticas envolvidas, bem como as diferentes respostas clínicas, dificultam a compreensão dos mecanismos envolvidos no processo de carcinogênese e a identificação da melhor forma de tratamento (VARGO-GOGOLA & ROSEN, 2007).
Câncer é responsável por mais de 12% de todas as causas de óbito no mundo, onde mais de 7 milhões de pessoas morrem anualmente da doença (INCA, 2018). De acordo com a estimativas da Organização Mundial da Saúde (OMS, 2014) desde 2012, o câncer já causa mais mortes do que todas as doenças cardíacas coronárias ou acidentes vasculares cerebrais por ano. As transições demográficas e epidemiológicas globais vividas atualmente sinalizam para uma crescente do número de cânceres nas próximas décadas. Estimativas apontam um número de mais de 20 milhões de novos casos da doença já em 2025 (FERLAY et al., 2015).
A explicação para este crescimento está na maior exposição dos indivíduos à fatores de risco cancerígenos. A estrapolação de hábitos tidos como nocivos à outras culturas, modificações nos costumes alimentares e consumo desencadeada pelo processo global de industrialização, por exemplo, têm acarretado reflexos importantes no perfil epidemiológico das populações (INCA, 2006). As alterações demográficas, com redução das taxas de mortalidade e natalidade, indicam o prolongamento da expectativa de vida e o envelhecimento populacional, o que também colabora para o aumento da incidência de doenças crônico-degenerativas, especialmente as cardiovasculares e o câncer (FERLAY et al., 2015).
sistema imunitário, proliferação ilimitada, invasão tecidual e metástase, angiogênese, instabilidade genética e mutações, resistência a morte celular, reprogramação do metabolismo e manutenção da sinalização proliferativa (HANAHAN & WEINBERG, 2011) (figura 1). Mais recentemente, as alterações epigenéticas também têm sido implicadas no desenvolvimento do câncer, e podem representar o evento chave que inicia e propaga o processo de carcinogênese (FEINBERG et al., 2006).
Figura 1. Principais alterações de uma célula tumoral.
A imagem ilustra importantes características de células tumorais. Fonte: adaptado de HANAHAN & WEINBERG, 2011.
transdutores de sinais relacionados com o crescimento e proliferação. As oncoproteinas apresentam função similar às proteínas codificadas pelos proto-oncogenes. Entretanto, por estarem expressas praticamente de modo constitutivo, promovem um aumento na taxa de duplicação celular (KUMAR et al., 2012). Outro grupo de genes que caracterizam o microambiente do tumor são os supressores tumorais. Tal família de genes promove uma diminuição de sensibilidade aos sinais inibidores do crescimento. Logo, a ausência dessas proteínas caracteriza uma das alterações fundamentais no processo da carcinogênese (RANG et al., 2012).
Os avanços no estudo da patologia do câncer têm sua origem na disponibilidade de diferentes tipos de sistemas de modelos experimentais que analisam as várias formas desta doença, permitindo o conhecimento de alterações genéticas, epigenéticas relacionadas, bem como a identificação das melhores drogas antitumorais (VARGO-GOGOLA & ROSEN, 2007). Na oncologia, a utilização de amostras de exames de biópsias, linhagens celulares tumorais imortalizadas, modelos xenográficos e modelos geneticamente modificados possibilitam importantes avanços no estudo de patologia do câncer (BURDALL et al., 2003; VAN STAVEREN et al., 2009). Portanto, a disponibilidade de diferentes modelos experimentais permite avaliar várias formas desta doença, possibilitando o conhecimento dos mecanismos envolvidos no processo de carcinogênese, as alterações genéticas e epigenéticas em células tumorais e a identificação de novas moléculas com atividade antitumoral (VARGO-GOGOLA & ROSEN, 2007).
1.2 Modelos in vitro.
Não somente com linhagens celulares tradicionais, modelos in vitro geneticamente modificados têm sido construídos para melhorar aqueles já utilizados e facilitar o trabalho frente a alvos específicos. Um exemplo desse desenvolvimento é o trabalho de Karlgren e colaboradores (2016), que produziu uma linhagem nocaute para a proteína Mdr1, parte da super família de transportadores ABC (Cassete ligado a ATP), grupo de proteínas envolvidas no transporte e excreção de substância. Para tal, utilizou-se a linhagem derivada de rim de cão (MDCK) comumente utilizada em estudos de transportes de drogas. O estabelecimento da nova linhagem funciona como um novo modelo celular de estudo para transporte de drogas. Sabendo dessa tendência, companhias de desenvolvimento e comercialização de produtos biológicos, como ATCC (Coleção de Cultura Celular Americana), têm utilizado de mecanismos de edição gênica para gerar novos modelos celulares para serem comercializados.
A avaliação do potencial terapêutico de compostos em modelos experimentais geneticamente modificados é de extrema importância no processo de desenvolvimento de novas drogas e identificação do mecanismo de ação para terapia alvo-dirigida. Investir em modelos celulares que facilitem a triagem de novas moléculas para estudos farmacológicos dependente de via, isto é, a análise do potencial de uma substância em larga escala frente a alvos específicos é uma tendência no trabalho com descoberta novos compostos. Ainda, o uso de linhagens celulares quando comparados ao uso de animais não enfrenta problemas éticos, além dos custos de manutenção de um biotério e a demora na aquisição dos resultados (CASTANOTTO & ROSSI, 2009; HUGHES et al., 2011).
1.3 Vias tumorigênicas.
perda de função) ou a ausência total da proteína ou transcrito primário (OLIVIER et al, 2008).
1.3.1 MYC proto-oncogene, C-MYC.
O proto-oncogene C-MYC, em humanos está localizado na posição 8q24.21 e 15 D1 8 em camundongos, apresentando três e quatro isoformas, humana e murina, respectivamente. Neste trabalho serão seguidas as regras de nomenclatura do Comitê Internacional de Nomenclatura Genética (revisada em 2015), na qual genes devem ser escritos sempre na configuração itálica, sendo humano em maiúsculo e murino somente a primeira letra em maiúsculo.
As isoformas se referem a diferentes versões de proteínas do mesmo gene, originadas de diferentes versões do transcrito de mRNA advindos de reestruturações da transcrição de seus éxons. Como um regulador de transcrição vital, o C-MYC desempenha um papel essencial na regulação de muitos processos fisiológicos, incluindo controle do ciclo celular, apoptose, síntese proteica e adesão celular (DANG, 2012). A super expressão do mesmo é gerada, principalmente, devido às alterações diretas no próprio gene, que se associa à tumorigênese e facilita a progressão tumoral (CHEN et al., 2005).
