Caracterização de Células melhas por Microscopia de Força Atômica

Centro de Ciênias

Departamento de Físia

Caraterização de Células Vermelhas por

Mirosopia de Força Atmia

Erivelton Façanha da Costa

Dissertação apresentada ao Departamentode Físia

daUniversidade Federal doCeará omo parte

dos requisitos para a obtenção do título de

Mestre em Ciênias

Centro de Ciênias

Departamento de Físia

Caraterização de Células Vermelhas por

Mirosopia de Força Atmia

Erivelton Façanha da Costa

Dissertação apresentada ao Departamento de Físia

daUniversidade Federal doCeará omo parte dos requisitos

para a obtenção dotítulo de Mestre em Ciênias

BANCA EXAMINADORA:

Dr. José Alexander deKing Freire (Orientador, UFC)

Dra. Silvia MariaMeira Magalhães(UFC)

irmãose amigos,

pelodiabo."

AoprofessorDr. José Alexander deKing Freire,peloapoio,orientaçãoe inentivo

à realização deste trabalho.

Àsprofessoras Dra. Silvia MariaMeira MagalhãeseDra. Helena Pitombeira, pela

o-orientação e enorajamento durante esta aventura dafísia em meio à mediina.

Ao professor Valder Nogueira Freire, pelas inspiradoras idéias e valiosas opiniões

sobre este e outros trabalhos.

AoprofessorBenildodeSousaCavada,doDepartamentodeBioquímia,por

disponi-bilizar o BIOMOL-LABpara a preparaçãodas amostras.

À olaboradorano departamento de bioquímia, Raquel, aquem devo a paiênia

e presteza na preparaçãodo sanguepara os experimentos.

AoprofessorDr. GildeAquino Farias,pelaliderançadogrupodepesquisa aoqual

pertenço.

Ao professor Dr. José Soares Andrade Jr., oordenador da pós-graduação do

De-partamentode Físia.

Aos professores do urso de mestrado e graduação, pelavaliosa formação.

Àminhaúniairmãfísia,Luiana,aquemdevoaompanhia,todaagrandeajuda

e as boas gargalhadas durante ashoras ansativas de trabalho.

AosarosamigosdelaboratórioThiagoeMarelo. Aesteúltimo,pelasvaliosíssimas

disussões sobre biologia.

ÀSuelieSolenes, ténios de laboratóriode hematologianoHEMOCE-Centro de

HematologiaeHemoterapia doCeará,pelaatenção eajudanaobtençãodas amostras.

neessário.

AoCNPq, pelosuporte naneiro.

À minha mãe, a quem eu devo a mais profunda gratidão e admiração. Sem o seu

referenial de oragem e luta, ertamente eu teria fraquejado durante as diuldades

destajornada.

Aos meus irmãos, que sempre areditaram em mim e me apoiaram em todos os

Amaneiramais difundidanaobservaçãode élulassanguíneas (hemáias)éaquela

que utiliza mirosopia ótia onvenional. Devido ao limite de resolução dos

instru-mentos ótios, novas ténias de mirosopia oloam-se omo alternativas para o

es-tudo de élulas, taisomo: a mirosopiaeletrnia (de varredura e transmissão) e as

ténias de varredura por sonda. Inlui-se neste último grupo a mirosopia de força

atmia(AFM).

Este trabalho disute as possibilidades de uso da Mirosopia de Força Atmia

( Atomi Fore Mirosopy - AFM) em iênias da vida, para ser mais espeío, na

araterização de eritróitos. Cino experimentos envolvendo hemáias e AFM estão

aqui desritos: difereniação entre os grupos sanguíneos AB+ e O+; análise do perl

da membrana eritroitária de indivíduos sadios e portadores de SMD; preparação de

élulasvermelhasparaanáliseemmirosopiadeforçaatmia;análisevolumétriade

élulas vermelhas; e monitoramento doenvelheimento de um eritróito ao ar usando

o AFM.

No primeiroexperimento, a rugosidade das membranas elulares dos grupos AB+

e O+ mostraram-se diferentes. Já no segundo experimento, depressões foram

enon-tradassobreamembranadepaientesomSMDeindivíduossadios,ontudo,

aparente-mentemaisprofundasnoprimeirogrupo. Otereiroestudotrouxeàtonaaimportânia

dapreparaçãoadequadadoseritróitosparamedidasespeíasemAFM.Aquarta

ex-periêniaomprovouaapaidadeda téniaAFMde forneer informação de volume,

oquetambém foiutilizadonoúltimoexperimentoparamonitoraroenvelheimentode

Theoptialmirosopyisthemostemployedtehniqueusedforvisualizeredbloodells

(RBCs). But, due to its resolution limit, it is neessary to use other omplementary

tehniques to study the ells, suh as: the sanning and transmission eletron

mi-rosopy, andthe sanning probingmirosopy. The Atomi ForeMirosopy (AFM)

is inluded in the lastgroup.

This work refers to the possibilities of using AFM in life siene, fousing on the

erythroytes haraterization. Five experiments involving red blood ells and AFM

were arried out: AB+ and O+ blood types dierentiation; RBCs membrane study

of donors and patients with MDS (Myelodysplasti Syndrome); suitable preparation

of red blood ells for AFM analysis; volume study of erythroytes; and nally aging

proess observation of RBC inair.

The rst experiment determined the ell membrane roughness for AB+ and O+

groups, whih were dierent. For the seond one, depressions were found on the ell

surfaeofbothMSDpatientsandhealthypeople. These"holes"weredeeperintherst

group. The third experiment showed the importane of sample (RBCs) preparation

for eah AFM spei analysis. The fourth experimental proedure showed the AFM

tehnique apability forprovidingvolumeinformation,whih wasalsoused inthe last

1 Introdução 1

1.1 UmaBreve História daMirosopia.. . . 1

1.2 Poder de Resolução de um Mirosópio Ótio. . . 6

1.3 Da Mirosopia Ótia à Mirosopia de Varredura por Sonda. . . 12

1.3.1 O Mirosópio Eletrnio. . . 13

1.3.2 O Mirosópio de CampoInio. . . 15

1.4 OsMirosópios de Varredura porSonda.. . . 16

1.4.1 O Mirosópio de Varredura por Tunelamento. . . 17

1.4.2 O Mirosópio Ótio de Varredura por Campo Próximo. . . 19

1.4.3 O AFM(Atomi Fore Mirosope). . . 23

1.5 O AFMem Biologia. . . 24

1.6 Síntese da Dissertação. . . 28

2 O Mirosópio de Força Atmia - AFM. 31 2.1 O nasimento doAFM. . . 32

2.1.1 Forças em Nanoesala. . . 35

2.2 Aparato experimental. . . 38

2.2.1 O Sanner. . . 38

2.2.2 A Sonda.. . . 40

2.2.3 O Sistemade Realimentação( feedbak). . . 45

2.2.4 Modos de Operação doMirosópio de Força Atmia. . . 48

2.2.5 Preparação de amostraspara varredura em AFM. . . 49

3 Eritróitos sob a "ótia"AFM. 51 3.1 Análise de eritróitos om AFM -Introdução. . . 52

3.2 Difereniação de Grupossanguíneos por meio de análise AFM. . . 53

3.2.1 Materiais emétodos. . . 54

3.2.2 Resultados. . . 57

3.3 Análise topográa da membrana de hemáias via AFM - eritróitos sadios versus SMD. . . 58

3.3.1 Materiais emétodos. . . 58

3.3.2 Resultados. . . 61

3.4.3 Resultados MétodoII - NaCl. . . 67

3.4.4 Resultados MétodoIII -PBS+ALB. . . 68

3.4.5 Resultados MétodoIV - PBS. . . 69

4 Análise volumétria de eritróitos om o AFM. 73 4.1 O VCM - Volume orpusular médio. . . 74

4.2 Determinação do volume de partíulas om oAFM. . . 77

4.3 Materiais e métodos. . . 80

4.3.1 Preparação da Amostra. . . 80

4.3.2 Análise no Mirosópio de Força Atmia. . . 81

4.3.3 Análise quantitativadas imagensAFM.. . . 81

4.3.4 Resultados. . . 82

4.4 Envelheimentode eritróitos ao ar- Introdução. . . 85

4.4.1 Materiais e métodos. . . 86

4.4.2 Resultados. . . 87

5 Conlusões e Perspetivas 91

Referênias 96

Glossário 103

A Tabelas de dados. 107

B Apresentações em Conferênias. 119

C Artigos Publi ados. 121

1.1 Máximoângulo deabertura dalente objetivade um mirosópio ótio. . . . 7

1.2 Formação da imagem através de uma lente num sistema ótio, omo por

ex-emplo um mirosópio ótio. . . 8

1.3 Campoelétrio Einidindo sobreo plano( x,y ,0),propagando- se nadireção z

positivo. . . 9

1.4 Espetro deradiação eletromagnétia. . . 14

1.5 Diagrama esquemátio deum mirosópio eletrnio de varredura. . . 16

1.6 Operação do mirosópio de tunelamento (a)no modo orrente onstante (a

distânia s não muda) e (b)altura onstante ( s varia).. . . 19

1.7 Imagens omresolução atmiado Si(111) obtidas omo STM. (a)Primeira

imagemdasuperfíiedeumaamostradeSi(111)7x7obtidaporBinnige

Ro-her,inventoresdoMirosópiodeVarreduraporTunelamento(STM)(Retirado

de G. Binnigand H.Rohrer, Rev. Mod. Phys. 59, 615 (1987)). (b)Imagem

da mesma superfíie obtida om uma STM moderno (Retirado de Y. Chen,

K. S. Shneider, B. G. Orr, M. M. Banaszak Holl, Phys. Rev. B. 70 85402

(2004)). . . 20

1.8 Foto de uma sonda SNOMvista om um mirosópio ótio onvenional. O

raiodapontaédaordemde50nm. (RetiradodeDušanVOBORNIK'sThesis,

SCANNING NEAR-FIELD INFRARED MICROSCOPY AND

Nanotehnology: A Brief Overview, www.barrett

-group.mgill.a-teahing-nanotehnol ogy-n ano02.ht m℄. . . 24

1.10 (A) Imagem topográa de um romossomo humano após disseação. (B)

