Influência da cristalinidade das hidroxiapatitas carbonatadas nanoestruturadas na viabilidade de células THP-1

INFLUÊNCIA DA CRISTALINIDADE DAS HIDROXIAPATITAS CARBONATADAS NANOESTRUTURADAS NA VIABILIDADE DE CÉLULAS THP-1

Niterói 2016

FACULDADE DE ODONTOLOGIA

RENATA MORAES LIRA

Tese apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor(a), pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia.

Área de Concentração: Odontologia

Orientador: Prof. Dr. José Mauro Granjeiro.

Co-orientador: Dr. Paulo Emílio Corrêa Leite

Niterói 2016

L768 Lira, Renata Moraes

Influência da cristalinidade das hidroxiapatitas carbonatadas nanoestruturadas na viabilidade de células THP-1 /Renata Moraes; orientador: Prof. Dr. José Mauro Granjeiro, coorientador: Prof. Dr. Paulo Emílio Corrêa Leite – Niterói: [s.n.], 2016.

58 f.: il.

Inclui gráficos e tabelas

Tese (Doutorado em Clínica Odontológica) – Universidade Federal Fluminense, 2016.

Bibliografia: f. 42-48

1.Hidroxiapatita 2.Viabilidade celular 3. Adesão celular 4. Adenosina trifosfato 5. Espécies reativas de oxigênio 6. macrófago I.Granjeiro, José Mauro [orien.] II.Leite, Paulo Emílio Corrêa [coorien.] III.Título

Prof(a). Dr(a). Elena Mavropoulos Oliveira Tude

Instituição: Centro Brasileiro de Pesquisa Física (CBPF)

Decisão: _________________________Assinatura:_________________________

Prof(a). Dr(a). Esther Rieko Takamori

Instituição: Faculdade de Medicina de Petrópolis

Decisão: _________________________Assinatura:_________________________

Prof. Dr. José Mauro Granjeiro

Instituição: Instituto Nacional de Metrologia (INMETRO)

Decisão: _________________________Assinatura:_________________________

Prof(a). Dr(a). Mônica Diuana Calasans Maia

Instituição: Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense (FO-UFF)

Decisão: _________________________Assinatura:_________________________

Prof. Dr. Paulo Emílio Corrêa Leite

Instituição: Instituto Nacional de Metrologia (INMETRO)

Dedico este trabalho ao meu marido Flávio e ao meu filho Rafael, que me deram força para continuar a cada obstáculo, e foram extremamente compreensivos com minhas ausências para que eu conseguisse chegar ao fim. Amo vocês infinitamente.

Agradeço a Deus pela proteção durante todo o caminhar deste projeto.

Agradeço ao meu marido e companheiro de vida Flávio. Sem seu amor e compreensão não teria conseguido. Sua presença é minha fortaleza. Seu caráter e equilíbrio me ensinam diariamente. Amo você.

Agradeço ao meu filho Rafael que ao seu modo, com tão pouca idade, entendeu minhas ausências para o estudo. E que a cada sorriso, me deu mais força para continuar. Você me ensinou o que é amor incondicional e reforça diariamente minha vontade de ser uma pessoa melhor. Amo você.

Agradeço aos meus pais Omar e Maria Tereza, pelo amor, pelo exemplo de caráter, e por todos ensinamentos que me passaram ao longo da vida, permitindo que eu chegasse onde estou, além de cuidarem do Rafael com enorme dedicação e carinho nos meus momentos de ausência. Amo vocês.

Agradeço a grande amiga Suelen que ganhei nesta caminhada. Sem seu suporte, esse projeto não teria êxito. Sua amizade e generosidade me inspiram.

Agradeço ao meu co-orientador Paulo Emílio por todo suporte laboratorial que tornou possível o meu caminhar em um universo tão diferente.

Agradeço a professora Mônica Calasans e ao professor Mauro Granjeiro que me receberam de braços abertos. Obrigada pela tranquilidade e generosidade com que sempre me atenderam.

Lira RM. Influência da cristalinidade das hidroxiapatitas carbonatadas nanoestruturadas na viabilidade de células thp-1 [tese]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2016.

O objetivo deste estudo in vitro foi avaliar a viabilidade de células THP-1 expostas a extratos de hidroxiapatitas carbonatadas nanoestruturadas (cHA), não sinterizadas e processadas a 5 ºC e 37 ºC em comparação com a hidroxiapatita sinterizada e processada a 90º C. Foram obtidos extratos dos biomateriais em diferentes concentrações (1%, 10% e 90%) para interagir com células THP-1. A viabilidade celular foi determinada através dos testes de adesão e diferenciação celular (sistema xCELLingence), MMP, ATP, ROS, e morte celular. O teste two-way ANOVA com post test de Tukey avaliou a significância estatística (p <0,05). O sistema xCELLingence demonstrou que todos os extratos dos biomateriais em diferentes concentrações não induziram a ativação de monócitos em macrófagos aderentes durante 60 horas. Além disso, os biomateriais em diferentes concentrações também não induziram perda de MMP, diminuição da liberação de ATP, aumento de produção de EROs e aumento da morte celular com significado biológico, tanto em 24 e 72 horas. Os biomaterias avaliados não induziram a diferenciação das células THP-1 em macrófagos e não afetaram viabilidade dos macrófagos ativados independentemente de sua cristalinidade. A hidroxiapatita carbonatada nanoestruturada parecem ser um biomaterial promissor na bioengenharia de tecidos ósseos.

Palavras-chave: Biomaterial, hidroxiapatita, viabilidade celular, adesão celular, adenosina trifosfato, espécies reativas de oxigênio, macrófago.

Lira RM. Influence of nanostructured carbonated hydroxyapatite in THP-1 cell viability [thesis]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2016.

The aim of this in vitro study was to evaluate THP-1 cell viability when exposed to extracts of nanostructure carbonate hydroxyapatite (cHA) unsinterde and processed at 5 and 37ºC compared to hydroxyapatite sintered and processed at 90ºC. Biomaterial extracts were obtained with different concentrations (1%, 10% and 90%) to interact with THP-1 cells. Cell viability was determined by measuring cell adhesion and differentiation (xCELLingence system), MMP, ATP, ROS, and cell death assays. Two-way ANOVA and Tukey’s post-test were used to identify statistical significance at P <0.05. The xCELLingence system showed that all biomaterial extracts at different concentrations did not promote the activation of monocytes into adherent macrophages over 60 hours. Additionally, the biomaterials in different concentrations did not induce MMP loss, decrease ATP release, increase ROS generation or increase cell death with biological significance both after 24 and 72 hours. All biomaterials that were evaluated did not activate THP-1 cells and did not affect activated macrophages independently of their crystallinities. CHAs seem to be a promising biomaterial in bone tissue engineering.

Keywords: Biomaterial, hydroxyapatite, cell viability, cell adhesion, adhenosine triphosphate, reactive oxygen species, macrophages.

