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TÍTULO: EFEITO PROTETOR DA OLEORRESINA DE COPAIFERA RETICULATA CONTRA DANOS NO DNA EM CÉLULAS DE CÓLON DE RATOS WISTAR
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE FRANCA INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): LARISSA DANIELA RIBEIRO DE SOUZA AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): JULIANA MARQUE SENEDESE ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): DENISE CRISPIM TAVARES, JAIRO KENUPP BASTOS, RICARDO ANDRADE FURTADO
RESUMO
O uso de produtos extraídos de plantas para fins medicinais é praticado desde a civilização antiga. Entre os produtos de origem natural, os vegetais representam as maiores fontes de substâncias bioativas que podem ser usadas na terapêutica, devido à grande diversidade estrutural de metabólitos produzidos e, talvez, por ser a fonte mais antiga de medicamentos para o homem. A oleorresina das árvores de copaíba é amplamente conhecida no Brasil por sua atividade terapêutica baseada no uso popular. As propriedades farmacológicas da copaíba incluem: atividade anti-inflamatória; antioxidante; antitumoral; ação cicatrizante e potencial antisséptico. Dentre as espécies mais promissoras podemos destacar a Copaifera reticulata Ducke, pois apresenta efeito anti-inflamatório mais eficiente comparada a C. multijuga Hayne e C. cearensis Huber ex Ducke e além de aprensetar uma grande produção da oleoresina (70%). Sabendo-se que os produtos naturais representam agentes terapêuticos em potencial e que a elucidação dos mecanismos de ação pelos quais eles exercem seus efeitos biológicos constitui uma das etapas preliminares para a implementação desses agentes na prática clínica, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a genotoxidade e antigenotoxidade da oleorresina de C. reticulata em células do cólon de ratos Wistar por meio do ensaio Cometa. Para tanto, os animais foram tratados via gavage com diferentes concentrações de oleoresina da C. reticulata 20, 40 e 80 mg/Kg p.c. A citotoxicidade dos tratamentos foi avaliada pelo método dual dye. Para avaliação da antigenotoxicidade, as diferentes concentrações da oleoresina de C. reticulata foram associadas a 40 mg/kg do carcinógeno 1,2-dimetilhidrazina (DMH). Os resultados obtidos por meio das análises mostraram que a oleoresina da C. reticulata não apresentou efeito citotóxico e nem genotóxico nas concentrações testadas e efeito antigenotóxico nas doses de 40 e 80 mg/kg p.c. nas condições experimentais utilizadas. Assim, realização deste trabalho, contribui para o melhor conhecimento das atividades biológicas da oleorresina de C. reticulata, o qual é de grande importância etnofarmacológica.
Palavras-chave: Copaifera reticulata, ensaio Cometa, genototoxidade, antigenotoxidade, ratos Wistar.
INTRODUÇÃO
O uso de produtos extraídos de plantas para fins medicinais é praticado desde a civilização antiga (Seidl, 2002). Entre os produtos de origem natural, os vegetais representam as maiores fontes de substâncias bioativas que podem ser usadas na terapêutica, devido à grande diversidade estrutural de metabólitos produzidos e, talvez, por ser a fonte mais antiga de medicamentos para o homem (Balunas e Kinghorn, 2005; Santos et al., 2011).