Um dos ligantes reconhecidos como essencial para a maioria das atividades biológicas de C-MYC é a proteína MAX (fator X associado a C-MYC). Por sua vez, esta quando se dimerizada com C-MYC funciona como ativadora transcripcional (CARROLL et al., 2015). Praticamente todo fator de transcrição codificado pelo gene está complexado com a proteína MAX que, ao contrário da C-MYC, é constitutivamente expressa (HARDIE & ALESSI, 2013). Como mencionado, tal gene está envolvido em diversos mecanismos celulares, onde acredita-se que apresente uma quantidade próxima de mil alvos, incluindo, por exemplo, genes responsáveis pela biogênese de ribossomos, mitocôndrias, metabolismo de carboidratos e outros (PONZIELLI et al., 2005).
regiões codificantes de C-MYC. As investigações se concentram principalmente na mutação T58A (treonina/alanina). Isso se dá porque a estabilização de MYC depende de um resíduo de dois aminoácidos, Ser 62 e Thr 58. No caso, essa estabilização da estrutura da proteína MYC depende de uma sinalização via RAS que tem por objetivo fosforilar o resíduo Ser 62 e a uma fosforilação secundária em Thr 58. Esse último quando fosforilado funciona como uma marcação para reação de ubiquitinação, isto é, degradação da proteína via vesícula lisossomal (AMATI et al., 1992). Sendo assim, a mutação T58A dificulta a degradação natural da molécula, levando, consequentemente, a um aumento no tempo de meia vida do fator.
Sabe-se hoje que os transcritos de c-Myc são regulados por múltiplos promotores, sendo os promotores P1 e P2 os mais importantes. Além da modulação governada por eles, existem sequencias de poucos nucleotídeos em geral ricos em guanina conhecidas como regiões de Elementos Hipersensíveis a Nuclease (NHE, do ingês Nuclease Hypersensitive Element). Esses elementos geram um desdobramento da cromatina estimulando seus promotores (TRAVERS & MUSKHELISHVILI, 2007). A NHE III é a principal dessas regiões, localizado a 142 pares de base do promotor P1, e é a responsável por controlar 80% das transcrições de c-Myc (ISLAM et al, 2014). Sabendo dessa regulação, muitas moléculas que diminuem o efeito modulador de NHE sobre os promotores têm mostrado efeito satisfatório in vitro e in vivo, como derivados de perileno (PIPER), porfirinas catiônicas (TMPyP4), quindolinas (SYUIQ-05), quarfloxina (fluoroquinolona já em estudo clínico de fase II) (DAVIS et al., 2008; LU et al., 2011) entre outros. Assim, a inibição de c-Myc promete ser uma possível estratégia terapêutica para tumores de diversas origens.
1.3.2 Fator de transcrição p53, TP53.
normais perdem as habilidades para controlar seu crescimento e morte, levando a um descontrole de funções fisiológicas (LEROY et al., 2014).
Estima-se que mais 50% dos tipos de cânceres apresentem alguma mutação no gene TP53 (RIVLIN, 2011). Pode-se dizer que alterações de inserções e deleções (indels) de nucleotídeos e as mutações de polimorfismo de nucleotídeos único (SNPs) não sinônimos, ou seja, que alteram a sequência de aminoácidos, representam a maior parte dessas mutações (LEROY, 2014). A frequência de mutações desse gene nos tipos de tumores abrange uma faixa muito ampla e varia dependendo do tipo de tumor, onde, por exemplo, apresenta uma frequência de alteração menor que 5% em carcinoma cervical e maior que 90% em câncer de ovário (AHMED et al., 2013). Embora mais frequentes, os indels e SNPs não sinônimos não são as únicas formas de mutações nesse gene, deleções conhecidas como Variação do Número de Cópia (CNV, do inglês Copy Number Variation) são relatadas como a principal via de supressão da função de TP53 em osteossarcomas (BARRETINA et al., 2010).
Já se sabe que as modificações via indels no TP53 ocorrem naturalmente com mais facilidade nos éxons 4, 9 e 10 e são conhecidas pelo padrão de mutação que altera o quadro de leitura do transcrito durante a tradução na maquinaria ribossomomal (LEROY, 2014). Diferentemente, os SNPs não sinônimos, que são mais comuns que os próprios indels, se caracterizam por serem mutações pontuais, que levam a alteração de um único nucleotídeo. Logo, a alteração em um dos dois primeiros pares de base de um códon, provavelmente, levará a tradução de um diferente aminoácido (HAINOUT & HOLLSTEIN, 2000).
1.3.3. Transcrito de expressão materna, H19.
em que apenas um membro de um par alélico é expresso dependendo da sua origem parental (do ingês, genomic inprinting) (PAOLONI-GIACOBINO, 2006). H19 tem sua expressão associada ao gene IGF2 (do inglês, Insulin-Like Growth Factor 2), de modo que a mesma região controladora de imprinting (ICR) modula a expressão do H19 (expresso no alelo materno) e do IGF2 (expresso no alelo paterno). Nos seres humanos, as aberrações nos loci de imprinting estão associadas a vários transtornos do desenvolvimento e a muitos tipos de câncer em humanos (BEATTY et al., 2006).
Trata-se de um gene não codificante, e além do lncRNA, um dos transcritos principais desse gene é o micro RNA 675 (miR-675), altamente conservado que é transcrito pelo exón 1 do H19. Os RNAs não codificantes possuem importante papel na regulação da expressão de outros genes, e a expressão bialélica ou o silenciamento desse gene pode apresentar um perfil de oncogene ou supressor tumoral, respectivamente (MATOUK et al., 2007). Um exemplo é o caso do câncer gástrico, pois já se sabe que a super expressão de H19 está intrinsecamente relacionada ao aumento da proliferação e invasão celular nesse tumor e terapias alvo dirigidas que baixem a expressão de H19 já estão em teste (JIA et al., 2013).
Contudo, fisiologicamente a maior atividade de expressão de H19 é encontrada durante o desenvolvimento embrionário do indivíduo, modulando a atividade de outras vias como a do supressor tumoral retinoblastoma (Rb), estando assim bem mais associado a tumores congênitos (TSANG et al., 2010). Hoje em dia, encontra-se um crescente aumento no número de diagnósticos de tumores em neonatais e a vulnerabilidade desses indivíduos dificulta muito as terapias tradicionais e principalmente que envolvam excisão cirúrgica (ORBACH et al., 2013). Porém, os estudos que investigam moléculas ou terapias que impulsionem restabelecimento da expressão de H19 ainda são pouco discutidas (MATOUK et al., 2007).
1.4 Edição gênica.
1.4.1 Mecanismos de edição.
curar diversas doenças (HSU et al, 2014). Um grande achado nesse campo foi a descoberta de que a quebra de dupla fita (DSB, do inglês, Double Stranded Break) DNA, que acontece naturalmente em uma célula eucariótica, poderia ser utilizada como um mecanismo de modificação do DNA. Os dois tipos principais de reparo a uma DSB acontecem ou por uma via dirigida por homologia (HDR, do inglês, Homology Directed Repair), isto é, que depende de um molde, ou pela união de pontas soltas não dirigida por homologia (NHEJ, do inglês, Non-Homologous End Joining) (TAKATA et al., 1998).