A regeneração de grandes defeitos ósseos, tanto na área médica como na odontológica, é um processo no qual, de modo geral é necessário o suporte de um enxerto ósseo para obtenção de sucesso. Dentre os enxertos existentes (autógeno, alógeno, xenógeno e aloplásticos), o autógeno é considerado a melhor alternativa para esta terapia e inclusive considerado “padrão ouro”, reflexo de suas excelentes propriedades de osteocondução e osteogênese além ausência de resposta imunológica adversa. Porém, o enxerto autógeno apresenta algumas limitações, como a necessidade de internação, elevado tempo operatório, baixa disponibilidade de tecido para o enxerto, morbidade do sítio doador, dificuldade de adquirir uma anatomia funcional, além do alto custo (1). Diante destas limitações, há um grande interesse pela bioengenharia de tecidos no desenvolvimento de um material sintético para enxerto (enxerto aloplástico) que consiga incorporar as propriedades positivas do enxerto autógeno e superar suas limitações.

O biomaterial sintético que hoje é utilizado em substituição ao enxerto autógeno, é a cerâmica de fosfato de cálcio. Dentre as disponíveis, a mais comum é a hidroxiapatita (HA) [Ca10(PO4)6OH2], um composto encontrado na fase inorgânica do tecido ósseo (2), e similar às suas características de biocompatibilidade, bioatividade e propriedades de osteocondução (1) além da osteoindução (3, 4). Entretanto, as hidroxiapatitas disponíveis no mercado são, em sua maioria, estequiométricas e por isso apresentam alta cristalinidade e consequentemente baixa bioabsorção, permanecendo no corpo por longos períodos pós enxerto (5). Diante destes inconvenientes, vários são os estudos que buscam o aprimoramento deste composto em suas características, com o intuito de desenvolver um biomaterial mais próximo do osso, com melhores resultados biológicos principalmente quanto a sua cristalinidade e bioabsorção e otimizando a reparação óssea (6). As modificações propostas vão desde alterações na sua composição química, associando a HA a outros elementos químicos como o estrôncio (7, 8), o zinco (7, 9, 10), o carbono (5, 7, 11-13), ou alterando sua estrutura como o tamanho e formato de sua partícula (14-17) ou sua cristalinidade (18, 19).

O biomaterial que se apresenta como alternativa mais promissora à HA convencional na medicina regenerativa é a hidroxiapatita carbonatada (cHA) que além de biocompatibilidade, bioatividade e osteocondução (5, 6,11, 12, 18, 20, 21),

também apresenta absorção pelos tecidos (5, 13, 18, 19). A cHA é um biomaterial mais similar a fase mineral do tecido ósseo em relação a HA (22) por apresentar em sua composição o íon carbonato (CO3). Vale ressaltar que no tecido ósseo a HA é normalmente impura, sendo o CO3 a impureza mais frequentemente encontrada substituindo o grupo fosfato (PO4) (variando de 2 a 8%) (2). Estudos demonstram que a presença do íon CO3 na estrutura da hidroxiapatita promove uma diminuição na cristalinidade do biomaterial (5, 13, 18, 23) e que quanto maior o conteúdo de carbonato na estrutura da HA menor a densidade e a cristalinidade do biomaterial (23) e com isso, maior bioabsorção pelos tecidos (5, 6, 11-13).

Além de alterações na estrutura química, mudanças na temperatura de síntese destes biomateriais também demonstram efeito direto na sua cristalinidade (5, 23, 24, 19) e consequentemente na sua bioabsorção (5, 19, 23). Apesar da biocompatibilidade reconhecida da HA, os produtos disponíveis são praticamente não reabsorvíveis, e, portanto, menos adequados para bioengenharia óssea que almeja a regeneração de tecidos. Por outro lado, a interação entre células e biomateriais não deve induzir uma resposta inflamatória exacerbada, comprometendo o processo de reparo.

Desta forma o objetivo do presente estudo é avaliar in vitro a influência da cristalinidade das hidroxiapatitas carbonatadas nanoestruturadas (cHA) e sintetizadas a 5 ºC (cHA 5) ou 37 ºC (cHA37) em relação à hidroxiapatita sintetizada a 90 ºC (HA90) e sinterizada, na viabilidade celular de células THP-1. Especificamente pretendemos:

1. Avaliar o potencial de ativação da diferenciação celular de monócitos (THP-1) em macrófagos (potencial de inflamação) pelas cHA5 ou cHA37 em relação à HA90 através do teste de impedância elétrica em tempo real pelo sistema xCELLingence.

2. Avaliar o efeito das das amostras sobre o potencial de membrana mitocondrial (PMM) de macrófagos.

3. Avaliar o efeito das amostras sobre a geração de espécies reativas de oxigênio (ERO) por macrófagos.

4. Avaliar o efeito das amostras sobre a produção de adenosina trifosfato (ATP) por macrófagos.

2.1 Biomateriais

Para o presente estudo foram utilizados os seguintes biomateriais: esferas de hidroxiapatitas carbonatadas nanoestruturadas, processadas a 5 °C (cHA5) e 37 °C (cHA37) não sinterizadas e, esferas de hidroxiapatita processadas a 90 °C (HA90) e sinterizadas. Ambos os materiais foram preparados no Laboratório de Biomateriais do Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas (CBPF- Rio de Janeiro) conforme descrito por Sartoretto (2014). As esferas de cHAs foram desenvolvidas com dimensões micrométricas de 425 a 600 μm constituídas por pó nanométrico de hidroxiapatita carbonatada (Tipo AB, concentração de 6% de CO3) com cristais de dimensões

inferiores a 20 nm e razão Ca/P de 1,70. As esferas de HA também foram desenvolvidas com dimensões de 425 a 600 μm constituída de pó de hidroxiapatita estequiométrica sintetizada a 90 °C, sinterizada a 1100 °C e razão Ca/P de 1,67. Os mesmos foram esterilizados após serem embalados em frasco de polipropileno no Instituto Alberto Luiz Coimbra (COPPE - UFRJ) por radiação gama através de Irradiador de Cobalto 60, sendo a dose total aplicada nas amostras de 15 kGy, taxa dose de 19,72 Gy/min e o tempo total de irradiação foi de 760 minutos. Os materiais foram estocados em dessecador com temperatura e umidade controlados. Todos os biomateriais foram caracterizados físico-quimicamente.

2.1.1 Caracterização dos materiais

Os biomateriais foram caracterizados por Difração de Raio X (DRX), Espectrometria Vibracional Infravermelha por Transformada de Fourier (EVIVTF) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) no CBPF para coleta de informações relacionadas a características estruturais, superficiais e de composição química.

2.1.1.1 Difração de Raios X (DRX)

Para a caracterização quantitativa de fases minerais e cristalinas de materiais compostos por uma mistura de fases foi utilizada a análise por Difração de Raio X (DRX). Foi realizada a análise comparativa com padrões difratométricos de fases individuais disponíveis no JCPDS – Joint Committe of Powder Diffraction

Standards, para os vários fosfatos de cálcio. As análises foram realizadas no Laboratório de Cristalografia e Difração de Raios X no CBPF, com o difratômetro de pó Zeiss HZG4 usando radiação de CuKa (= 1,5418 Å) e varredura angular de 10 – 100° com passo de 0,05/s.

