UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
RODRIGO SCARPARI CARRARO
INFLAMAÇÃO PRECEDE ESTRESSE DE RETÍCULO E DISFUNÇÃO MITOCONDRIAL NO HIPOTÁLAMO DURANTE AS ETAPAS INICIAIS DA INSTALAÇÃO DA OBESIDADE
CAMPINAS 2016
RODRIGO SCARPARI CARRARO
INFLAMAÇÃO PRECEDE ESTRESSE DE RETÍCULO E DISFUNÇÃO MITOCONDRIAL NO HIPOTÁLAMO DURANTE AS ETAPAS INICIAIS DA INSTALAÇÃO DA OBESIDADE
Orientador: Prof. Dr. Licio Augusto Velloso
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médica da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestre em Ciências
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃODEFENDIDA PELO ALUNO RODRIGO SCARPARI CARRARO, E ORIENTADO PELO PROF. DR. LICIO AUGUSTO VELLOSO.
CAMPINAS 2016
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
RODRIGO SCARPARI CARRARO
Orientador PROF. DR. LICIO AUGUSTO VELLOSO
MEMBROS:
1. PROF. DR. LICIO AUGUSTO VELLOSO
2. PROF. DR. GABRIEL FORATO ANHE
3. PROF. DR. JOSÉ DONATO JÚNIOR
Programa de Pós‐Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra‐se no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais e irmã (Denise, João Marcos e Vanessa) pelo amor incondicional, caráter, valores, carinho e por trilhar de maneira preciosa meus caminhos sempre incentivando meus estudos e também comemorando e vibrando junto a mim as conquistas e apoio em momentos difíceis;
Ao meu cunhado Paulo pela grande amizade que fortalece cada vez mais nossos vínculos familiares; Ao professor Licio Augusto Velloso, que gentilmente aceitou dividir comigo seus conhecimentos permeando minha carreira científica com entusiasmo e ética. Mais do que orientador científico, você foi sábio e fundamental ao esclarecer minhas dúvidas e compreender minhas ansiedades e angustias que de forma singular me fez crescer como profissional;
À professora Alicia Juliana Kowaltowski pela excepcional contribuição intelectual na produção e execução deste projeto;
Aos grandes amigos e primos Fernando, Giovanni e Danilo, que sempre estiveram comigo em diversos períodos da minha vida, tanto em momentos tristes como nos mais divertidos e inesquecíveis;
Ao João Vitor Carvalho, embora nos conhecemos há pouco tempo, criamos um laço forte de amizade que irei levar para o resto da minha vida. Agradeço também, o companheirismo e de passar tantos momentos agradáveis fazendo músicas até altas horas;
Ao Deivid Lemos pela recente e grande amizade que cresce a cada dia;
À Fernanda Augustini Pezzato por ser uma pessoa imprescindível na minha vida. Você me ajudou e entusiasmou na minha escolha para a carreira acadêmica. Admiro seu talento profissional e me espelho muito em você. Agradeço também, por me confortar nos momentos que mais precisei e pelo carinho e amizade que levarei comigo pelo resto da vida;
À Gabriela Freitas Pereira de Souza (Gabi). Você foi a minha primeira grande amiga do laboratório, nos identificamos já na primeira semana e fiz questão de continuar meus experimentos com você, pois admiro muito sua capacidade, inteligência, pensamento crítico e várias outras características que poderia escrever mais uma dissertação para falar de suas qualidades e obrigado pela participação na construção da minha carreira científica;
À Juliana Contin, já que estou neste laboratório por sua causa! A sua excelente palestra no CAEB, me deixou apaixonado pelo seu conhecimento e entusiasmo pela pesquisa, fato este que sem dúvidas, foi determinante para que eu buscasse carreira acadêmica;
Ao José Carlos (Zeca) pela amizade que se torna mais sólida a cada dia. Obrigado por me passar vários conhecimentos tanto profissional quanto da vida;
À Daniela Razolli por estar sempre presente nos experimentos quando precisei de ajuda e pela parceria não só no laboratório, mas nas mesas de barzinhos e por passar vários momentos agradáveis e hilários juntos;
À Carina Solon por me ensinar diversas técnicas do laboratório de maneira simples e extremamente eficiente, também por estar presente nos experimentos, principalmente quando estes eram difíceis e longos. Agradeço, sobretudo, a companhia em diversos happy hours, e por alegrar estes momentos; Ao Bruno Chausse, embora recente no laboratório teve um papel ímpar na ajuda de meus experimentos e na produção da minha aula de qualificação, assim como na produção deste texto. Agradeço também, a amizade e pelas várias histórias engraçadas que alegra os dias no laboratório; Ao Alexandre Moura pela amizade e pela agradável companhia nas viagens para congressos, assim como no laboratório, e que com uma imensa paciência me ensinou diversas teorias de sinalização celular;
Aos colegas Thiago Matos, Guilherme Nogueira, Lucas Nascimento, Letícia Pires, por serem pessoas extremamente agradáveis de conviver diariamente tanto em ambiente de trabalho quanto em momentos de distração e risadas;
Erika Anne, que com muito carinho, teve paciência e calma para me ensinar vários procedimentos e conceitos biológicos, além de estar sempre presente e disponível quando queremos um ombro amigo;
Andressa Coope, Carolina Solon, Albina Garcia, Gerson Ferraz, Bruna Bombassaro, Milena Fioravante, Nathalia Dragano, Livia Bittencourt, Carlos Poblete, Vanessa Bóbbo, Vanessa Oliveira, Mariana Freschi, Roberta Haddad, Roberta Barbizan, Rafael Marostica, Joseane Morari, Felipe, pelas discussões científicas, ajudas com experimentos, gargalhadas e por tornarem meus dias no laboratório mais alegres;
Ao Márcio Cruz, pela paciência e cuidado excepcional com os animais;
Animais de experimentação, que sem saber, acrescentam diariamente valores inestimáveis à ciência; Agência FAPESP, pelo apoio financeiro que permitiu a realização desta dissertação e meu desenvolvimento como cientista.