A oleorresina das árvores de copaíba é amplamente conhecida no Brasil por sua atividade terapêutica baseada no uso popular. Botanicamente classificada como Leguminosae, gênero Copaifera, pode ser conhecida também como ‘’copaiva’’, ‘’copaibeira’’ ou ‘’pau d´óleo”, as espécies desse gênero destacam-se em função de suas aplicações farmacológicas historicamente comprovadas pela medicina popular (Veiga Jr. et al., 1997; Veiga Jr. & Pinto, 2002). Dentre as propriedades biológicas da oleorresina das espécies do gênero copaifera podemos citar, atividade anti-inflamatória (Veiga Jr. et al., 2007; Carvalho et al., 2005), antioxidante (Paiva et al., 2004), antitumoral (Lima et al., 2003; Gomes et al., 2008), além de ação cicatrizante (Oliveira et al., 2010) e potencial antisséptico (Gomes et al., 2007). A oleoresina da C. reticulata apresenta efeito anti-inflamatório mais eficiente comparada a C. multijuga Hayne e C. cearensis Huber ex Ducke (Veiga Jr. et al., 2007), De acordo com Veiga Jr. e Pinto (2002) oleoresina da C. reticulata está entre as espécies mais frequentes utilizadas na produção da oleoresina (70%). Apesar de, elementos presentes em vegetais da dieta humana, além de outros tidos como medicinais, apresentam substâncias nocivas para o organismo ( Ames et al., 1983). Plantas utilizadas por um grande número de pessoas podem possuir propriedades farmacológicas e, simultaneamente, também estar causando alterações no DNA (Marques et al., 2003). Nesse sentido, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a genotoxidade e antigenotoxidade da oleorresina de C. reticulata visando colaborar para a construção da literatura a respeito dessa planta, contribuindo para sua utilização mais efetiva e segura, e posteriormente oferecer perspectivas de aplicações clinica.
OBJETIVO
O presente trabalho teve como objetivo avaliar a genotoxidade e antigenotoxidade da oleorresina de C. reticulata em células do cólon de ratos Wistar por meio do ensaio Cometa.
METODOLOGIA E DESENVOLVIMENTO
A oleorresina da espécie Copaifera reticulata foi coletada no município de Brasil Nova, Pará, por membros da equipe do projeto temático intitulado “Validação química e farmacológica de extratos e princípios ativos de espécies de Copaifera” (Proc. n° 2011/13630-7), que tem como coordenador o Prof. Dr. Jairo Kenupp Bastos.
O carcinógeno DMH (Sigma-Aldrich, CAS:306-37-6; pureza > 99%; 40 mg/kg peso corpóreo [p.c.]) foi utilizado como indutor de danos no DNA em cólon de ratos Wistar. O DMH foi dissolvido em uma solução de EDTA (ácido diaminoetil tetra acético [37 mg/100 mL água destilada]) imediatamente antes da utilização (Agner et al. 2005).
Para a realização do presente trabalho, foram utilizados ratos machos da espécie Rattus novergicus da linhagem Wistar, de cinco semanas e pesando inicialmente aproximadamente 120 g peso corpóreo (p.c.), provenientes do Biotério Central do Campus de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Cada grupo de tratamento foi composto por seis animais. Durante o ensaio Cometa os animais foram tratados com concentrações de 20, 40 e 80 mg/kg p.c. da oleorresina de C. reticulada via gavage (1 mL/animal) durante sete dias consecutivos. No sétimo dia foi administrado subcutaneamente (s.c.) 40 mg/kg de DMH. O peso corporal e consumo de água foram medidos uma vez ao dia durante todo o período experimental. Os animais foram eutanasiados com o anestésico pentobarbital sódico (45 mg/kg; i.p.), no sétimo dia, 4 h após o tratamento com DMH ou EDTA (ácido diaminoetil tetra acético [37 mg/100 mL água destilada]). Após a avaliação macroscópica da cavidade abdominal, o cólon foi retirado, amarrado em uma extremidade, e lavado com solução salina para remover fezes. Então, a outra extremidade foi amarrada e um complexo enzimático (0,3 mg de colagenase I + 5 mg tripsina/EDTA) foi injetado no cólon. O cólon contendo o coquetel enzimático foi colocado em PBS e mantido a 37° C
em banho-maria por 40 min. Após esse período, uma extremidade do cólon foi cortada para coletar a suspensão de células (Agner et al., 2005). Aplicação do DMH ou EDTA e realização da eutanásia 4 h após.