A via NHEJ é ativa durante todos os estágios do ciclo celular, onde funciona como um reparo de DSB através do reestabelecimento da união entre as fitas quebradas. Essa via de reparo é propensa a indels aleatórios que podem ocorrer no local da quebra a ser restaurada. A restauração de uma quebra da fita de DNA se dá através do reconhecimento das extremidades livres da fita pelo dímero de proteínas Ku70 e Ku80, onde essas servem como ponto de ancoragem a proteínas como DNA polimerase e DNA ligase IV (ANDERS et al., 2015). Estímulos a essa via por DSB têm sido usados para causar nocautes em genes alvos em uma variedade de tipos celulares e diferentes organismos (CHAPMAN et al., 2015). Quando o dano ao DNA ocorre em uma região codificante os resultados dos indels podem acarretar em mutações de alteração de quadro de leitura durante a tradução, o que pode ocasionar proteína com conformação alterada, perda de função parcial ou até mesmo silenciamento, assim como a formação de mutação nonsense com um códon de parada prematuro (MORGAN et al., 2017).
interesse de uma maneira sítio específica (ZHANG et al., 2017). A figura abaixo (figura 2) exemplifica esquematicamente os reparos a DSB capaz de serem mimetizados com as ferramentas de edição gênica.
Figura 2. Vias de reparo de quebra de dupla fita de DNA.
A DSB está representada acima seguida das duas formas de reparo a lesão. À esquerda, observa-se a junção de pontas não dirigida por homologia (NHEJ), onde pequenas deleções e inserções podem gerar indels de tamanhos variáveis. À direita, tem-se a utilização de fita molde para o reestabelecimento da ruptura através de homologia (HDR), permitindo assim o reparo com precisão. Fonte: adaptado de Sander Joung (2014).
tratamento de hemoglobinopatias por deleção do acentuadores específico do gene BCL11A que está associado a inibição da expressão de Hemoglobina Adulta (HbA) (CANVER et al., 2015; SANKARAN et al., 2015).
Figura 3. Deleção através da quebra de dupla fita de DNA.
Deleção de sequencias de diferentes tamanhos são originadas pela quebra de dupla fita de DNA. Fonte: adaptado de Maeder e Gersbach, 2016.
1.4.2 Repetições Palindrômicas Pequenas Regularmente Espaçadas e Agrupadas - CRISPR
Na natureza, o complexo CRISPR/Cas é um sistema procariótico de defesa baseado na captura e inserção de pequenos fragmentos de DNA advindos de agentes invasores como vírus, plasmídeos e transposons. Esses fragmentos são incorporados ao próprio genoma da bactéria em uma região conhecida como locus CRISPR, tornando-a resistente a uma nova invasão (HORVATH & BARRANGOU, 2010). Um conjunto de genes localizados próximo a esse locus foi identificado e nomeado de genes Cas (CRISPR associated genes), dentre os genes mais conhecidos dessa região estão endonucleases (JANSEN et al., 2002).
essa localização precisa, um segundo transcrito de RNA é gerado, denominado crRNA transativador (tracrRNA), e se liga ao crRNA pareado a sequência do agente invasor. A união entre essas duas sequências é essencial para recrutar uma endonuclease ao complexo para gerar DSB (HSU et al., 2014; SCHIML et al., 2014).
Em 2012, demonstrou-se que os três componentes necessários para o sistema CRISPR funcionar são as endonucleases Cas, o crRNA maduro e o tracrRNA. Entretanto, Doudna, Charpentier e colaboradores (2012) mostraram através de experiências de clivagem de DNA in vitro que este sistema poderia ser reduzido a somente dois componentes por fusão do crRNA e tracrRNA em um único guia de RNA (gRNA) (JINEK et al., 2012). Além disso, eles mostraram que a modulação do complexo Cas/gRNA para novos sítios poderia ser realizada alterando a sequência de uma pequena porção do gRNA. Posteriormente, uma série de trabalhos demonstraram que o sistema CRISPR/Cas9, sendo a Cas9 a endonucleases obtida de Streptococcus pyogenes, poderia ser projetado para modificações genéticas eficientes em células de mamíferos (MALI et al, 2013). Juntos, esses estudos impulsionaram a tecnologia CRISPR/Cas9 no centro das atenções do campo de edição do genoma.
O mecanismo de funcionamento do complexo CRISPR/Cas9 depende necessariamente de uma região, ou seja, conjunto de poucos nucleotídeos, conhecida como Motivo Adjacente ao Protoespaçador (PAM) localizado imediatamente na porção 3' do sítio alvo. A sequência PAM é específica para cada endonuclease Cas advinda de cada bactéria. Por exemplo, a sequência PAM 5'-NGG-3 é necessária para que a Cas9 identifique uma região alvo e o gRNA se ligue a ela, promovendo a clivagem do DNA pela enzima (HSU et al., 2014).
necessidade de homologia dá-se o nome de sequência seed. O gRNA universal é conhecido assim pois funciona apenas como um elo entre o gRNA localizador do DNA alvo e a endonuclease Cas (PEREIRA, 2016) (figura 4).
Figura 4. Representação dos componentes e do funcionamento do sistema CRISPR/Cas9 sobre o DNA alvo.
Acima temos os três elementos necessários para o funcionamento da edição através do sistema CRISPR/Cas9, a enzima Cas9 e suas duas subunidades, gRNA e DNA alvo. A enzima Cas9 está representada ao fundo em laranja. Os domínios catalíticos HNH e RuvC dentro da subunidade NUC são os responsáveis pela ação catalítica gerando a DSB. O gRNA está representado em verde, onde a sequência universal está ancorada na subunidade REC da enzima. A sequência seed compreende os oito primeiros nucleotídeos antepostos ao PAM (amarela) na subunidade NUC. Fonte: adaptado de CHRISTOPHER et al., 2017.
alanina será construído utilizando da estratégia de reparo de quebra de dupla fita meado por homologia. Para tal, um óligo doador é desenhado e serve como molde para a reconstrução da sequência editada.
1.4.2.1. Erros de edição – Off-targets
A sequência PAM ótima reconhecida pela Cas9 derivada de S. pyogenes é a 5'-NGG-3', como já anteriormente mencionado. Embora raro, Cas9 pode exercer sua função de quebra de DNA em sítios com um PAM 5'-NAG-3' ou 5'-NGA-3 ', porém de forma menos eficiente (HSU et al., 2013). Fora isso, alguns desajustes de pareamento de nucleotídeos entre uma sequência de um gRNA e uma sequência qualquer de DNA também são tolerados pela enzima, ou seja, quanto mais específico o gRNA for a região de homologia interessada, menor serão os riscos de o gRNA localizar outra região que não seja a região alvo (off-targets). Erros de pareamento na sequência PAM-distal no terminal 5' são tolerados melhor do que aqueles na região seed (LIN et al., 2014).