Imagem demirosopia eletrnia dasondautilizada nadisseação. Évisível

o depósito de material biológio na ponta dasonda. Abarra deesalaindia

1

µ

m [RetiradodeVesenkaJ,MosherC,ShausS,AmbrosioL,HendersonE.,

Biotehniques. 1995 19(2) 852 (1995)℄. . . 26

1.11 (a) Sonda funionalizada om a letina HPL presa à sua ponta. (b) Evento

de interação entre a sonda e umaélula vermelhado grupo A. Ao entrar em

ontatoomaamostra,asondaérepelida. Quandoosannerretrai-se,devido

àadesão daletinaomaélula (atração),o antilever éexionadoatéquea

força elástia rompe a ligação entre a letina e a superfíie elular (ruptura)

[Retirado de M. Grandbois, W. Dettmann, M. Benoit and H. E. Gaub., J.

Histohem. Cytohem. 48(5) 719 (2000)℄. . . 27

1.12 (a) Mapa de força de adesão entre a sonda e a amostra. Os pontos branos

orrespondem a eventos de maior atração. Noteque essasregiões demaram

a existênia de élulas vermelhas do tipo A, omo pode ser visto na imagem

topográa em (b). Barra de esala 5

µ

m. [Retirado de M. Grandbois, W.

Dettmann, M. Benoitand H.E. Gaub.,J.Histohem. Cytohem. 48(5) 719

(2000)℄. . . 28

2.1 (a) Varredura STM om a distânia sonda-amostra s estável em materiais

rígidos. (b)Materiais de baixa resistênia meânia levavam à instabilidade

de s, logo,do sinalde orrente detunelamento . . . 34

2.2 Gráo do potenial entredois átomosadistânias mirosópias. . . 35

2.3 (a) Cilo deforça. (b)Gráo de força orrespondendo aos 5 pontosA-E do

ilo de força. . . 36

superfíiedemiaemdiferentespHs. Notequeparaum pHbaixo,existeuma

atração forte entre a sonda e amostra. A situação é reversa para altos pHs,

quando a repulsão entre íons domina. (Retirado de H. J. Butt, Biophys J.

60(26), 1438 (1991)). . . 37

2.6 Diagrama esquemátio dosistemade mirosopia deForçaAtmia . . . 39

2.7 Cantilever (a) emforma de haste retangular e (b)em forma triangular. Nas

duasguras pode-sever aponta loalizada naextremidade do antilever. . . 41

2.8 Deexãodoantileverdevidoàsforçasdeinteraçãosonda-amostra. (a)Atração

à distânia entrea sonda e a amostra. (b) Repulsão devido ao ontato entre

a ponta ea amostra. . . 41

2.9 (a)Perl araterizado omuma ponta de baixo aspet ratio. (b) Aimagem

resultante do proesso de varredura em(a)pouo tem a ver om aestrutura

real. ()O mesmoperl agoraé araterizado omumasondade alto aspet

ratio. (d)Issoresulta numaaproximação maior om operlreal da amostra. 43

2.10 A razãoentreaaltura ( y) ea largura daponta ( x) determinamoaspet raio

da sonda AFM. Esta medida nos diz quão omprida é a ponta em relação a

suabase. . . 43

2.11 (a)ExemplodesondadebaixoaspetratioDNP-S(VeeoProbes). (b)Sonda

de altoaspet ratioTESPA-HAR(VeeoProbes). . . 44

2.12 Diferença entre a imagem obtida (linha pontilhada) de pequenos pers de

uma amostra quando araterizados om sondas de raios de urvatura da

ponta diferentes. (a) Pequeno raio de urvatura daponta. (b) Sonda deraio

de urvaturada ponta maior. . . 44

2.13 Esquema do sistema de realimentaç ão do primeiro AFM. As duas ténias

funionavam simultaneament e, oque experimentalment etrazia algumas

fornee informação do desloamento do antilever na direção vertial z. ()

Campos B e C, uja diferença no sinal fotoelétrio fornee informação de

torção do antilever na direção horizontal. (1-5) Funionamento do sistema

de feedbak para ontrole dosanner na direção z. . . 47

2.15 Modotapping de varredura. . . 49

3.1 Ilustração dapresença deantígenosna membrana deeritróitos.. . . 52

3.2 Imagem tridimensional de umahemáiavistaom oAFM. . . 53

3.3 VistasuperiordamembranadeumahemáiaomoAFM(área4.85x4.85

µ

m) e zoomsobrea membrana (área 1x1

µ

m). . . 54

3.4 Preparaçã o da amostra para análise AFM. (a) Coleta om apilar; (b) De-posiçãodagotasobrealamínula; ()Esfregaço omextensor;(d)Seagem da amostra. . . 55

3.5 Análise derugosidade. . . 56

3.6 Diferença derugosidade entreosdois grupos. . . 58

3.7 "Buraos"enont rados sobre a membrana elular. . . 59

3.8 Análise daseção transversalda membrana eritroitária. . . 60

3.9 (a)Medida deprofundidade (vertial) dasdepressõesna membrana. (b) Me-didado raio deabertura (horizontal) dadepressão. . . 60

3.10 (a)Histogramaom afrequênia dosvaloresde profundidade(P)para 10 in-divíduossadios. (b)Histogramaomafrequêniadosvaloresdeprofundidade (P)para 8 indivíduosportadoresde SMD. . . 61

3.11 (a) Histograma om a frequênia dos valores do raio de abertura abertura (A) para 10 indivíduos sadios. (b) Histograma om a frequênia do raio de abertura (A)para 8 indivíduosomSMD. . . 62

varredura-50.2x 50.2

µ

m.) (b). Seçãotransversalda imagem preedente. ()

Umzoom sobre a membrana da élula (Área de varredura-2.5 x 2.5

µ

m.) (d)

Superfíie do vidro(Áreade varredura-2.5 x2.5

µ

m.) . . . 68

3.14 (a) Imagens AFMde élulas vermelhas lavadas emNaCl(Área de varredura

- 50.2 x 50.2

µ

m). (b) Imagem feita sobre uma região do vidro, onde

pode-mos ver pequenos ristais de sal (Área da imagem - 5 x 5

µ

m). () Cristais

enontrados sobre a superfíie das élulas (Área da imagem - 5 x5

µ

m.) (d)

Superfíie elularlivre do lme de plasma (Área da imagem - 1 x 1

µ

m). (e)

Reonstituição tridimensionalda imagem anterior. . . 69

3.15 (a) Imagens AFM de élulas vermelhas lavadas em solução tampão de PBS

ontendo albumina 6

%

(Área de varredura - 50.2 x 50.2

µ

m). (b) A forma

irular e binava foi preservada. () Partíulas sobre a membrana elular

(Áreadevarredura-5x5

µ

m). (d)Partíulassobreovidro(Áreadevarredura

- 5x5

µ

m). . . 70

3.16 (a) Imagens AFM de élulas vermelhas lavadas em solução tampão de PBS

(Áreadaimagem-50.2x50.2

µ

m). Aformadasélulasfoinovamenteafetada.

(b) Contudo, sobre a membrana não houve deposição de ristais (Área da

imagem-5x5

µ

m). ()Rugosidadearaterístiadamembrana elular(Área

da imagem- 1 x1

µ

m). (e) Reonstituiçãotridimensional da imagemanterior. 71

4.1 (a) Normais, (b)hemáias miroítias, () maroitose e pleoariótios, (d)

maroitose, (e) eliptoitose, (f) estomatóitos, (g) aantóitos ( spurr ells),

(h) esquistóitos[Retirado de M. C. Zago, R. P. Falão, R. Pasquini,

Hema-tologia- Fundamentose Prátia Ed. Atheneu p.80(2001)℄. . . 76

4.2 (a) Hemáias faliformes, (b)hemáias em alvo,() hemáias piriformes, (d)

hemáias semilunares ou em apaete, (e) esferóitos, (f) hemáias renadas

(Retirado de M. C. Zago, R. P. Falão, R. Pasquini, Hematologia - F

imagem. . . 78

4.4 Partile Analisys. Osparâmetros métrios deada partíula foram oletados

individualment e(hemáiamaradaemvermelho). Noquadroinferior,pode-se

ver osvaloresde altura ( Hight) eárea ( Area) dospixelsseleionados. . . 79

4.5 DimensõesonsideradasnoálulodovolumedoseritróitosomoAFM:MH

(MeanHight)eMA (Meanarea). . . 80

4.6 Imagens AFMdeélulasvermelhas. (a)Hemáias maroítias ,VCM=105

. (b)Hemáiasnormoítias,VCM=88. (a)Hemáiasmiroítias,VCM

=67 . . . 82

4.7 Histogramas de frequênia dosvolumes para as amostras A

[

V P M

(

AF M

) =

19

.