2.1.1.2 Espectroscopia Vibracional no Infra Vermelho por Transformada de Fourier (EVIVTF)

Esta técnica identifica os grupos funcionais (CO3, PO4, OH, H2O) pela comparação do modo vibracional de um material padrão. Permite identificar algumas substituições importantes ou alterações na composição da hidroxiapatita podendo diferenciar a substituição dos grupos OH- e (PO4)-3 pelos grupos (CO3)-2. As amostras foram preparadas e trituradas no Laboratório de Biomateriais do CBPF. Os espectros do infra vermelho para as amostras em pó das cHAs foram obtidos utilizando o espectrofotômetro por transformada de Fourier da Schimadzu, IR-Prestige 21 com detector DTGS KBr e separador de feixes de KBr. A análise foi feita por transmitância utilizando pastilhas com 1% de KBr na região mediana do infravermelho (4000 – 400 cm-1).

Os dados obtidos pela EVIVTF e pela DRX são complementares uma. Enquanto a DRX identifica o fosfato de cálcio a EVIVTF identifica a composição química dos fosfatos de cálcio, ou seja, alguns elementos da sua composição, principalmente a substituição de grupos e a presença de grupos carbonato e hidroxila. A combinação destes dados fornece informações precisas nas substituições encontradas na estrutura da HA.

2.1.1.3 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

Com o objetivo de avaliar a morfologia da superfície dos biomateriais (cHA5, cHA37 e HA90) antes do início dos testes biológicos, foi realizada a microscopia eletrônica de varredura. Para tal, as esferas de cada biomaterial foram fixadas com fitas de carbono sobre stubs e cobertas com fina camada de ouro. Para a análise foi utilizado o microscópio de alta resolução JSM – 7100F – Field Emission Scanning Electron Microscope e as imagens, capturadas em aumentos de 130x, 1000x, 5000 e 10.000x.

Foram preparados extratos de todos os biomateriais com a finalidade de serem utilizados para a análise do tamanho das partículas dispersas nestes extratos e para serem utilizados nos testes de viabilidade celular.

Para o preparo, esferas dos biomateriais (cHA5, cHA37 e HA90) foram transferidas separadamente para tubos cônicos contendo meio de cultura RPMI-1640 na proporção de 0,1 g de biomaterial para 2,5 ml de meio, contendo antibióticos na concentração de 1% (estreptomicina e penicilina) e suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado (SFB) (adaptação da ISO 10993-12). A extração ocorreu por incubação dos biomateriais no meio de cultura a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 por 24 horas. Após este período os extratos de cada biomaterial foram centrifugados a 1500 rpms por 5 min e diluídos em meio RPMI-1640 em três concentrações diferentes (1%, 10% e 90%) (Figura 1).

Figura 1: Extratos dos biomateriais (cHA5, cHA37 e HA90) produzidos na proporção de 0,1 g de biomaterial para 2,5 ml de meio de cultura e as diluições utilizadas (1%, 10% e 90%) na pesquisa.

2.2 Análise do tamanho das partículas dos extratos através de Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS)

Para avaliação do tamanho das partículas dos biomateriais, dispersas nos extratos após 24 horas de incubação, foi utilizado o teste de espalhamento de luz

dinâmico (DLS). O DLS é uma técnica de medição do tamanho e de distribuição do tamanho de moléculas e partículas. De modo geral é uma técnica utilizada para caracterização de partículas que foram dispersas em um líquido. Para o teste foi transferido 1 ml de cada extrato nas diferentes diluições (1%, 10% e 90%) para as cubetas (figura 2) do equipamento Zetasizer µV (Malvern Instruments) (figura 3). A leitura foi feita pelo equipamento em três rodadas diferentes com cinco leituras em cada etapa. A Análise foi desenvolvida no Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO).

Figura 2: Transferência dos extratos dos biomateriais nas diferentes diluições (1%, 10% e 90%) para as cubetas do equipamento Zetasizer para avaliação do DLS.

2.3 Testes de viabilidade celular

Para avaliação do efeito dos biomateriais sobre a viabilidade celular, foram analisados cinco parâmetros: 1) Adesão celular através da impedância elétrica em tempo real pelo sistema xCELLingence; 2 Potencial de Membrana Mitocondrial (PMM); 3) Espécies Reativas de Oxigênio (EROs); 4) níveis de Adenosina Trifosfato (ATP); 5) Morte celular. Todos os ensaios foram desenvolvidos no Instituto Nacional de Metrologia (INMETRO).

2.3.1 Cultura celular

Para os ensaios foi utilizada a linhagem celular de monócitos humanos THP-1 (ATCC, Manassas VA) livre de micoplasma (MycoAlert Mycoplasma Detection Kit – Lonza, Bazel, Switzerland). As células foram cultivadas em garrafas de 25 cm2 contendo meio de cultura RPMI-1640 completo, contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e os antibióticos penicilina e estreptomicina (1%) em ambiente de 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas. As células foram utilizadas até completarem no máximo 20 passagens, a fim de evitar eventuais alterações indesejadas

2.3.2. Análise de impedância elétrica através do sistema xCELLingence

O sistema xCELLingence é um biosensor celular de alta tecnologia, capaz de mensurar a adesão celular sobre as matrizes de eletrodos de ouro de alta densidade localizadas nas bases das placas de cultura celular, personalizadas para o sistema (E-plates) (figura 4). A mensuração da adesão celular se dá através da impedância elétrica através dos eletrodos (figura 5) de forma não invasiva e em tempo real por longos períodos (28, 39, 40). Esta impedância é registrada e convertida pelo software do sistema em um índice celular (Cell Index). Quanto maior a adesão celular sobre os eletrodos, maior a impedância elétrica e maior o Cell Index. Em contrapartida, quanto menor a adesão celular sobre os eletrodos, menor a impedância elétrica e menor o Cell Index (figuras 5 e 6). Ou seja, uma avaliação quantitativa. A diminuição deste índice durante o período do experimento em geral é considerada sinal de citotoxicidade. É importante mencionar que a adesão celular é

influenciada por inúmeros fatores como o tipo celular, viabilidade celular, crescimento, migração, espraiamento e proliferação (40). Para este estudo foi ultilizado o sistema xCELLingence (ACEA – Bioscience.inc) (figura7).

Figura 4: E-plate - Placa especial de cultura celular de 96 poços do sistema xCELLingence. Base da placa dourada devido a presença das matrizes de eletrodos de ouro de alta densidade responsáveis pela detecção da impedância elétrica.

Figura 5: Adesão celular sobre as matrizes dos eletrodos das E-plates do sistema xCELLingence e o impedimento de passagem elétrica. Quanto maior a presença de células aderidas nas matrizes de ouro da placa, maior o impedimento ou impedância de passagem de corrente elétrica.

Figura 6: Mensuração da adesão celular sobre as matrizes dos eletrodos e a sua relação com o Cell Index. Quanto maior a presença de células aderidas nas matrizes de ouro da placa, maior o impedimento de passagem de corrente elétrica e maior o resultado do índice celular Fonte: Artigo - Comparative analysis of dynamic viability, migration and invasion assessments by real-time technology and classic endpoints assays.

2.3.2.1 Ensaio de Impedância elétrica celular

O sistema xCELLingence foi utilizado para verificar eventual ativação dos monócitos THP-1 em macrófagos (potencial de ativação da inflamação) mediado pelos extratos dos materiais. Vale ressaltar que os monócitos são células flutuantes e durante o processo de diferenciação passam a ser células aderentes.