1.4.2.2 Validação da edição
A fim de determinar se as mudanças no sítio alvo ocorreram como previstas in silico, o sequenciamento da região editada é uma boa opção de validão da edição, contudo, em larga escala torna-se economicamente secundária. Isso faz com que técnicas mais baratas e rápidas de triagem possam ser úteis para analisar o DNA. Após esses testes de triagens, as amostras podem então ser sequenciadas e gerar uma análise mais precisa e detalhada (PEREIRA, 2016). O ensaio enzimático de clivagem de bases não pareadas, EMC (do inglês, Enzymatic Mismatch Cleavage) é o mais utilizado para triagem de mutações (indels).
reconhecem essas inconsistências e clivam essas sequências (VOUILLOT et al., 2015). Finalmente, por eletroforese os perfis de bandas indicam o resultado ou não da edição.
2. Justificafica e relevância.
3. Objetivos. 3.1 Objetivo geral
Produzir e validar o sistema CRISPR/Cas9 para geração de quebra de dupla fita de DNA nos genes c-Myc, Trp53 e H19 em linhagem de mioblasto murino C2C12. 3.2 Objetivos específicos
Desenhar gRNAs específicos para geração de DSBs nos genes murinos C-myc, Trp53 e H19;
Ligar os gRNAs específicos ao vetor px458 (px458-c-Myc; px458-Trp53; px458
-H19 upstream e downstream);
Transformar em bactérias competentes os vetores de CRISPR/Cas9 produzidos;
Transfectar os vetores de CRISPR/Cas9 produzidos na linhagem de mioblasto murino C2C12;
Validar a atividade dos vetores CRISPR/Cas9 produzidas via ensaio de identificação de mismatches com endonuclease T7;
4. Materiais e Métodos
4.1 Delineamento experimental.
As etapas de edição gênica podem ser sintetizadas conforme o fluxograma abaixo (figura 5). O desenvolvimento do trabalho se deu conforma a sequência, que se inicia com o desenho in silico das estruturas dos guias de RNAs (gRNA), iniciadores e óligo doador, passando por etapas de construção e clonagem dos vetores para finalmente avaliar se estes são funcionais, isto é, capazes de gerar DSB. Caso sejam, os mesmos estarão aptos para a edição final nas células e construção de linhagens.
Figura 5. Delineamento experimental do trabalho para construção e validação dos vetores.
Doze passos são necessários para se construir e validar o desenvolvimento dos
Análise
in silico
Digestão do vetor
Anelamento/
ligação
Clonagem dos
vetores
PCR de colônia
Inóculo/ Extração
de DNA
plasmidial
Transfecção
Amplificação da
região alvo
modelos in vitro. Por se tratar de uma sequência linear de etapas, erros não percebidos durante o começo ou meio do trabalho podem gerar imprevistos nos resultados seguintes.
4.2 Desenho in silico de gRNAs para os genes c-Myc, Trp53 e H19.
Para a análise da estrutura dos genes em estudo, utilizou-se a plataforma de banco de dados de sequência de DNA Genbank do National Institutes of Health (NIH – departamento de Saúdes dos Estados Unidos) (NCBI, 2017).
Com o auxílio da plataforma CRISPR Design
(http:http://crispr.mit.edu/about), desenhou-se as sequências candidatas a gRNAs para cada gene. A plataforma CRISPR design é uma ferramenta que simplifica o processo de seleção do guia de RNA frente uma sequência de DNA desejada, ranqueando os guias encontrados de acordo com sua especificidade. Os guias com menor probabilidade de mais de uma região homóloga foram selecionados (tabela 1). Além dos gRNAs para as edições, o óligo doado para a realização da mutação T58A foi desenhado:
agccgcccgcgcccagtgaggatatctggaagaaattcgagctgcttcccGCCCCGCCCCTGTCCCCGAG CCGCCGCTCCGGGCTCTGCTCTCCATCCTATGccgcccctgtccccgagccgccgctccgggctct gctctccatcctatgt. A região central do óligo doador (maiúsculo) representa a região de edição, enquanto que as extremidades (minúsculo) representam seus braços homólogos.
As sequências dos guias passaram ainda por modificações necessárias a fim de permitir que as etapas de ligação e clonagem no vetor px458 ocorram com sucesso, que consistem na adição dos sítios de restrição para a enzima BbsI e adição de um nucleotídeo inicial de guanina.
Tabela 1. gRNAs desenhados para cada gene. Iniciadores Sequência
gRNA c-Myc
gRNA Trp53
S - CACCGTGTCCCCGAGCCGCCGCTC
AS - AAACGAGCGGCGGCTCGGGGACAC
S - CACCGCTACAGATGACTGCCATGG
gRNA H19 S (Up) - CACCGATCAGCAGACTAAAGGCCG
AS (Up) - AAACCGGCCTTTAGTCTGCTGATC
S (Down) - CACCGGTGGCGGCTGGTCGGATAA
AS (Down) – AAACTTATCCGACCAGCCGCCACC
S = sense. AS = Anti-sense. Up = Upstream ao promotor. Down = Downstream ao promotor.
Vermelho = Sequência complementar as extremidades abruptas geradas pela BbsI. Amarelo = G adicionado para o funcionamento do promotor U6. As sequências estão todas escritas no sentido 5’-3’.
4.3 Montagem Molecular do Sistema CRISPR/Cas9. 4.3.1 Digestão do vetor px458.
A etapa de digestão do vetor foi realiza pelo grupo do Laboratório de Biologia Molecular e do Desenvolvimento – UNIFOR – e gentilmente cedida para a realização desse projeto. O objetivo deste passo é linearizar o vetor comercial px458 (Addgene #48138). Primeiramente, 5 ug do plasmídeo foram colocados em uma reação de digestão com 50 unidades da enzima BbsI (New England Biolabs Inc.), 25 µl de tampão 2.1 (New England Biolabs Inc.) em um volume final de 250 µl sob temperatura de 37 °C overnight. Para a visualização da eficiência da reação, foi efetuada uma eletroforese
com uma alíquota de 10 µl do produto da reação em gel de agarose (1%) corado com
Figura 6. Mapa do vetor px458.
