Dedico este trabalho
a minha família
.AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural, em especial às Dras. Laurecir Gomes e Maria Julia Marques, coordenadoras do curso durante o período de tese, e à Líliam A. S. Panagio, pelo apoio e compreensão demonstrados.
Ao Dr. Marcos Buckeridge pela orientação, paciência e dedicação.
À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de doutorado concedida.
À Universidade Estadual de Campinas, ao Instituto de Botânica de São Paulo (IBt) e à Universidade de São Paulo pela indispensável infra-estrutura oferecida.
Ao Dr. Angelo Luiz Cortelazzo por ter me recebido em Campinas e me apresentado à Unicamp. Aos Drs. Marcos P. M. Aidar e Marco A. Tiné, da Seção de Fisiologia do IBt, pelas importantes contribuições neste trabalho.
Às pesquisadoras da Seção de Anatomia e Morfologia do IBt, Dras. Solange C. Mazzoni-Viveiros, Edenise S. Alves e Agnes E. Luchi pelo apoio e disponibilidade de equipamentos e reagentes.
Aos Drs. Antonio Salatino, Maria Luíza Salatino e Gina pelas importantes contribuições aos estudos das ceras epicuticulares.
À Mourisa, Cíntia e Anary, do Laboratório de Fitoquímica do Departamento de Botânica da USP, à Maria Manoel, técnica da Seção de Anatomia e Morfologia do IBt, e a Waldir Caldeira, do Instituto de Biologia da USP, pelo apoio e paciência dispensados.
Aos estagiários e pós-graduandos do IBt, em especial a Andréa, Telma e Renata pelos ensinamentos das técnicas de histologia.
À Fernanda Tresmondi pela amizade, apoio e dedicação nas horas mais difíceis.
Aos amigos Giovanna (amiga sempre presente), Mauro Marabesi, Mari Ionashiro, João Godoy, figuras que conheci nesse período, amigos pra toda vida.
SUMÁRIO
RESUMO... 1
ABSTRACT... 2
INTRODUÇÃO... 3
O estudo no contexto das mudanças climáticas: um breve histórico... 3
Efeitos da alta [CO2] em plantas... 9
Fisiologia e crescimento... 12 Aspectos morfológicos... 14 Desenvolvimento estomático... 22 As espécies investigadas... 28 Justificativa... 30 Da temática... 30 Da metodologia...... 32 Objetivos... 32 Gerais... 32 Específicos... 32 MATERIAL E MÉTODOS... 33
Cultivo das plântulas em diferentes concentrações de CO2... 33
Medidas de crescimento... 35
Análises microscópicas... 35
Diafanização...... 35
Análise histológica... 36
Microscopia eletrônica de varredura... 37
Determinação quantitativa da cera epicuticular... 38
Determinação qualitativa da cera epicuticular... 39
Análises estatísticas... 40
RESULTADOS E DISCUSSÃO... 40
Efeitos sobre o crescimento... 40
Efeitos no número de estômatos... 46
Efeitos ultra-estruturais... 49
Efeitos sobre a cera epicuticular... 54
CONSIDERAÇÕES FINAIS... 59
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 74
RESUMO
A concentração atmosférica de dióxido de carbono (CO2) aumentou de 280 ppm, à época da
Revolução Industrial, para cerca de 370 ppm atualmente, e continua a aumentar cerca de 1,8 ppm ao ano. Os efeitos dessa elevação no sistema climático global têm atraído considerável atenção, mas ainda não há informações suficientes sobre como essas mudanças podem afetar as espécies arbóreas tropicais, em especial na estrutura dessas plantas, componente relevante no sucesso competitivo e fisiológico dos vegetais. Nesse estudo são apresentados dados de análises estruturais, ultra-estruturais e bioquímicas de folhas de duas espécies tropicais − o jatobá da mata
Hymenaea courbaril e o do cerrado H. stigonocarpa − expostas à elevada concentração de CO2.
Após cem dias de exposição em câmaras de topo aberto, as espécies demonstraram ser reativas ao aumento da [CO2], especialmente H. stigonocarpa. Essa alteração atmosférica resultou em maior
crescimento das plantas, com significativa redução do número de estômatos e aumento dos parênquimas fotossinteticamente ativos, especialmente do paliçádico. A análise quantitativa da cera epicuticular indicou haver variação, porém não significativa, da cera bruta total das espécies. A cromatografia gasosa e a espectrometria de massa mostraram que a cera epicuticular das duas espécies é constituída, principalmente, por nonacosanos e triterpenódes de provável função alcoólica. Os estudos ultra-estruturais evidenciaram alterações na morfologia dos cloroplastos, em decorrência do aumento na deposição de amido, nos exemplares submetidos à elevada [CO2],
mas não há evidências de que esse depósito afete o desenvolvimento do vegetal. Também houve alteração na morfologia da cera epicuticular. As técnicas microscópicas e bioquímicas adotadas mostraram-se úteis na determinação de respostas de plantas tropicais a elevadas concentrações de CO2, constituindo-se em ferramentas de aplicação viável em estudos de mudança climática.
ABSTRACT
The atmospheric concentration of carbon dioxide (CO2) increased from 280 ppm, during the
Industrial Revolution period, to about 370 ppm in the nowadays. It is continuing to increase about 1.8 ppm per year. The effect of this rise in CO2, which is leading to global warming have
attracted considerable attention, generating reports on how these changes can affect vegetables, in particular tropical trees species. There are few reports on the consequences of the rise in atmospheric CO2 on plant structure, even considering its relevance for the competitive and
physiological success of plants. In this study we present the data about structural, ultrastructural and biochemical analyses of seedlings from two tropical species – the jatobá Hymenaea courbaril and H. stigonocarpa – both exposed to high CO2 concentration. After one hundred days of
exposure to elevated CO2 (720 ppm) in open top chambers, the species demonstrated to be
reactive, in particular the H. stigonocarpa. This atmospheric alteration resulted in slightly higher plant growth, with significant reduction of the number of stomata and increase of the photosynthetically active tissues, especially of the palissadic layer of the leaves. The quantitative analysis of the epicuticular wax indicated no variation in the species. Gas chromatography and mass spectrometry analyses have shown that the epicuticular wax of the two species is constituted mainly of nonacosans and triterpenoids of probable alcoholic function. The ultrastructural studies revealed alterations in the morphology of the epicuticular wax, and of the chloroplasts the later due to the increase in starch deposition, in the samples submitted to increased CO2 concentration. However, there were no evidences that these changes affect plant
development as a whole. The microscopical and biochemical techniques used were useful in determining the responses of tropical plants to the increase of CO2 concentrations, being
INTRODUÇÃO
O estudo no contexto das mudanças climáticas: um breve histórico.
A expressão ‛aquecimento global’ tem aparecido com bastante freqüência nos vários tipos de mídia, chamando a atenção de leigos a especialistas, ainda que a ciência já venha alertando para o problema desde o século XVII. No plano político, falou-se da questão por ocasião da primeira Conferência Mundial sobre o Clima, realizada em 1979 em Genebra; na década seguinte com a assinatura da convenção da ONU sobre mudança climática, a Eco-92, no Rio de Janeiro; e em 1997 com a negociação do Protocolo de Kyoto (Kandel, 2007).
Por definição, ‛clima’ e ‛sistema climático’ são diferentes. O sistema climático é mais complexo e interativo, pois consiste de elementos presentes na atmosfera, na superfície terrestre e em corpos d’água, além dos organismos que habitam o planeta, enquanto clima é usualmente descrito por variáveis de temperatura, precipitação e dinâmica dos ventos ao longo de um período que pode ser de meses a milhões de anos. Dessa forma, o sistema climático sofre influência de sua própria dinâmica interna e de fatores externos – forcings1–, que incluem fenômenos naturais como erupções vulcânicas e variações solares, bem como mudanças induzidas por atividades antrópicas na composição atmosférica (Le Treut et al., 2007).