Para o teste, o sistema xCELLingence foi previamente calibrado com meio de cultura celular RPMI-1640 e com os extratos do biomateriais nas diferentes concentrações, de acordo com as recomendações do fabricante. A calibração teve como objetivo excluir um eventual registro de impedância elétrica causada pelos constituintes do meio de cultura assim como dos biomateriais. Para tal 50 µL de meio de cultura e dos extratos dos biomateriais foram transferidos separadamente para os poços da E-plate de 96 poços, em quadruplicata. A impedância do meio de cultura e dos extratos foi avaliada pelo software e considerada o baseline.

Após o preparo da cultura celular, 50 µL de meio com densidade celular de 5x103 _{foram transferidos para os poços, os quais já continham 50 µL de meio de} cultura. Após 24 horas o sobrenadante de cada poço foi retirado e substituído por 100 µL do extrato dos biomateriais nas diferentes concentrações. Para o controle positivo as células não receberam extrato e foram tratadas com 1µM de de Acetado de Miristrato de Forbol (PMA) (PMA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) para indução de diferenciação. Vale ressaltar que células THP-1 são células não aderentes, mas passam a apresentar essa característica durante o processo de diferenciação em macrófagos que são células aderentes. Para o controle negativo, foi utilizado apenas meio de cultura RPMI-1640. A adesão celular e consequentemente a diferenciação de monócitos em macrófagos, foi continuamente monitorada em tempo real pelo sistema xCELLigence em intervalos de uma hora, por um período total de monitoramento de 60 horas. Os dados obtidos referentes a impedância elétrica celular de cada poço foram captados pelo software do sistema e processados para gerar o Cell Index (figura 8). Todo o experimento foi desenvolvido em quadruplicata e de acordo com as instruções do fabricante. Ao final do processo foram registradas imagens celulares pelo microscópio de campo claro Axio – Observer.D1 (Zeiss) com aumento de 40X.

Figura 8: Descrição do ensaio de Impedância elétrica celular: Plaqueamento celular, inclusão dos biomaterias e leitura da adesão durante 60 horas.

2.3.3 Diferenciação de células THP-1 em macrófagos para os ensaios de PMM, ERO, ATP e morte celular.

Para os ensaios de viabilidade de PMM, ERO, ATP e morte celular as células THP-1 foram previamente cultivadas como descrito no item 2.3.1, e diferenciadas em macrófagos. Para a diferenciação celular, 100 µL de meio RPMI-1640 com densidade celular de 5x103 _{foram transferidos para placas de 96 poços e} acrescidos 1 µM de PMA e mantidos em ambiente de a 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas. Após 24h de diferenciação celular, o meio de cultura RPMI contendo PMA foi substituído por 100 µL de meio de cultura contendo os extratos dos biomateriais nas diferentes diluições, porém sem PMA. Todas as diluições dos biomateriais foram utilizadas em quadruplicata assim como os controles positivo e negativo. Foram utilizadas duas placas de 96 poços para cada ensaio biológico, uma para análises

após 24 horas de diferenciação celular e a outra após 72 horas de diferenciação celular.

2.3.4 Potencial de Membrana Mitocondrial (PMM) e morte celular

O potencial de membrana mitocondrial é o potencial elétrico da membrana interna da mitocôndria, que em situação de hemostasia é mantida em aproximadamente 180 milivolts por uma rede de movimentos de cargas positivas, garantindo o funcionamento correto da cadeia respiratória celular com a geração de energia (ATP) (41).

Diante da dissipação do potencial elétrico da membrana interna da mitocôndria (perda do PMM) a permeabilidade desta membrana, que em situação de hemostasia é altamente impermeável, é alterada e permite a entrada de moléculas, o que não seria possível em condições de pleno funcionamento celular. Esta permeabilidade pode variar de moléculas <300 KDa até moléculas <1,5 KDa. A permeabilidade da membrana mitocondrial aos solutos com massa molecular < 1,5 KDa representa um colapso irreversível da organela levando ao extravasamento de fatores pré-apoptóticos para o citoplasma (figura 9). Desta forma a perda do PMM é considerado um indicador de dano a mitocôndria e geralmente relacionada ao estágio inicial de apoptose celular (41).

Figura 9: Potencial de Membrana Mitocondrial. (a) membrana mitocondrial integra e (b) perda do potencial de membrana mitocondrial e extravasamento de fatores pré-apoptótico (FP-A).

mitocôndria que é capaz de traduzir a condição de integridade da membrana desta organela, e consequentemente de saúde celular quando mensurado.

Para este teste foi ultilizado o Kit HCS Mitochondrial Health (Invitrogen Detection Technologies - Molecular Probes) capaz de avaliar simultaneamente a mitotoxicidade através do PMM, e a citotoxicidade através da avaliação de morte celular. Dois parametros qualitativos de saúde celular. Este kit ultiliza dois pigmentos (MitoHealth e Image-iT DEAD Green) com finalidades específicas. O corante MitoHealth de cor vermelha com a capacidade de acumular dentro da mitocôndria em células vivas proporcionalmente ao PMM. O corante Image-iT DEAD Green de cor verde é capaz de se tornar fluorescente quando ligado ao DNA da célula (somente possível com a morte celular por necrose via rompimento da membrana celular) com a finalidade de quantificar a viabilidade celular. A substância presente neste reagente, o homodímero de etídeo (EthD-1), possui alta afinidade pelo DNA celular. A sua ligação a esta estrutura somente é possível quando há rompimento da membrana celular, ou seja, células em processo de necrose.

2.3.4.1 Ensaio para avaliação do potencial de membrana mitocondrial (PMM) e de morte celular

Após 24 horas da cultura de células THP-1 conforme descrito no item 2.3.1 100 µL de meio com densidade celular de 5x103 _{foram transferidos para placas de} 96 poços e acrescidos de 1 µM de PMA (PMA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) para indução de diferenciação dos monócitos THP-1 em macrófagos. As placas foram mantidas em ambiente de 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas.

Após 24h de diferenciação celular, o meio de cultura RPMI contendo PMA foi substituído por 100 µL dos extratos dos biomateriais nas diferentes concentrações e as placas mantidas em ambiente de 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas. Aos poços referentes ao controle positivo foram acrescidos 100 µL de peróxido de hidrogênio na concentração de 200 µM durante 30 minutos. Após este período a solução de peróxido de hidrogênio foi retirada dos poços do controle positivo e então adicionada em todos os poços, a solução contendo os corantes MitoHealth e Image-iT DEAD Green conforme indicado pelo fabricante. As placas foram mantidas por 30 minutos em condições descritas acima de cultivo celular e após este período as soluções

contendo reagentes foram trocadas pela solução de fixação (paraformaldeído a 4% e Hoechst 33342 na concentração de 1:4000 diluídos em PBS) por 15 minutos em temperatura ambiente. Após o período de fixação, os poços foram lavados com PBS e obtidas imagens através do equipamento IN CELL analyser 2000 system (GE Healthcare Life Sciences) para subsequente quantificação (figura 10). Todo o ensaio foi repetido após 72 horas de incubação dos macrófagos diferenciados com os extratos dos biomateriais. Todas as diluições dos biomateriais assim como os controles positivo e negativo foram testados em quadruplicata.

Figura 10: Descrição do ensaio de Potencial de Membrana Mitocondrial e Morte Celular: Plaqueamento celular, inclusão dos biomaterias, inclusão dos corantes MitoHealth e Image-iT DEAD Green e leitura.