98

f l

]

,B

[

V P M

(

AF M

) = 20

.

86

f l

]

,C

[

V P M

(

AF M

) = 22

.

94

f l

]

,D

[

V P M

(

AF M

) =

24

.

65

f l

]

, E

[

V P M

(

AF M

) = 25

.

73

f l

]

eF

[

V P M

(

AF M

) = 28

.

78

f l

]

. . . 83

4.8 RelaçãoentreovolumealuladoviaAFM(VPM-AFM)eovolumeforneido

peloontadorde élulas vermelhas (VCM). . . 85

4.9 (a)Hemáia exposta aoar - 0h. (b)Hemáia após84h de exposição ao ar. . 87

4.10 (a) Comportament o do volume do eritróito exposto ao ar por 3.5 dias. (b)

Primeira urva reportadadeste mesmoexperimento [Retirado deY.Chen, J.

Cai, Miron37339 (2006)℄. . . 88

1.1 Ténias de mirosopia, meio deoperação epoder de magniaçã o.. . . 23

2.1 Modelosde sanners tubularese suasrespetivas amplitudeslaterais. . . . 40

3.1 Rugosidadedeumaáreade 1

µ

m

2

sobreasuperfíie deeritróitosdosgrupos

AB+ eO+. . . 57

3.2 Testesde normalidade om resultados apliadosàsvariáveisP eA. . . 63

3.3 Teste Mann-Whitneypara asvariáveisPe Aentreosgrupos: sadiose

porta-dores deSMD. . . 63

3.4 Vantagense desvantagens dosmétodos depreparação de eritróitoso AFM.. 71

4.1 Formasanormaisdeeritróitosesuasoorrênias[RetiradodeM.C.Zago,R.

P. Falão, R.Pasquini,Hematologia - Fundamentos ePrátia Ed. Atheneu

p.79(2001)℄. . . 74

4.2 Parâmetro sforneidospelohemograma(RetiradodeM.C.Zago,R.P.Falão,

R.Pasquini,Hematologia-FundamentosePrátiaEd. Atheneup.83(2001)). 75

4.3 Comparação entreosvaloresde VCM e VPM(AFM). . . 84

A.1 Valores das profundidades (P) dos buraos enontraddo s sobre a membrana

de doadores epaientesom SMD. . . 109

A.2 Valores das aberturas (A) dos buraos enontraddo s sobre a membrana de

doadores e paientes omSMD. . . 110

A.3 Valoresde volume para aamostra A.. . . 111

A.6 Valoresde volume para a amostraD.. . . 114

A.7 Valoresde volume para a amostraE. . . 115

A.8 Valoresde volume para a amostraF. . . 116

A.9 Valoresde volume em24h de envelheimento. . . 117

A.10Valores de volume em 84h de envelheimento, om intervalos de 12h entre

Introdução

1.1 Uma Breve História da Mirosopia.

Um observador interessado em examinar pequenos detalhes de um objeto traz o

mesmo parabem próximode seu olho, de formaquesua imagempareçamaior. À

me-dida que o objeto é aproximado, sua projeção na retina vai aumentando de tamanho

e permanee em foo até o ponto onde o ristalino pode garantir aomodação

ade-quada dos raios. Além deste ponto, onheido omo ponto próximo, a imagem perde

resolução e torna-se embaçada. Chegou-se ao limite da visão humana para pequenos

objetos. Hoje, sabemos que uma simples lente onvergente, também onheida omo

lentedeaumento,éapazdeontornaresteproblema. Contudo,oexperimentodesrito

aima e a limitação imposta por ele tem grande hane de ter sido a motivação que

levouasgeraçõespassadas aonentrar esforçosparaentenderedominarosfenmenos

ótios. Osprimeirosartefatos datenologia ótiaremontamà antiguidade (1200AC),

quando lemos nolivro de Êxodo 38:8 queuma mulher doa o metalde suporte de suas

lentes de enxergar para a onfeção de um lavatório de metal usado em erimoniais

notabernáulo [1℄. Fisólofosgregosomo Pitágoras,Demóritus,Empedoles, Platão,

Aristóteles,dentre outros, apresentaramsuas própriasteorias sobre anatureza daluz.

Eulides(300AC)registrouqueonheiaofenmenodapropagaçãoretilíneadaluzem

seu livroCatoptris. Umalente onvergenteusada para onentrar os raios luminosos

e produzir fogoé desritaporAristófanes em sua peça As Nuvens(50 DC):

qual se aende fogo?

- Está falandodo ristal?

- Sim. Ora, que aonteeria se eu a tomasse no momento em que o esrivão

es-tivesse anotando a queixa, de longe, assim,parado diante do Sol, e zesse derreter os

doumentos do meu proesso?

- Voê fala om sabedoria. Sim, pelas Graças!"[2℄.

Os registros do historiador Plínio revelam que os romanos possuíam tais lentes.

Maisque isso, exemplares de esferas de vidro e ristal, que provavelmente serviam ao

propósito de aender fogueiras, foram enontradas entre ruínas romanas. Já olósofo

romano Senea (3 AC - 65 DC) observou em sua obra que esferas de vidro heias de

água poderiam ser usadas omo lentes de aumento. É possível que artistas romanos

possamterusadotaislentesparafailitaraonfeçãodetrabalhosartesanaisdegrande

preisão.

Comaquedadoimpérioromano(475DC)mara-se oiníiodaidademédia. Neste

período,o progressoientíoestanou naEuropaemuitodoquejá haviasido esrito

pelosantigosfoiesqueidoemfunçãododomíniodaulturaristãgreo-romana.

Con-tudo, a tomada de Alexandria pelos muçulmanos em 642 DC deu iníio à oupação

islâmia do oidente. Pelo nal do sétimo séulo, o império de Alá estendia-se da

Pérsia à Espanha, passando por toda a osta sul do Mediterrâneo. O império árabe

passou então a possuir o onheimento do velho mundo e muito da sabedoria antiga

foitraduzida epreservada. Noque onerneaos avanços emótia, Alhazen(1000 DC)

deusua ontribuiçãopara aleidareexão, oloandooângulode inidênia ereexão

no mesmo plano normal à interfae. Ele também ensaiou sobre espelhos

parabóli-os e esférios, além de registrar uma desrição detalhada do mais omum e eiente

instrumento ótio,o olho humano.

AEuropaomeçariaasairde seutorporinteletualpelonaldoséuloXIII.Desta

époa, sabe-se que otrabalho de Alhazen foratraduzido para o latim, inueniandoa

Baon (1215-1294). Aredita-se que partiu dele a primeira iniiativa de usar lentes

para orrigir osproblemas da visãohumana. Baontambém sugeriu a ombinaçãode

lentes para aonstrução de um telesópio.

Após amorte de Baonnão há registrosde outrosestudos envolvendo ótia.

Con-tudo,pareequeseu trabalhoserviuàpopularizaçãodosinstrumentos ótiosomopor

exemplo, os óulos omo os onheemos hoje. Datam da segunda metade do séulo

XIII várias obras de artistas retratando monges usando óulos. Leonardo da Vini

(1452-1519) ensaiou sobre a âmera esura [3℄, popularizada posteriormente por

Gio-vanni Battista Della Porta (1535-1615). Em seu livro Magia Naturalis (1589), Porta

desreve aombinaçãode lentes onvergentes edivergentes [4℄.

Osgrandes avançosnaótiaviriamapenas noséuloXVII. Quaseque

onomitan-tementeforam inventados otelesópio eo mirosópio. O primeiroomo instrumento

de auxílioàvisão domuito grande,oudo muito distante, enquanto o segundo à visão

domuitopequeno. Tais instrumentos são provasdaneessidadede ver alémdoque se

vê. Não está laro quem onstruiu o primeiro telesópio, mas há registros de que em

2 de outubro de 1608, o fabriante de óulos holandês Hans Lippershev (1587-1619)

requereuapatentedonovoequipamento. Sabe-sequeemPádua,GalilieuGalilei

(1564-1642) ao tomar onheimento da nova invenção, ps-se a trabalhar na fabriação do

seu próprio telesópio, o que onseguiu nalizar em alguns meses polindo as lentes à

mão. Pelos mesmostempos,omirosópioomposto( i.e., queusaduas oumais lentes

ombinadas)foi onstruído pelo holandês Zaharias Janssen(1588-1632).