O sistema climático sofre efeito da radiação solar, sendo três os mecanismos fundamentais que podem agir: mudanças na órbita terrestre, na radiação que é refletida da superfície do planeta (albedo), e mudanças na concentração de gases de efeito estufa, que alteram o comprimento de onda da radiação refletida da Terra de volta para o espaço. Se o planeta refletisse toda a energia
1 Forcing Radioativo (RF) – Conceito usado para comparações quantitativas da força de diferentes agentes (naturais
que recebe do Sol, sua superfície teria uma temperatura média de -19°C, valor bem diferente da média que conhecemos (+14°C). A razão dessa diferença está na presença de gases que agem bloqueando parcialmente a energia refletida pela superfície, evitando que esta retorne ao espaço (Fig. 1). É o chamado ‛efeito estufa’, e seus mais importantes elementos são o dióxido de carbono (CO2) e o vapor d’água (Le Treut et al., 2007).
Figura 1. Modelo esquemático do efeito estufa natural. As setas amarelas indicam radiação solar de comprimentos de onda curtos, essencialmente ultravioleta, enquanto as vermelhas a refletida pela superfície terrestre (infravermelho) (Le Treut et al., 2007).
Outro componente importante são as nuvens, que absorvem a radiação infravermelha emitida pela Terra, aquecendo-a, mas também absorvem a radiação ultravioleta do Sol, contribuindo para o resfriamento do planeta. Mudanças no seu aspecto, tais como tipo, localização, conteúdo de água, altitude, forma e tamanho das partículas afetam o grau com que as nuvens aquecem ou resfriam a superfície terrestre. Isso alerta para a complexidade do tema e reforça a necessidade de mais pesquisas para melhor compreendê-lo (IPCC, 2001).
As atividades humanas têm intensificado os efeitos desses gases ao elevar a concentração de alguns de seus componentes (Buckeridge & Aidar, 2002), principalmente após o advento da era industrial, no século XVIII (Fig. 2). Modelos de reconstrução climática de longos períodos (Fig. 3) indicam que o planeta realmente está mais quente. Primariamente, esses aumentos são devidos à queima de combustíveis fósseis e ao desflorestamento, o que têm alterado a composição química da atmosfera com substancial implicação sobre o sistema climático global (Hugues, 2000).
Além do CO2 e do vapor d’água, outros importantes elementos que exercem efeito estufa são o
metano (CH4), o óxido nitroso (N2O) e os clorofluorcarbonos (CFCs) (Tabela 1), gases com alto
potencial de aquecimento global (Foster et al., 2007). A concentração de dióxido de carbono − [CO2] − prevista para o ano de 2100 varia de 540 ppm (partes por milhão) a 970 ppm, elevação
relevante se comparada aos 280 ppm do período pré-industrial e 368 ppm do ano 2000. Entretanto, cenários incertos, como a persistência do processo de desflorestamento e a magnitude do feedback climático na biosfera, causam variação na estimativa da [CO2] para o ano 2100, entre
490 e 1260 ppm (75 a 350% de aumento em relação ao período pré-industrial) (Gitay et al., 2002). Para Prentice (2001), as previsões indicam concentrações próximas a 720 ppm para a metade do século XXI.
Figura 2. Concentrações atmosféricas de importantes gases de efeito estufa nos últimos 2000 anos. Aumentos registrados desde 1750 são atribuídos a atividades antrópicas da era industrial (Foster et al., 2007).
Figura 3. Reconstrução da temperatura anual média da superfície terrestre no hemisfério norte no último milênio. Tendência linear (linha branca) entre os anos 1000 e 1850. A área cinza representa erro padrão (Hugues, 2000).
Tabela 1. Alterações recentes nas concentrações de alguns dos principais gases de efeito estufa e respectivo forcing radioativo. Os dados mostram as concentrações atmosféricas de dióxido de carbono (CO2), metano (CH4), óxido de nitrogênio (N2O) e de três tipos de clorofluorcarbonos (CFCs), suas contribuições na mudança climática (forcing radioativo) e sua evolução de 1998 a 2005. Unidades: a ppm,
b ppb, c ppt. Em parênteses, a variação percentual. (Modificado de Foster et al., 2007).
Alterações nas concentrações Forcing radioativo
Gás 1998 2005 1998 2005 (W m-2) CO2 a 338 379 (13%) 1,48 1,66 (13%) CH4 b 1,6 1,7 (11%) ND 0,48 N2O c 303 319 (5%) 0,14 0,16 (11%) CFC-11 c 258 251 (3%) 0,063 0,06 (5%) CFC-12 c 518 538 (4%) 0,15 0,17 (1%) CFC-113 c 83 80 (4%) 0,022 0,02 (5%)
A observação de que a atmosfera age como uma estufa, permitindo a passagem de radiação e retendo parte do calor, foi registrada no século XVII por Edme Mariotte. Dois séculos mais tarde, em 1859, John Tyndall notou que mudanças na concentração de componentes atmosféricos radioativamente ativos, como CO2 e água, poderiam produzir as mudanças climáticas, então
citadas em estudos geológicos prévios. Em 1895, o químico sueco Svante Arrhenius observou que a combustão crescente de combustíveis fósseis (carvão, gás e petróleo) aumentaria a quantidade de CO2 na atmosfera, e formulou a hipótese de que isso reforçaria o efeito estufa e
acarretaria em reaquecimento da superfície do planeta. Em 1938, por meio de cálculos matemáticos, Callendar postulou que dobrando a concentração de CO2 atmosférico, a temperatura
elevação da [CO2] à queima de combustíveis fósseis e a seu efeito estufa. A partir de 1957
Charles David Keeling inicia longa série de medições sistemáticas e precisas da concentração atmosférica de CO2, confirmando a hipótese de Arrhenius: a concentração média anual do gás
passou de 315 ppm, em 1958, para 330 ppm, em 1974. Desde 2001 a concentração média de CO2
ultrapassa 370 ppm (Le Treut et al., 2007).
De acordo com projeções do Painel Intergovernamental de Mudanças Climáticas (IPCC), criado pela ONU em 1988, o aumento da temperatura média da superfície terrestre até 2100 estará entre 1,4°C e 5,7°C, e se essa previsão se confirmar, o planeta passará por alterações tão radicais quanto as que puseram fim ao último período glacial. Entretanto, enquanto nesse período a mudança natural levou milhares de anos para acontecer, o aquecimento observado atualmente pode ocorrer em pouco mais de um século. E uma das razões apontadas para esse rápido aquecimento seriam as atividades humanas sobre o meio, como crescimento populacional, desmatamento nos trópicos, expansão das atividades agrícolas e pecuárias, ampliação de áreas urbanas e industriais, entre outras (Kandel, 2007).
Em reuniões políticas, o atual governo norte americano coloca em dúvida a participação humana no recente aquecimento climático do planeta. Entretanto, sua Agência de Proteção Ambiental – US Environmental Protection Agency – alerta que as atividades humanas, em especial as emissões industriais, mudaram a composição da atmosfera e, provavelmente, estão influenciando o clima da Terra, mesmo considerando que fatores naturais, como erupções vulcânicas, tiveram participação no processo (www.epa.gov/climatechange. Acesso em 20/09/2007).
Em recente estudo que utilizou séries anuais (1980 a 2004) de emissão de CO2, consumo de
energia primária, crescimento populacional e das riquezas de países como EUA, Japão, China, Índia, países da Comunidade Européia, entre outros, Raupach et al. (2007) afirmam que as emissões de CO2 previstas nos relatórios do IPCC estão subestimadas. Para os autores, as taxas
de emissão do gás cresceram de 1,1% ao ano na década de 90, para mais de 3% ao ano (mais de 2 ppm/ano), entre 2000 e 2004. Esse crescimento, observado em países pouco desenvolvidos e em desenvolvimento, como a China, teria sido impulsionado por expansão econômica mais expressiva, traduzida por maiores renda per capita e PIB, e ainda sustentada por demanda energética baseada em combustíveis fósseis e carvão. Outra constatação foi que tanto países em desenvolvimento como os desenvolvidos aumentaram suas emissões de CO2, e que, portanto,
nenhuma região está “descarbonizando” sua matriz energética, a despeito de todos os alertas da comunidade científica.