O vetor acima apresenta 9289 pb de extensão. Os sítios de restrição para a enzima
BsbI então na posição 253 pb e 275 pb. Seguido a ela, observamos o guia de RNA de
sequência universal, responsável pelo ancoramento a enzima. A NLS (sinal de localização nuclear), sequência usada para direcionar a proteína para onúcleo celular. O vetor apresenta duas regiões de origem de replicação, uma região que codifica EGFP e uma responsável por conferir resistência a antibiótico (ampicilina). Fonte: adaptado de KRISHNA et al., 2017.
4.3.2 Reação de anelamento dos gRNAs.
ambiente sobre a bancada durante 2 horas.
4.3.3 Reação de ligação dos gRNAs anelados ao plasmídeo px458.
Os gRNAs anelados estão prontos para serem inseridos na estrutura do vetor. Para a reação de ligação foram utilizados 20 ng do vetor px458, 5 ul do produto da reação de anelamento, 1 ul do Tampão T4 DNA Ligase 10X (New England Biolabs Inc.) e 400 u da enzima T4 DNA Ligase (New England Biolabs Inc.) em 10 ul. A reação foi incubada a 4 °C overnight.
4.4 Transformação química em bactérias com o sistema CRISPR/Cas9
Objetiva-se aqui clonar os vetores inseridos com os gRNAs. Preparou-se uma solução de KCM (1.25 ml de 4M KCl, 1.5 ml de 1M CaCl2, 2.5 ml de 1M MgCl2,
4.75 ml de água Mili-Q) para facilitar a sensibilização da membrana bacteriana. Em um microtubo, misturou-se, para a transformação de cada um dos três genes, 40 ul de KCM 2.5X, 4 µl do vetor plasmidial e 56 µl de água Mili-Q para um volume final de 100 ul. Em seguida foram adicionados a reação supracitada 100 ul de bactérias competentes TOP 10 (E. coli). A reação de transformação se iniciou com a incubação dos microtubos em gelo por 20 minutos e, posteriormente, a temperatura ambiente por 10 minutos. Para estabilização das células bacterianas, adiciona-se 800 ul de meio Luriana-Bertani (LB) líquido sob agitação a 220 g, por 1 hora a 37ºC. Após a incubação, os microtubos foram centrifugados a 300 g por dois minutos e o produto transformado foi plaqueado em meio LB sólido contendo antibiótico ampicilina 50 ul/ml. As placas foram incubadas a 37ºC overnight. Sabendo que o vetor utilizado neste trabalho apresenta gene para resistência a ampicilina, espera-se que somente as células bacterianas devidamente transformadas possam crescer.
4.5 PCR de colônias
iniciador em um volume final de 25 ul. O iniciador sense é a própria sequência do gRNA de cada gene e o anti-sense se liga ao arcabouço do plasmídeo, sendo este único para todas as reações de PCR de colônia (tabela 2). Para a identificação dos clones positivos, foram selecionadas 6 UFC (unidades formadoras de colônias) transformadas para os gRNA de c-Myc e Trp53 e 4 para cada um dos dois guias de H19 (guias desenhados para deleção).
Tabela 2. Lista de iniciadores para PCR de colônia.
Iniciadores Sequência
px458-gRNA-c-Myc px458-gRNA-Trp53 px458-gRNA-H19
px458-arcabouço
S – TGTCCCCGAGCCGCCGCTC
S - CTACAGATGACTGCCATGG
S (Up) - ATCAGCAGACTAAAGGCCG
S (Down) - GTGGCGGCTGGTCGGATAA
AS – GTCAATAGGGGGTACTTG
S = sense. AS = Anti-sense. Up = Upstream ao promotor. Down = Downstream ao promotor. O iniciador anti-sense é igual para todos os grupos, pois se anela ao próprio plasmídeo px458. As sequências estão todas escritas no sentido 5’-3’.
A ciclagem de temperatura se deu com uma desnaturação inicial de 95 ºC por 5 minutos, seguidos de 35 ciclos de desnaturação/anelamento/extensão de 95 ºC (30 segundos)/ 60 ºC (30 segundos)/ 72ºC (45 segundos), respectivamente, e extensão final de 72 ºC por 5 minutos. O produto de PCR visualizado em gel de agarose (1%) corado com corante GelRed.
4.6 Preparação de inóculo e crescimento de clones positivos
Depois de verificar os clones positivos, preparou-se o inóculo para permitir o crescimento dessas colônias em meio líquido. Foram preparados 3 erlenmeyers contendo 200 ml do meio líquido LB adicionado de ampicilina (50 µg/mL). Em cada erlenmeyer foi inoculada uma colônia positiva para cada gRNA a serem validados. Os erlenmeyers ficaram sob agitação 220 g a 37ºC overnight.
Como os vetores construídos foram clonados pelas colônias crescidas no inóculo, os mesmos tiveram que ser extraídos para as demais etapas. Para a extração de DNA plasmidial 50 ml de inóculo foram adicionados em tubos tipo falcon e centrifugados a 12000 g durante 10 minutos. Em seguida, descartou-se o sobrenadante e ao precipitado formado foram adicionados mais 50 ml do mesmo inóculo. Essa operação foi realizada num total de 4 vezes, de modo que os 200 ml de inóculo fossem todos concentrados. Após a última decantação, o precipitado formado foi utilizado para a extração do DNA plasmidial com o kit Pure Yield™Plasmid Midiprep System (Promega), de acordo com as instruções do fabricante.
4.8 Transfecção de mioblastos murinho C2C12 com os vetores construídos (px458-c-Myc; px458-Trp53; px458-H19)
Com os plasmídeos construídos em estoque após a extração, faz-se necessário transfectar os vetores para dentro das células a serem editadas C2C12. As transfecções foram conduzidas usando eletroporação através do Neon Transfection
System® (Thermo Fisher Scientific). Os mioblastos foram primeiramente cultivados em
meio DMEM, enriquecido com 10% de soro bovino fetal e 2% de antibiótico (penicilina/estreptomicina), até alcançarem confluência de 80-90%. Os parâmetros utilizados na eletroporação foram um pulso de 1650 volts durante 10 mS com 7.5 ug de cada vetor de CRISPR/Cas9 correspondente de cada gene. Após a eletroporação, as células foram cultivadas em DMEM sem antibiótico durante 24 horas para a recomposição da membrana celular. Depois desse período, as células foram observadas em microscópio de fluorescência (Eclipse Ti-S®, Nikon) para a detecção e estimativa da taxa de transfecção.
4.9 Extração de DNA genômico
4.10 PCR para amplificação da região-alvo
A partir do DNA extraído, amplificou-se a região alvo por PCR. Os iniciadores utilizados na reação e seus respectivos produtos estão exibidos na tabela abaixo (tabela 3). Para o desenho dos iniciadores, utilizou-se o programa Primer3 de acordo com sequências depositadas no GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Tabela 3. Iniciadores para amplificação da região-alvo.