A partir de então, as modiações e desobertas viriam em turbilhão. Franiso

Fontana (1580-1656)de Nápoles, substituiua lenteoular nava domirosópio por

umaonvexa. UmamodiaçãosemelhantefoifeitanotelesópioporJohannes Kepler

(1571-1630). Olhando para o éu om seu telesópio, Galileu desobriu as luas de

Júpiter em6 de janeirode 1610. Nomesmoano eleonseguiu verosanéis de Saturno.

Ele também onluiuque o Solpossuía uma rotação pelaobservação de manhas que

da ótia de primeira ordem para sistemas de lentes delgadas, além de desrever om

detalhes o funionamento do telesópio galileano (oular divergente) e o kepleriano

(oular onvergente). Em 1621 oorre um dos grandes momentos no desenvolvimento

da ótia moderna. Willebrord Snell (1591-1626), professor em Leyden, desobriu de

maneiraempíriaa leidarefração.

Ao entender de maneira preisa omo os raios de luz se omportam ao atravessar

uma interfae entre dois meios, Snell abriu de uma só vez a porta para o

desenvolvi-mento da ótia moderna. Depois disso, o primeiro a publiar a lei da refração em

termosde senos omoaonheemos hoje foiRené Desartes (1596-1650)[5℄. Também

Pierre Fermat (1601-1665) formulou sua versão para a lei da refração. Este último

props que a luz propagava-se de um ponto a outro tomando o aminho ujo tempo

de perurso era o menorpossível. Este éo famoso prinípiodotempo mínimo.

Também digna de menção é a desoberta do fenmeno da difração (o desvio da

luz de sua trajetória retilínea ao passar por um orifíio ou obstáulo muito pequeno)

pelo professor jesuíta Franeso Maria Grimaldi (1618-1663), em Bolonha na Itália.

Ele observou bandas de luz (laros e esuros) na sombra de uma haste na quando

iluminadaporumapequena fontedeluz. Paralelamente, Robert Hooke,naInglaterra,

desreveu em seu famoso livro Mirographia(1665) padrões de interferênia oloridos

geradospor lmes nos. Hooke onluiu orretamente que tais padrões eram devidos

àinteraçãoentre aluzreetida nas superfíies frontaleposteriordolme. Alémdisso,

Hookepropsaidéiadequealuzeraummovimentovibratóriorápidoquesepropagava

num meio a alta veloidade. Props ainda que ada pulso ou vibração de um orpo

luminosogerariauma esfera. Foio nasimento dateoria ondulatória daluz.

As realizações de Hooke em iênia não se restringiram apenas à físia. Ele

tam-bém ontribuiu em áreas omo paleontologia,químia, meteorologia ebiologia. Nesta

última, seu livro Mirographia tem espeial relevânia [6℄. Ao trazer desrições

de-talhadas de suas observações om o mirosópio ótio de diversos sistemas biológios

os poros no teidoda ortiça,Hooke desreveu:

"... estes poros ou élulas, foram de fato os primeiros poros mirosópios que eu

já vi, ou quealguém já viu, issoporqueaindanão enontrei nenhumesritor ou pessoa

que os tenhamenionado."[7, 8℄

Defato,estafoiaprimeiravezqueapalavraélulafoiutilizada. Paraele,asélulas

retangulares doteido da ortiçalembravamas elas de um monastério (em inglês, as

duas palavras têm amesma graa ell).

ApesardoMirographiaterpopularizadoamirosopiaomoténia,algunsatribuem

ao holandês Antony van Leeuwenh oek o mérito de ter apliado o mirosópio ótio

a estudos mais preisos de mirosistemas. Leeuwenh oek, um omeriante de Delft,

Holanda, não era rio, não tinhaformação aadêmia e nem falava outra línguasenão

o holandês. Isso já o oloariade antemãofora da omunidade ientía. No entanto,

sua determinação, uriosidade e a mente livre dopensamento ientío dogmátio da

époa, olevaramagrandes desobertas em biologia. Leeuwenhoek foioprimeiroa

ob-servar a vidaem esala mirosópia. Dentre suas desobertas estão: hemáias (tema

deste trabalho), espermatozóides, protozoários e talvez a mais relevantes de todas, as

batérias.

Fabriantede suas própriaslentese mirosópios,eleonseguiuom auráiae

ha-bilidade surpreendentes imagens om aumento de até duzentas vezes , enquanto o

mi-rosópio omposto, inventadoem 1595,erade quarentaanosantes de Leeuwenh oek

naser,eraapazdeaumentosdeapenas vinteatrintavezes . Suasartas,destinadasà

RoyalSoiety of London,eramtraduzidas doholandês paraoinglês elatimesóentão

publiadas no Philosophial Transations of the Royal Soiety .

Asdesobertas de Antonymostraram aomundo ientíoum mundo mirosópio

onde a vida também aonteia. Elas também renderam-lhe a asensão a membro

da Royal Soiety em 1680, ao lado de nomes omo Robert Hooke, Henry Oldenburg,

Delft esreveu à RoyalSoiety:

"Antony van Leeuwenhoek onsiderou que o que é verdadeiro em losoa natural

pode serainda mais frutífero se investigado pelo método experimental, suportado pelas

evidênias dos nossos sentidos. Por esta razão, om diligênia e trabalho inansável,

fez om suas próprias mãos lentes de onsiderável qualidade, om a ajuda das quais

desobriu diversossegredos danatureza, agorafamosos por todoomundolosóo."[9,

10℄

OsmirosópiosótiosompostosdaépoadeHookeeLeeuwenhoek tinhampoder

de resolução similar aos atuais utilizados em laboratório. Isso mostra que apesar de

a tenologia de fabriação de lentes ter atingido onsiderável avanço, bem omo os

métodos de iluminaçãoe aptaçãodaluz reetida pelaamostra,odesenvolvimentoda

mirosopiaótia atingiuum pontode saturação. De fato,noséuloXIX, desobriu-se

queos mirosópiosótios têm um poder de resolução limitado, não importando quão

exelente seja a fabriação de suas lentes ou as ondições experimentais em que se

observa aamostra.

1.2 Poder de Resolução de um Mirosópio Ótio.

O poder de resolução de um mirosópio ótio é determinado pela apaidade do

mesmo de mostrar de maneira distinguível a imagem de dois pontos separados por

uma distâniad . Costuma-se onsiderar nesta denição o famoso ritériode Rayleigh

(1842-1919)[11℄. Ouseja,aimagemde doisobjetoséditaresolvidaquando,omáximo

dopadrão de difração de Airy do primeiro ponto oinide om o primeiro mínimo do

padrão de difração do outro ponto. Para muitos, o ritério de Rayleigh é algum tipo

de lei natural esrita por anjosem tábuas de ouro. Para o próprio Raylaeigh, elenão

passa de uma aproximação. Contudo, sabe-se quenão foi o Lord Rayleigho primeiro

de mirosópios em Jena, Alemanha. Naquela époa, os mirosópios ainda eram

fabriados de maneira impreisa e rudimentar. Logo Zeiss pereberia que o método

tentativa e erro levava a avanços insigniantes. Foi quando em 1866 ele persuadiu

o físio Ernest Abbe, então professor na Universidade de Jena, a trabalhar om ele e

estabeleer bases ientías para o funionamento do mirosópio [13, 14℄. Abbe foi

o primeiro a denir a mínimadistânia transversal (D) entre dois objetos pontuais, a

partir daqual os mesmospodem ser resolvidos numa imagem,omo

D

=

1

,

22

λ

n

o

sin

θ

max

,

(1.1)

onde

n

o

é o índie de refração do meio entre a amostra e a lente e

θ

max

é o ângulo

máximo de abertura da objetiva (Fig. 1.1). Abbe desobriu por meio da experiênia

que uma grande abertura resultava em maior resolução, mesmo que o one de luz

inidentepreenhesse apenas uma pequena porção daobjetiva. De alguma maneira,a

região esura aoredor doone de luz estava ontribuindo para aimagem.

Figura1.1: Máximoângulo de abertura da lente objetivade um mirosópio ótio.

AFig. 1.2mostraumafontedeluzoerenteiluminandoumagradededifração,esta

poderia ser, por exemplo, uma amostra de teido sobre uma lamínula transparente.

Observe que a abertura da lente não é suiente para oletar toda a luz difratada,

ou seja, a imagem não orresponde exatamente ao objeto observado. Na realidade,

de difração e a remoção desta porção de informação resulta exatamente na perda de

denição e resolução daimagem. Do ponto de vista oneitual, agrade de difração

G

só poderia ser onsiderada estritamente periódia se ela tivesse uma largura innita.

Istosignia quenaprátia elatem um espetro de Fourier ontínuo, dominado pelos

termos disretos da série de Fourier próximos à periodiidade onsiderada da grade,

mais os termos de ordem maior, ontudo, om amplitude menor. Assim, superfíies

ompliadaseirregulares naturalmenteapresentarão um espetro de Fourierontínuo,

logo,podemosonluirquedesdequealenteobjetivade ummirosópioótionãotem

umaaberturainnita,elafunionaomumltropassa-baixa,rejeitandoasfrequênias

de ordem superior a uma dada frequênia, deixando passar todas as outras abaixo.