Efeitos da alta [CO2] em plantas.
As evidências de que o aumento da concentração atmosférica de gases de efeito estufa, em especial o CO2, trará efeitos para o clima do planeta têm atraído esforços em vários ramos da
ciência. Climatologistas procuram identificar se as mudanças atuais são decorrentes de atividades antrópicas ou de variáveis naturais, e, dessa forma, elaborar cenários climáticos para o futuro. Para ecologistas e fisiologistas, o desafio é prever os efeitos dessas mudanças nas espécies e comunidades, já que alterações na concentração de CO2, na temperatura e no ciclo das chuvas
podem afetar diretamente processos biológicos como fotossíntese, respiração, crescimento e a composição dos tecidos das plantas. Efeitos na distribuição das espécies e na fenologia também não são descartados. Em suma, se confirmadas, essas mudanças inevitavelmente alterarão a competição e a interação entre as espécies (Hugues, 2000).
Diversos componentes do sistema climático, entre eles os oceanos e a biota, afetam as concentrações atmosféricas de gases de efeito estufa. Os vegetais formam um exemplo importante, pois são organismos que retiram CO2 da atmosfera e o convertem, na presença de
água, em carboidratos (Le Treut et al., 2007).
Fotossíntese e, por conseqüência, crescimento e produtividade, são diretamente afetados pelo CO2, que parece exercer efeito fertilizante nas plantas. Esse efeito é mais evidente em espécies de
clima temperado, como coníferas, onde o carbono fixado é primariamente alocado no câmbio vascular. Entretanto, em espécies tropicais, eventuais adições de biomassa são mais distribuídas pela planta (Phillips et al., 1998).
São amplamente conhecidos os efeitos diretos do CO2 atmosférico nas atividades
fotossintetizantes e de uso da água pelas plantas (Jarvis et al., 1999; Teng et al., 2006). Dessa forma, a elevação da concentração desse gás potencialmente afetará a vegetação e os ecossistemas, tanto florestais como agrícolas. Analisar as respostas vegetais torna-se, portanto, componente essencial para compreensão dos efeitos das mudanças globais.
Amostras de herbários e fósseis de plantas (Paleobotânica) podem oferecer indícios da atmosfera de outros séculos e de eras geológicas, respectivamente. Registros obtidos a partir de bolhas de ar aprisionado em gelo polar, particularmente na Antártica, têm mostrado que a concentração atmosférica de CO2 oscilou entre 180 e 280 ppm em ciclos de 100 mil anos. Os
estudos que determinam a concentração de gases da paleo-atmosfera são divididos em dois grupos. O primeiro é baseado em modelagem geoquímica do ciclo do carbono em milhões de anos, invocando vulcanismo e tectônica. O segundo usa indicadores geoquímicos e paleobiológicos, e é neste que segmentos de plantas fossilizadas são utilizados para estimar níveis
milenares de CO2. Amostras de herbário, por sua vez, permitem predizer se a atmosfera do
período pré-industrial, reconhecidamente com menor concentração de CO2, alterou aspectos das
plantas, como o número dos estômatos das suas folhas, por exemplo. São, portanto, abordagens de estudo do clima de tempos passados (Beerling & Royer, 2002).
Algumas abordagens metodológicas vêm sendo aplicadas desde o início dos trabalhos sobre os efeitos da elevação do CO2 atmosférico em plantas. No início, apenas espécies de interesse
econômico, em sua maior parte hortaliças, eram submetidas a condições especiais de crescimento. Com a evolução do sistema de câmaras, espécies arbóreas passaram a ser examinadas em experimentos com parâmetros ambientais controlados (Ceulemans & Mousseau, 1994).
Essas estruturas, entretanto, limitam o estudo de árvores adultas e de áreas florestais, o que foi parcialmente resolvido com a técnica que submete individualmente ramos de árvores adultas a condições estabelecidas e controladas. A técnica (branch bag) envolve um ramo da árvore numa bolsa, no interior da qual condições ambientais como concentração de CO2 e temperatura podem
ser controladas. Por sua vez, assume-se como válida a teoria da autonomia do ramo em relação ao restante do vegetal (Sprugel et al., 1991), o que é questionável, em especial quando se consideram as espécies decíduas.
O sistema FACE (Free-Air CO2 Enrichment), outra abordagem de estudo, foi desenvolvido
para excluir as limitações dos sistemas anteriores (como diferenças relativas ao solo, por exemplo), e submeter grupos de plantas a elevadas [CO2]. Entretanto, seus custos de investimento
As câmaras de topo aberto (ATCs), originalmente utilizadas em estudos de poluição atmosférica, constituem o sistema de atmosfera controlada mais utilizado, ainda que seja necessário considerar diferenças com o meio, como temperatura, umidade relativa e ação dos ventos.
Fisiologia e crescimento.
Muitos dados fisiológicos foram obtidos a partir da condução de experimentos como os descritos acima. Em espécies arbóreas expostas à elevada [CO2], observou-se uma tendência
geral de aumento do crescimento, resultante de aporte extra de assimilados distribuídos em diferentes estruturas da planta, conduzindo a modificações na razão raiz/parte aérea (Poorter, 1993), e indicando haver preferência de estocagem extra nas raízes em detrimento do restante do vegetal (Rogers et al., 1992). O maior investimento em raízes parece ser uma resposta à necessidade de maior aquisição de nutrientes minerais em solos pobres. Entretanto, Petterson et
al. (1993) não encontraram associação entre alta [CO2] e diferenças na massa seca de raiz e caule
de Betula pendula.
O aumento nas taxas fotossintéticas e a melhora nas relações hídricas, observados nas plantas cultivadas em elevado teor de CO2, normalmente geram incrementos de biomassa e altura nestas
plantas, respectivamente 49% e 12% maiores do que nas plantas cultivadas em atmosfera com concentração de CO2 ambiente (Ainsworth & Long, 2005). Aidar et al. (2002), estudando
plântulas do jatobá Hymenaea courbaril, também encontraram alterações na relação raiz:parte aérea, decorrentes das mudanças no conteúdo de biomassa dos diferentes tecidos, quando as plantas foram cultivadas em ambiente com elevada [CO2].
Estudos de alterações de componentes da parede celular em plantas crescidas em elevada [CO2], em especial da celulose, são importantes na medida em que o acúmulo de celulose nos
vegetais é uma forma de seqüestro de carbono (Buckeridge & Aidar, 2002). Ao estudar árvores de carvalho, Aranda et al. (2006) encontraram diferenças significativas no conteúdo de celulose em folhas, mas não observaram mudanças nos teores de lignina e hemiceluloses. Um aumento no conteúdo de celulose (aproximadamente 33% em folhas e 19% em caules) também foi observado em plântulas de jatobá crescidas em atmosfera com 720 ppm de CO2 (Gaspar & Buckeridge,
comunicação pessoal). Em folhas de Arabidopsis o aumento desse composto foi de 22% (Teng et
al., 2006).
Espécies expostas por longos períodos (semanas ou meses) a altas concentrações de CO2
podem aclimatar, reduzindo sua atividade fotossintetizante. Prevalece o conceito de que nessa condição atmosférica aumenta a quantidade disponível de carboidratos, e a planta responde a esse aumento de diferentes formas, dependendo de sua capacidade de estocagem. Em determinadas espécies, a capacidade fotossintetizante permanece alta durante longo período de exposição em elevado teor de CO2, em vista de sua capacidade genética em aumentar o tamanho ou o número
de alguns órgãos de estocagem (Ceulemans & Mousseau, 1994). Novos drenos de carbono, como folhas, podem surgir, como no caso de Fagus sylvatica (El Kohen et al., 1993), mas em outras espécies pode haver um modelo de crescimento determinado geneticamente que conduz ao processo de aclimatação (Mousseau & Enoch, 1989).
