Cultivo das plântulas em diferentes concentrações de CO2.
Essa etapa dos experimentos foi realizada na Seção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas do Instituto de Botânica de São Paulo, no período compreendido entre os meses de junho a setembro de 2005, que teve como temperatura média 24,5°C.
As Câmaras de Topo Aberto (CTAs) (Figuras 7 e 8) possuíam sistema de injeção de CO2
constituído por um ventilador que forçava o ar externo para dentro da câmara. O ar passava por dentro da câmara saindo pelo topo. O período de passagem foi estabelecido com um fluxo tal que permitia a renovação de todo o ar interno da câmara em aproximadamente 1 minuto, evitando turbulência e permitindo a captação do CO2 sem causar distúrbios excessivos na camada de gases
sobre as folhas.
Neste experimento foram utilizadas duas câmaras – uma recebeu injeção de ar ambiente filtrado, sem enriquecimento de CO2 (cerca de 370 ppm), e a outra recebeu ar enriquecido, de
maneira a se manter um ambiente com 720 ppm de CO2. A [CO2] nas câmaras foi monitorada
diariamente através de um medidor Testo 535, e a temperatura foi aferida diariamente com termômetro digital.
Figura 7. Esquema do sistema das câmaras de topo aberto utilizadas para o crescimento das plântulas: 1 – cilindro de CO2; 2 – válvula; 3 – tubulação; 4 – tomada de ar externo; 5 – filtro de partículas em suspensão; 6 – ventilador; 7 e 8 – plântulas; 9 – termômetro; 10 – sensor de CO2 (extraído de Aidar et al., 2002).
Figura 8. Câmaras de topo aberto (CTAs) instaladas na Seção de Fisiologia do Instituto de Botânica, com exemplares de Hymenaea courbaril e H. stigonocarpa, após quarenta dias de exposição. A – Plântulas das espécies expostas a 720 (esquerda) e 370 ppm (direita). B – Detalhe do sistema de injeção de CO2 (seta).
Foram utilizadas 120 sementes de jatobás adquiridas junto ao Instituto Florestal de São Paulo e procedentes da Estação Experimental de Itirapina (jatobá da mata) e da Floresta Estadual de Assis (jatobá de cerrado). As sementes, 60 de cada espécie e com peso médio de 4,8 gramas para
Hymenaea courbaril e 3,7 gramas para H. stigonocarpa, foram desinfetadas em hipoclorito de sódio 1,5% por 30 minutos para evitar a contaminação por fungos, lavadas em água corrente pelo mesmo período e escarificadas mecanicamente. A germinação, caracterizada pela protrusão da raiz, foi conduzida em estufas do tipo BOD, a 25°C, em recipientes contendo substrato (vermiculita) embebido em água destilada. Após esse período (21 dias) as sementes foram dispostas em vasos plásticos de cinco litros com areia e vermiculita (1:2), conduzidas às CTAs e regadas periodicamente com solução nutritiva (Hoagland & Arnon, 1938). Após 100 dias de exposição às condições das CTAs, as plântulas foram cuidadosamente removidas do substrato com auxílio de um jato fraco de água, lavadas e medidas.
Medidas de crescimento.
Foram realizadas medidas de crescimento das seguintes estruturas das plântulas: altura (medida da junção caule/raiz até meristema apical caulinar), área do primeiro par de folíolos, comprimento do epicótilo, do hipocótilo e do primeiro entrenó.
Análises microscópicas.
Diafanização. Segmentos de 1cm2 da região mediana do primeiro par de folíolos (Fig. 9) de 5
plantas de cada grupo, previamente fixados em FAA 70 (Kraus & Arduin, 1997), foram fervidos em álcool 96%, e em solução de álcool 96% e NaOH 5% (1:1), ambos por 10 minutos. Em seguida as amostras foram lavadas em água destilada, dispostas em solução de hipoclorito de sódio a 50% até tornarem-se transparentes. Lavadas novamente em água destilada (por 5 vezes, 3
minutos cada), colocadas em cloral hidratado 5% por 10 minutos (Strittmatter, 1973), coradas em azul de astra e safranina, ambos a 1% e na proporção 9:1 (v/v), e montadas em resina Permount.
As lâminas foram observadas em fotomicroscópio BX 41 Olimpus Video Print acoplado a um microcomputador com software Image Pro® Express. Para obtenção da densidade estomática (DE) e do índice estomático (IE), foram realizadas contagens em dez campos de 0,04mm2 (aumento de 200x), em cinco folhas por espécie/tratamento, sendo evitados campos que contivessem feixes vasculares e glândulas. A DE foi obtida por meio de contagem do número de estômatos/área, enquanto que o IE foi obtido por meio da aplicação da fórmula:
IE = [E / (E+C)] x 100,
sendo (IE) Índice Estomático, (E) Estômato e (C) Célula epidérmica (pavimentosa).
Análise histológica. Foram coletados segmentos da região mediana do primeiro par de folíolos (Fig. 9). Os materiais foram fixados em FAA 70 por 24h e mantidos em etanol 70%. A desidratação ocorreu por meio de série etílica e a inclusão foi feita em historesina, conforme especificações do fabricante. Seções transversais foram efetuadas com navalhas de vidro, e cortes de 2 µm de espessura foram obtidos em micrótomo Leica RM 2155. As lâminas foram coradas em azul de metileno a 1% e montadas em resina Permount.
Para investigar eventuais efeitos da alta [CO2] sobre a anatomia foliar, foram feitas, em cinco
plantas de cada grupo, medições de espessura da epiderme das faces abaxial e adaxial, dos parênquimas paliçádico e lacunoso, além da área dos espaços intercelulares, por meio do software Image Pro® Express. Assim como procedido para contagem dos estômatos, essas medidas foram
obtidas em regiões do mesofilo livres de interferências (glândulas e feixes vasculares) que pudessem comprometer os resultados.