Consequentemente, qualquer lente real é limitada em sua habilidade de reproduzir as

araterístias de um objeto relaionadas às omponentes de alta frequênia da luz

difratadapela amostra,quando sob iluminaçãooerente[15℄.

Figura1.2: Formaçãodaimagematravésdeumalentenumsistemaótio,omoporexemplo

um mirosópioótio.

Umaoutra abordagempara oproblema daresolução de um sistema ótiopode ser

feita por meio da análise de Fourier [16, 17, 18℄. Consideremos uma amostra sobre

umalamínula,sendooplanodalamínula( x,y, 0). Suponhamosqueuma ondaplana

−

→

inide transversalmente sobre o plano da lamínula, sepropagando na direção positiva

de z (Fig. 1.3). Atransformadade Fourrierem duasdimensõespara oampo

−

→

E

pode

ser esritaomo:

Y

X

Z

E(x,y

,o)

E(x,y

,z

)

E

Figura 1.3: Campo elétrio E inidindo sobre o plano ( x,y ,0), propagando- se na direção z

positivo.

−

→

E

(

w

x

, w

y

) =

Z

Z

₋

_→

E

(

x, y,

0)

e

−

2

iπ

(

w

x

x

+

w

y

y

)

_dxdy.

(1.2)

Na Eq.(1.2)

w

x

e

w

y

são as frequênias espaiais das estruturas sobre o plano de

inidênia, as quais, de maneira geral podem assumir qualquer valor entre 0 e

∞

.

Assim,

−

→

E

( x,y ,0) pode ser esrito em termos dasua transformada de Fourierinversa:

−

→

E

(

x, y,

0) =

Z

Z

₋

_→

E

(

w

x

, w

y

,

0)

e

2

iπ

(

w

x

x

+

w

y

y

)

dxdy.

(1.3)

Oamposobreoplanodaamostrapodeentão seronsideradoomoasuperposição

de ondas planaspropagando-se na direçãodos vetores de onda:

−

→

k

= (

−

→

k

x

,

−

→

k

y

,

−

→

k

z

) = (

α, β, γ

)

2

π

λ

,

(1.4)

ujos ossenos do ângulode propagaçãosão:

α

=

λw

x

, β

=

λw

y

, γ

=

p

1

−

_α

2

₋

_β

2

_.

(1.5)

Demaneirasemelhantea Eq.(1.3), oampo elétrio

−

→

−

→

E

(

x, y, z

) =

Z

Z

₋

_→

E

(

w

x

, w

y

, z

)

e

2

iπ

(

w

x

x

+

w

y

y

)

dw

x

dw

y

.

(1.6)

Da eletrodinâmia, sabemos que onsiderando o meio de propagação homogêneo,

isotrópioelinear, o ampo elétrio

−

→

E

deve satisfazer àequação de Helmholtz

∇

2

−

→

_E

₊

_k

2

−

→

_E

_{= 0}

_.

(1.7)

AapliaçãodiretadestaondiçãoaoampodaEq.(1.6)noslevaàseguintesolução:

−

→

E

(

w

x

, w

y

, z

) =

Z

Z

₋

_→

E

(

w

x

, w

y

)

e

2

izπ

q

1

λ

2

−

w

x

2

−

w

y

2

dxdy.

(1.8)

CombinandoasEq.(1.8) e (1.6), obtemoso valordo ampo elétriopara z>0:

−

→

E

(

x, y, z

) =

Z

Z

₋

_→

E

(

w

x

, w

y

)

e

2

iπ

(

w

x

x

+

w

y

y

+

z

q

1

λ

2

−

w

x

x

−

w

y

y

)

dw

x

dw

y

.

(1.9)

Têm-seentão duas situações possíveis:

1 -

w

x

2

₊

_w

y

2

<

_λ

1

2

.

Neste aso, o argumento da função exponenial na Eq.(1.8) é imaginário, o que

orresponde auma onda quese propaganoeixoz em direçãoaoplano de observação.

2 -

w

x

2

₊

_w

y

2

>

_λ

1

2

.

Agora, afunção exponenial naEq.(1.8) tem um argumentoreal. Istonos permite

reesrever aEq.(1.8) omo:

−

→

E

(

w

x

, w

y

, z

) =

Z

Z

₋

_→

E

(

w

x

, w

y

)

e

−

2

zπ

q

w

x

2

+

w

y

2

−

_λ

1

₂

dxdy.

(1.10)

Consequentemente, aamplitude daonda ai exponenialmente nadireçãode z.

Isto nos leva a rer que para frequênias espaiais baixas, as ondas se propagam

normalmenteemz nadireçãodoplanodeobservação. Estasondassãoonheidasomo

da amostra, não atingindo o plano de observação. A região onde estas ondas podem

ser detetadas é onheida omo ampo próximo (near-eld). Nesta região trabalha o

SNOM, uma téniade mirosopia ótia queonsegue atingironsiderávelresolução.

Falaremos destaténia mais adiante.

Nummirosópio ótio onvenional, aslentes estão loalizadas numa região onde

apenas as omponentes de ampo distante podem ser aptadas. Como visto

anterior-mente, as únias ondas aptadas pela lente objetiva são aquelas limitadas pela

aber-tura dalente. NaEq.(1.1),onumerador

n

o

sin

θ

max

foihamadoporAbbede abertura

numéria da lente, ou NA ( numerial aperture). Considerando então que o índie de

refração do ar

n

o

é igual a1, e

θ

é

θ

(

−

→

z ,

−

→

k

)

, as ondas aptadas pelalente são aquelas

que obedeem à seguinte ondição:

sin(

θ

(

−

→

z ,

−

→

k

))

< N A.

(1.11)

Agora, sabendo quepara osossenos direionais denidospelaEq.(1.5)valearelação:

θ

= arcsin

p

α

2

₊

_β

2

_,

(1.12)

onluímos por meio daEq.(1.5) e (1.11) que:

α

2

+

β

2

<

(

N A

)

2

,

(1.13)

w

x

2

+

w

y

2

<

(

N A

λ

)

2

,

(1.14)

p

w

x

2

+

w

y

2

<

(

N A

λ

)

.

(1.15)

DoladoesquerdodaEq.(1.15)temosafrequêniaespaialdasuperfíiedaamostra

em suas duas omponentes dimensionais. Por denição, afrequênia espaial é:

w

=

1

λ

e

sendo

λ

e

o omprimento de onda espaial da amostra e

w

=

p

w

x

2

+

w

y

2

. Ora,

λ

e

é

a distânia no plano ( x,y) da amostra entre, por exemplo, dois máximos do padrão

regularde superfíie, portantopodemos dizer que

λ

e

=

p

∆

x

2

+ ∆

y

2

, oque nos deixa

om:

q

∆

x

2

+ ∆

y

2

>

(

λ

N A

)

.

(1.17)

AsEq.(1.15)e(1.17)nosdizemqueapenasfrequêniasespaiaismenoresque

N A/λ

sãodetetadas,orrespondendo adistâniasnoplano( x,y)maioresque

λ/N A

. Logo,o

máximopoderde resoluçãodomirosópioótioestálimitadoa

λ/N A

. Esteresultado

está de aordo om o que Abbe havia previsto experimentalmente, posteriormente

também anuniado por Rayleigh [Eq.(1.1)℄. Em termos prátios, isto signia que

uma amostra iluminada om luz brana de omprimento de onda efetivo de 560nm,

onsiderandoaabertura numéria

N A

=1.6, oque sepode onseguir quando oloa-se

óleo entre a lente objetiva e a amostra, a distânia máxima resolvível é da ordem de

350nm. Para a iênia de hoje este é um limiteabsurdamente grande, uma vez que a

esalade grandeza dos proessos maisestudados atualmenteestão dentro da esalade

algunsnanmetros (nanoiênia).

1.3 Da Mirosopia Ótia à Mirosopia de Varredura

por Sonda.

Uma forma de transpor o limite imposto pelo ritério de Rayleigh é diminuir o

omprimentode onda daradiaçãoinidentesobre aamostra,mas esta não semostrou

uma boa saída experimental para o problema, omo veremos adiante. De fato, as

primeiras observações bem suedidas em esalas atmias só vieram depois de uma

desoberta básia em meânia quântia. Isto é, a de que a luz e a matéria exibem

também onstataram que elétrons de alta energia apresentavam um omprimento de

onda menor que ode elétronsde baixa energia.

Estasdesobertas,juntamenteomoestabeleimentodaótiageométriaeletrnia,

levaram à onstrução do primeiro mirosópio eletrnio por E. Ruska e M. Knoll

em 1931. Desde então, uma gama de tipos de mirosópios foram desenvolvidos.