Este teste quantifica o nucleotídeo trifosfato de adenosina (ATP) intracelular que é responsável pelo armazenamento de energia intracelular proveniente da respiração e traduz a atividade metabólica celular.

A sua mensuração é possível através da reação entre a luciferina (um ácido carboxílico), a luciferase (uma enzima), o oxigênio e o ATP. Como resultado desta reação há a transformação de energia química em energia luminosa, uma reação de bioluminescência (45) (figura 11) com a liberação de fótons (Luz) de comprimento de onda de no máximo 560 nm. Por ser uma reação ATP dependente, a mensuração da energia luminosa, neste ensaio, traduz a concentração de ATP presente no ambiente. A intensidade luz produzida é diretamente proporcional a concentração de ATP (44). Para este ensaio foi utilizado o Kit Molecular Probes ATP Determination A22066 (Molecular Probes – Invitrogen Detection technologie, Paisley, Reino Unido).

Figura11: Reação resumida de bioluminescência

2.3.5.1 Ensaio para quantificação do ATP

Após 24 horas da cultura de células THP-1 conforme descrito no item 2.3.1 100 µL de meio com densidade celular de 5x103 _{foram transferidos para placas de} 96 poços e acrescidos de 1 µM de PMA (PMA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) para indução de diferenciação dos monócitos THP-1 em macrófagos. As placas foram mantidas em ambiente de 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas.

Após 24 horas de diferenciação celular, o meio de cultura RPMI contendo PMA foi substituído por 100 µL dos extratos dos biomateriais nas diferentes concentrações e as placas mantidas em ambiente de 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas. Aos poços referentes ao controle positivo foi acrescido Triton a 1%. Após este período o sobrenadante foi retirado dos poços e então inserido 30 µl de solução de lise com inibidor de protease e a placa levada para o shaker por 5 minutos. Após a

lise das células, 25 µl de cada amostra foi transferida para uma placa de 96 poços totalmente preta e adicionado a solução de reação do kit ATP Determination A22066 (Molecular Probes – Invitrogen Detection technologie) contendo entre outros agentes a luciferina e a luciferase, previamente preparada e testada conforme instruções do fabricante. A placa foi levada para a leitura da bioluminescência em um leitor multiplacas Tecan Infinite 200PRO (Tecan) (figura 12). Para excluir possíveis interferência dos biomateriais na leitura do teste, os extratos dos biomaterias nas diferentes concentrações também foram testados. A leitura máxima de produção de luz foi de 490 nm. Todo o procedimento foi repetido após 72 horas de incubação dos macrófagos diferenciados com os biomateriais. Todas as diluições dos biomateriais assim como os controles positivo e negativo foram testados em quadruplicata.

Figura 12: Descrição do ensaio de quantificação de ATP: Plaqueamento celular, inclusão dos biomaterias, inclusão da solução de reação, e leitura da bioluminescência.

Espécies reativas de oxigênio (ERO) são resultado da redução parcial da molécula de oxigênio com um número menor de elétrons. São moléculas eletronicamente instáveis e altamente reativas e por isso, com capacidade de reagir com um grande número de compostos que estejam próximos promovendo a sua oxidação. Em concentrações fisiológicas possuem a função de mensageiro de sinalização e são responsáveis pelo transporte de elétrons na cadeia respiratória garantindo o bom funcionamento celular. Quando em altas concentrações, leva ao estado de desequilíbrio de estresse oxidativo, condição que desencadeia a oxidação de moléculas como lipídeos, proteínas, e ácidos nucleicos promovendo a alteração na estrutura e na função das membranas mitocondriais e no DNA celular podendo determinar a morte celular (47).

2.3.6.1 Ensaio para quantificação de ERO

Após 24 horas da cultura de células THP-1 conforme descrito no item 2.3.1 100 µL de meio com densidade celular de 5x103 _{foram transferidos para placas de} 96 poços e acrescidos de 1 µM de PMA (PMA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) para indução de diferenciação dos monócitos THP-1 em macrófagos. As placas foram mantidas em ambiente de 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas.

Após 24 horas de diferenciação celular, o meio de cultura RPMI contendo PMA foi substituído por 100 µL dos extratos dos biomateriais nas diferentes concentrações e as placas mantidas em ambiente de 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas. Após 24 horas, o extrato foi retirado e as células do controle positivo foram tratadas com 100µl de peróxido de hidrogênio na concentração de 200 µM durante 30 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi retirado dos poços e então adicionado o reagente CellROX Deep red do kit CellROX Oxidative Stress Reagent (Molecular Probes) em concentração final de 5 µM aos poços por 30 min a 37ºC. Após este período, reagente foi retirado e os poços lavados com PBS e as células fixadas com solução a base de formaldeído a 4% por 15 minutos. Em seguida analisada no sistema IN CELL analyser 2000 system (GE Healthcare Life Sciences) (figura 13). Todo o procedimento foi repetido após 72 h de incubação dos macrófagos diferenciados com os biomateriais. Todas as diluições dos biomateriais assim como os controles positivo e negativo foram testados em quadruplicata.

Figura 13: Descrição do ensaio de quantificação de EROs: Plaqueamento celular, inclusão dos biomaterias, inclusão do reagente CellROX Deep red e leitura.

2.4 Análise estatística

Os dados coletados em todos os testes utilizados no estudo (em quadruplicata) foram transformados em logaritmo para normalização e analisados pelo teste de variância Two-way ANOVA com post test de Tukey. P valores < 0,05 foram considerados significativos. Os resultados foram apresentados como média e desvio padrão. A análise estatística foi desenvolvida usando o programa Graph Pad Prysm 7 (GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA, USA) assim como a construção dos gráficos.

3 - ARTIGO PRODUZIDO

TITLE: IS THP-1 VIABILITY AFFECTED BY THE CRYSTALLINITY OF NANOSTRUCTURED CARBONATED HYDROXYAPATITES?

Author names and affiliations: Renata Moraes LIRAa; Suelen Cristina SARTORETTOb; Carolina da Silva Gouveia PEDROSAc; Mônica Diuana CALASANS-MAIAd; Paulo Emílio LEITEe; José Mauro GRANJEIROf.

a _{Graduate Program in Dentistry, Fluminense Federal University, Niterói, RJ, Brazil.} renatamoraeslira@hotmail.com

b _{Graduate Program in Dentistry, Fluminense Federal University, Niterói, RJ, Brazil.} susartoretto@hotmail.com

c _{National Institute of Metrology, Quality and Technology, Duque de Caxias, RJ,} Brazil. carol.s.g.p@gmail.com

d _{School of Dentistry, Fluminense Federal University, Niterói, RJ, Brazil.} monicacalasansmaia@gmail.com

e _{National Institute of Metrology, Quality and Technology, Duque de Caxias, RJ,} Brazil. leitepec@gmail.com

f_{National Institute of Metrology, Quality and Technology, Duque de Caxias, RJ, Brazil.} jmgranjeiro@inmetro.gov.br

Corresponding author: José Mauro Granjeiro: Av. Nossa Senhora das Graças, 50, Xerém, Duque de Caxias, RJ, Brazil, CEP: 25250-020. Phone-Fax: +55 (21) 2679-9834. E-mail: jmgranjeiro@inmetro.gov.br

Abstract: The aim of this in vitro study was to evaluate THP-1 cell viability when exposed to extracts of nanostructure carbonate hydroxyapatite (cHA) unsinterde and processed at 5 and 37ºC compared to hydroxyapatite sintered and processed at 90ºC. Biomaterial extracts were obtained with different concentrations (1%, 10% and 90%) to interact with THP-1 cells. Cell viability was determined by measuring cell adhesion and differentiation (xCELLingence system), MMP, ATP, ROS, and cell death assays. Two-way ANOVA and Tukey’s post-test were used to identify statistical significance at P <0.05. The xCELLingence system showed that all biomaterial extracts at different concentrations did not promote the activation of monocytes into adherent macrophages over 60 hours. Additionally, the biomaterials in different concentrations did not induce MMP loss, decrease ATP release, increase ROS generation or increase cell death with biological significance both after 24 and 72 hours. All biomaterials that were evaluated did not activate THP-1 cells and did not affect activated macrophages independently of their crystallinities. CHAs seem to be a promising biomaterial in bone tissue engineering.