Smith & Stitt (2007) propõem que respostas de aclimatação ajustem o balanço entre fornecimento e consumo de carbono, coordenando a partição dos produtos da fotossíntese, sua taxa de utilização de amido no escuro e a taxa de crescimento. As respostas de aclimatação ainda permitiriam ajustes em situações de mudanças ambientais que afetassem a disponibilidade de
carbono, de forma a otimizar o crescimento vegetal. Estas respostas requerem mecanismos que identifiquem o nível de carbono disponível na planta (sugar sensing), o convertam em sinal metabólico que, ligado à molécula específica, desencadeia eventos em cascata que culminam em controle do crescimento e balanço de carbono.
Aspectos morfológicos.
Dentre os órgãos da planta, a folha é o que apresenta a maior diversidade, exibindo grande plasticidade estrutural em resposta a diferentes condições ambientais (Esau, 1977). Seu desenvolvimento é crucial à planta na medida em que é responsável pela interceptação da luz, fotossíntese, uso da água e, em última instância, pela produtividade total da planta. Em outro contexto, suas características anatômicas, ultra-estruturais e bioquímicas definem o índice de produtividade de uma floresta, que pode ser, portanto, impactado pela elevação da [CO2] na
atmosfera (Pritchard et al., 1999).
Dos parâmetros utilizados na investigação dos eventuais efeitos da alta [CO2] em plantas, a
área foliar é um dos mais visados na medida em que é um importante componente na determinação da produtividade total dos vegetais, já que a interceptação da luz, relacionada à fotossíntese, é também determinada pelo índice de área foliar (Ewert, 2004). O crescimento das folhas envolve produção e expansão celular, e é possível que esses dois processos sejam influenciados por um aporte adicional de CO2. Entretanto, a resposta não parece ser única para
todos os grupos.
Em Ranasinghe & Taylor (1996) encontramos que o crescimento da área foliar de Phaseolus
vulgaris exposto à elevada [CO2] ocorreu como resultado de aumento da expansão celular,
confirmação do efeito positivo do aumento da [CO2] na expansão celular de clones de Populus,
mas o tamanho das células epidérmicas de folhas totalmente expandidas não foi influenciado pelo alto teor de CO2, sugerindo que a produção de novas células pode ter contribuído para o
crescimento das folhas. Há evidências sugerindo que o carbono, provavelmente da sacarose, age como molécula reguladora permitindo às células um ciclo de divisão mais rápido em raízes (Taylor et al. 1994).
Outro componente das folhas que responde a diferentes tipos de estresse é a cera cuticular, que tem em Shepherd & Griffiths (2006) uma importante revisão. O interesse por essa estrutura dos vegetais decorre principalmente da ação das ceras como barreiras protetoras contra uma ampla gama de estresses abióticos, entre eles, a elevação da concentração atmosférica de CO2.
A cutícula, uma camada delgada que recobre as folhas (Fig. 4), é composta por polímeros de ácidos graxos de 16 e 18 carbonos que formam uma matriz (cutina), onde são encontrados microfibrilas de celulose, oligossacarídeos e ceras. Esta camada consiste predominantemente de hidrocarbonetos de cadeia longa, incluindo alcanos, álcoois primários e secundários, aldeídos, cetonas, ésteres e outros compostos derivados, constituindo a primeira barreira entre a planta e o meio. Uma nova camada de cera pode ser depositada sobre a cutícula, formando a cera epicuticular (Willmer & Fricker, 1996). Dadas as suas características bioquímicas, o desenvolvimento de uma cutícula impermeável foi fundamental para o sucesso de colonização das plantas no ambiente terrestre, por ter função primordial no controle da perda de água (Shepherd & Griffiths, 2006).
Figura 4. Esquema de seção transversal de membrana cuticular típica de uma folha madura (Gülz, 1994).
A biossíntese e o mecanismo de deposição da cera cuticular envolvem complexas reações químicas ainda não completamente elucidadas. O passo inicial é a formação de malonil-CoA a partir de acetil-CoA, reação catalisada pelo sistema enzimático multifuncional acetil-CoA carboxilase, com a participação do CO2. Em etapa subseqüente, cadeias acil de 16 a 18 carbonos
são formadas e incorporadas aos complexos lipídicos celulares, cutina, suberina e componentes da cera; em seguida são hidrolisados por tioesterases, e os ácidos graxos resultantes são transportados através da membrana dos cloroplastos. Alongamento e modificações na cadeia acil ocorrem por meio de reações enzimáticas no citosol das células epidermais; são, portanto, sistemas enzimáticos extra-plastidiais (Gülz, 1994).
A maioria dos componentes da cera surge de reações de redução, que formam álcoois primários, ácidos graxos livres e cetoaldeídos, e de decarboxilação, formando alcanos, álcoois secundários e cetonas (Kunst & Samuels, 2003). No citosol das células epidermais, os sítios das reações químicas estão no retículo endoplasmático, no aparelho de Golgi e na membrana celular.
Os compostos formados atravessam essas estruturas, provavelmente por meio de vesículas, para então se depositarem na superfície cuticular. A passagem de componentes da cera através da parede celular e da cutícula provavelmente ocorre por difusão, por meio de espaços de dimensões moleculares e canais de abertura temporária (Kunst & Samuels, 2003).
De modo geral, vistas ao microscópio eletrônico de varredura (MEV), as ceras epicuticulares têm estrutura microcristalina, algumas vezes surgindo de uma camada amorfa interna (Bianchi, 1995). O aspecto das ceras epicuticulares vem sendo investigado para diversos fins. Barthlott et
al. (1998) fizeram uso de MEV de alta resolução para identificar e classificar 23 tipos de ceras, propondo estruturas na forma de hastes, fitas, filamentos, tubos e placas, sendo que algumas dessas podem ser relacionadas à presença de compostos específicos, como álcoois primários, secundários, ésteres entre outros.
A base química e o tamanho das ceras variam entre as espécies. Em Rubus fruticosus a cera epicuticular consiste de álcoois livres, ésteres e acetatos alcoólicos, com menor quantidade de ácidos graxos livres e alcanos. Já em Prunus lauroceratus, a cera epicuticular consiste em compostos alifáticos, ao passo que a cuticular, primariamente, de triterpenóides (Jetter et al., 2000).
Intensidade luminosa, temperatura e umidade são fatores que também influenciam a morfologia das ceras, favorecendo uma ou outra forma estrutural. Altas temperaturas, por exemplo, favorecem estruturas paralelas à superfície da cutícula, como placas e escamas, enquanto baixas temperaturas, hastes e tubos. Estruturas já estabelecidas podem mudar de forma sob determinadas condições. Formas tubulares são termodinamicamente instáveis, e, sob efeito de calor excessivo, transformam-se em estruturas planares e estáveis (Shepherd & Griffiths,
2006). Estes dados ainda são incertos, dadas as variações nas respostas dos vegetais, mas merecem atenção em estudos que investiguem os efeitos da elevação do teor de CO2, porque tal
modificação atmosférica deverá vir acompanhada de alterações na temperatura e na umidade, por afetar o ciclo das chuvas e a exposição aos raios UV-B (Long et al., 2004).
As respostas do conteúdo e da composição da cera foliar à elevação da [CO2] são variáveis.
Vanhatalo et al. (2001) encontraram relação direta entre esse aumento e a espessura da cera em
Betula pubescens. Já em Pinus palustris (Prior et al., 1997) e em Agave deserti (Graham & Nobel, 1996), houve redução da cera em condições de elevação da [CO2]. Nota-se alguma
contradição nos relatos das respostas das plantas aos diferentes estresses ambientais, em especial ao alto teor de CO2.