1 cm 1 cm
Microscopia eletrônica de varredura. Com o objetivo de verificar eventuais efeitos da elevada [CO2] sobre a cera epicuticular, o primeiro par de folíolos dos jatobás foi seco em estufa a 25 °C.
Após a secagem, segmentos de 1 cm2 da região mediana foram fixados em suportes de alumínio (stubs), recobertos com ouro durante 2 minutos a 40 mA em atmosfera de argônio com 1 mBar de pressão (Das & Saha, 1999), em equipamento Balzers SCD 050, e observados em microscópio eletrônico de varredura DSM 940 Zeiss, do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo.
Microscopia eletrônica de transmissão. Segmentos de 1cm2 da região mediana do primeiro par de folíolos totalmente expandidos foram fixados em solução de glutaraldeído (2,5%) e formaldeído (2,0%), em tampão cacodilato de sódio 0,2M, pH 7,2, e CaCl2 0,1M por duas horas,
Figura 9. Indicação da região do folíolo (aprox. 1cm2), de onde foram retiradas amostras para análises microscópicas.
a 4°C (Karnovsky, 1965). Após isso, as amostras foram lavadas três vezes com a mesma solução tampão e pós-fixadas em tetróxido de ósmio por 2 horas. Em seguida foram novamente lavadas com a mesma solução tampão, submetidas à desidratação em série etanólica, infiltradas e embebidas em resina Spurr (resina mais óxido de propileno, overnight), e resina pura (6h), para polimerização.
Seções de 60 nm foram feitas em ultramicrótomo Leica Ultracut-R, dispostas em telas de 200
mesh, contrastadas em acetato de uranila e nitrato de chumbo (cinco minutos em cada), observadas e fotografadas no microscópio eletrônico de transmissão Zeiss EM 900, do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo.
Determinação quantitativa da cera epicuticular.
Para a quantificação da cera epicuticular foliar, foram coletadas folhas plenamente desenvolvidas e sem lesões, do primeiro nó de dez indivíduos/tratamento, com três repetições. Este material foi acondicionado em sacos de papel e mantido em estufa a 25 °C por três dias. Para extração da cera, a face abaxial das folhas foi gentilmente lavada com 15 mL de clorofórmio (Silva Fernandes, 1964), usando-se pipeta Pasteur. Por serem espécies hipoestomáticas (informação obtida em estudos prévios), apenas a face abaxial das folhas de Hymenaea courbaril e H. stigonocarpa foi submetida à extração com clorofórmio.
Os extratos clorofórmicos foram reunidos, filtrados, concentrados em rotaevaporador, transferidos para frascos de vidro previamente pesados e evaporados em banho-maria. Posteriormente os frascos foram colocados em dessecador até obtenção de massa constante. A área foliar foi obtida utilizando-se o software “Leaf Area Measurement”, versão 1.3
(www.shef.ac.uk/~nuocpe/), sendo que a quantidade de cera obedeceu à relação entre sua massa (µg) e a área foliar (cm2).
Determinação qualitativa dos componentes da cera epicuticular.
Foi realizado o mesmo procedimento para extração da cera, descrito acima. Com o objetivo de se verificar os componentes predominantes de cada amostra, foi feita uma cromatografia em camada delgada (CCD) em sílica-gel G Typ 60, impregnada com fluoresceína sódica a 0,2%. A placa foi desenvolvida nos sistemas de solventes hexano/clorofórmio (7:3) e acetato de etila/clorofórmio/metanol (4:4:3), e a visualização feita em luz ultravioleta de ondas longas. Cada uma das frações visualizadas no cromatograma foi separada utilizando-se a cromatografia preparativa em camada delgada de sílica-gel. Essas frações foram retiradas da sílica com clorofórmio por três vezes, filtradas e concentradas em rotaevaporador. Uma nova CCD de cada uma das frações foi realizada, a fim de se certificar da pureza do material.
Novamente ressuspensas em clorofórmio, as amostras foram misturadas à sílica-gel 60 (70 a 230 mesh), secas em banho-maria overnight e submetidas à cromatografia em coluna utilizando- se como fase móvel os solventes hexano, clorofórmio e metanol. Os eluatos foram concentrados até total secura e os resíduos obtidos dissolvidos em pequeno volume de hexano para posterior injeção no cromatógrafo a gás HP 5890, utilizando-se a coluna DB-5HT HP (30 m e 0,32 mm de diâmetro) e hélio como gás de arraste, com fluxo de 1 mL/min. A programação de temperaturas da coluna foi de 6°C/min, sendo a temperatura inicial de 100°C, e a final, mantida durante 15 min, de 300°C. A temperatura do injetor e do detector foi de 300°C. Os espectros de massas foram obtidos por ionização eletrônica no aparelho HP 5889B, e o limite das massas foi de 50 até 600 unidades de massas atômicas. As amostras cujo perfil cromatográfico sugeriu serem
triterpenóides com função alcoólica foram metiladas segundo Vogel (1971), antes de submetidas ao espectrômetro de massas.
Os procedimentos relativos à análise das ceras foram realizados no Laboratório de Fitoquímica do Instituto de Biociências da USP, e na Seção de Fisiologia do Instituto de Botânica de São Paulo.
Análises estatísticas.
O número de amostras foi testado no Sample Size Estimator Worksheet, e os dados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e teste-t, com 0,05 e 0,001% de significância (P < 0,05 e 0,001), pelo software Bioestat 2.0. Para avaliação estatística das ceras epicuticulares, utilizou-se de amostragem composta − 10 indivíduos/espécie/tratamento.