Dentre os mais onheidos poderíamos itar o Mirosópio Eletrnio de Varredura

(SEM-SanningEletronMirosope), oMirosópiodeTransmissãoEletrnia(TEM

- Transmission Eletron Mirosope), Mirosópio de Campo Inio (FIM-Field Ion

Mirosope) e os Mirosópios de Varredura porSonda (SPM-Sanning Probe

Miro-sope). NesteúltimogrupoestãoinlusosoMirosópiodeVarreduraporTunelamento

(STM-Sanning Tunneling Mirosope), o Mirosópio Ótio de Varredura de Campo

Próximo (SNOM-Sanning Near-ledOptial Mirosope) e nalmenteo Mirosópio

de Força Atmia (AFM-Atomi Fore Mirosope).

1.3.1 O Mirosópio Eletrnio.

AsoluçãoimediataparaolimitederesoluçãoimpostopelaEq.(1.1)aosinstrumentos

ótios, era diminuir o omprimento de onda da radiação inidente sobre a amostra.

Contudo, radiações aima do espetro de luz visível (Fig. 1.4) não funionavam bem

emmirosopia. Porexemplo,ousodoultravioletaapresentavaproblemasdeabsorção.

Jáosraios-Xinteragiamfraamenteomaamostraeomoutrosmateriais,diultando

afabriaçãodelenteseportantolevandoaproblemasdefoalização. Estasdiuldades

só puderam ser superadas om a invençãodo mirosópioeletrnio em 1931.

Oprinípiodefunionamentodestesequipamentoséanálogoaode um mirosópio

ótio. Porém, ao invés de usar luz e lentes de vidro omo meio de magniação e

foalizaçãodaimagem, omirosópioeletrnio utilizaum feixede elétronsfoalizado

pormeiode lentesmagnétias. Comoseu prinípiode funionamentotambémobedee

às leis físias da ótia, ele também está sujeito ao limite de resolução imposto pela

Figura1.4: Espetro de radiação eletromagnétia.

"ondasde matéria".

O oneito de

”

onda material

”

veioom a meânia ondulatória,proposta por de

Broglie em 1921 [19℄. Segundo ele, uma partíula em movimento possui uma onda

assoiada ao seu movimento,ujo omprimentode onda édado por:

λ

=

h

p

,

(1.18)

ondeh éa onstante de Plank (4,135667 x

10

−

15

eV.s) ep é o momentodapartíula.

Para um elétronem movimento,sua energiarelativístiaédada por:

E

2

=

pc

2

+ (

m

r

c

2

)

2

=

K

+

m

r

c

2

,

(1.19)

om

m

r

igualamassa de repousodoelétron(9,11 x

10

−

31

Kg), éaveloidadedaluz

expressão:

λ

=

q

h

2

m

r

K

(1 +

₂

_m

K

_r

_c

2

)

.

(1.20)

A pista que levou os físios da déada de 30 a onstruir um mirosópio a partir

de um feixe eletrnio está naequaçãoaima. Ora,se submetermosum elétronauma

diferença de potenial de 100kV (o quenão édifíilde seonseguir em laboratório), o

mesmoganharáenergiainétiaKsuienteparaexibiromprimentodeondadaordem

de

λ

≃

0,0037nm. Isto era suiente para fazer rer que um mirosópio eletrnio

deveria ter um limite de resolução deveras maior que um mirosópio ótio omum

(que utilizaluz om

λ

daordem de 550nm).

OesquemadeummirosópioeletrniodevarreduraestárepresentadonaFig. 1.5.

O equipamento éonstituído basiamente poruma olunamantida sob váuo inferior

a

10

−

4

Torr, onde existe na parte superior um lamento de tungstênio aqueido a

2700

o

K.O lamentoémantido aum potenialnegativodaordem de 40kV em relação

ao anodo. Assim, os elétronsliberados pelo lamento aqueido são aelerados devido

à diferençade potenial,ganhamenergiae viajamaté aamostra. Duranteo perurso,

o feixe é foalizado pelas lentes magnétias, omo visto na gura. Tal diferença de

potenialde 40kV, segundo aEq.(1.20), éapaz de gerar elétronsuja ondaassoiada

tem omprimento

λ

≃

0,006018nm.

1.3.2 O Mirosópio de Campo Inio.

Em 1951, E.W. Muller inventou o Mirosópio de Campo Inio (FIM - Ion Field

Mirosope) [20℄, um instrumentoom altíssimasensibilidade para araterizar

super-fíies. Nesta ténia, átomos de

H

2

e

He

são ionizados próximo à amostra que deve

ser preparada de formaque tenhao formatode uma ponta muito na. Ogás ionizado

é então aelerado por um ampo elétrio, atingindo posteriormente um anteparo que

Figura1.5: Diagrama esquemátio deum mirosópio eletrnio de varredura.

Paraatingiraintensidadedeampoelétrioneessáriasobreasuperfíie,aamostra

deveserpreparadanaformadeumapontaujaurvaturadeveestaremtornode

algu-mas dezenas a entenas de Angstrons. Tal métodode preparaçãoda amostra,deveras

ompliado, aliado ao fato de requerer que o material analisado deve permaneer

es-tável quando submetidoao intenso ampo elétrioapliado,limitarammuito oampo

de apliaçãodaténiaFIM.Contudo, ténias posteriores resolveriam oproblema de

preparaçãodaamostra,das ondiçõesde análiseedos tipospossíveisde materiaispor

elaestudados [22℄.

1.4 Os Mirosópios de Varredura por Sonda.

Existe uma diferença oneitual importante entre os mirosópios ótios

lentes(sejamelasmagnétias,elétriasoudevidro)estãosujeitosaolimitederesolução

de Raylaeigh desrito anteriormente [Eq.(1.1)℄ ausado pelo proesso de difração dos

raios (luminosos ou eletrnios). No aso dos mirosópios eletrnios, seu grande

poder de resolução é devido ao pequeno omprimento de onda atingido om elétrons

de altaenergia.

Amirosopiadevarreduraporsondarepresentaumamaneiraúniadeobservarum

objeto. Aoinvésdeoloarum detetornumadadaposiçãodistantedaamostraom o

objetivode oletar apropagaçãode algumaquantidadefísia quearrega informações

sobre a mesma (fótons, elétrons ou íons), o detetor é oloado muito mais próximo

à amostra, algumas vezes toando-a. Mirosópios onvenionais utilizam lentes para

magniar a imagem da amostra, já um SPM usa uma sonda muito na que varre a

região de interesse, oletando informações pontoa ponto da superfíie. Assim, o sinal

gerado pelasonda loalmentetorna-seum pixelde uma imagem digitalizada.

1.4.1 O Mirosópio de Varredura por Tunelamento.

OMirosópio de Varredura porTunelamento ( STM - Sanning Tunneling

Miro-sope) foi inventado nos laboratórios da IBM por Derder Binnig eHeinrih Roher em

1981 [21℄. Apenas em 1986 eles seriam reonheidos para o prêmio Nobel em físia

por sua invenção. O STM usa os elétrons da própria amostra omo geradores da

in-formação sobre as estruturas da superfíieanalisada. Basiamente, elefundamenta-se

no ontrole de uma orrente de tunelamento

I

através de uma barreira de potenial

entre asuperfíieinvestigadaeumasondademetal. Se umapequenatensãoéapliada

entre a superfíie da amostra e a ponta (teoriamente, o aso ideal seria uma sonda

ujapontafosse umúnioátomo),uma orrentede tunelamentoiráuirentre asduas

quando adistâniade separaçãoentre elas éreduzida apouos diâmetrosatmios. A

grandepreisãodestaténiaestá assoiada àfortedependên ia(noaso exponenial)

daprobabilidadede tunelamentodos elétronspelabarreirade potenial,om a

seomporta de aordo om aexpressão (abaixas tensões

V

T

ebaixas temperaturas):

I

= 18

V

T

10

4

_Ω

k

d

A

ef f

e

−

2

kd

,

(1.21)

onde 2k

−

1

= 1

.

025Φ

1

/

2

[

eV

]

e

Φ

éa função trabalho média,a qual seonsidera igual à

alturamédia dabarreirade potenialentre osdois eletrodos,

A

ef f

=

π

×

(1

/

2

L

ef f

)

2

é

a área efetiva, determinada pela resolução lateral

L

ef f

≈

2

×

[(

R

t

+

d

)

k

]

1

_/

₂

, om

R

t

igualao raiodapontae

d

àseparação sonda-amostra [22℄.

Paraummetaltípio(

Φ

≈

5

eV

),veriou-sequeaorrentedetunelamento

I

muda

em uma ordem de magnitude para uma variação de

∆

d

≈

1Å. Se a orrente pode ser

mantida onstante dentro de uma margem de, por exemplo 2

%

(por ento), então a

separação

d

permanee onstantedentro dolimite de 0.01Å.

O STM pode operar de duas maneiras diferentes: om a orrente de tunelamento

onstante ou om a altura da sonda onstante (Fig. 1.6). No modo de orrente

on-stante (Fig. 1.6(a)), a sonda varre a superfíie da amostra om a orrente de

tunela-mento mantida num valorque não se altera no tempo, previamente esolhido através

da tensão de feedbak

V

z

. No aso de uma superfíie eletroniamente homogênea,

uma orrente onstante signia uma distâniade separação

d

onstante, logo, o

per-l topográo da amostra pode ser obtido através de uma varredura no plano ( x,y),

obtendo-sea altura z daomparação dos valores

V

z

. A altura da sondaz(x,y) é então

gravada para ada pontoda superfíie, proessada por um omputadore reonstruída

num monitor. A outramaneiraseria omadistâniaentre sondaeamostraonstante.

