UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS FACULDADE DE FARMÁCIA
FARMACOGNOSIA
APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS
Prof. Dr. José Realino de Paula
Prof
a. Dra. Maria Teresa Freitas Bara Prof. Dr. Pierre Alexandre dos Santos
Goiânia – GO - 2018
Agosto / 2018
SUMÁRIO
CONSIDERAÇÕES GERAIS 3
OBTENÇÃO E PRODUÇÃO DE MATÉRIAS-PRIMAS VEGETAIS
4MÉTODOS EXTRATIVOS 7
DETERMINAÇÂO DO RESÍDUO SECO DE EXTRATOS VEGETAIS 13
ANÁLISE MACRO E MICROSCÓPICA DE FOLHAS 14
REAÇÕES DE HISTOQUÍMICA 17
MICROSCOPIA DE PÓS 18
PESQUISA DE MATERIAL ESTRANHO 19
MICROSSUBLIMAÇÃO 20
DETERMINAÇÃO DE UMIDADE EM MATÉRIAS-PRIMAS VEGETAIS 21
DETERMINAÇÃO DE CINZAS TOTAIS E INSOLÚVEIS EM ÁCIDO 22
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA – PLANTAS MEDICINAIS 23
CROMATOGRAFIA EM COLUNA 25
IDENTIFICAÇÃO DE GOMAS 26
DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE INTUMESCÊNCIA 27
PESQUISA DE HETEROSÍDEOS ANTRAQUINÔNICOS 28
PESQUISA DE HETEROSÍDEOS CIANOGENÉTICOS 29
PESQUISA DE HETEROSÍDEOS FLAVONOIDES 30
DOSEAMENTO DE FLAVONOIDES TOTAIS 32
PESQUISA DE HETEROSÍDEOS DIGITÁLICOS 33
PESQUISA DE SAPONINAS 34
PESQUISA DE HETEROSÍDEOS CUMARÍNICOS 35
CARACTERIZAÇÃO DE ÓLEOS ESSENCIAIS 36
PESQUISA DE ALCALOIDES 40
DOSEAMENTO DE ALCALOIDES 42
ALCALOIDES – EXERCÍCIOS 43
DOSEAMENTO DE METILXANTINAS 44
PESQUISA DE TANINOS 45
DOSEAMENTO DE TANINOS 46
MATÉRIA PRIMA DE ORIGEM ANIMAL 47
CONSIDERAÇÔES GERAIS
RECOMENDAÇÕES SOBRE PRÁTICAS LABORATORIAIS
Visando um melhor andamento das atividades práticas e a busca de resultados mais precisos possível, as análises laboratoriais devem ser realizadas segundo critérios rigorosos.
Os acadêmicos e demais usuários do laboratório deverão observar as seguintes normas gerais:
1. Observar e seguir rigorosamente o horário estabelecido para as atividades práticas;
2. O jaleco é de uso obrigatório para as atividades laboratoriais;
3. As aulas práticas serão executadas em grupos, sendo dois grupos por bancada;
4. Sobre as bancadas de trabalho somente se colocam os materiais de análise. Cadernos, bolsas e outros objetos deverão ser colocados nas prateleiras;
5. Enquanto um colega executa a análise, os demais devem permanecer atentos;
6. Laboratório é um local de silêncio, devendo os usuários conversarem apenas o estritamente necessário, referente ao assunto da aula;
7. Ao manusear um frasco de reagente, leia atentamente o rótulo;
8. As pipetas deverão ficar à direita do frasco em que forem usadas;
9. Não deixe soluções em bureta, esgote-as após o uso;
10. Os resultados de pesagens e doseamentos devem ser anotados em rascunho, para posteriores cálculos;
11. Execute os trabalhos com o máximo de cuidado e lembre-se: "a pressa é inimiga da perfeição";
12. Evite fazer trocas de material entre os grupos, solicite o necessário ao Professor ou servidor autorizado;
13. Atente para não deixar ligada a aparelhagem após o uso (fogareiro, chapa aquecedora, etc);
14. Não utilize produtos inflamáveis quando o fogareiro estiver aceso;
15. Não deixe o recipiente contendo a droga a ser analisada , as soluções e demais reagentes destampados;
16. No caso de acidentes com ácidos, álcalis, etc, lave a área afetada com bastante água e avise imediatamente ao Professor;
17. Não fume e não coma no laboratório. Trabalhe de pé;
18. Terminados os trabalhos, antes de descartar as soluções ácidas na tubulação (pia),
neutralize-as com soda (NaOH). Solventes orgânicos devem ser desprezados à
parte (galão apropriado). Depois disso, enxague a vidraria utilizada, deixando-a sobre
o balcão da pia.
Assunto: OBTENÇÃO E PRODUÇÃO DE MATÉRIAS-PRIMAS VEGETAIS
Etapas:Seleção: das espécies: visando a obtenção de matérias primas (drogas) padronizadas
Uma certa espécie vegetal pode apresentar indivíduos morfologicamente iguais, porém com componentes químicos diferentes. Esta variação pode estar relacionada com caracteres genéticos flutuantes. Deste modo a seleção de indivíduos melhores levará a produção de cultura de melhor qualidade.
Cultivo: Fatores que influenciam no conteúdo de princípios ativos:
temperatura (Goma adragante Astragalus gummifer, quando cultivado em países de clima frio, não produz princípio ativo);
tipo de solo (plantas alcaloídicas produzem mais alcalóides em terrenos ácidos; e com adição adubos nitrogenados);
umidade ( transporte de alimentos do solo para a planta e na planta, de um órgão para outro, depende fundamentalmente de água. A síntese de carboidratos, ponto de partida para as demais sínteses depende fundamentalmente de água)
idade da planta clima
altitude (óleo essencial) estado patológico
Colheita
O teor de princípio ativo varia de um órgão para outro, com a idade, época de colheita e mesmo o período do dia no qual é efetuada.
Para cada planta medicinal existe um momento adequado para se realizar a colheita. O monitoramento fitoquímico dos p a permite estabelecer com exatidão a época certa para a colheita.
Para plantas cujos p a ainda não são conhecidos, podem ser aplicadas algumas regras gerais.
Conforme o órgão da planta a ser coletado, existem algumas normas gerais:
Raízes, rizomas, tubérculos e bulbos devem ser coletados no outono ou inverno (fase
estacionária de desenvolvimento vegetativo)
Cascas devem ser coletadas no outono ou início do inverno Folhas e ervas devem ser coletadas quando se inicia a floração
Flores e inflorescências devem ser coletadas em plena floração e antes da formação de sementes
Frutos colhem-se antes de atingir o estado maduro (“de vez”)
Sementes devem ser coletadas quando completamente maduras e de preferência antes da deiscência do fruto)
Fonte: Farmacognosia. Oliveira et al, 1991
Obs: Colheita pode ser manual ou mecanizada, devendo-se evitar compressões violentas e lesões profundas dos órgãos coletados.
Via de regra: Flores, inflorescência e ramos floridos podem ser coletados Mecanicamente.
Folhas: deve ser manual
Órgãos subterrâneos devem ser coletados e limpos em seguida Cascas, coletar apenas a região indicada, não contaminando com o lenho.
Processamento pós-colheita ( preparo)
O processamento pós-colheita tem por objetivo a conservação das características físicas, químicas, organolépticas e farmacológicas da matéria prima vegetal.
A 1ª etapa consiste no exame e separação manual das partes deterioradas, manchadas e com sinais de ataque por insetos e/ou fungos. A seguir podem ser lavadas em água corrente e desinfectadas em sol de hipoclorito de sódio (controvérsia). A seguir seca-se.
Obs:Raízes devem ser lavadas (rapidamente) e secas adequadamente.