Key words: Biomaterial, hydroxyapatite, cell viability, cell adhesion, adenosine triphosphate, reactive oxygen species, macrophages.

The regeneration of large bone defects is a process that generally requires the support of a bone graft for success. Among the existing grafts (autografts, allogeneic, xenogeneic and alloplastic), the autograft is considered the best alternative to this type of therapy and is even considered a "gold standard", as it reflects excellent properties of osteoconduction, osteoinduction and osteogenesis in addition to the absence of adverse immune responses. However, the autograft has some limitations, such as the need for hospitalization in some cases, long operation times, restricted tissue availability, donor site morbidity, difficulty in acquiring functional anatomy, and higher costs (1). Aiming to overcome these limitations, the goal of tissue bioengineering is to provide a synthetic graft material (alloplastic).

A synthetic biomaterial that is largely used in association with or for the replacement of autografts is calcium phosphate ceramics. The most commonly available material is hydroxyapatite (HA) [Ca10 (PO4) 6OH2], which is a compound found in the inorganic phase of bone tissue (2) that has excellent biocompatibility, bioactivity and osteoconductive properties (1) in addition to osteoinduction (3,4). However, the majority of commercially available hydroxyapatites are stoichiometric, and therefore, they consequently have a high crystallinity and low bioabsorption. They remain in the body for extended periods after grafting (5). Given these drawbacks, a number of studies have sought improvements in the characteristics of this compound (i.e., crystallinity and bioabsorption) by providing biomaterials that are able to mimic natural bone with better biological results to optimize bone repair (6). Incorporation of other chemical elements, such as strontium (7, 8), zinc (7, 9, 10), carbon (5, 7, 11-13), or changing the particle size, shape (14-17) or crystallinity (18, 19) have been attempted.

Nanostructured carbonated hydroxyapatite (cHA) represents an alternative to conventional HA in regenerative medicine due to its biocompatibility, bioactivity and osteoconductivity (5, 6,11, 12, 18, 20, 21) along with good tissue absorption (5, 13, 18, 19). This biomaterial is more similar to the mineral phase of bone than hydroxyapatite (22) due to the presence of carbonate (CO3) -2 _{in its composition. In} fact, (CO3) -2 _{is the most frequently found impurity in bone, with HA replacing 2 to 8%} of the phosphate groups (PO4) -2 _{(2). Studies have shown that the presence of (CO3)} -2 _{in the hydroxyapatite structure promotes a decrease in crystallinity (5, 13, 18, 23).} When the carbonate content in the HA structure is higher, the density and the crystallinity of the biomaterial are lower (23). The solubility in body fluids is also higher and consequently increases bioabsorption by tissues compared to HA (5, 6, 11-13).

In addition to the chemical structure differences, changes in the synthesis temperature also directly affect crystallinity (5, 23, 24, 19) and bioabsorption of hydroxyapatites (5, 19, 23). Despite the recognized biocompatibility of HA, the available related products are virtually not resorbable, and therefore, they are less adequate for bone bioengineering that aims to promote tissue regeneration. On the other hand, cell–biomaterial interactions should not elicit an exacerbated inflammatory response, which would compromise the repair process. Thus, the goal of this study was to evaluate the effects of crystallinity of nanostructured carbonated hydroxyapatites synthesized at 5°C (cHA5) or 37°C (cHA37) in relation to sintered hydroxyapatite synthesized at 90ºC (HA90) on THP-1 cell viability in vitro.

Biomaterials

For this study, the following biomaterials were used: unsintered nanostructured carbonated hydroxyapatites spheres processed at 5°C and 37°C and sintered, hydroxyapatite spheres processed at 90°C, which were prepared as described by Sartoretto (5) at the Brazilian Center for Physical Research (CBPF, Rio de Janeiro) Laboratory of Biomaterials, following a good manufacturing process. Briefly, the cHA spheres (425-600 µm) were produced from the powder of carbonated hydroxyapatite (AB Type, 6% of (CO3) -2_{) with crystal dimensions less} than 20 nm and a Ca / P ratio of 1.70. The HA spheres (425-600 µm) were produced from powder of stoichiometric hydroxyapatite synthesized at 90°C and sintered at 1100 °C, with a Ca / P ratio of 1.67 Gamma irradiation (15 kGy dose, 19.72 Gy / min over 760 minutes), using a Cobalt 60 irradiator to sterilize the biomaterials packaged in polypropylene vials at Alberto Luiz Coimbra (COPPE- UFRJ, Rio de Janeiro). The materials were stored in a desiccator with controlled temperature and humidity. All the chemical and physical properties of the biomaterials were previously characterized by Sartoretto (5) and Mavropoulos (19).

Biomaterial morphological analysis

Morphological analysis of the surfaces of the hydroxyapatite spheres was performed with the JSM - 7100F - Field Emission Scanning Electron Microscope (SEM) at both fast and high resolutions (currents up to 200 nA [15 V]), with magnifications of 130x, 1000x, 5000x and 10000x.

Preparation of biomaterial extracts

Biomaterials (0.1 g) were transferred to conical tubes containing RPMI-1640 culture medium (2.5 ml) with penicillin and streptomycin (1%) and supplemented with

10% inactivated fetal bovine serum (SFB) (ISO 10993-12 adaptation). The biomaterials were incubated for 24 hours at 37 °C and 5% CO2 for 24 hours. After this period, the extract of each biomaterial was centrifuged at 1500 rpm for 5 min, followed by dilution in RPMI-1640 to 1%, 10% and 90%.

Dynamic Light Scattering (DLS)

A dynamic light scattering test (DLS - Zetasizer µV, Malvern Instruments) was used for particle size determination for the extracts of each biomaterial (1 mL sample size) after 24 hours. Readings were taken at three different stages, and five readings were performed at each stage.

Cell proliferation and viability tests

Cell viability was assessed using five different parameters on the same cell culture: 1) cellular adhesion and differentiation through electrical Impedance in real time by the xCELLingence system, 2) adenosine triphosphate levels (ATP), 3) reactive oxygen species (ROS) 4) mitochondrial membrane potential (MMP), and 5) cell death. All tests were performed with four replicates according to the manufacturer’s instructions, as described below.