Outro importante elemento presente na resposta dos vegetais às variáveis ambientais são os estômatos, estruturas formadas por duas células-guarda presentes na epiderme e essenciais à sobrevivência das plantas, pois controlam a entrada de CO2 e otimizam a eficiência do uso da
água. Embora presentes em todos os órgãos da parte aérea revestida por epiderme, são mais comuns nas folhas. Nelas, estão presentes nas faces abaxial (folhas hipostomáticas), adaxial (epistomáticas), ou em ambas (anfiestomáticas). Cada estômato é originado por uma série de divisões que constituem um ‛modelo de espaçamento estomático’, controlando sua freqüência na epiderme e produzindo as células-guarda. Com algumas raras exceções, os estômatos são encontrados em todos os grupos vegetais, de briófitas a angiospermas (Willmer & Fricker, 1996).
A entrada de água nas células-guarda induz a abertura do estômato. Esse movimento ocorre ao longo do dia, dependendo da disponibilidade de água e de outros fatores, que podem ser
ambientais (luz e temperatura, por exemplo) ou internos (níveis endógenos de açúcares, de potássio e de ácido abscísico) (Willmer & Fricker, 1996).
Os mecanismos envolvidos na abertura e no fechamento dos estômatos já foram bastante estudados, mas ainda não estão claros os fatores que controlam o seu funcionamento. De maneira geral, através dos estômatos as folhas das plantas que possuem fotossíntese do tipo C3 (presente
na maioria das plantas terrestres) possibilitam as trocas gasosas com o meio,ao mesmo tempo em que perdem água. Essa regulação é efetuada por controle da abertura do ostíolo, o qual, por sua vez, é regulado por modificações na morfologia das células-guarda induzidas por pressão de turgor. Coletivamente, os estômatos aumentam o desempenho da planta e influenciam os ciclos globais de carbono e água (Brownlee, 2001). Normalmente o período de abertura ocorre ao amanhecer e vai até o meio da tarde, podendo haver uma diminuição no meio do dia, dependendo das condições atmosféricas. Este processo é fundamental para o crescimento e a manutenção de todas as plantas, uma vez que este carbono, assimilado na fotossíntese, é incorporado como celulose, proteínas, ácidos nucléicos e demais compostos de carbono das plantas (Pons & Welschen, 2003).
Os estômatos têm despertado o interesse dos pesquisadores pelas respostas das células-guarda a uma ampla variedade de estímulos ambientais, como intensidade luminosa, umidade e pressão parcial de CO2. A resposta estomática ao CO2 tem atraído particular interesse nas últimas três
décadas porque (1) suas células respondem à concentração intercelular de CO2 (Ci), que é
determinada pela concentração desse gás na superfície da folha e por sua taxa de assimilação no mesofilo (Mott, 1988); e, mais recentemente, (2) por seu potencial de utilização como estrutura indicadora de alterações da concentração atmosférica de CO2 (Beerling & Woodward, 1995;
crescimento vegetal, para a distribuição das espécies e para o funcionamento do ecossistema fazem da fisiologia estomática ponto central nas ciências ambientais (Morison, 1998), já que, anualmente, 40% de todo CO2 atmosférico (cerca de 300 trilhões de toneladas de carbono)
passam pelos estômatos (Cias et al., 1997 apud Lake et al., 2001).
Por meio de modelos de dinâmica vegetacional, Cramer et al. (2001) adicionaram dados novos a respeito da contribuição da transpiração estomática no ciclo global da água e do carbono. Por este estudo conclui-se que as maiores taxas de transpiração ocorrem nas florestas tropicais, com 32 Gt/ano de vapor d’água passando pelos estômatos, cerca de duas vezes o contido na atmosfera (15 Gt/ano). Quanto ao ciclo do carbono estima-se que a fotossíntese fixe cerca de 120 trilhões de toneladas de carbono dos 730 trilhões presentes na atmosfera anualmente. O estudo identifica, portanto, a relação direta entre controle estomático, difusão de vapor d’água e CO2 (Hetherington
& Woodward, 2003).
Diversos trabalhos relatam redução do número de estômatos em espécies crescidas em alto teor de CO2 (Woodward & Kelly, 1995). Assim, plantas crescidas em reduzida concentração de
CO2 têm maior número de estômatos que aquelas crescidas em concentrações mais altas. Futuros
aumentos nessa concentração podem, portanto, resultar em decréscimo da densidade estomática de muitas espécies. Essas observações são consistentes com comparações de densidades estomáticas de plantas atuais com exemplares coletados antes da era industrial, reconhecidamente agente causador da elevação atmosférica desse gás (Brownlee, 2001).
Os primeiros experimentos que investigaram os efeitos da concentração de CO2 no número de
estômatos foram conduzidos em atmosfera enriquecida − 1000 ppm de CO2 (Madsen, 1973 apud
apenas uma das espécies mostrou declínio. Entretanto, a hipótese de que o número de estômatos pode ser modificado em decorrência de alterações na pressão parcial de CO2 foi
confirmada por Woodward (1987), que comparou o índice estomático de espécies arbóreas de amostras de herbário (coletadas em 1787, na era pré-industrial) com amostras recentes, encontrando redução de 40%. Quando essas mesmas espécies foram submetidas a variações na [CO2], o decréscimo na densidade estomática foi de 67%.
‛Densidade Estomática’ (DE) é o número de estômatos por unidade de área (mm2), mas pode ter seu valor influenciado pela expansão das células epidérmicas. Essa expansão é dependente de variáveis como luz, temperatura, umidade, posição da folha na planta, entre outros, podendo mascarar o sinal relativo à diferenciação estomática. Assim, foi introduzido o conceito de ‛Índice Estomático’ (IE), que é a proporção de estômatos relativa ao número de células epidérmicas. O IE foi sugerido para normalizar os efeitos da expansão dessas células (Royer, 2001).
Densidade e índice estomáticos foram ferramentas centrais utilizadas por Woodward e colaboradores (2002) para explicar possíveis conseqüências ecológicas do alto teor de CO2 sobre
as plantas. Os autores concluíram que disponibilidade de água, incidência luminosa e hormônios, quando atuam em conjunto com elevada [CO2], produzem respostas distintas se comparadas às
obtidas em experimentos em que somente a concentração do gás é alterada. Para os autores, a reconhecida redução do número de estômatos na maioria das espécies crescidas em alta [CO2]
(Pritchard et al., 1999 e Wagner et al., 2005), tanto em experimentos de curta duração (dias a meses) como nos realizados em registros fósseis (até milhões de anos), configura-se em vantagem evolutiva que deve ser traduzida não somente por melhor eficiência do uso da água (WUE), posto que esta redução age sobre outros efeitos fisiológicos nos vegetais.
Em um experimento simples, porém clássico e esclarecedor, Lake et al. (2001) comprovaram que folhas maduras de Arabidopsis thaliana detectam mudanças na concentração de CO2
atmosférico e na intensidade luminosa, e as enviam por meio de sinais químicos de longa distância às folhas em desenvolvimento. Da mesma forma, folhas em desenvolvimento parecem ser capazes de detectar esses sinais e responder a eles alterando o processo de diferenciação estomática. Como resultado, o número de estômatos nas folhas mais jovens será diferente do encontrado nas maduras, sugerindo haver uma ligação ecológica importante nas respostas induzidas por luz e CO2.
Desenvolvimento estomático.
As divisões celulares assimétricas que definem o número e a organização dos estômatos na epiderme das folhas obedecem a sinais intrínsecos de ação local (entre células da epiderme) ou a distância (das folhas maduras para as em desenvolvimento), e por fatores extrínsecos, como luz, água e CO2 atmosférico. Estudos recentes têm demonstrado a presença de receptores de
superfície celular e moléculas de sinalização intracelular na percepção e resposta a esses fatores (Bergmann, 2006).
Durante o desenvolvimento da folha, um padrão de divisões celulares, regulado por sinais genéticos e ambientais, determina o aparecimento dos estômatos. Ainda que a densidade estomática seja variável, os estômatos são separados por ao menos uma célula pavimentosa − a mais numerosa das células epidérmicas, com funções variadas, como estoque de água em seus grandes vacúolos e proteção contra ataque de insetos e patógenos. Este espaçamento, referido em
Arabidopsis como ‛one-cell spacing’, é uma provável solução adaptativa para minimizar
quando se inicia uma nova divisão assimétrica próxima a um estômato (Bergmann & Sack, 2007).