Mondagem (retirada da camada externa de qualquer órgão) pode resultar no desdobramento dos p.a.
Secagem
Métodos de secagem:
Processos naturais: Secagem à sombra Secagem ao sol
Secagem mista (sol e sombra)
Obs.: Dependem das condições locais onde deve ser realizado e somente em regiões de clima quente e seco. São interrompidas ao anoitecer
Processos artificiais: com circulação de ar, aquecimento, aquecimento com circulação de ar, vácuo e resfriamento (liofilização)
Obs.: Maioria das plantas pode ser seca em temperatura de 30-60°C (óleos essenciais abaixo de 40°C), com circulação de ar
O método de secagem deve ser determinado experimentalmente para cada planta.
Estabilização
Visa inativação de enzimas, normalmente usado somente quando a secagem por si só não for suficiente
Métodos: aquecimento (80 a 90°C) 15 a 30 min Uso de solvente: vapor de etanol Irradiação UV
Armazenamento:
ambiente limpo, seco (baixa umidade), bem ventilados, sem incidência de luz solar direta e temperatura de 5 a 15°C
estado de divisão (menos dividido)
embalagem (sacos de aniagem ou em fardos prensados, não colocados no chão; frascos âmbar hermeticamente fechados). Evitar sacos plásticos. Etiquetar (nome cientifico, parte usada, data de entrada, fornecedor, procedência e aprovação controle de qualidade)
tempo: analisar (folhas/flores:12 a 18 meses, cascas e raízes: 12 a 36 meses, regra geral).
Assunto: MÉTODOS EXTRATIVOS Produtos derivados das plantas medicinais
a) Produtos obtidos por tratamentos mecânicos:
Plantas empregadas
in natura; pós vegetais; produtos líquidos obtidos por expressão(suco fresco da planta).
b) Produtos obtidos por ação do calor:
Destilação: óleos essenciais, águas destiladas (hidrolatos), alcoolatos c) Produtos obtidos por ação de um solvente:
Álcool: tinturas; tinturas-mães; alcoolaturas.
Água: infusos e decoctos
Solução açucarada: sacaróleos (xaropes e melitos) Solventes diversos: óleos, propilenoglicol, glicerinas d) Produtos obtidos por concentração de soluções extrativas:
Extratos fluidos, extratos moles, extratos secos.
Processos de Extração
Três etapas: penetração do solvente nas células, a dissolução das substâncias extraíveis e a difusão da solução para fora da célula vegetal
-Influenciado por:
Divisão da droga (pós moderadamente grosso 710 mm) Agitação (equilíbrio de saturação do solvente - eficiência) Temperatura
pH (influenciar na solubilidade – sais)
Natureza do solvente: seletividade, preço, segurança e riscos (geral: alcóol 3C, água, misturas destes)
Tempo de extração
Processo de extração : Dois Grupos:
A) Processos que resultam no equilíbrio de concentração entre o soluto e solvente (difusão) ex: maceração, maceração dinâmica B) Processos que esgotam a droga
ex: percolação e repercolação
Maceração
Contato da droga, geralmente pulverizada, com o líquido extrator em um frasco bem fechado por vários dias com agitação ocasional (maceração simples ou estática)
Maceração dinâmica: agitação constante. Diminuição do tempo.
Temperatura ambiente ou temperatura elevada (digestão) Desvantagem da maceração:
Lentidão do processo
Não alcança o esgotamento da droga Muito utilizada em pequena escala.
Indústria usa apenas para drogas vegetais ricas em mucilagens (intumescem).
Etapa Final: prensagem ou centrifugação do resíduo Percolação ( Per = através
Colare = filtrar)Extração por deslocamento (lixiviação) lento e regular do líquido extrator através da droga pulverizada e acondicionada em um percolador, até esgotamento completo
Percolação simples: extração exaustiva da droga com solvente sempre renovado (elevado consumo de solvente)
Indústria: usa a repercolação: recircular o mesmo solvente por meio de bombas. (apenas o 1 lote de matéria-prima é extraído com solvente novo)
Repercolação: Usa-se baterias de percoladores e os extratos menos ricos em substâncias extraíveis são utilizados para extrair novas porções da droga
Liofilização:
Operação de secagem de substâncias termolábeis
Consiste em congelar a solução em temperatura de -40ºC e colocá-la sob alto vácuo, quando ocorrerá a sublimação do gelo.
Pode ocorrer perda de voláteis Caro
Obs.: Atomização (spray-drying) é mais usado. A solução é seca e dispersa na forma de
gotículas muito finas numa corrente de ar quente. A secagem se dá em segundos. Pode ser
adicionado pó inerte (Aerosil, lactose, amido, malto-dextrina).
Solventes inflamáveis devem ser evaporados anteriormente.
Soluções extrativas:
Soluções extrativas de origem vegetal são resultantes da dissolução incompleta ou parcial de uma droga vegetal, num determinado solvente.
PRINCIPAIS TIPOS:
INFUSÃO:
Usa-se o infuso para drogas ricas em óleos essenciais, substâncias aromáticas e em geral para todas as que perdem os princípios ativos com ação de calor.
Geralmente é empregado para as folhas, flores e frutos carnosos e preparados a 5%, exceto para drogas muito ativas.
Técnica: esquentar a água na quantia certa e despejar sobre a droga indicada e colocada em recipiente de vidro ou porcelana. Tampar e deixar em infusão no máximo durante 10-20 minutos. Depois coar e beber por xícaras.
O infuso não deve ser tomado muito quente ou muito gelado. A sua preparação tem de ser feita no momento da utilização. Se for indispensável guardar o infuso, ele pode ficar na geladeira no máximo 24 horas.
DECOCÇÃO:
A operação de extrair os princípios ativos de uma substância vegetal por contato mais ou menos prolongado com um liquido (água) em ebulição. A temperatura provoca aumento de solubilidade dos princípios ativos.
Esse procedimento é usado para drogas não aromáticas que contém princípios ativos estáveis ao calor, geralmente é aplicada para raízes, caules, sementes, cascas e frutos secos.
Via de regra são preparados a 5%, observando as exceções.
Técnica: é necessário triturar as drogas, colocá-las, na quantia indicada, em água quente (colocar 2/3 colheres a mais do que a quantia indicada) e deixar ferver em fogo baixo durante cerca de 15 minutos. Deixar descansar por 5 minutos. Depois coar e beber por xícaras.
MACERAÇÃO
É uma técnica de extração de p.a. em que a droga e o solvente são postos em contato, durante certo tempo, mais ou menos prolongado à temperatura ambiente, obtendo- se deste modo, uma solução extrativa (macerado). O macerado normalmente é preparado a 2% e é utilizado especialmente, para drogas com estrutura pouco compacta e cujos p.a.
sejam solúveis a frio.
TINTURAS:
São soluções extrativas preparadas com drogas secas e usando como líquido extrator o álcool. São preparadas a 20%, exceto para as drogas heróicas, que são a 10%. As tinturas de drogas não heróicas são corretamente preparadas pelo processo de maceração, durante 10 dias. A percolação ou lixiviação é indicada para drogas heróicas. Podem ser usadas interna ou externamente. De modo geral, o teor alcóolico indicado é 85 GL para extrair resinas, bálsamos, essências e mucilagens; 70 GL para alcalóides (heróicas) e 65 GL para as demais, como taninos, drogas pouco ativas, amargas e digestivas. Se pretende preparar um medicamento com mais de uma tintura, deve-se padronizar uma única graduação alcoólica.
Obs.: ao se usar planta fresca e álcool, normalmente na proporção de 50% de planta, estará sendo preparada uma alcoolatura e não uma tintura.