A viabilidade celular foi determinada em uma porção da suspensão celular usando o método dual dye. Uma alíquota de 10 μL da solução corante (10 μL laranja de acridina [100 μg/mL]: 10 μL brometo de etídeo [100 μg/mL]) foi misturada com 10 μL da suspensão celular e analisadas em microscopia de fluorescência (epi-fluorescência Zeiss- Germany). As células viáveis que metabolizam o corante laranja de acridina aparecem coradas de verde, e as células inviáveis se coravam de vermelho. Um total de 200 células foram analisadas por animal. As concentrações que foram avaliadas pelo ensaio cometa, apresentaram a sua viabilidade ≥ 95% (Lima et al., 2005).
A obtenção das células do cólon de ratos Wistar foi realizada de acordo com Ward et al. (1997).
Para cada tratamento, a extensão e distribuição de danos no DNA indicado pelo ensaio cometa foi avaliada em 100 nucleoides selecionados aleatoriamente e não sobrepostos nas lâminas. Para cada lâmina, os nucleoides eram visualmente marcados e classificados em uma das quatro classes (0, 1, 2 e 3) e de acordo com o tamanho da cauda, do seguinte modo: classe 0, não danificada (sem cauda); classe 1, uma cauda curta, cujo comprimento era menor que o diâmetro da cabeça (núcleo), classe 2, comprimento da cauda entre 1 e 2 vezes o diâmetro da cabeça, e classe 3, maximamente danificados: uma longa cauda com mais de duas vezes o diâmetro da cabeça. Os poucos cometas que não contenham cabeça e aqueles com DNA quase todo na cauda, ou com uma cauda muito ampla, foram excluídos da análise, uma vez que podem corresponder a células mortas (Hartmann e Speit, 1997).
Para a avaliação da antigenotoxicidade, foi calculada a porcentagem de redução no escore do cometa usando a seguinte fórmula a proposta por Manoharan e Banerjee (1985).
Escore = (1 x n1) + (2 x n2) + (3 x n3)
Os dados foram analisados estatisticamente por análise de variância para experimentos inteiramente aleatorizados, com o cálculo da estatística F e de seu
respectivo “p-value”. Nos casos em que P < 0, 05, as médias de tratamentos foram comparadas pelo método de Tukey, com o cálculo da diferença mínima significativa para α = 0,05.
RESULTADOS PRELIMINARES
As frequências de danos no DNA em células de cólon de ratos expostos ao tratamento com a maior dose de C. reticulata avaliada (80 mg/kg) e as três doses (20, 40 e 80 mg/kg) associadas ao carcinógeno DMH estão apresentadas nas Tabela 1 e Figura 1. Os resultados mostraram que os animais tratados com a dose de 80 mg/kg da oleorresina e aqueles tratados com solução solvente (Tween 80 – 1%) apresentaram frequências de danos ao DNA que não diferiram significativamente daquelas do controle negativo. Como esperado, a extensão dos danos de DNA para o grupo que recebeu apenas DMH foi significativamente maior do que para o controle negativo.
Os animais tratados com as diferentes doses (20, 40 e 80 mg/kg) da oleorresina de C. reticulata, associadas ao DMH, apresentaram frequências de danos no DNA estatisticamente significativas em comparação ao controle positivo. A porcentagem de redução na frequência de danos ao DNA variou de 50,40% a 45,46%. Foi observado relação dose-dependente estatisticamente significativa entre os grupos tratados com C. reticulata e DMH, para as doses de 40 e 80 mg/kg. Não houve diferença significativa na frequência de danos no DNA entre os animais tratados com a solução de solvente mais DMH e controle positivo (Tabela 1, Figura 1).