Neste aso, a sonda varre a amostra rapidamente om a tensão

V

z

aproximadamente

onstante, sendo aorrentede tunelamentomonitoradadurante todoo proesso (Fig.

1.6(b)). As variações da orrente de tunelamento são então gravadas, proessadas e

então plotadasomo função daposiçãoda sonda noplano (x,y).

Cada modo de operação tem suas vantagens e desvantagens. Quando riado, o

modode orrenteonstante foiprinipalmenteempregadopara lersuperfíies quenão

eram atomiamenteplanas. Assim, a alturados arateres da superfíie poderiam ser

Figura 1.6: Operação do mirosópio de tunelamento (a) no modo orrente onstante (a

distânia s nãomuda) e (b)altura onstante ( s varia).

que ontrola omovimentodasondasobre asuperfíie(sanner). Adesvantagemdeste

modo de operação está no fato de que existe um tempo nito na resposta (feedbak)

do próprio sistema, o que impõe limites relativamente baixos para a veloidade de

varredura. Já omodode alturaonstantepermitequesefaçamimagensde superfíies

atomiamente planas om grande rapidez, desde que o sistema não preisa responder

à passagem de pers om alturas disrepantes sob a sonda durante a varredura. A

aquisição rápida de imagens é importante por permitir que pesquisadores estudem

proessos dinâmios, bem omoreduzir o tempo de aquisição de dados [22℄.

Épatentequeodesenvolvimentodomirosópiode varredura portunelamento

au-mentouonsideravelmenteaapaidadedeobservação desuperfíiesem esalas

atmi-as (Fig 1.7). Contudo, para o STM éimpresindível a natureza metáliada amostra

paraqueseproduzaaorrentede tunelamentodesritaaima. Semdúvida,issolimita

oampode apliaçãodestaténia,prinipalmenteemiêniasdavida,ondeuma

or-rente elétria sendo extraída daamostra ertamenteausaria danos irreparáveis. Tais

problemas tiveram suas soluções om o aprimoramento da ténia de varredura por

sonda, levando enm à invenção do Mirosópio de Força Atmia (AFM), que será

disutido mais adiante.

1.4.2 O Mirosópio Ótio de Varredura por Campo Próximo.

Figura 1.7: Imagens om resolução atmia do Si(111) obtidas om o STM. (a) Primeira

imagem da superfíie de umaamostra de Si(111) 7x7obtida por Binnig e Roher, inventores

doMirosópiode VarreduraporTunelamento (STM)(Retirado deG.BinnigandH.Rohrer,

Rev. Mod. Phys. 59, 615 (1987)). (b) Imagem da mesma superfíie obtida om uma STM

moderno(RetiradodeY.Chen,K.S.Shneider,B.G.Orr,M.M.BanaszakHoll,Phys. Rev.

B.7085402 (2004)).

de onda da luz utilizada na observação. Paralelamente, através daanálisede Fourier,

veriamos que omponentes de alta frequênia da radiação espalhada pela amostra

(que nesteaso fazopapeldagradede difração) deaemexponenialmentenadireção

doobservador. Istoquefaz om queasinformaçõesarregadas porestas omponentes

não atinjam o detetor de imagem (lme, olho humano, et.). Desta maneira,

ap-tar estas omponentes torna-se uma alternativa à melhora do poder de resolução do

sistema ótio. Estas informações, antes perdidas, arregadas pelas omponentes de

ampo próximo ( near eld) são a base de funionamento do SNOM ( Sanning

Near-eld Optial Mirosope) , ouMirosópio Ótio de Varredura por Campo Próximo.

Não raramente J. A. O'Keefe é itado omo inventor do oneito de SNOM mas,

de fato,nãofoi eleoprimeiroadesrever um arranjoexperimentalapazde aumentar

a resolução do mirosópio ótio. Em seu artigo de 1956 [23℄ O'Keefe lançou uma

idéia geral de omo tal arranjo experimentalpoderia operar, mas não ontribuiu om

nenhuma solução prátia de omo onstruir tal instrumento. De fato, em 1928, o

irlandêsE.Syngejáhaviadesritoumesquemaexperimentalondeopoderderesolução

fonte de luz de grande intensidade oloada atrás de uma plaa de metal om um

pequenoorifíio(era de 100nmde diâmetro) que funionariaomouma fontede luz

pontual. Esteorifíiodeveriaentãoseroloadoaumadistâniadaamostranãomaior

que o diâmetro do orifíio (ou seja, menor que 100nm). A imagem da amostra seria

formadaentãopelasváriasimagensobtidasporum fotodetetorpontoaponto. Assim,

ada pequena imagem seriaum pixelnuma imagemmaior. Segundo ele, a maneirade

varrerestaamostraomtamanhapreisãoseriaatravésdeatuadorespiezoelétrios[25℄.

Infelizmente, a tenologia da époanão era suiente para atender às neessidades de

Synge, portanto,seu trabalhoaiuem ompletoesqueimentoatéquenadéadade 90

foi redesobe rto pelohistoriador D. MMullan,já apóso desenvolvimentodoprimeiro

SNOM.

ApesardabaseteóriadoSNOMser onheidadesteoiníiodoséuloXX,apenas

na déada de 70 foi realizado o primeiro experimento que onrmou as previsões de

Synge. Em 1972, utilizando miroondas de

λ

= 3

cm

de omprimento de onda, Ash e

Niholasobservaram pequenas linhasde alumíniodepositadassobre vidro, alançando

uma resolução de

λ/

60

, omprovandoassim a viabilidadeda ténia[26℄.

A invenção do Mirosópio de Varredura por Tunelamento na IBM em 1981

on-tribuiu deisivamente para o avanço de todas as ténias de varredura por sonda. O

problema até então era: omo manipular om preisão nanométriauma sonda sobre

a região a ser estudada? Tal questão foi soluionado quando G. Binning e H. Rohrer

utilizaram erâmias piezoelétrias para onstruir um sanner apaz de

movimentar-se om a preisão requerida. Finalmente, o SNOM passou a funionar exatamente

omo Synge havia idealizado 53 anos antes. Dois grupos trabalharam paralelamente

no desenvolvimento do aparelho. O primeiro, nos laboratórios da IBM em Zurique,

liderado porD. W. Pohl[27℄ ,e osegundo naUniversidade de Cornellem Nova York,

então liderado por A. Lewis [28℄. Apesar de designar o mesmo instrumento, o grupo

europeu hamou-ode SNOM, enquantoo segundo hamou-ode NSNOM. Ambos

Atualmente o tipo de SNOM omerialmente mais omum é o que utiliza omo

sondaum guia de onda (braótia) uja ponta é muito pequena (Fig. 1.8), om uma

abertura de ordem de tamanho menor que o omprimento de onda da luz utilizada.

Esta ponta é oloada então na região de ampo próximo (entre 0 e 10nm distante

dasuperfíiedaamostra), onde ela oletaas ondas evanesentes da luz espalhada que

arregaasinformaçõessobreaamostraem nanoesala. Estas ondassãoentão

onduzi-das pela bra até um detetor loalizado na região de ampo distante, onde também

a a iluminação da amostra. Durante a varredura, a sonda mantém uma distânia

onstantedaamostradevidoaodeaimentoexponenialdasondasevanenentes, omo

já foi mostrado na seção 1.2. De outra maneira, a variação desta distânia ausaria

efeitos de ontraste que não orresponderiam aos arateres reais da amostra.

Figura 1.8: Foto de uma sonda SNOM vista om um mirosópio ótio onvenional. O

raioda ponta é daordem de 50nm. (Retirado deDušan VOBORNIK'sThesis,SCANNING

NEAR-FIELDINFRAREDMICROSCOPYANDSPECTROMICROSCOPYAPPLIEDTO

NANO-SYSTEMSANDCELLS (2005).

O SNOM desrito aima foi o primeiro tipo deste mirosópio a ser desenvolvido

na déada de 80, e é onheido omo

aperture

SNOM. Uma outra variação deste

instrumento foi riada na déada de 90 e é onheida omo

apertureless

SNOM. A

prinipaldiferença entre osdois équeneste, asonda,aoinvésde braótia, éfeitade

se levar em onta que o poder de resolução do aperture SNOM está entre 20-150nm,

enquantoo doaperturelessSNOM hega a um intervalode 5-30nm.

Nos parágrafos anteriores apresentamos algumas das ténias mais onheidas de

mirosopia de varredura porsonda. Elastornaram-se assimfamosas talvez porterem

sido as primeiras a ser desenvolvidas e quebrar o limite de observação de estruturas

minúsulasimpostopeloritériodeRayleight. Atabela1.1reúneasténiasdisutidas

até aqui, relaionando seu poder de magniação, ambiente de operação e poteniais

danosausadosàamostra. Alémdestas,existeminúmerasoutrasténiasqueutilizam

uma sonda omo elementosensor. Alguns exemplos são: EFM (Eletron Fore

Miro-sope)apazde mapear aestruturaeletrniadaamostraemestudo,MFM(Magneti

Fore Mirosope) que distingue as araterístias magnétias da amostra e o AFM

(Atomi Fore Mirosope) que leva em onta as forças de interação atmia entre a

sonda e amostraomo prinípiode operação.