EXTRATOS:
São preparações concentradas, obtidas de drogas vegetais ou animais, frescas ou secas, por meio de um solvente apropriado, seguido de evaporação total ou parcial. A extração geralmente é executada pelo processo da percolação. A evaporação pode ser feita em banho-maria e vácuo, em temperatura inferior a 60 ºC.
Os extratos fluidos são manipulados de forma que cada 1 mL contenha os p.a.
solúveis em 1 g da droga.
De acordo com a Farm. Bras. II, existem 4 processos para preparação: no A, o solvente é o álcool ou mistura hidro-alcoólica; no B, álcool ou álcool-água + ácido e glicerina; e C, é percolação fracionada, empregada para princípios termolábeis e o D, usa-se água fervente.
A velocidade de saída do percolato deve ser controlada. Padronizou-se que percolar lentamente: 1 mL/min; percolar rapidamente: 3-5 mL/min e percolar moderadamente: 1 – 3 mL/min.
Procedimento para percolação:
1. Pulverizar a droga
2. Umedecer o pó e macerar por 2 a 3 h 3. Acondicionar o macerado
4. Deixar em maceração, ppdita, por um período de 24 h, geralmente 5. Deslocamento do solvente
OBS: Extrato seco: o extrato é submetido a evaporação completa do solvente. Se necessário, usar excipientes para tornar pó (lactose) – possibilidade de produzir Extratos padronizados:
Obs.: Extrato glicólico:
Não é uma preparação farmacopêica e tem sido usada exclusivamente na cosmetologia, ou seja, externamente. São preparações feitas normalmente com propilenoglicol, sendo este utilizado em diversas concentrações, depende da droga.
PROPORÇÔES: 200 g droga: 250 ml de álcool 96 % : 1000 ml propilenoglicol Usar processo de maceração, durante 10 dias, com agitações ocasionais. Filtrar e completar o vojlume com a mistura de álcool/propilenoglicol, na mesma proporção citada acima.
OBS: INCOMPATIBILIDADE ENTRE OS EXTRATOS:
As tinturas alcóolicas são incompatíveis com as enzimas, com as tinturas de diferentes graduações alcóolicas, com ácido tânico, os sais de metais pesados.
PRÁTICA
1- Preparar 25 mL de tintura de açafrão a 20% (Curcuma longa L., Zingiberaceae) por maceração.
Relação droga vegetal:líquido extrator 1:5 (m/v). Líquido extrator: solução hidroalcoólica (SHA) a 70%.
2- Preparar 5,0 mL de tintura de açafrão a 20% (Curcuma longa L., Zingiberaceae) por percolação.
Líquido extrator: solução hidroalcoólica (SHA) a 70%.
3- Preparar um extrato fluido de açafrão (Curcuma longa L., Zingiberaceae) por percolação.
Massa a ser utilizada 25 g Líquido extrator: SHA 70%.
4- Preparar 20 mL extrato glicólico de calêndula (Calendula officinalis L.- Asteraceae) a 10%
Líquido extrator: mistura contendo 80% de SHA a 70% + 20% de glicerina (PA).
Pesar a droga vegetal e colocá-la num frasco. Adicionar a SHA 70% e agitar bem.
Deixar em maceração por 24 horas. Adicionar 20% de glicerina e deixar macerando por mais 7-10 dias com agitações ocasionais. Após esse período, filtrar diretamente para uma proveta.
Se for necessário acrescentar mais líquido extrator preparar uma mistura contendo:
80% de SHA a 70% + 20% de glicerina.
Bibliografia
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Formulário de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira/Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Brasília: Anvisa, 2011.
DÍPPOLITO, J. A. C.; ROCHA, L. M.; SILVA, R. F. Fitoterapia magistral: um guia prático para a manipulação de fitoterápicos. São Paulo: ANFARMAG, 2005.
Assunto: DETERMINAÇÂO DO RESÍDUO SECO DE EXTRATOS VEGETAIS
A determinação do resíduo seco visa estabelecer um título para tinturas e extratos fluidos, buscando padronizar a concentração de seus princípio a serem incorporados em determinada formulação.
É uma análise muito usada em tinturas-mães (homeopatia), sendo que diversas destas têm a especificaçãoo definida pela farmacopéia Homeopática.
PARTE PRÁTICA
Procedimento: Pese uma cápsula de porcelana, previamente dessecada, tarada e resfriada (p). Acrescente um volume (v) conhecido de tintura (ex.: 10 ml). Desseque em estufa a 100 – 105C até evaporar totalmente a TM. Resfrie a cápsula em dessecador e pese o resíduo (P). Calcule o resíduo seco (r.s).da tintura.
r. s. = (P – p) x 100 / V
Assunto: ANÁLISE MACRO E MICROSCÓPICA DE FOLHAS
CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS:
1. Aspecto geral:
inteiras, amarrotadas, fragmentadas, pulverizadas.
2. Consistência:
dura, mole, flexível, friável.
F. Bras.: coriácea membranácea papirácea
carnosa ou suculenta 3. Forma:
Lâmina foliar: tipo de: ápice: emarginado, acuminado, agudo, obtuso, mucronado, truncado.
base: atenuada, arredondada, reentrante, amplexicaule,
cuneata, decurrente, assimétrica, simétrica.
contorno foliar: lanceolada, oval,elíptica, orbicular, cordiforme, falsiforme, reniforme, romboidal, linear, oblonga, subulada, orbicular-peltada, oboval, acicular.
margem (borda): inteira (lisa), sinuada, crenada, denteada, serrilhada, mucronato-serrata, revoluta.
nervação: uninérvia, peninérvia, palmatinérvia, curvinérvia, paralelinérvia, mista.
Pecíolo: ausente ou presente e:
aspecto geral: achatado, torcido, curvo, reto.
inserção: central, lateral.
secção tranversal: circular, obtuso -triangular, obtuso- quadrangular, côncavo-convexo, ovalado.
4. Superfície: Limbo: ao tato: lisa , áspera, sedosa.
visão: glabra, pubescente, rugosa, ondulada, luzidia, verrucosa.
Pecíolo: estriada, rugosa, verrucosa, pilosa.
5. Tamanho:
6. Transparência: presença de pontos translúcidos.
7. Cor:
8. Odor:
9. Sabor:
OBS: Exemplos de drogas constituídas de folhas: abacate, beladona, boldo, chapéu-de-couro, digitalis, estramônio, eucalipto, guaco, hamamélis, jaborandi, malva, maracujá, meimendro, sene, entre outras.
CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS:
A análise microscópica de matérias-primas vegetais permite fazer o julgamento sobre a droga em questão, verificando a sua identidade ou reconhecendo a presença de possíveis fraudes ou contaminações, em curto espaço de tempo e com preço reduzido.
Para o estudo da anatomia e histologia vegetal é necessário a elaboração de cortes no material a ser estudado, que podem ser obtidos à mão livre ou com o auxílio de micrótomos. No preparo de cortes à mão livre é necessário o uso de suportes (rolha de cortiça ou isopor), no interior dos quais se incluem as peças a serem cortadas. Os cortes são obtidos por meio de giletes ou navalhas. Com o auxílio de um pincel, leva-se o corte para um recipiente contendo água e após a obtenção de diversos cortes, escolhem-se os melhores (mais finos). Efetua-se, então, o clareamento do material vegetal com o auxílio de solução de cloral hidratado a 60% ou com solução de hipoclorito de sódio. Após a completa descoloração, lava-se o material em água destilada. Os cortes podem ser observados sem ou com coloração por corantes adequados. Os cortes são montados sobre lâminas e lamínulas e são observados em aumento de até 40x.