Diversos estudos que abordam o desenvolvimento estomático vêm sendo conduzidos nos últimos anos, em sua maior parte com células de Arabidopsis. Para formação dos estômatos, uma primeira divisão assimétrica ocorre na célula meristemóide-mãe (MMC), produzindo uma célula menor, a meristemóide (M), que é convertida em célula-guarda mãe (GMC). Posteriormente, uma divisão simétrica da GMC forma as duas células-guarda que deverão compor os estômatos (Bergmann & Sack, 2007) (Fig. 5).
Vários reguladores do desenvolvimento estomático, como proteínas receptoras e MAP quinases, agem como inibidores no surgimento de novos estômatos, e publicações recentes (Gray, 2007) têm esclarecido esse processo ao identificar fatores de transcrição essenciais na diferenciação estomática (Fig. 6). SPEECHLESS, MUTE e FAMA são membros de uma família de proteínas de Arabidopsis thaliana com expressão distinta e função específica nessa diferenciação.
Proteínas SPEECHLESS participam da primeira divisão assimétrica, iniciando a linhagem de células estomáticas na camada da epiderme em desenvolvimento. Plantas mutantes para o gene
SPEECHLESS não produzem células meristemóides, células-guarda ou estômatos, seu crescimento é mais lento e não atingem a maturidade. O gene MUTE é requerido nos passos finais de divisão assimétrica e no início da diferenciação. Plantas mutantes que perderam a expressão desse gene produzem células meristemóides, mas não estômatos, ao passo que as que têm expressão excessiva têm a epiderme constituída, basicamente, por estômatos (Bird & Gray, 2003).
Figura 5. Diagrama de estágios e divisões do desenvolvimento estomático em Arabidopsis thaliana (Bergmann & Sack, 2007).
O gene FAMA é especificamente expresso em células-guarda mãe, e participa diretamente da diferenciação que origina os estômatos. Plantas mutantes para esse gene possuem grupos de células-guarda imaturas, incompletamente diferenciadas e não-funcionais (Ohashi-Ito & Bergmann, 2006; MacAlister et al., 2007). Assim como FAMA, dois outros fatores de transcrição – FOUR LIPS e MYB88 – parecem estar envolvidos na diferenciação das células-guarda, ainda que o primeiro atue independentemente dos demais (Gray, 2007).
Figura 6. Controle genético do desenvolvimento dos estômatos. (A) Prováveis pontos de ação dos genes. Regulação negativa é indicada por linhas em forma de T, enquanto as positivas apenas com a abreviação do gene. (B) Diagrama de fenótipos de folha de mutantes indicando distribuição e arranjo dos estômatos (verdes) e de tipos celulares terminais (rosa). Células brancas em erecta e four lips 1; myb88 representam células de identidade não determinada (Bergmann & Sack, 2007).
A
Os mais recentes progressos no campo do desenvolvimento estomático têm identificado os genes que controlam a produção e o espaçamento dos estômatos em Arabidopsis. Esses genes compreendem receptores, proteases e quinases, e agem primariamente modulando o número e a localização das divisões assimétricas da linhagem celular estomática. Bergmann & Sack (2007) descrevem a participação desses genes segundo a fase em que participam.
O gene ERECTA (ER) codifica um receptor que contém um domínio extracelular rico em leucina (LRR), um domínio transmembrana e uma quinase citoplasmática (RLK). Esta proteína participa de diversos processos, incluindo crescimento e desenvolvimento, bem como respostas a estresses bióticos e abióticos. Diferenças na eficiência de transpiração, fenômeno diretamente ligado ao comportamento estomático, são relacionadas ao gene ER. É possível que as quinases
ER, juntamente com outras proteínas, tenham participação nos processos de desenvolvimento estomático, transpiração e fotossíntese, e que mudanças na eficiência da transpiração de mutantes
er sejam conseqüências indiretas sobre o desenvolvimento estomático, isto é, morfologia da planta alterada, espessura foliar e densidade estomática (Masle et al., 2005 e Bergmann, 2006).
TOO MANY MOUNTHS (TMM), outro gene de ação inicial, codifica receptores de superfície presentes em células meristemóides e em células-guarda mãe, mas ausentes em células-guarda totalmente diferenciadas. Em Arabidopsis mais de 200 quinases compartilham uma estrutura comum de domínio extracelular rico em leucina, um único domínio transmembrana e uma quinase citoplasmática. Mutações desse gene provocam alterações em todos os tipos de divisões assimétricas da linhagem estomática, formando excesso de estômatos nas folhas e indicando que a função desse gene é reprimir divisões. Em mutantes tmm-1 foram observados erros na assimetria das divisões, essencial para criação do espaçamento, e nas divisões de ampliação, o que levou à conversão prematura de células meristemóides em células-guarda mãe. Portanto,
proteínas das famílias ER e TMM controlam as divisões assimétricas do desenvolvimento estomático (Bergmann & Sack, 2007).
YODA é membro de uma classe de MAP (mitogen-actived protein) quinases que possuem extensão N-terminal longa e atividade regulatória negativa. Plantas mutantes com proteínas sem essa extensão possuem folhas com epiderme composta somente de células pavimentosas.
Após a fase inicial de divisões assimétricas e estabelecimento do modelo de espaçamento, o programa celular é direcionado para divisões simétricas e diferenciação. Os genes conhecidos que agem durante essa fase participam da proliferação celular, da citocinese das GMC e regulam a diferenciação das células-guarda (Bergmann & Sack, 2007).
O gene HIC (HIgh Carbon dioxide), recentemente descoberto em Arabidopsis e que significou um marco nas pesquisas genéticas em estômatos, codifica um regulador negativo (inibidor) do desenvolvimento estomático que responde à concentração de CO2. Há muitas incertezas nesse
campo e ainda não está claro o mecanismo pelo qual o HIC afeta o desenvolvimento estomático em resposta ao CO2, mas pesquisas sugerem que esse gene codifique uma 3-cetoacil CoA sintase,
enzima envolvida na síntese de ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA – very long chain fatty acids). Plantas mutantes para esse gene exibem até 42% de aumento do índice estomático quando expostas ao dobro da concentração atmosférica de CO2. A explicação estaria em
alterações na permeabilidade da matriz extracelular das células-guarda, que então modificariam a difusão de uma molécula estimulada pelo alto teor de CO2, molécula esta responsável pelo
controle do desenvolvimento estomático. Com a difusão prejudicada, não haveria inibição da diferenciação da célula vizinha, originando uma nova célula-guarda. A princípio, esse foi o
primeiro gene do desenvolvimento de plantas identificado que responde a mudanças globais da atmosfera (Gray et al., 2000).
Estes estudos ratificam o envolvimento da cutícula na movimentação apoplástica de sinais na epiderme foliar, que determinarão o número de estômatos da planta. A elucidação mais precisa desse mecanismo deve se constituir em peça-chave da biologia de plantas nos próximos anos, já que pelos ostíolos passa um dos principais componentes do efeito estufa, evento de preocupação científica e política mundial recente, mas alertado por Arrhenius há mais de um século.
As espécies investigadas.
Há diversos gêneros de plantas que apresentam espécies muito semelhantes, mas que habitam biomas diferentes. Rizzini (1997) chama esse fenômeno de vicariância, no qual, no curso de sua especiação, certas espécies ou variedades morfologicamente afins ocupam áreas geograficamente vizinhas e que se excluem mutuamente. Além da relação estrutural e da distribuição em áreas próximas, tais formas são descendentes de um mesmo ancestral.
Hymenaea courbaril e H. stigonocarpa são reconhecidas como espécies vicariantes de matas e cerrados brasileiros (Rizzini, 1997). As duas espécies pertencem à família Fabaceae (sub-família Caesalpinoideae), à tribo Detariae e ao gênero Hymenaea, estabelecido por Linnaeus, que descreveu a espécie H. courbaril em 1753 (Lewinsohn, 1980). São reconhecidas 14 espécies e 12 variedades do gênero, sendo a maior parte de distribuição Neotropical (Lee & Langenheim, 1975).