Genes Sequência de iniciadores Produto
c-Myc
Trp53
H19
S – CATCTGCGACGAGGAAGAGA AS – TGAAGGTCTCGTCGTCAGGA
S - CCTGGGGGAATCCCTACACT
AS – GCCCCAAAAAGATCCACTCA
S (Up) - GGGGGATATAGCAGGGGTGT
AS (Up) - AAAAGCCCTGGTCATTGCTG
S (Down) - GATGGGAGAGCTGGAGGAGA
AS (Down) - GCTATACCTTCACTGCCCAGGT
266 pb
308 pb
285 pb
400 pb
S = sense. AS = Anti-sense. Up = Upstream ao promotor. Down = Downstream ao promotor. As sequências estão todas escritas no sentido 5’-3’.
4.11 Ensaio da Endonuclease T7
Inicialmente, 2.5 µl do produto de PCR de cada a guia purificado foi aplicado em gel de agarose para realizar eletroforese a fim de se determinar a sua concentração. Essa estimativa da concentração se deu por meio da comparação de intensidade de brilho do produto com as bandas do marcador molecular de 100 pb (Ludwing Biotec). Segundo fabricante, 5 ul do marcador aplicado no gel apresenta concentração de 40 ng para cada banda e, consequentemente, intensidade de brilho específica verificada através do programa AlphaView.
Após ter estimado a concentração do produto de PCR de cada guia, o primeiro passo consistiu em preparar as amostras para a reação de digestão com a enzima T7. Para tal, adicionou-se em um microtubo 200 ng do produto amplificado, 1.9 µl de Tampão 2 (New England Biolabs Inc.) e completou-se com água Mili-Q a um volume final de 19 µl. As amostras foram então submetidas a um ciclo de desnaturação e anelamento no termociclador. Os parâmetros utilizados foram de desnaturação inicial a 95ºC por 10 minutos, seguido de uma fase de anelamento a 85ºC por 5 minutos e estabilização a 25ºC por 5 minutos.
Feito isso, foi adicionado 10 unidades de Endonuclease T7 (New England
Biolabs) e incubou-se a reação a 37ºC durante 15 minutos. O produto da digestão foi
visualizado em gel de agarose 2% corado com GelRed. Com o auxílio de um transiluminador observou-se o padrão de bandas resultante da eletroforese para confirmação da atividade dos vetores de CRISPR/Cas9 produzidas.
4.12 Isolamento de células para formação de colônias com deleção da região promotora de H19.
Com a confirmação da validação da capacidade de edição dos vetores
px458-H19 upstream e downstream, os mesmos voltaram a ser tansfectados, agora
foi realizado através de diluição limitante, o que significa que se estimou uma concentração média de uma única célula por poço. Cada poço foi mantido com 200 ul de meio TCM-199 (do inglês, Tissue Culture Medium 199) e teve seu crescimento acompanhado semanalmente a fim de se encontrar somente aqueles poços que apresentassem um único agrupamento celular. Poços com mais de um agrupamento celular foram descartados.
4.13 Identificação de colônias com deleção da região promotora de H19.
Das seis placas de 96 poços mantidas, apenas 76 poços foram estipulados com crescimento a partir de uma única célula. Ao atingir a confluência máxima de cada poço, parte da população de células das colônias convenientes tiveram seu DNA extraído por extração térmica. Inicialmente cada colônia foi tripsinizada e 150 ul de cada uma foi transferida para nova placa de 96 poços para então ser centrifugada a 10.000 rpm por 5 minutos e ressuspendida em 150 ul de água ultrapura. Novamente foram transferidas, agora para estantes de microtubos de 200 ul, para serem incubadas a 100 ºC por 15 minutos e posteriormente a 4 ºC por 5 minutos em termociclador
T100™ Thermal Cycler (Bio-Rad) (ROWLANDS et al, 2006).
Por fim, utilizou-se do sobrenadante das extrações de DNA de cada colônia para reações de PCR (tabela 4) a fim de se identificar colônias com deleção de promotor. A ciclagem de temperatura se deu com uma desnaturação inicial de 95 ºC por 5 minutos, seguidos de 35 ciclos de desnaturação/anelamento/extensão de 95 ºC (30 segundos)/ 62 ºC (30 segundos)/ 72ºC (2 minutos), respectivamente, e extensão final de 72 ºC por 5 minutos. O produto de PCR visualizado em gel de agarose (1%) corado com GelRed.
Tabela 4. Pares de iniciadores utilizados para amplificação da região com deleção de promotor.
Gene Sequência de iniciadores Produto
H19 S – GGGGGATATAGCAGGGGTGT
AS – ACCTGGGCAGTGAAGGTATAGC
1739 pb
4.14 Sequenciamento de DNA de colônias de H19.
Após a prévia identificação de colônias com produtos de PCR diferenciados em relação ao controle não editado, utilizou-se de reação de sequenciamento Sanger para validação de possível deleção. Para tal, utilizou-se de uma nova amplificação da região de interesse a partir da mesma ciclagem e par de iniciadores (tabela 4) descritos no item acima. Posteriormente os produtos foram purificados do gel de agarose 1% utilizando-se de kit QIAquick PCR Purification (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos devidamente purificados foram sequenciados utilizando dos mesmos pares de iniciadores da reação de PCR através do equipamento Sequenciador Automático de DNA -ABI 3100 (Thermo Fisher). Ao final, a análise se dá alinhando as sequências obtidas com o DNA de referência (Mus musculus - assembly GRCm38.p6) utilizando a Bioedit (do inglês, Biological Sequence Alignment Editor).
4.15 Linhagem celular.
A linhagem C2C12 foi obtida a partir do Banco de Células do Rio de janeiro (BCRJ) e utilizadas em todas etapas de edição genética com o sistema CRISPR/Cas9. As linhagens celulares foram manuseadas em ambiente estéril de câmara de fluxo laminar vertical (VECO 12, classe II) e mantidas em incubadoras a 37ºC com atmosfera de 5% de CO2 (NUAIRE, modelo TS Autoflow). As células foram cultivadas em garrafas
5. Resultados.
5.1 Desenho in silico de gRNAs para os genes c-Myc, Trp53 e H19.
Utilizando da plataforma de desenho de gRNA CRISPR design foi possível identificar in silico qual foi o gRNA com maior pontuação, isto é, com o menor efeito off-target possível. Segundo a plataforma utilizada, os guias podem ser ranqueados em pontuações de zero a cem, de acordo com a quantidade de sequências homólogas existentes entre gRNA e o genoma analisado, os nucleotídeos envolvidos nessas sequências off-targets e a disposição desses nucleotídeos no próprio gRNA (Zhang 2013). Vale ressaltar que nenhum dos gRNAs escolhidos apresentam homologia com outras regiões, fora a sequência de interesse, maior que quatro nucleotídeos. A tabela abaixo (tabela 5) apresenta as respectivas pontuações de cada gRNA utilizado neste trabalho, bem como a quantidade de eventos off-targets passíveis de edição.