OBS.: Análise microscópica de folhas:
. cortes paradérmicos: epiderme e anexos, como tricomas e estômatos.
. cortes transversais: tecidos : epidermes superior e inferior, parenquimático e vascular, hipoderme.
inclusões de oxalato de cálcio, carbonato de cálcio, grãos de amido, gotículas de óleo, etc.
. obs : o tecido parenquimático e vascular localizam-se na região do mesofilo, que por sua vez pode ser homogêneo ou heterogêneo, este último, pode ser parênquima paliçadico ou lacunoso, simétrico ou assimétrico.
. onde executar estes cortes?
. A observação destas características, associadas às características macroscópicas, são de extrema importância na identificação e diagnose de drogas vegetais.
PRÁTICA:
1) Analisar algumas drogas constituídas de folhas, quanto às características macroscópicas.
Anote o resultado no quadro em anexo.
2) Executar cortes à mão livre em drogas constituídas por folhas, prepará-los adequadamente e observar ao microscópio. Desenhe as estruturas visualizadas e compare com uma droga padrão ou com dados de literatura especializada neste assunto.
Obs.: Será feito a coloração dos cortes com Azul de Alcian (azul de astra) / safranina
Dupla Coloração – azul de alcian (1%)/ safranina (1%) 9:1, realizada segundo o protocolo:
Fazer cortes à mão livre de materiais frescos e colocá-los em fixador FPA 70%
(formaldeído, ácido propiônico e etanol 70%, 1:1:18 v/v).
Clarificar os cortes com hipoclorito de sódio 50%.
Lavar com água destilada (3 vezes,1 minuto cada).
Passar em ácido acético 5%.
Lavar com água destilada (1x).
Corar com azul de Alcian / safranina, 9:1(v/v), durante 10 segundos.
Lavar os cortes com água destilada (1 minuto).
Montar entre lâmina e lamínula em glicerina 50%.
Assunto : REAÇÕES DE HISTOQUÍMICA
Nos vegetais clorofilados, a membrana vegetal é dupla (citoplasmática e celulósica). A membrana secundária (parede celulósica) surge em determinadas células, após atingirem seu crescimento máximo. Pode ser de natureza lignificada, suberificada, cutinizada, cerificada, hemicelulósica e silificada.
As inclusões celulares orgânicas e inorgânicas também são importantes na diagnose das drogas vegetais: pesquisa-se amido, aleurona, inulina, gotículas de óleo, sílica, cristais de oxalato de cálcio, carbonato de cálcio,entre outros.
Estas características podem ser evidenciadas laboratorialmente, em reações de histoquímicas, com o objetivo de identificação de drogas vegetais.
PRINCIPAIS REATIVOS PARA REAÇÕES DE HISTOQUÍMICA : 1. Hematoxilina de Delafield
cora celulose = roxo ou azul 2. Solução de cloreto férrico a 2%:
evidencia taninos = verde, azul ou coloração negra 3. Sudan III :
cora parede suberificada, cutícula, óleo fixo, óleo essencial, resinas (lipídios) = amarelo - alaranjado ou vermelho-alaranjado
4. Solução de iodo (lugol):
cora celulose ( H2SO4 ou H3PO4) = azul grãos de amido = azul
aleurona = amarelo-claro 5. Azul de metileno a 1%:
evidencia células mucilaginosas = azul (intumescimento) 6. Reativo de Steinmetz:
coloração diferencial: celulose = incolor lignina = amarelo-dourado amido = azul cutina , suberina, material lipofílico = vermelho tanino = azul,negra
7. Azul de Alcian (azul de astra) / safranina
tecido não lignificado= azul tecido lignificado = vermelho 8. Reativo de Etzold
tecido não lignificado= azul tecido lignificado = vermelho
PARTE PRÁTICA
1) Execute cortes histológicos de drogas vegetais. Core pela hematoxilina (3 min), FeCl3, Sudam e lugol, lave com água e monte em lâmina / lamínula. Observe as estruturas e esquematize-as.
OBS.: Reagente de Steinmetz, (Costa, 2001)
Cloral hidratado...40,00 g Alumen de ferro...3,00 g Sulfato de anilina...1,00 g Iodo...0,45 g Sudam III...0,10 g Etanol 96°GL...30,00 ml Água destilada...30,00 ml Glicerina...25,00 ml
Assunto:MICROSCOPIA DE PÓS
Procedimento: colocar uma pequena quantidade de material pulverizado numa lâmina, adicione 1 gota de reagente de Steinmetz, cobrir com lamínula e observar ao microscópio. Identificar as estruturas visualizadas.
Exercício:
Suspeita-se que uma partida de folhas secas e moídas de Digitalis purpurea esteja misturada com folhas da Digitalis lanata. Sabe-se que folhas frescas de D. purpurea possuem odor fraco, enquanto as folhas de D. lanata são inodoras. As características microscópicas das Digitalis, designadas por I e II são:
Espécie I
Raros pêlos tectores
Mesófilo com 3 ou 4 camadas de células paliçádicas com parênquima lacunoso denso, com até 12 camadas de células
Espécie II
Pêlos tectores e glandulares
Mesófilo com fileira de células paliçádicas
Tecido esponjoso com 3 a 4 fileiras de células arredondadas e cilíndricas Obs.: Digitalis purpurea : fonte de digitoxina
Digitalis lanata.: fonte de digoxina
Com as informações acima:
a) correlacione as espécies I e II à Digitalis purpurea e a Digitalis lanata, justificando tal correlação por meio de suas características morfológicas.
b) Explique de que forma se identifica a mistura de pó de folhas de Digitalis purpurea e Digitalis lanata
Assunto: PESQUISA DE MATERIAL ESTRANHO
A pureza da droga pode ser modificada em função de contaminação ou fraude ou adulteração. A contaminação ocorre acidentalmente durante as etapas de coleta do vegetal, preparo, conservação ou armazenamento. A fraude ou adulteração tem caráter intencional. Há também a sofisticação, que conta da adição de princípio ativo sintético a uma droga natural.
Material estranho (sujidades) incluem:
a)Partes do organismo ou organismos dos quais a droga deriva, excetuando aqueles incluídos na definição e descrição da droga, acima do limite de tolerância especificado na monografia.
b) Quaisquer organismos, porções ou produtos de organismos além daqueles especificados na definição e descrição da droga.
c) Impurezas de natureza mineral ou orgânica, não inerentes à droga.
Em outras palavras, as drogas vegetais devem estar isentas de mofos, insetos e outras contaminações. Estes contaminantes podem ser de diversas origens, a saber:
* órgão diferente do mesmo vegetal (limite de tolerância é de 10-15 %), desde que não contenha substâncias tóxicas;
* órgão de outro vegetal;
* outros materiais orgânicos ( amido, açúcar, serragem);
* material inorgânico ( areia, pedra, terra, gesso, sílica);
* parasitas ( carunchos): tolera-se de 1 - 2%, desde que não influencie consideravelmente na qualidade da droga);
* mofos ( 1 a 2 %, se inócuos);
* insetos e roedores.
Além disso, devem apresentar aspecto, odor e cor dentro de padrões normais.
Tomada para ensaio (Farm. Bras. IV):
____________________________________________________________
Raízes, rizomas, cascas, planta inteira e partes aéreas 500 g Folhas, inflorescências, sementes e frutos 250 g Matéria particulados ou fracionados (peso médio inferior a 0,5g ) 50 g Pós 25 g ______________________________________________________________
PARTE PRÁTICA:
Analisar diversos pós de drogas vegetais, com o auxílio de lupas e pesquisar a presença de material estranho. Anotar e discutir os resultados encontrados.