Cell culture

For all tests, human monocyte THP-1 cells (American Type Culture Collection ATCC - Manassas, VA) free of mycoplasma were used (Mycoplasma Detection Kit MycoAlert - Lonza, Bazel, Switzerland). THP-1 cells were cultivated in RPM-1640 I medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA, USA) and 1% penicillin-streptomycin antibiotics (Life Technologies). The cells were incubated at 37°C in a 5% CO2 atmosphere for 24 hours.

xCELLingence

The xCELLingence system was used to assess possible THP-1 monocyte differentiation into adherent macrophages (inflammation activation potential) in the extracts of the materials.

The xCELLingence system was previously calibrated with RPMI-1640 medium and biomaterial extracts at different concentrations according to the manufacturer's recommendations. Calibration aimed to exclude a possible record of electrical impedance caused by the constituents of the culture medium as well as biomaterials. The impedance of the medium and the extracts were evaluated by software and were used as the baseline values.

After cell culture preparation, 5x103 _{cells/well were transferred to 96-well} E-plates in 50 µL of culture medium and adjusted to a final volume of 100 µL of culture medium. After 24 hours, the supernatant from each well was removed and replaced with 100 µL of biomaterial extract at different concentrations. Positive control cells were treated with 1 μM of phorbol 12-myristate 13-acetate- acetate (PMA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) to induce differentiation. For the negative control, only RPMI-1640 culture medium was used.

Cell adhesion and proliferation were continuously monitored in real time by the xCELLigence system at one hour intervals for a total period of 60 hours. Electrical impedance of each well was collected by the system software and processed into a cell index. Cell images were captured with an Axio microscope - Observer.D1 (Zeiss) with 40x magnification.

After 24 hours of THP-1 cell culture, 100 µL of RPMI-1640 medium with a cell density of 5x103 _{cells was transferred into 96-well plates with 1 µM PMA} (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) to induce THP-1 differentiation in adherent macrophages. Plates were maintained in 5% of the CO2 atmosphere at 37°C. After 24 and 72 hours of cell differentiation, the culture medium was replaced with 100 µL of biomaterial extracts at different concentrations, and the plates were maintained at 37 °C in 5% CO2 for 24 hours. Positive control cells received 100 µL of H2O2 at 200 µM for 30 minutes. After that treatment, a solution containing MitoHealth and Image-iT DEAD Green dyes from the HCS Mitochondrial Health Kit (Invitrogen Molecular Probes) were added for 30 min. The red MitoHealth dye accumulates inside mitochondria in living cells in proportion to the MMP. Dye Image-iT DEAD Green, which has a green color, becomes fluorescent when bound to cell DNA. The solutions were replaced by a fixing solution (4% paraformaldehyde and Hoechst 33342 at a concentration of 1:4000 diluted in PBS). After 15 minutes, the wells were washed with PBS, and images were captured with Cell Analyzer 2000 system equipment (GE Healthcare Life Sciences).

ATP

Following the same differentiation protocol described above, 24 hours after cell differentiation, the culture medium was replaced with 100 µL of biomaterial extracts at different concentrations, and the plates were maintained at 37 °C. Positive control cells were treated with Triton X-100 (1%). After 24 and 72 hours, the supernatant was removed, 30 µL of lysis solution containing protease inhibitor was added, and the plate was put on a plate shaker for 5 minutes. After cell lysis, 10 µL of each sample was transferred to black 96-well plates plus 90 µL of the reaction solution from the ATP Determination A22066 kit (Molecular Probes - Invitrogen

measured in a Tecan Infinite 200PRO (Tecan) multiplate reader. To exclude possible interference from biomaterials in the test, biomaterial extracts at different concentrations were also tested.

ROS

THP-1 differentiated cells, as described above, were treated with biomaterial extracts at different concentrations at 37°C in 5% CO2 for 24 and 72 hours. Positive control cells were treated with 100 µl of H2O2 at 200 μM for 30 minutes. The supernatant was removed, and 5 μM of the reagent CellROX deep red (CellROX Oxidative Stress Reagent Kit -Molecular Probes) was added at 37°C. After 30 min, the reagent was removed, then the cells were washed with PBS and fixed with formaldehyde solution (4%) for 15 minutes. ROS was measured with the Cell Analyzer 2000 system equipment (GE Healthcare Life Sciences).

Statistical analysis

All the parametric data were transformed into logarithms for normalization and analyzed by Two-way ANOVA with Tukey’s post-test. All p values <0.05 were considered to be significant. The results are presented as the mean and standard deviation. Statistical analyses and graphics were performed using the Graph Pad Prism 7 program (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).

Results

Morphological analysis

The SEM images of biomaterial spheres (Figure 1) revealed a different surface topography between cHAs and HA. The cHAs spheres presented a more irregular surface and had higher roughness compared to HA. At all magnifications, cHA5 showed a more amorphous surface than cHA37 and HA90.

Particle sizes

Particle sizes scattered in HA extracts almost maintained the same particle size that was used for sphere synthesis (20 nm). However, particles scattered in the cHAs extracts were statistically bigger than the particles used for sphere synthesis, and the size increase was directly proportional to the cHA extract concentrations, especiallyfor the cHA5 extract (p<0.05) (Table 1).

Impedance analysis

The Cell Index recorded for all biomaterials was similar to the negative control, which strongly suggested that the biomaterial extracts did not promote the activation of monocytes into adherent macrophages. The opposite trend was observed on positive control cells activated with PMA.

Measurement of mitochondrial membrane potential (MMP)

Significant MMP loss (p<0.05) was observed in the cHA extract at the 90% concentration compared to the control both after 24 and 72 hours. However, this difference was lower than 5%, which showed that there was no biological significance. All biomaterials that were evaluated did not induce MMP loss of macrophages (figure 4).

Cell death

Biomaterials did not induce macrophage death. Cell death was observed for almost all extracts, although statistical significance was tenuously lower than 5% relative to the control without biological significance in the MMP assay (figure 5). ROS quantification

ROS generation was similar to the control for all the extracts, with some extracts presenting a lower ROS generation with statistical significance (p<0.05), although it was a tenuous significance (figure 6).

Quantification of ATP

Almost all biomaterial extract concentrations, except in cHA5 at 90%, induced a statistically significant higher ATP release (p<0.05) (figure 7).

Discussion

Although the HA cytocompatibility has been well-established by various studies, changes in its structure can strongly impact the biocompatibility of new biomaterials that must be evaluated in vitro before their use in therapeutic practice (7, 18) to avoid negative outcomes and unnecessary tests in animals (ISSO 10993-1). The most important aspect in developing new biomaterials is preclinical testing, and in vitro evaluation of single parameters of biocompatibility must be avoided (7, 26). In the present study, four different viability tests were performed to analyze different parameters within the same cell group and the biomaterials. This approach represents a great methodological advantage compared to the use of just one method, through which the results could be over- or under-estimated due interference or methodological limitations that could mask the result (13). Additionally, it is important to mention that it is possible that different biomaterial compositions exert different effects on cell viability tests according to cell type (7).