Tabela 1.1: Ténias demirosopia, meiode operaçãoe poder de magniaçã o.

1.4.3 O AFM (Atomi Fore Mirosope).

Inventado em meados da déada de 80, o AFM tornou-se um dos instrumentos de

maior importânia em nanotenologia. A possibilidade de uso em materiais diversos

(orgânios e inorgânios) e sua grande resolução que hega a pouos nanmetros, o

Nesta pequena introdução, queremos apenas loalizar o que será disutido mais

adiante. Para tanto, a Fig. 1.9 mostra o esquema básio de um AFM. Basiamente,

ele é onstituído por uma sonda muito na que varre a superfíie de uma amostra

guiada por um sistema meânio, uja base são erâmias piezoelétrias. Um feixe

de laser inide sobre o antilever , ou o braço de suporte da sonda. De aordo om a

topograa aompanhada peloantileverdurantea varredura, adeexão dolaser varia

sobreumsensordenominadofotodetetor. Osinalelétriodestesensoréenviadoaum

sistema que interpreta estes dados e produz uma imagem tridimensional da amostra

em estudo.

Figura 1.9: Superfíie sob análise em um mirosópio de força atõmia.[Adaptado de

Nanotehnology: A Brief Overview, www.barrett

-group.mgill.a-teahing-nanotehnology-nano02.htm℄.

1.5 O AFM em Biologia.

O mirosópio de força atmia, tem se tornado uma ferramenta de grande

im-portânia em iênias da vida, espeialmente no que diz respeito à investigação de

estruturas elulares om alta resolução [30℄. Tais estudos morfológios em esalas

nanométrias, os quais eram impossíveis por meio da mirosopia ótia devido à sua

limitada resolução já disutida neste apítulo, agora são fatíveis via AFM. As

superfí-[31, 32, 33℄. Umavez quea apaidade de aumentoalançado pelo AFMpode hegar

a 1.000.000.000 de vezes , moléulasde granderelevânia biológia eas interações que

oorrem entre elas, podem ser observadas. Tal habilidade oloou o AFM na lista de

ferramentas esseniais à pesquisa de proteínas [34, 35℄, monitoramento de interações

do tiporeeptor-ligante[36℄,interaçõesmoleularesde adesãoelular [37℄ einterações

do tipoantígeno-antiorpo[38, 39℄.

O prinipalfator que inseriu a mirosopia de força atmiano rol de

instrumen-tação em pesquisas biológias foi a possibilidade de operar em meio aquoso, ou seja,

num meio que mantém as araterístias químias e físias próprias do ambiente

na-tivo a que pertene o ente biológio em estudo [40℄. Tais insights têm trazido à tona

onheimentos antes inaessíveis, tornando mais preiso o entendimento de sistemas

biológios já onheidos.

A primeira manipulação ontrolada de biomoléulas foi realizada om material

genétio (DNA), retirado de uma adeia romossmia [41℄. Loalizado no núleo

das élulas euariótias, o DNA enontra-se agregado à proteínas estruturais, as

his-tonas, formando as romátides (ou braços do romossomo), visíveis ao mirosópio

ótio somentedurante afase de divisão elular(mitose). Oálulodo volume de

ima-gens topográas de romossomos de plantas [42℄, insetos [43, 44℄ e humanos [45, 46℄,

adquiridas om o AFM, é útil na determiação do ariótipo destas espéies [47℄. Na

Fig. 1.10 vemos uma imagem AFM de um romossomo isolado e depositado sobre

uma superfíiedemia. Utilizandoomodoontato devarreduraeaumentandoaforça

gradativamente exerida pelo antilever sobre a amostra até aproximadamente 5nN,

foi possíveldissear DNA de um das romátides, omo está indiado pelaseta brana

(Fig. 1.11). Esta foi aprimeirareferênia aum proedimento de disseação em esala

nanométria [48, 49℄.

Medir a força que a amostra exere sobre o antilever , e vie-versa, é uma prátia

orrente om o AFM. Em iênias da vida, interações em nanoesala são lugar

Figura 1.10: (A) Imagem topográa de um romossomo humano após disseação. (B)

Imagem de mirosopia eletrnia da sonda utilizada na disseação. É visível o depósito de

material biológio naponta da sonda. Abarra deesalaindia 1

µ

m [Retirado de Vesenka J,

MosherC, Shaus S, Ambrosio L,HendersonE., Biotehniques. 1995 19(2) 852 (1995)℄.

moleulares. Com a sensibilidade que hega a dezenas de pionewtons, o AFM pode

exeutar medidas nanomeânias (omo elastiidade, por exemplo) em espéimes

bi-ológios. Destas medidas, pode-se obter informações a respeito de fenmenos omo

dinâmiaelular e de proteínas. Forças entre grupos químios espeíos e interações

de origem ovalente entre a sonda e uma superfíie já foram testados diversas vezes .

Comoexemplodessetipode medida,poderíamositaruma apliaçãodiretaem

hema-tologia: o reonheimento de proteínas espeías nasuperfíie das hemáias.

Oglioálie,uma estrutura loalizada naparte externa das élulaseuariótias, é

ompostobasiamenteporarboidratoseproteínas(glioproteínas). Esteenvelope

ex-ternotem várias funçõesinteressantes. Umadelas é a repulsãoentre élulas, evitando

indesejáveisadesões[50℄. Sãoasglioproteínaspresentes noglioáliequeagem omo

intermediáriasemproessosdereonheimentoelular[51,52,53℄. Estasinteraçõessão

mediadas por uma família de proteínas reeptoras hamadas letinas. A letina Helix

pomatia(HPL)liga-seespeiamenteaogliolipídiogalNAC( N-aetylgalatosamine),

presente na superfíie de élulas vermelhas do grupo A [58℄. Na Fig. 1.11(a), vemos

uma medida do ilo de força, ou seja, aproximação-repulsão-extensão-ruptura, omo

mostrado na Fig. 1.11(b), sobre a membrana de uma hemáia pertenente ao grupo

sanguíneo A, obtendo-se a urva de força para ainteraçãosonda-amostra. Esta urva

fornee failmente a força de ruptura da ligação entre a sonda funionalizada e a

su-perfíieelular.

Figura 1.11: (a) Sonda funionalizada om a letina HPL presa à sua ponta. (b) Evento

de interação entre a sonda e uma élula vermelha do grupo A. Ao entrar em ontato om

a amostra, a sonda é repelida. Quando o sanner retrai-se, devido à adesão da letina om

a élula (atração), o antilever é exionado até que a força elástia rompe a ligaçãoentre a

letina e asuperfíie elular(ruptura) [Retiradode M. Grandbois,W. Dettmann, M. Benoit

and H.E. Gaub., J.Histohem. Cytohem. 48(5) 719 (2000)℄.

A imagem da Fig. 1.12 foi obtida om o valorda força de ruptura alulada para

ada ilo de força numa matriz de 55x55 eventos de interação, sobre uma amostra

onde haviam élulasvermelhas de dois grupossanguíneos diferentes, A e O.

Os pontos branos na imagem orrespondem à maior adesão, enquanto os pontos

pretos a nenhuma interação. Tal imagem de anidade (entre a sonda funionalizada

Figura 1.12: (a) Mapa de força de adesão entre a sonda e a amostra. Os pontos branos

orrespondem a eventos de maior atração. Note que essas regiões demaram a existênia

de élulas vermelhas do tipo A, omo pode ser visto na imagem topográa em (b). Barra

de esala 5

µ

m. [Retirado de M. Grandbois, W. Dettmann, M. Benoit and H. E. Gaub., J.

Histohem. Cytohem. 48(5) 719(2000)℄.

1.6 Síntese da Dissertação.

O intento deste trabalho é apliar a mirosopia de força atmia no estudo de

eritróitos humanos. Uma vez apaz de resolver arateres em esalas nanométrias

[56, 57℄, o AFM guarda outras qualidades que o tornam ideal para a investigação de

amostrasbiológiasomo: nãoser umaténiainvasiva,istoé,possibilitaaobservação

de amostrasfrágeissem quesejam destruídase operar em meio líquido,ondição

rele-vanteàmanutençãodafunçãoeestruturadosentesbiológiosemestudo. Dentro desta

ótia,este estudoinvestigaaestrutura externa(membrana)de élulasvermelhas, bem

omoalguns parâmetros métriosda élula(área e volume)om o AFM.

Oapítulo2éumarevisãodofunionamentodomirosópiodeforçaatmia. Nele

são vistos os prinipais omponentes que onstituem o mirosópio, omo: o sanner,

o antilever, a ponta, o sistema de realimentação e os modos prinipais de operação

do AFM, ou seja, ontato e tapping . De maneira breve, um pouo da história do