Pesquisa de amido:
1. Microscopia:
Monte entre lâmina e lamínula, grãos de diversas origens (batata, trigo, arroz, milho, mandioca) e observe ao microscópio a forma e outras características de identificação do amido examinado ( hilo, lamelas).
2 . Caracterização:
Prepare uma solução de amido a 1% (0,5g de amido em 50ml de água); após esfriar, transfira 10ml da goma de amido para um tubo de ensaio e adicione duas gotas de solução de iodo (lugol). Observe a coloração desenvolvida.
Assunto: MICROSSUBLIMAÇÃO
Microssublimação é um método usado para a verificação da presença de constituintes de drogas que têm a propriedade de se vaporizarem quando submetidos à ação do calor, condensando-se posteriormente, em seu estado sólido. A substância condensada pode ser identificada por meio de métodos físicos e químicos.
Algumas drogas vegetais são portadoras de princípios sublimáveis, como:
. café, guaraná, cola, cacau metil xantinas : reação de murexida = coloração vermelha
. sene, ruibarbo, cáscara sagrada, áloe heterosídeos antraquinônicos : tratados por base = coloração vermelha.
. hidraste, beladona, papoula, etc alcalóides sólidos: reativos gerais -ex: Mayer, Dragendorff = precipitação.
. uva ursi heterosídeos fenólicos : HCl / AgNO3 = ppt negro ; floroglucinol / (OH-) = coloração alaranjada.
PARTE PRÁTICA:
Procedimento: colocar uma lâmina sobre um tripé munido de tela de amianto. Sobre a lâmina, coloca-se um anel de vidro, cobre ou “tampinha de garrafa” e dentro deste, acrescente uma pequena quantidade da droga a ser analisada, em pó. Cubra este objeto com outra lâmina de vidro. Aquecer o material de forma moderada e aguardar a vaporização dos componentes da droga. Trocar as lâminas de 1 em 1 minuto, aproximadamente, até totalizar um conjunto de 6 lâminas. A presença de cristais sublimados é constatada pelo exame microscópico ou por meio de reações de microquímica.
Assunto: DETERMINAÇÃO DE ÁGUA (UMIDADE) EM DROGAS VEGETAIS
A presença de quantidade excessiva de água em drogas vegetais propicia o desenvolvimento de microrganismos, insetos, hidrólise e atividade enzimática com consequente deterioração dos constituintes da droga. Sendo assim, torna-se necessário o estabelecimento de limites de umidade para drogas vegetais, em geral, na faixa de 8 a 14%.
TEOR DE UMIDADE EM ÓRGÃOS VEGETAIS:
Órgão vegetal Umidade no órgão fresco (%) Umidade permitida na droga (%)
CASCA 50 a 55 8 a 14
ERVA 50 a 90 12 a 15
FOLHA 60 a 98 8 a 14
FLOR 60 a 95 8 a 15
FRUTO 15 a 95 8 a 15
RAIZ 50 a 85 8 a 14
RIZOMA 50 a 85 12 a 16
SEMENTE 10 a 15 12 a 13
TEOR DE UMIDADE X CONSERVAÇÃO DAS DROGAS:
Agentes deletérios às drogas vegetais % de umidade
BACTÉRIAS 40 a 45
ENZIMAS 20 a 25
FUNGOS 15 a 20
Dos métodos empregados, o gravimétrico (dessecação) é tecnicamente mais simples e rápido. A droga deve ser reduzida a pó de no máximo 3mm de espessura.
* Procedimento:Transferir cerca de 2 a 5g, ou o especificado na monografia, exatamente pesados, de amostra para pesa-filtro tarado, previamente dessecado a 100-105 C / 30min. Dessecar a amostra em estufa a 100-105 C durante 5 horas antes da primeira pesagem. Resfrie em dessecador e pese. Continue a dessecação, pesando o material em intervalos de 1 hora. O ensaio é dado por concluido quando duas pesagens sucessivas não diferirem entre si por mais de 5mg. Calcular a porcentagem de água em relação à droga seca ao ar.
% umidade = Pu – Ps / Pu x 100
Assunto: DETERMINAÇÃO DE CINZAS TOTAIS E INSOLÚVEIS EM ÁCIDO
1. Determinação do teor de cinzas :
A determinação de cinzas totais destina-se a estabelecer a quantidade de substância residual não volátil no processo de incineração especificado. As cinzas totais incluem as derivadas de tecido vegetal (cinzas fisiológicas) e de materiais estranhos, especialmente areia e terra.
Procedimento:
Pese exatamente cerca de 3g - ou a quantidade especificada na monografia - da droga pulverizada, transferir para cadinho previamente calcinado, resfriado e pesado. Distribua a droga de maneira uniforme, incinere-a aumentando gradativamente a temperatura, não ultrapassando 450 C, até que o carvão seja eliminado. Resfrie em dessecador e pese. Calcular a porcentagem de cinzas em relação à droga seca ao ar.
2. Determinação de cinzas insolúveis em ácido:
Cinzas insolúveis em ácido compreendem o resíduo obtido na fervura de cinzas totais, após filtragem, lavagem e incineração. O método destina-se à determinação de sílica e constituintes silicosos da droga.
Procedimento:
Ferva o resíduo obtido na determinação de cinzas totais durante 5 minutos com 25ml de HCl SR em cadinho coberto com vidro de relógio. Lavar o vidro de relógio com 5ml de água quente, juntando-a ao cadinho. Recolher o resíduo insolúvel em ácido sobre papel de filtro isento de cinza, lavando com água quente até que o filtrado se torne neutro. Transfira o papel de filtro contendo o resíduo para o cadinho original, secar sobre chapa quente e incinerar a cerca de 500 C até peso constante.
Calcular a porcentagem de cinzas insolúveis em ácido em relação à droga seca ao ar.
Assunto: CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA - PLANTAS MEDICINAIS
A cromatografia de camada delgada (CCD) consiste na separação dos componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana.
É uma técnica praticamente indispensável em qualquer laboratório que envolva análise de substâncias orgânicas e apresenta vantagens como: fácil execução, separações em curto espaço de tempo, versatilidade, grande reprodutibilidade e baixo custo.
Existem no mercado grande número de adsorventes para fins cromatográficos; entre os mais utilizados em CCD estão a sílica, alumina, poliamida, celulose.
A sílica (SiO2) é o mais usado, é altamente porosa e apresenta caráter fracamente ácido e em geral é empregada na separação de compostos lipofílicos como aldeídos, cetonas, fenóis, ácidos graxos, aminoácidos, alcalóides, terpenóides e esteróides, usando o mecanismo de adsorção.
A escolha do solvente, eluente ou fase móvel é de fundamental importância na separação da mistura. Como regra geral: quanto mais polar a substância, maior a polaridade do eluente. A pureza dos solventes também é fator essencial a ser observado.
Há uma tabela (série eluotrópica dos solventes), que os ordena segundo suas polaridades . Ex.:
Fase Móvel polaridade n-hexano 0,01 ciclohexano 0,04
CCl4 0,18
Tolueno 0,29
Benzeno 0,32
CHCl3 0,40
Diclorometano 0,42 Trietilamina 0,54
Acetona 0,56
Acetato de etila 0,58 Acetato de metila 0,60 Acetonitrila 0,65
Propanol 0,82
Etanol 0,88
Metanol 0,95
Ácido acético -
Água -
As amostras (10 l) as serem aplicadas (micropipetas) devem estar na forma de soluções, em solventes bastante voláteis, em geral, preparadas na concentração de 0,1-1%. Devem ser aplicadas numa distância de 1,5 a 2 cm do bordo inferior das placas e numa distância de cerca de 1cm entre cada gota. O desenvolvimento ascendente do cromatograma é o mais utilizado, sendo as placas colocadas na posição vertical e tão logo a FM atinja a parte superior das placas, estas são retiradas (não esquecer de marcar a distância percorrida pela FM), secas e reveladas ( métodos físicos, químicos e biológicos) e finalmente , os resultados devem ser documentados ( desenho, cópia, fotografia). A escolha do revelador depende do natureza química tipo de princípio ativo presente. Na análise qualitativa, a determinação do Rf (fator de retenção) pode auxiliar na identificação de uma substância por comparação com padrões. Rf = d percorrida pela amostra / d percorrida pela FM.