Tabela 5. Pontuação de gRNAs e número de efeitos off-targets segundo a plataforma CRISPR design.
Genes gRNA Pontuação Off-targets (gene)
c-Myc Trp53 H19
TGTCCCCGAGCCGCCGCTC CTACAGATGACTGCCATGG
(Up) - ATCAGCAGACTAAAGGCCG
(Down) - GTGGCGGCTGGTCGGATAA
83 76 97 89 23 11 3 7
Acima estão apresentados os genes murinos trabalhados, seguidos de seus guias e as duas principais informações fornecidas pela plataforma, pontuação e quantidade de sequências com alguma homologia (off-targets).
foram desenhados. Vale ressaltar que para a validação final da atividade independente de cada vetor construído (px458-C-myc; px458-Trp53; px458-H19 upstream e downstream), deve-se sempre haver um par de iniciadores para confirmar a validação. A figura abaixo (figura 7) exemplifica a localização de cada gRNAs e seus respectivos iniciadores.
Setas pretas indicam o local de corte da enzima Cas9 a partir do domínio PAM sublinhado. Guias estão representados em verde e iniciadores em azul. (A) c-Myc: sequência em azul escuro e amarelo representam íntron e éxon, respectivamente. Letras em vermelho indicam as bases oscilantes que podem ser alteradas pela inserção de um óligo doador evitando novos anelamentos. (B) Trp53: Sequência em azul e amarelo representam íntron e éxon, respectivamente. (C) H19: Sequência em amarelo representa a região do promotor flanqueada. O guia upstream ao promotor está na construído para a fita com sentido antisenso. Fonte: elaborado pelo próprio autor.
5.2 Digestão do vetor px458
Figura 8. Gel da reação de digestão do vetor px458.
MM = marcador molecular de 1Kb; C = controle do vetor não digerido; D = digestão do vetor. (MARCADOR MOLECULAR)
5.3 PCR de colônia
A confirmação do processo de transformação do vetor px458 nas colônias crescidas em meio enriquecido com ampicilina se dá através do resultado do PCR de colônia (figura 9). Os clones positivos apresentam produto de amplificação na altura de 349 pb tendo em vista que esse é o tamanho do amplicons entre o gRNA utilizado como iniciador sense e o iniciador anti-sense que se liga diretamente ao arcabouço do plasmídeo. A digestão com BbsI gera extremidades coesivas diferentes, portanto a inserção dos gRNAs anelados sempre é feita na orientação correta, dispensado qualquer tipo de teste adicional. Observa-se que para o gene c-Myc de seis colônias avaliadas, quatro foram devidamente amplificadas, enquanto que para Trp53 das seis colônias avaliadas, cinco foram positivas. Dos quatro clones para cada um dos gRNAs
de H19, upstream (colônias C1 a C4) e downstream (colônias C5 a C8) ao promotor,
Figura 9. Géis de eletroforese dos PCRs de colônia.
Setas pretas apontam para o marcador no peso de 300 pb. MM = marcador molecular de 100 pb. (A) c-Myc. (B) Trp53. (C) H19.
5.4 Extração de DNA plasmidial
Figura 10. Géis de eletroforese de extração de DNA plasmidial de colônias positivas pelo PCR de colônia.
Marcador molecular de 1 kb. EC = extração de colônia. (A) Extração de colônias para c -Myc. (B) Extração de colônias para Trp53. (C) Extração de colônias para H19, onde de EC1 a EC3 se refere ao vetor contendo o gRNA upstream ao promotor e de EC4 a EC6 ao gRNA downstream ao promotor.
5.5 Transfecção em células muninas C2C12
Figura 11. Transfecção dos vetores px458-c-Myc; px458-Trp53; px458-H19 em mioblastos murinos C2C12.
Aumento de 200x. Fotos superiores representam campo escuro e células com expressão de GFP. Fotos inferiores representam os respectivos campos claros com células transfectadas e não transfectadas. (A) c-Myc. (B) Trp53. (C) H19 upstream. (D)
H19 downstream.
5.6 Amplificação da região de edição
Figura 12. Reação de PCR para amplificação de regiões de edição.
Marcador molecular de 100 pb. AMP = amplificação. Setas indicam o tamanho dos produtos gerados. C- = controle negativo (sem reação sem DNA). (A) c-Myc. (B) Trp53.
(C) H19 upstream. (D) H19 downstream.
5.7 Ensaio da Endonuclease T7
seguido de seus pares de bandas editadas de 227 pb e 58 pb e 257 pb e 143 pb.
Figura 13. Géis de eletroforese do tratamento com Endonuclease T7.
MM = Marcador molecular. DNA EDIT = DNA editado. CN = controle negativo (ausência de edição genômica). Seta laranja indica a banda de 500 pb do marcador. Setas azuis indicam o peso molecular das bandas editadas. (A) c-Myc. (B) Trp53. (C) H19.
5.8 Isolamento de colônias transfectadas com os vetores px458-H19 upstream e downstream.
plasmídeos px-458-H19 upstream e downstream ao promotor de H19.
A eficiência da reação de transfecção simultânea dos dois vetores em células C2C12 pode ser observada abaixo (figura 14 – A). As células transfectadas foram utilizadas para diluição limitante a fim de se obter colônias crescidas a partir de uma única célula (figura 14 – B). Das seis placas de 96 poços mantidas, apenas 76 poços foram estipulados com crescimento a partir de uma única célula. Cada uma das 76 colônias teve parte de seu DNA extraído para avaliação por PCR. O resultado da PCR abaixo (figura 14 – C) apresenta a única colônia que resultou em produto diferente do observado no controle negativo. Pela figura, fica claro que para a colônia C21 temos dois produtos ambos com forte intensidade de brilho em 1.7 kb e 1.6 kb. O controle negativo, DNA de células não transfectadas, apresentou produto de 1.7 kb já esperado tendo em vista o tamanho da amplificação dos iniciadores utilizados (tabela 4).