Com exceção de H. verrucosa, encontrada exclusivamente no continente africano, as demais espécies do gênero têm distribuição Neotropical centrada na Bacia Amazônica, estendendo-se
desde o centro do México até o norte da Argentina. A maioria das espécies está distribuída em formações florestais, mas algumas ocorrem em áreas de caatinga do nordeste brasileiro e em áreas de cerrado do Brasil central (Lee & Langenheim, 1975).
A composição florística moderna é primariamente resultado de eventos biogeográficos. Durante o Pleistoceno e início do Holoceno ocorreram grandes alterações climáticas, representadas pela alternância de períodos quentes e frios, que conduziram à expansão e retração de florestas úmidas e de formações vegetais de clima seco. Essa alternância provocou grandes alterações na disponibilidade de recursos e o surgimento de novos hábitats, propiciando os processos de especiação e de diversificação das angiospermas (Langenheim et al., 1973).
O processo brevemente descrito acima ocorreu na região amazônica, centro de diversidade do gênero Hymenaea, e para Dechoum (2004), a espécie H. stigonocarpa, que é exclusiva dos cerrados brasileiros, foi originada a partir de H. courbaril, de mais ampla distribuição. Ainda segundo Dechoum (2004), que avaliou o desempenho fotossintético e de crescimento das duas espécies em diferentes condições edáficas e de luminosidade, H. courbaril parece ter maior plasticidade que H. stigonocarpa, podendo obter maior sucesso na ocupação de novos hábitats.
Hymenaea courbaril, popularmente conhecida como jatobá, é uma espécie bastante conhecida, principalmente devido à sua produção de resina no tronco e porque é indicada para uso em reflorestamentos, dada a facilidade de obtenção de mudas em viveiro. A polpa farinácea de seu fruto é muito procurada por várias espécies da fauna, que dispersam suas sementes, tornando o jatobá muito útil em plantios de áreas degradadas destinadas à recomposição da vegetação arbórea (Lorenzi, 2002).
Vários estudos que abordam os compostos de reserva das sementes de H. courbaril vêm sendo realizados por Buckeridge e colaboradores, abrangendo desde a estrutura, o armazenamento e a mobilização destes polissacarídeos na germinação e no desenvolvimento das plântulas (Buckeridge & Dietrich, 1990; Buckeridge et al., 1997; Tiné et al., 2000; Buckeridge et al., 2000), até os efeitos da elevada concentração de CO2 sobre seu estabelecimento (Aidar et al.,
2002; Godoy, 2007).
Hymenaea stigonocarpa, popularmente chamada de jatobá-do-cerrado, tem sua distribuição restrita a ambientes sazonais, tais como os cerrados do centro e do sudeste do Brasil. Apesar de sua ampla distribuição nos cerrados (está entre as 26 espécies que ocorrem em, pelo menos, 50% das áreas de cerrado sentido restrito), a espécie apresenta baixa densidade de indivíduos (Dechoum, 2004). As duas espécies são morfologicamente semelhantes, mas se diferenciam principalmente pelo tamanho e forma de folhas e frutos, tamanho e coloração das flores, tamanho das sementes, além de diferenças no porte – H. stigonocarpa atinge de 5 a 12 metros de altura, enquanto H. courbaril, 12 a 20 metros.
Justificativa
Da temática
Os diversos cenários de emissões de gases de efeito estufa para os próximos 100 anos indicam a possibilidade de impactos climáticos significativos sobre ecossistemas brasileiros e de outras partes do planeta. Se as tendências de crescimento das emissões se confirmarem, os modelos climáticos indicam que poderá ocorrer aquecimento de 4 a 6oC em partes do País (principalmente na Amazônia) até o final do século XXI. Dessa forma, é inevitável incluir as árvores no estudo
das mudanças climáticas globais, na medida em que elas exercem claro papel no balanço global de carbono e provável participação no seqüestro desse elemento da atmosfera.
A biota global atual é adaptada às mudanças climáticas dentro das taxas de concentração de CO2, temperaturas e precipitações atmosféricas do Pleistoceno. Mudanças no clima não são
necessariamente danosas à biodiversidade, pois as comunidades bióticas nunca estiveram estáveis por longos períodos de tempo. As espécies têm constantemente ajustado suas distribuições e abundâncias em resposta a diversos fatores, incluindo concentrações de CO2, temperatura e
precipitação. Entretanto, as taxas projetadas e magnitudes das mudanças climáticas durante o século XXI são sem precedentes, quando comparadas àquelas apresentadas nos últimos 2 milhões de anos, e a habilidade das espécies em se ajustarem às novas condições do ambiente atual é questionável.
Para o monitoramento e avaliações qualitativas e quantitativas do impacto das mudanças do clima é necessário um sistema de critérios de indicadores em todos os âmbitos – internacionais, nacionais e regionais. Segundo o PROBIO – Projeto de Conservação e Utilização Sustentável da Diversidade Biológica Brasileira, do Ministério do Meio Ambiente –, as relações entre ecossistemas naturais e as mudanças climáticas globais (MCG), no Brasil, ainda não estão estabelecidas (www6.cptec.inpe.br/mudancas_climaticas/probio.shtml. Acesso em 03/09/2007). A partir desses fatos fica claramente identificada a necessidade de estabelecer a natureza e a profundidade dos impactos das mudanças climáticas globais sobre os ecossistemas, com o objetivo de aprimorar as políticas públicas relativas à conservação da biodiversidade, garantindo o uso sustentável deste recurso para as gerações futuras. É nesse contexto que se insere o presente trabalho.
Da metodologia
As metodologias propostas neste trabalho têm-se mostrado eficientes na investigação dos efeitos provocados na estrutura e ultra-estrutura de células e organelas de plantas submetidas a alterações ambientais.
Objetivos
Gerais
Conhecer as alterações estruturais, ultra-estruturais e bioquímicas nas folhas de plântulas do jatobá da mata Hymenaea courbaril L. (espécie característica da floresta latifoliada semidecídua), e do jatobá do cerrado H. stigonocarpa Mart. (de formações abertas do cerrado e campo cerrado), crescidas em ambientes de 370 (controle) e 720 ppm de CO2, visando determinar o possível
efeito da elevação da pressão parcial do CO2 sobre espécies estabelecidas em diferentes biomas.
Dados da literatura sugerem maior plasticidade fisiológica de H. courbaril em relação a H.
stigonocarpa, mas ainda há escassas informações sobre suas respostas morfológicas, e como espécies que ocupam biomas distintos poderão responder a essa alteração atmosférica.
Específicos
1. Descrever a estrutura e a ultra-estrutura foliar das espécies Hymenaea courbaril e H.
stigonocarpa, de forma a oferecer subsídios a pesquisas futuras.
2. Avaliar aspectos dos eventuais efeitos da alta [CO2] na estrutura, na ultra-estrutura e na
3. Investigar as respostas das espécies à elevada concentração de CO2, comparando seus efeitos
com dados da literatura.
4. Oferecer subsídios a estudos relacionados ao seqüestro de carbono e ao levantamento de indicadores sensíveis a parâmetros climáticos.
MATERIAL E MÉTODOS
Cultivo das plântulas em diferentes concentrações de CO2.
Essa etapa dos experimentos foi realizada na Seção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas do Instituto de Botânica de São Paulo, no período compreendido entre os meses de junho a setembro de 2005, que teve como temperatura média 24,5°C.
As Câmaras de Topo Aberto (CTAs) (Figuras 7 e 8) possuíam sistema de injeção de CO2
constituído por um ventilador que forçava o ar externo para dentro da câmara. O ar passava por dentro da câmara saindo pelo topo. O período de passagem foi estabelecido com um fluxo tal que permitia a renovação de todo o ar interno da câmara em aproximadamente 1 minuto, evitando turbulência e permitindo a captação do CO2 sem causar distúrbios excessivos na camada de gases
sobre as folhas.