Para o protocolo de genotoxidade, a classe de cometa mais frequente foi a classe 0 e a de menor frequência a classe 3. Na avaliação da antigenotoxicidade, os animais tratados com as diferentes doses da oleorresina de C. reticulata associada ao carcinógeno DMH apresentaram os danos de classe 1 com mais frequência e a classe 3 com menor frequência. Nos animais tratados com DMH e Tween + DMH, a maioria dos danos foram de classe 2 (Tabela 1).
No protocolo de viabilidade celular pelo método dual dye, todos os tratamentos apresentaram viabilidade maior que 96%, demonstrando assim ausência de citotoxicidade (Tabela 2).
Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada no peso corpóreo inicial, peso corpóreo final, ganho de peso e consumo de água obtidos nos diferentes grupos de tratamentos durante o experimento.
Tabela 1: Frequências médias de nucleóides observadas em cada classe cometa em células de cólon de ratos Wistar tratados com as diferentes doses da oleorresina de C. reticulata e/ou DMH, e seus respectivos controles.
Tratamentos Classe do Cometa Escore* %
(mg/Kg/p.c.) 1 2 3 4 Redução Controle (EDTA) 106,0±15,1 65,8±12,5 19,2±5,8 9,0±2,5 131,2±21,9 - Tween 95,2±10,4 82,8±13,5 13,4±8,7 7,8±3,8 130,0±14,4 - 80 81,2±13,8 83,8±5,7 15,4±6,6 13,2±7,3 151,4±25,3 - DMH 33,1±10,6 35,0±8,3 51,2±9,8 80,8±13,8 379,8±41,4a - Tween+DMH 25,8±12,9 42,2±5,4 45,4±11,5 88,6±12,0 402,0±47,8a - 20+DMH 31,2±8,3 53,4±8,0 38,4±18,9 77,2±16,1 361,8±16,6a - 40+DMH 39,6±5,1 64,0±12,1 74,6±8,3 21,8±5,8 254,4±31,5ab 50,40 80+DMH 51,2±13,1 66,0±22,5 48,2±20,7 34,6±6,6 266,2±39,2ab 45,56
Foram analisados 100 nucleóides por animal, correspondendo a 600 nucleóides por tratamento. *Escore: 0 (classe 0) + 1(classe 1) + 2(classe 2) + 3(classe 3).
EDTA= ácido etileno tetra acético (37 mg/100 mL água destilada); Tween 80 – 1%; DMH – 1,2 dimetilhidrazina (40 mg/kg).
a
Significativamente diferente do grupo controle (P<0,05).
a
Significativamente diferente do grupo DMH (P<0,05).
Tabela 2: Valores médios de células viáveis e não viáveis obtidas pelo método dual dye em células de cólon de ratos.
Foram analisadas 200 células por animal, somando um total de 1.200 células por tratamento. Valores são médias ± desvio-padrão.
Tratamentos (mg/kg)
Células viáveis Células não viáveis Viabilidade (%)
Controle (EDTA) 198 ± 1,4 2,0 ± 1,4 99,0 Tween 80 195 ± 1,4 5,0± 1,4 97,5 80 197 ± 0,7 2,5 ± 0,7 98,7 DMH 194 ± 1,7 5,5 ± 1,7 97,2 Tween + DMH 196 ± 0,9 3,2 ± 0,9 98,3 20 + DMH 193 ± 2,0 7,0 ± 2,0 96,5 40 + DMH 195 ± 1,2 4,2 ± 1,2 97,8 80 + DMH 196 ± 1,8 3,2 ± 1,8 98,3
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Diante dos resultados obtidos com análise de danos no DNA de células do cólon de ratos Wistar após o tratamento com oleoresina de C. reticulata, concluiu-se que:
- os animais tratados com as três doses de C. reticulata não apresentaram aumento estatisticamente significativo quando comparados às frequências de danos no DNA encontradas nos animais dos grupos controles negativo e solvente (Tween), indicando a ausência de potencial genotóxico;
- a viabilidade celular foi superior a 96% nos diferentes tratamentos, revelando ausência de citotoxicidade.
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