Desenvolver as cromatoplacas em cuba saturada. Aplicar as soluções das amostras de forma circulares ou bandas de 1 cm de largura sobre a placa. Deixar evaporar o solvente, marcar a distância de 10 a 15 cm a partir do ponto de aplicação das amostras e introduzir a cromatoplaca na cuba, colocando-a na posição mais próxima da vertical. Os pontos de aplicação devem ficar acima do nível do eluente. Fechar a cuba e deixar desenvolver o cromatograma até que o eluente atinja o limite marcado. Remover a cromatoplaca, deixar secar e visualizar conforme monografia.
PARTE PRÁTICA:
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DAS PRINCIPAIS ASTERACEAS
Esta análise visa a comparação cromatográfica de amostras de Arnica montana, Matricaria chamomilla e Calendula officinalis .
PROCEDIMENTO:
Pesar diretamente em frascos Erlemeyers 1g das amostras de Arnica montana, Matricaria chamomilla e Calendula officinalis pulverizadas. Adicionar em cada um dos erlemeyers 10ml de metanol. Aquecer em chapa aquecedora por aproximadamente 5 minutos à 600C. Deixar esfriar e filtrar. Aplicar 30l de cada uma dessas tinturas e 10l de um mistura padrão de rutina, ácido clorogênico, hiperosídeo, isoquercitrina e ácido cafêico. Colocar a placa em cuba de vidro desenvolvendo-a com o seguinte sistema de solventes: Acetato de Etila/Ácido fórmico/Ácido Acético/Água (100:11:11:27 ). Revelar a placa com NP (difenilborato de aminoetanol - NST- 1%
em etanol. Observar sob luz UV a 365 nm.
O
O
OH
OH
OR OH
HO
R= galactose - hiperosídeo R= glucose-rhamnose - rutina
R= glucose - isoquercitrina
Ac.Clorogênico HO
HO CH CH C O
O COOH
OH OH HO
Ácido Cafêico Ácido Quínico
CROMATOGRAFIA EM COLUNA
A cromatografia em coluna (CC) consiste na separação dos componentes de uma mistura por meio da migração diferencial dos mesmos através de uma coluna de fase estacionária (adsorvente) disposta em um tubo cilíndrico. Esta migração diferencial resulta da distribuição dos componentes da mistura entre a fase estacionária e a fase móvel líquida (eluente) que flui uniformemente através da coluna.
De uma maneira geral, a coluna cromatográfica é constituída por um tubo de vidro, em posição vertical. A extremidade superior é aberta e a inferior é afilada terminando em uma torneira. As dimensões da coluna dependerão da quantidade de material a ser analisado.
Se a quantidade de material for pequena, uma simples bureta pode ser usada para empacotar a coluna.
Abaixo da torneira colocam-se os recipientes ou frascos coletores do eluente, cujas dimensões dependem do volume de cada fração a ser coletada. Para preparar a coluna, coloca- se um chumaço de algodão na coluna logo acima da torneira, em seguida adiciona-se o adsorvente já em mistura com o eluente a ser usado incialmente. Os adsorventes mais usados são a sílica (SiO2) e alumina (Al2O3)
Separação dos Componentes do Extrato fluido de Curcuma longa L.
Colocar um chumaço de algodão ou lã de vidro) na parte inferior de uma bureta com auxílio de uma haste de metal. Umedecer com a fase móvel. Preparar uma suspensão de 4 g de sílica em hexano. Verter a suspensão, com ajuda de um funil, na bureta. Abrir a torneira para deixar o líquido escoar parcialmente e ao mesmo tempo formar a coluna de fase estacionária. Deixar em repouso por um certo tempo.
Utilizar o ext. flu. Preparado na aula anterior. Aplicar na coluna já empacotada com sílica: abrir a torneira até que o eluente atinja o topo da fase estacionária. Com uma pipeta ou conta-gotas, transferir cuidadosamente uma porção do extrato de C. longa L. (ca. 1,0 mL) para o topo da coluna. Abrir a torneira até a solução atingir o nível da fase estacionária.
Iniciar a eluição com hexano. Mudar a fase móvel para uma mistura de hexano:acetona (8:2) – cerca de 10 mL. Após isto, eluir com uma mistura de hexano:acetona (7:3) – cerca de 10 mL e finalmente com uma mistura de hexano:acetona (1:1) – cerca de 10 mL. Se necessário, eluir com acetona – cerca de 10 mL.
Assunto: IDENTIFICAÇÃO DE GOMAS
As gomas são consideradas produtos patológicos resultantes da ação física sofrida pelo tecido vegetal (feridas, picadas de insetos, contusões). Podem ser extraídas por incisões realizadas na planta, de onde exsudam sob a forma de geléia, que rapidamente solidificam em contato com o ar.
As principais gomas de interesse farmacêutico são: goma arábica (exsudatos de Acacia senegal, A. seyal, A. arabica - Leguminosae), goma adragante ou alcatira (Astragalus gummifer, A. microcephalus - Leguminosae) goma caraia ou indiana ( Sterculia urens Rox - Sterculiaceae).
PARTE PRÁTICA
1. Caracteres Organolépticos
Observar a cor e odor da goma 2. Análise microscópica
Colocar uma pequena quantidade de pó em uma lâmina adicionar uma gota de água ou lugol, cobrir com lamínula e observar ao microscópio.
3. Solubilidade em água
Observar o aspecto da goma ao ser misturada com água: líquida, viscosa ou gelatinosa.
4. Pesquisa de Amido
Preparo da dispersão de Goma a 1%: colocar 0,30 g de goma em pó em um gral de porcelana, triturar e adicionar gradativamente 30 ml de água destilada, triturando sempre até obter goma homogênea.
Transferir 5 ml da dispersão de goma para um tubo de ensaio e adicionar uma a duas gotas de lugol. Homogeneizar.
Teste positivo: Coloração azul.
5. Pesquisa de Lignina
Transferir 5 ml da dispersão de goma para um tubo de ensaio. Adicionar 2 ml de HCl conc., aquecer em banho maria por 5 minutos.
Teste positivo: coloração rósea.
6. Reação com NaOH
Transferir 5 ml da dispersão de goma para um tubo ensaio. Adicionar 2 ml de NaOH a 15%.
Aquecer em banho-maria por 5 minutos.
Teste positivo: coloração amarelo-canário.
7. Pesquisa de adulteração por taninos
Transferir 5 ml da dispersão de goma para um tubo de ensaio. Adicionar 2 a 4 gotas de solução de FeCl3 a 9%. Não deve escurecer.
Assunto: DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE INTUMESCÊNCIA
Índice de intumescência é a medida do volume ocupado pelo inchamento de 1g da droga, pela adição de água ou outro agente intumescente, sob condições definidas.
Conduzir, simultaneamente, no mínimo três determinações.
Procedimento:
Pesar exatamente 1 g da droga vegetal pulverizada e colocar numa proveta de 25 mL (125 mm comprimento x 16 mm diâmetro interno) com tampa esmerilhada.
Medir o volume ocupado pela planta seca (Vi)
Adicionar 25 mL de água, ou outro agente definido e agitar a cada 10 min, por 1 hora.