Neste experimento foram utilizadas duas câmaras – uma recebeu injeção de ar ambiente filtrado, sem enriquecimento de CO2 (cerca de 370 ppm), e a outra recebeu ar enriquecido, de
maneira a se manter um ambiente com 720 ppm de CO2. A [CO2] nas câmaras foi monitorada
diariamente através de um medidor Testo 535, e a temperatura foi aferida diariamente com termômetro digital.
Figura 7. Esquema do sistema das câmaras de topo aberto utilizadas para o crescimento das plântulas: 1 – cilindro de CO2; 2 – válvula; 3 – tubulação; 4 – tomada de ar externo; 5 – filtro de partículas em suspensão; 6 – ventilador; 7 e 8 – plântulas; 9 – termômetro; 10 – sensor de CO2 (extraído de Aidar et al., 2002).
Figura 8. Câmaras de topo aberto (CTAs) instaladas na Seção de Fisiologia do Instituto de Botânica, com exemplares de Hymenaea courbaril e H. stigonocarpa, após quarenta dias de exposição. A – Plântulas das espécies expostas a 720 (esquerda) e 370 ppm (direita). B – Detalhe do sistema de injeção de CO2 (seta).
Foram utilizadas 120 sementes de jatobás adquiridas junto ao Instituto Florestal de São Paulo e procedentes da Estação Experimental de Itirapina (jatobá da mata) e da Floresta Estadual de Assis (jatobá de cerrado). As sementes, 60 de cada espécie e com peso médio de 4,8 gramas para
Hymenaea courbaril e 3,7 gramas para H. stigonocarpa, foram desinfetadas em hipoclorito de sódio 1,5% por 30 minutos para evitar a contaminação por fungos, lavadas em água corrente pelo mesmo período e escarificadas mecanicamente. A germinação, caracterizada pela protrusão da raiz, foi conduzida em estufas do tipo BOD, a 25°C, em recipientes contendo substrato (vermiculita) embebido em água destilada. Após esse período (21 dias) as sementes foram dispostas em vasos plásticos de cinco litros com areia e vermiculita (1:2), conduzidas às CTAs e regadas periodicamente com solução nutritiva (Hoagland & Arnon, 1938). Após 100 dias de exposição às condições das CTAs, as plântulas foram cuidadosamente removidas do substrato com auxílio de um jato fraco de água, lavadas e medidas.
Medidas de crescimento.
Foram realizadas medidas de crescimento das seguintes estruturas das plântulas: altura (medida da junção caule/raiz até meristema apical caulinar), área do primeiro par de folíolos, comprimento do epicótilo, do hipocótilo e do primeiro entrenó.
Análises microscópicas.
Diafanização. Segmentos de 1cm2 da região mediana do primeiro par de folíolos (Fig. 9) de 5
plantas de cada grupo, previamente fixados em FAA 70 (Kraus & Arduin, 1997), foram fervidos em álcool 96%, e em solução de álcool 96% e NaOH 5% (1:1), ambos por 10 minutos. Em seguida as amostras foram lavadas em água destilada, dispostas em solução de hipoclorito de sódio a 50% até tornarem-se transparentes. Lavadas novamente em água destilada (por 5 vezes, 3
minutos cada), colocadas em cloral hidratado 5% por 10 minutos (Strittmatter, 1973), coradas em azul de astra e safranina, ambos a 1% e na proporção 9:1 (v/v), e montadas em resina Permount.
As lâminas foram observadas em fotomicroscópio BX 41 Olimpus Video Print acoplado a um microcomputador com software Image Pro® Express. Para obtenção da densidade estomática (DE) e do índice estomático (IE), foram realizadas contagens em dez campos de 0,04mm2 (aumento de 200x), em cinco folhas por espécie/tratamento, sendo evitados campos que contivessem feixes vasculares e glândulas. A DE foi obtida por meio de contagem do número de estômatos/área, enquanto que o IE foi obtido por meio da aplicação da fórmula:
IE = [E / (E+C)] x 100,
sendo (IE) Índice Estomático, (E) Estômato e (C) Célula epidérmica (pavimentosa).
Análise histológica. Foram coletados segmentos da região mediana do primeiro par de folíolos (Fig. 9). Os materiais foram fixados em FAA 70 por 24h e mantidos em etanol 70%. A desidratação ocorreu por meio de série etílica e a inclusão foi feita em historesina, conforme especificações do fabricante. Seções transversais foram efetuadas com navalhas de vidro, e cortes de 2 µm de espessura foram obtidos em micrótomo Leica RM 2155. As lâminas foram coradas em azul de metileno a 1% e montadas em resina Permount.
Para investigar eventuais efeitos da alta [CO2] sobre a anatomia foliar, foram feitas, em cinco
plantas de cada grupo, medições de espessura da epiderme das faces abaxial e adaxial, dos parênquimas paliçádico e lacunoso, além da área dos espaços intercelulares, por meio do software Image Pro® Express. Assim como procedido para contagem dos estômatos, essas medidas foram
obtidas em regiões do mesofilo livres de interferências (glândulas e feixes vasculares) que pudessem comprometer os resultados.
1 cm 1 cm
Microscopia eletrônica de varredura. Com o objetivo de verificar eventuais efeitos da elevada [CO2] sobre a cera epicuticular, o primeiro par de folíolos dos jatobás foi seco em estufa a 25 °C.
Após a secagem, segmentos de 1 cm2 da região mediana foram fixados em suportes de alumínio (stubs), recobertos com ouro durante 2 minutos a 40 mA em atmosfera de argônio com 1 mBar de pressão (Das & Saha, 1999), em equipamento Balzers SCD 050, e observados em microscópio eletrônico de varredura DSM 940 Zeiss, do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo.
Microscopia eletrônica de transmissão. Segmentos de 1cm2 da região mediana do primeiro par de folíolos totalmente expandidos foram fixados em solução de glutaraldeído (2,5%) e formaldeído (2,0%), em tampão cacodilato de sódio 0,2M, pH 7,2, e CaCl2 0,1M por duas horas,
Figura 9. Indicação da região do folíolo (aprox. 1cm2), de onde foram retiradas amostras para análises microscópicas.
a 4°C (Karnovsky, 1965). Após isso, as amostras foram lavadas três vezes com a mesma solução tampão e pós-fixadas em tetróxido de ósmio por 2 horas. Em seguida foram novamente lavadas com a mesma solução tampão, submetidas à desidratação em série etanólica, infiltradas e embebidas em resina Spurr (resina mais óxido de propileno, overnight), e resina pura (6h), para polimerização.
Seções de 60 nm foram feitas em ultramicrótomo Leica Ultracut-R, dispostas em telas de 200
mesh, contrastadas em acetato de uranila e nitrato de chumbo (cinco minutos em cada), observadas e fotografadas no microscópio eletrônico de transmissão Zeiss EM 900, do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo.
Determinação quantitativa da cera epicuticular.
Para a quantificação da cera epicuticular foliar, foram coletadas folhas plenamente desenvolvidas e sem lesões, do primeiro nó de dez indivíduos/tratamento, com três repetições. Este material foi acondicionado em sacos de papel e mantido em estufa a 25 °C por três dias. Para extração da cera, a face abaxial das folhas foi gentilmente lavada com 15 mL de clorofórmio (Silva Fernandes, 1964), usando-se pipeta Pasteur. Por serem espécies hipoestomáticas (informação obtida em estudos prévios), apenas a face abaxial das folhas de Hymenaea courbaril e H. stigonocarpa foi submetida à extração com clorofórmio.
Os extratos clorofórmicos foram reunidos, filtrados, concentrados em rotaevaporador, transferidos para frascos de vidro previamente pesados e evaporados em banho-maria. Posteriormente os frascos foram colocados em dessecador até obtenção de massa constante. A área foliar foi obtida utilizando-se o software “Leaf Area Measurement”, versão 1.3