Figura 14. Transfecção simultânea com vetores px458-H19 upstream e downstream, crescimento de colônias e PCR de colônias isoladas.
e não transfectadas. (B) Exemplo de diluição limitante da colônia C21. Foto à esquerda mostra o crescimento da colônia após duas semanas de transfecção. Foto à direita mostra o crescimento da colônia após três semanas de transfecção. (C) Setas indicam a altura dos produtos. C = Colônias. Para controle negativo (C-) utilizou-se de DNA genômico não transfectado. B = reação branco, sem DNA
5.9 Sequenciamento de DNA de colônia de H19.
Tendo em vista os produtos em alturas diferentes do controle negativo do resultado de PCR, a colônia 21 foi a selecionada para a reação de sequenciamento Sanger. Na figura 15 – A temos a representação da estrutura do alelo materno do gene H19 de camundongo. Observam-se os genes Ifg2 e H19, grupo regulado pela mesma Região Diferencialmente Metilada (DMR), e entre eles a própria DMR, no caso do alelo materno hipometilada. O cromatograma da região promotora (P) da colônia avaliada por sequenciamento é exibido na figura 15 – B. A colônia C21 foi alinhada com genoma de referência do genoma de Mus músculos (posição >NC_000073.6:c142578146-142575530). O alinhamento entre as sequências evidencia uma deleção de aproximadamente 80 nucleotídeos, como visto na figura 15 – C.
Figura 15. Esquema representativo da região de deleção no promotor sequenciado de H19.
6. Discussão
Atualmente, a maior parte dos modelos in vitro utilizados na identificação de novas moléculas com potencial anticancer são baseados em tipo histológico. Contudo, sabe-se que o câncer representa um conjunto complexo de alterações genéticas e epigenéticas que por consequência apresenta diferentes subtipos moleculares (SORLIE et al., 2001; SORLIE et al., 2003). Isso implica em dizer que apesar da similaridade histológica aparente dos mesmos tipos de tumores, os subtipos moleculares se diferem em termos de diferenciação, resposta terapêutica e sobrevida (PRAT et al., 2010). Portanto, o desenvolvimento de modelos celulares que, diferentemente daqueles já utilizados durante as prospecções de novas substâncias, apresentem apenas uma única via alterada, na tentativa de aumentar a precisão do estudo de mecanismo de ação e alvo de durante a triagem por novas moléculas na cadeia de desenvolvimento de fármacos é de grande valia.
Os trabalhos com edição gênica exigem que se tenha claro conhecimento sobre a estrutura e função do gene em estudo. Sabe-se que um mesmo gene pode expressar mais de um transcrito, fruto de um splicing alternativo, isto é, leitura diferente dos éxons disponíveis para transcrição que podem gerar isoformas diferentes, ou seja, proteínas com terminações N- e C- distintas (SHABALINA et al., 2010; NILSEN & GRAVELEY, 2010). Portando, antes de qualquer passo no trabalho com edição gênica, faz-se necessário conhecer a estrutura e função do gene em estudo para que, independentemente do transcrito, a modificação realizada gere a alteração proposta.
Utilizando as informações disponíveis no banco de dados do NCBI (do inglês
National Center for Biotechnology Information), Genbank, pode-se estudar as sequências
certas para cada edição. No caso do c-Myc, dos quatro transcritos existentes apenas dois apresentam um resíduo de treonina na posição 58. Entretanto, segundo Wang e colaboradores (2011), as duas isoformas em que a mutação T58A pode estar presente são as mais traduzidas das quatro.
A reprodução da mutação T58A in vitro através da substituição de apenas um nucleotídeo exige que o mecanismo de HDR seja a via utilizada para edição. Sabendo que quando o vetor for expresso e o sistema CRISPR/Cas9 exercer seu papel dentro das células, o mesmo somente vai parar de gerar DSB quando a sequência alvo reconhecida pelo gRNA gerar indels suficiente para impedir que o guia volte a parear na região alvo de DNA (PEREIRA, 2016). Contudo, a partir do momento em que o mecanismo de reparo via HDR ocorrer e inserir a mutação pontual desejada, qualquer outra modificação que um próximo vetor venha a gerar, secundariamente, será negativa para o desenvolvimento do modelo, tendo em vista que a única alteração desejada é a T58A.
Inicialmente, para contornar essa possível alteração secundária, deve-se ter em conta que o guia está dentro da própria zona de edição (figura 7 - A), isto é, entre o códon a ser alterado (vermelho) e o sítio de clivagem pela enzima Cas9 (seta) e que essa zona de edição seja correspondente (complementar) a parte do óligo doador a ser inserida. Dado isso, utilizou-se do princípio de que o terceiro par de base de um códon pode ser alterado e mesmo assim codificar um mesmo aminoácido, bases oscilantes (NELSON & COX, 2011).
Segundo Semenova e colaboradores (2011), o gRNA é capaz de reconhecer uma sequência com poucos nucleotídeos não pareados, entretanto a menor alteração na sequência seed do guia funcionará como um bloqueio no pareamento.
Figura 16. Representação da inserção do óligo doador e suas características.
Representação do óligo doador com seus braços homólogos. A sequência em azul é a zona de edição, região de inserção, onde na sua extremidade 5´ temos o códon a ser modificado (sublinhado) de alanina (ACC), onde apresenta uma alteração de adenina (A em vermelho na fita de DNA alvo) por guanina (G em vermelho na fita do óligo). demais alterações em nucleotídeos representam as modificações nas bases oscilantes do óligo. Traço verde indica o PAM, traço azul a sequência seed e traço preto a extensão da sequência do guia. Seta contínua indica que a substituição de citosina por adenina está inserida no seed, enquanto a seta pontilhada indica a DSB. Fonte: Elaborado pelo próprio autor.
ser de 60% a 70% (MEI et al., 2016). Portanto, a região escolhida para o desenho do guia para Trp53 foi o primeiro éxon do gene (figura 7 – B).
Tendo em vista que a clivagem no DNA acontece três nucleotídeos a partir do domínio PAM no sentido sentido 5’ (upstream), a quebra de dupla fita acontece entre os 15º (adenina) e 16º (timina) primeiros nucleotídeos da região codificante do gene. Em camundongos, Trp53 apresenta a expressão de três transcritos, porém o primeiro éxon é comum a todas eles (HSU et al., 2014; MEI et al., 2016).
O gene H19, possui um padrão de expressão monoalelica, cuja regulação da sua função se dá por uma região controladora de imprinting (ICR, do inglês, Imprinting Control Region), localizada upstream do promotor do H19, denominada H19DMR, por ser diferencialmente metilada dependendo da origem parental (GEBERT et al., 2010). O fator de transcrição CTCF (fator de ligação CCCTC) é conhecido por ser o principal fator que se liga à ICR quando esta não está metilada, reestruturando a arquitetura do DNA em um loop até o promotor do H19, ativando-o (LI et al., 2008).
Portanto, apesar do controle da expressão desse gene acontecer pela H19DMR, a deleção do promotor garante a inativação do gene. Para isso, sabendo que a sequência conservada em eucariotos TATAAA (TATA BOX) caracteriza um dos principais pontos de reconhecimento da região promotora, a retirada dessa sequência induz diretamente no bloqueio da expressão (NELSON & COX, 2011). Portanto, desenhou-se dois gRNA que flanqueiam a região promotora do H19 para a deleção do mesmo (figura 7 – C).