Deixar a mistura em repouso por 3 horas, à temperatura ambiente.
Medir o volume (mL) ocupado pelo material vegetal acrescido da mucilagem = Vf (ou qualquer material aderido).
Calcular o valor médio obtido a partir das várias determinações realizadas (triplicata), utilizando a fórmula:
I I = V F – V I , onde V F = volume final da droga V I = volume inicial
Obs.: Para Fucus vesiculosus não deve ser inferior a 6 (European Pharmacopoea, S2001)
ASSUNTO: PESQUISA DE HETEROSÍDEOS ANTRAQUINÔNICOS
A antraquinona, dicetona do antraceno, é o núcleo fundamental da estrutura química de muitas substâncias fenólicas, que se encontram nos diversos órgãos de uma grande variedade de plantas.
De um modo geral, os heterosídeos antraquinônicos são solúveis em água. Entretanto, dependendo da forma em que se encontram, podem apresentar a seguinte solubilidade:
SOLVENTE HETEROSÌDEO AGLICONA
Água Solúvel Insolúvel
Álcool diluido, á quente Solúvel Solúvel
Amônia SR - Solúvel
O reconhecimento desses heterosídeos pode ser feito através da reação de BORNTRAEGER, que consiste na formação de fenatos de amônia, de coloração rósea, após a extração das agliconas livres e das libertadas por hidrólise ácida. Nesta reação, a cor desenvolvida, no máximo dentro de 5 minutos, é devido as formas antraquinônicas (dicetona). A coloração se intensifica progressivamente, por oxidação das formas reduzidas – antrona e antranol – em antraquinona.
PARTE PRÁTICA
EXTRAÇÃO: Ferver 1g de droga portadora de heterosídeos antraquinônicos, grosseiramente pulverizada, com 30 ml de álcool a 75% v/v, durante 3 minutos. Filtrar o líquido obtido, ainda quente.
CARACTERIZAÇÃO: Transferir 10 ml do filtrado para béquer de 40 ml (I) e 10 ml para outro béquer (II). Acidifique o conteúdo do béquer I com 0,5 ml de HCl SR e ferva por 2 min. Faça o mesmo com o béquer II, porém não adicione ácido.
Transferir os líquidos para tubos de ensaio e após resfriar, adicione a cada um, 10 ml de hexano. Agite levemente e então, separe 5 ml dos tubos de ensaio I e II. Em ambos, adicione 4 ml de amônia SR e deixe a reação em repouso, durante 5 min. A camada amoniacal tomará uma coloração rósea, conforme a quantidade de princípio ativo (agliconas libertadas das cadeias glicídicas).
Anote os resultados e discuta-os.
Assunto: PESQUISA DE HETEROSÍDEOS CIANOGENÉTICOS
Os heterosídeos cianogenéticos são constituídos de uma cianidrina em combinação com um aldeído ou com uma cetona (aglicona) e, por uma parte glicídica ligada por ligação acetálica (O- glicosídeos) nos substituintes do aldeido ou da cetona.
Um heterosídeo cianogenético quando hidrolisado (enzimaticamente) dá origem a um aldeído (mais frequentemnete benzaldeído) ou uma cetona, ao açúcar e ao HCN.
O HCN é volátil e se perde quando o vegetal que o contem é submetido ao calor.
A maior importância dos heterosídoes cianogenéticos é quanto à toxicologia, visto que plantas portadoras dos mesmos podem causar sérios acidentes quando ingeridas na forma natural (cruas).
PARTE PRÁTICA
Pesquisar a presença de HCN, através de reações químicas, nas plantas portadoras de heterosídeos cianogenéticos (folhas de mandioca e de sabugueiro)
Pesquisa de HCN em Plantas Pela Técnica de Guignard
Triturar cerca de 10-15 g de vegetal fresco num gral com auxílio de um pistilo e transferir para um Erlenmeyer com boca esmerilhada. Adaptar o papel reativo de Guignard na boca do Erlenmeyer, prendendo-o com a tampa, de modo que a tira não encoste nas paredes internas do frasco e nem no material triturado. Dar um ligeiro aquecimento. Aguardar o resultado até o final da aula.
Papel reativo de Guignard: impregna-se tiras de papel de filtro com uma solução de ácido pícrico, seca-se. Embeber com uma solução de carbonato de sódio a 10%, secar.
POSITIVO: o papel passará de amarelo para alaranjado e finalmente avermelhado.
Assunto: PESQUISA DE HETEROSÍDEOS FLAVONÓIDES
Os flavonóides são compostos naturais que possuem como núcleo fundamental o BENZOPIRANO ou CROMANO.
Os heterosídeos flavonóides têm agliconas derivadas dos seguintes núcleos: chalconas e diidrochalconas, flavonas e flavanonas, isoflavonas e isoflavanonas, flavonol, auronas e mais recentemente os neoflavonoides.
A pesquisa e identificação dos compostos flavonóides baseia-se em reações características do núcleo fundamental benzopirano e em reações características de hidroxilas fenólicas.
EXTRAÇÃO
Ferva, por 5 minutos, 7 g da droga em pó em 60 ml de etanol a 70%. Filtre por papel de filtro, previamente umedecido com etanol 70%. Reserve para as reações.
CARACTERIZAÇÂO:
REAÇÕES RELACIONADAS COM O NÚCLEO FUNDAMENTAL 1. Reação da Cianidina ou Reação de Shinoda
Esta reação baseia-se na redução dos derivados flavônicos, de cor amarela, em antociânicos, vermelhos. As chalconas e isoflavonas não determinam o aparecimento de cor.
Transfira cerca de 3 ml do filtrado para um tubo de ensaio. Adicione cerca de 1 cm de fita de magnésio finamente cortada. Junte cerca de 1 ml de HCl conc. (com muito cuidado, se necessário resfrie com água). Observe a cor e anote .
1. Reação Oxalo-Bórica
Esta reação é exclusiva dos flavonóis. Os outros compostos (flavonas, flavanonas e isoflavonas) podem corar-se, mas não apresentam fluorescência.
Evapore em cápsula de porcelana 5 ml da solução extrativa. Junte ao resíduo semi-seco 3 ml de solução de ácido bórico a 3% e 1 ml de solução de ácido oxálico a 10%. Evapore até secura.
Junte ao resíduo seco, 7 ml de éter etílico. Observe sob luz ultravioleta. (Fluorescência amarelado- esverdeada).
3. Reação com H2SO4 concentrado.
Esta reação se baseia na formação de sais de oxônio, e suas soluções apresentam fluorescência variável conforme a posição do íon oxônio na molécula.
Adicione cerca de 3 ml de solução extrativa numa cápsula de porcelana. Evapore até semi- secura. Adicione 0,5 ml de H2SO4 concentrado e observe sob luz ultravioleta. Anote a fluorescência desenvolvida.
REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO DE HIDROXILAS FENÓLICAS
1. Reação com os Hidróxidos Alcalinos
Transfira 3 ml da solução extrativa para um tubo de ensaio. Adicione cerca de 1 ml de NaOH 20%. Agite o tubo. Observe a cor desenvolvida. Anote.
Em meio alcalino, alguns grupos de flavonóides apresentam cor amarela. A presença de chalconas pode dar cor vermelha-amarelada.
2. Reação com o Cloreto de Alumínio
Transfira cerca de 5 ml de solução extrativa para um béquer ou cápsula de porcelana.
Concentre até mais ou menos a metade. Transfira esta solução concentrada para um pedaço de papel de filtro espalhando sobre toda a superfície do mesmo. A seguir, umedeça uma das regiões do papel com solução de cloreto de alumínio à 5% e observe a fluorescência sob luz ultravioleta.