The THP-1 cell line was chosen for this study because using cell lines has some advantages compared to primary cultures. The degree of variability in the cell phenotypes of cell lines is minimal; cell lines standardize protocols for differentiation, and they have been used as a model for monocyte-macrophage differentiation, (27) which makes certain methods easier to apply (28). Furthermore, macrophages are the major players involved in the initiation of the pro-inflammatory cytokine cascade. Because THP-1 cells, a cell line of human monocyte cells, were used in the present study, we could evaluate not only the behavior of cells against the biomaterials but also the behavior of cells involved in the inflammatory immune process for protecting tissues from toxins and initiating the resolution of inflammation (29). It is very relevant once the biomaterial is recognized as a foreign body, and the immune response

Additionally, macrophages are the major cells responsible for mediating the pro-inflammatory response toward implant debris as a precursor of osteoclasts (31).

Some studies show that the size and shape of HA nano-sized particles negatively alter cellular viability (14, 16, 32, 33). To avoid a potential particle size or shape effect in the present study, biomaterials with similar morphology and size were prepared. Moreover, the size of biomaterial particles scattered into the extracts after incubation was also monitored by DLS, which is a technique for measuring the size of molecules and particles that are scattered in a liquid. It was observed that there were bigger particles in cHA extracts than the particles used for sphere synthesis (20 nm), especially in the cHA5 extract. Particle size was directly proportional to the extract concentration. These results could be associated with an elevated quantity of scattered particles inside the cHA extracts due to the higher dilution capacity of fluids in relation to lower crystallinity. It was already reported that nanoparticles tend to aggregate (34), and HA presents great affinity and adsorption with the albumin (34-37) that is found in FBS, which was used as supplement in media for the biomaterial extracts. Even with differences in particle size inside the extracts, none of the observed results indicated the influence of this parameter on cellular viability.

The first viability parameter assessed was cell proliferation and adhesion through cell impedance. The xCELLingence RTCA system (Roche Applied Science), a high throughput screening method, was used to assess impedance (28, 38). This technology is a simple, non-invasive and label-free cell-based assay that can assess cell behavior continuously over time in cell cultures (38-40). It has a cellular biosensor that can measure the net adhesion of cells as well as high-density gold electrode arrays on custom-designed E-plates that can evaluate electrical impedance

through arrays and convert this impedance value into the CELL Index. The occupation of cells on the array raises the impedance of the electrode. It is important to mention that cellular adhesion is influenced by several factors, such as cell type, cell viability, growth, migration, spreading and proliferation (40). This robust system can also assess and distinguish compound effects on cells in a simple in vitro assay (38-40) and does not affect cell viability (40).

THP-1 is a cell type that can differentiate into macrophages in suspension, which is a process that requires adhesion and spreading that can be assessed through the xCELLingence system (40). The results suggest that biomaterial extracts in different concentrations did not induce THP-1 cell adhesion and differentiation into macrophages. Therefore, the biomaterial tests did not initiate the inflammatory process. Cell images captured during xCELLingence did not show cell adhesion, proliferation or differentiation after the cells were treated with biomaterials and did not show any abnormal morphological alterations that indicated cell death. According to Remya (26) any abnormal morphological alterations in THP-1 cells could indicate a response after exposure to toxic materials. In contrast, positive control cells treated with PMA presented interdigitation in the cell membrane that proved to be efficient for the assay.

Mitochondrial membrane potential is the electric potential of the inner membrane of the mitochondria, which is maintained at approximately 180 millivolts during homeostasis to ensure the correct balance of cellular respiratory function with energy synthesis (adenosine nucleotide triphosphate - ATP). Therefore, MMP loss is considered to be an indicator of mitochondrial dysfunction. MMP loss inhibits the function of mitochondrial ATP synthesis, which occurs in the inner membrane of the mitochondria and is generally is defined as an early stage of apoptosis, preceding the

apoptosis (41). Therefore, MMP evaluation and ATP quantification signal the presence of metabolically active cells. Although a statistically significant loss of MMP was observed in cHA5 and cHA37 both after 24 and 72 hours relative to the control, the loss was in a range lower than 5% of the acceptable cytocompatibility, which showed that all biomaterials at different concentrations did not induce MMP loss. This result was similar to the results of previous reports examining cellular interactions with HA/ß-tricalcium phosphate (42,43).

ATP was evaluated through a bioluminescence assay (44,45). ATP generation, for all biomaterial extracts, was higher compared to the control group. Although the elevated ATP levels should be accompanied by an increase in the MMP, such an increase was not observed in this study. Therefore, this increase in ATP generation could be related to a higher amount of Ca2 _{and PO}

43- available in the biomaterial extracts after incubation due a dissolution that was previously reported (35). Mitochondria are able to absorb an elevated amount of Ca2 _{in the presence of} PO43- (46), and both are involved in ATP synthesis, which occurs through PO4 3-inclusion on AMP and ADP molecules during cellular respiration.

ROS are unstable and highly reactive molecules, but are products of normal cellular metabolism. However, elevated intracellular ROS generation is a consequence of an imbalance in the amount of ROS and the natural antioxidant capabilities of the cell, leading to oxidative stress. In this situation, these molecules are potentially toxic to cells, and they can react, oxidize and damage other molecules, including proteins, lipids and nucleic acids (DNA). As a result, ROS can modify cellular structure and function, and ROS may become involved in inflammatory reactions and cell death through apoptosis and necrosis (47). In the

present study, all biomaterials at all concentrations did not induce oxidative stress in macrophages, in accordance with previous studies that evaluated cell/cHA interactions (48), cell/HA interactions (26, 48, 49) and cell/HA (ßtricalcium phosphate). In contrast, it was observed (15) that HA, at elevated concentrations, induced higher ROS generation. This difference in results could be related to the different cell types used in those studies. According to LIMA et al, 2011 (7) it is possible that biomaterials exerted different effects on cell viability according to cell type.

The lethal effect of nanoparticles at the cellular level is evidenced by cellular death either by apoptosis or by necrosis (26). Although a statistically significant cell death was observed at almost all biomaterial concentrations in relation to the positive control, it was in a range that was lower than the 5% acceptable cytocompatibility. Therefore, the tests showed that all biomaterials at different concentrations have a marginal biological effect above macrophage death, which shows the biomaterials that were tested are not cytotoxic to macrophages. These results are in accordance with previous studies that did not observe cell death in relation to cHA (50), HA (7, 26), HA (ßtricalcium phosphate) (42, 43), or HA associated with Zn and Cu (7). Another HA association (Fe, Pb, Sr, Co and Mg) induced cell apoptosis at significant levels (7).

Viability tests used in this study (ATP, MMP, ROS and cell death) demonstrated mitochondrial activity, which is an important parameter for assessing cellular metabolic activity. The results demonstrated no effect on mitochondria and cell function by cHA and HA. Although a significant difference between cHA and HA at certain parameters and concentrations was observed, the differences were less than 10% over the acceptable viability. These results were similar to previous

carbonated apatite (5, 12-14, 18, 19, 22, 50) as well as interactions with carbonated apatite associated with other ions (8, 51) or substances (52).

Conclusion

Nanostructured carbonated hydroxyapatite synthesized at 5°C or 37°C and sintered hydroxyapatite synthesized at 90°C did not activate THP-1 cells and did not affect activated macrophage viability, which was independent of their crystallinities, demonstrating the biocompatibility of these materials. Carbonated hydroxyapatite synthesized at 5°C and 37°C seems to be a promising biomaterial for bone tissue engineering.

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