Os compostos flavonóides, em presença do cloreto de alumínio, possuem fluorescência amarela intensa quando observadas sob luz UV.
3. Reação com Cloreto Férrico
Transfira cerca de 3 ml da solução extrativa para um tubo de ensaio. Junte 2 gotas de cloreto férrico a 4,5%. Forma-se cor variável (verde, amarela, castanha, violeta); observe a cor e anote.
Assunto:
ANÁLISE QUANTITATIVA DOS FLAVONÓIDES DA CATUABA (Trichilia catingua A. Juss.)
Pesar 0,5g da amostra (pó da casca) e transferir para um balão esmerilhado de 250 mL.
Adicionar 100 mL de uma mistura de metanol:ácido acético 0,02M (99:1), aquecer em banho-maria sob refluxo a 90-100ºC por 40 minutos e filtrar. Resfriar e ler a absorbância em 361 nm.O branco deve ser preparado com a mistura de metanol:ácido acético 0,02M.
Construção da curva de calibração:
Pesar 5 mg de rutina e transferir para um balão volumétrico de 50 mL, completando-se o volume com metanol: ácido acético 0,02M.
Pipetar alíquotas de 200, 400, 600, 800 e 1000 µl e transferir para tubos de ensaio.
Homogeneizar e fazer a leitura a 361nm. Construir a curva de calibração padrão (Absorbância x Concentração).
Calcular o teor de flavonóides pela equação
% flavonóides = x (mg) . 100 . 10
-3. 10
2__________________
m (g)
Em que: 100: fator de diluição da amostra
ASSUNTO: PESQUISA DE HETEROSÍDEOS DIGITÁLICOS
Os heterosídeos digitálicos ou cardiotônicos possuem na sua estrutura química o núcleo fundamental do ciclopentanoperhidrofenantreno, apresentando na posição C17 uma lactona em pentanel (cardenólidos) ou hexanel (bufadienólidos).
Para a caracterização laboratorial destes princípios bioativos, empregam-se reações que evidenciam isoladamente partes das moléculas dos heterosídeos, como por exemplo, reações de caracterização do núcleo esteróide (Liebermann-Burchard, Pesez); reações relacionadas com o anel lactônico pentacíclico (Kedde, Baljet, Raymond, Legall); reações relacionadas com os desoxiaçúcares (Keller-Kiliani, Xantidrol).
PARTE PRÁTICA EXTRAÇÃO:
Ferver durante 4 min., 2,5 g da droga em pó (Digitalis) com 25 ml de álcool a 50% e 10 ml de solução de acetato de chumbo a 10%. Resfrie, filtrarcomplete o volume para 25 ml e filtre a solução hidroalcoólica. Adicione ao filtrado, 15 ml de clorofórmio (de 2 vezes), com agitação após a adição do solvente orgânico. Separe a fase clorofórmica.
CARACTERIZAÇÃO:
A-REAÇÃO DE LIEBERMANN-BURCHARD: esta reação se deve a desidratação ou desidrogenação do núcleo esteróide.
Procedimento: Transfira 3 ml da solução clorofórmica para um tubo de ensaio e evapore até secura.
Junte ao resíduo 1 ml de clorofórmio, 5 gotas de anidrido acético PA e 1 gota de ácido sulfúrico conecntrado PA ( reativo de Liebermann-Burchard - 50:1, anidrido acético R:H2SO4 P.A).
Homogeneíze e deixe em repouso por 5 min. Observe a coloração desenvolvida : “positiva” : castanho dedaleira; verde cila e estrofanto .
B-REAÇÃO DE PESEZ:
Procedimento: Transfira 3 ml da solução clorofórmica para uma cápsula de porcelana e evapore até secura em chapa aquecedora. Adicione ao resíduo, após esfriar, 3 a 6 gotas de H3PO4 P.A. Misture com o auxílio de um bastão e observe sob luz UV: “positiva” : fluorescência verde-amarelada.
C-REAÇÃO DE KELLER-KILIANI: esta reação é específica para desoxiaçúcares presentes na extremidade da parte glicídica..
Procedimento: Transfira 5 ml da solução clorofórmica para um tubo de ensaio e evapore em banho Maria, até secura. Dissolva o resíduo em 3 ml do seguinte reagente, recém-preparado: 3 ml de ácido acético glacial e 0,1 ml de FeCL2 9%. Homogeneíze e verta esta solução, lentamente, para um tubo de ensaio contendo 2 ml de H2SO4 P.A . Observe a coloração desenvolvida: “positiva”: anel castanho-avermelhado na fase de contato; a camada acética vai adquirindo uma coloração esverdeada.
D- REAÇÂO DE KEDDE: esta reação é específica para as agliconas (anel lactônico)
Procedimento: Evapore à secura, num tubo de ensaio, em banho-Maria, 6 ml da solução clorofórmica. Junte ao resíduo 2 ml de álcool 50%, 2 ml de água dest, 2 ml do reagente ácido 3,5- dinitrobenzóico a 1%, recém-preparado em etanol 96% e 2 ml de KOH 1:10. Após 5 min, observe a coloração desenvolvida: reação positiva: coloração castanho-avermelhada a vermelho-violeta.
Assunto: PESQUISA DE HETEROSÍDEOS SAPONÍNICOS
Heterosídeos saponínicos são substâncias que se dissolvem em água originando soluções afrógenas (espumante), por diminuição da tensão superficial do líquido.
Constituem um grupo heterogêneo, sendo classificado em heterosídeos saponínicos do tipo esteróide e do triterpenóide. São solúveis em solventes polares e insolúveis em solventes apolares.
As principais plantas portadoras de saponinas são a quilaia, alcaçuz, ginseng, polígala, salsaparrilha, etc.
PARTE PRÁTICA
Determinação do Índice de espuma (Afrosimétrico ou Espumígeno): determinado através da maior diluição em que 1g da droga em pó é capaz de formar 1 cm de espuma em determinadas condições.
Procedimento:
Pesar exatamente 1g do material vegetal pulverizado e transferir para erlenmeyer contendo 50 mL de água fervente. Manter sob fervura moderada durante 30 min. Resfriar, filtrar para balão volumétrico de 100 mL. Repetir a extração do mesmo material utilizando porções sucessivas de 10 mL de água fervente até completar o volume de 100 mL.
Distribuir o decocto obtido em 10 tubos de ensaio com tampa (16 cm diâmetro x 16 cm altura), em uma série sucessiva de 1, 2, 3 até 10 mL e ajustar o volume do líquido em cada tubo a 10 mL com água.
Tampar os tubos e agitá-los com movimentos verticais por 15 segundos. Deixar em repouso por 15 min e medir a altura da espuma:
Se a altura da espuma de todos os tubos for inferior a 1 cm, o índice de espuma é menor do que 100.
Se, em qualquer um dos tubos, a altura da espuma medida for 1 cm, a diluição do material vegetal nesse tubo (a) é o índice de espuma observado.
Se a altura da espuma for maior do que 1 cm em todos os tubos, o índice de espuma é maior do que 1000.
IE = 1000 / a ,
Onde:
a = volume (mL) do decocto usado para preparação da diluição no tubo onde a espuma foi observada.
Assunto: PESQUISA DE HETEROSÍDEOS CUMARÍNICOS
Procedimento:
Extrair 2 g da amostra com 30 ml água (a quente). Filtrar. Adicione 1 ml de HCl 1 N (até pH 1).
Transfira para funil de separação e extrair com 10 ml de éter, reduza o volume e goteje sobre papel de filtro. Acrescente 1 gota de NaOH 1N em uma das regiões onde foi aplicado o extrato etéreo e observe na luz UV: reação positiva: fluorescência verde.