RESUMO
Ácidos graxos saturados de cadeia longa, presentes na dieta, induzem uma resposta inflamatória muito precoce no hipotálamo, ao ativarem receptores TLR4 e induzirem tanto inflamação, quanto estresse de retículo endoplasmático (ER stress). Estudos recentes sugeriram que alterações na função mitocondrial poderiam também desempenhar um papel patofisiológico durante a instalação da disfunção hipotalâmica na obesidade. Neste estudo avaliamos marcadores de inflamação, estresse de retículo endoplasmático e alterações mitocondriais em etapas iniciais da obesidade induzida por dieta. Os nossos resultados demonstram um aumento precoce, no conteúdo de proteínas relacionadas à inflamação, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α e fractalkina, em camundongos Swiss submetidos a uma dieta rica em gordura saturada. A exposição dos camundongos a 3 horas de dieta hiperlipídica foi capaz de aumentar significativamente o conteúdo da fractalkina. Com 6 horas de exposição, observamos um aumento da chaperona GRP78, proteína envolvida na resposta às proteínas mal enoveladas (UPR) no retículo endoplasmático, e este aumento se conservou com o passar dos dias enquanto mantida a oferta da dieta hiperlipídica. As proteínas sensoras de distúrbios de enovelamento de proteínas no retículo foram afetadas algum tempo depois da indução da resposta inflamatória, IRE-1α aumentou com 3 dias e ATF6 no 7º dia de exposição à dieta hiperlipídica. A mitofusina 2, proteína envolvida na dinâmica morfológica mitocondrial, teve redução após 24 horas de exposição à dieta hiperlipidica e aumento após 7 dias. Como essas alterações sugerem mudanças morfológicas nas mitocôndrias, utilizamos a seguir a microscopia eletrônica por meio da qual identificamos variações nos contatos entre as mitocôndrias e o retículo endoplasmático. Entretanto, a exposição à dieta hiperlipídica nestes períodos não alterou a respiração mitocondrial no hipotálamo. Desta forma concluímos que o consumo de dieta hiperlipídica induz rápida resposta inflamatória no hipotálamo de camundongos, o que é seguido de indução de ER stress. Apesar de terem sido detectadas alterações no conteúdo proteico de pelo menos uma proteína envolvida na dinâmica morfológica mitocondrial e no número de contatos entre mitocôndrias com o retículo, tal fato não foi acompanhado de alterações na respiração mitocondrial no hipotálamo.
ABSTRACT
Long-chain saturated fatty acids present in the diet induce a very early inflammatory response in the hypothalamus through the activation of TLR4 and induction of endoplasmic reticulum stress (ER stress). Recent studies have suggested that changes in mitochondrial function could play a pathophysiological role during the installation of obesity-associated hypothalamic dysfunction. In this study we evaluated inflammatory markers, endoplasmic reticulum stress and mitochondrial alterations in the initial stages of diet-induced obesity. Our results showed an early increase in the expression of proteins related to inflammation, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α and fractalkine in Swiss mice subjected to a diet rich in saturated fat. The exposure of mice to 3 hours fat diet was capable of increasing the content of fractalkine. Six hours dietary exposure to fat resulted in the increase of the chaperone GRP78, which is involved in the unfolded protein response (UPR) in the endoplasmic reticulum. This increase remained steady as far as the high-fat diet was maintained. The ER stress sensor proteins were affected after the induction of the inflammatory response; thus, IRE-1α and ATF6 increased 3 and 7 days after dietary fat introduction, respectively. Mitofusin 2, which is involved in mitochondrial morphological dynamics, was reduced after 24 hours exposure and increased after 7 days of dietary fat exposure. Because these changes suggest morphological rearrangements of the mitochondria, we next employed electron microscopy and identified changes in contacts between mitochondria and the endoplasmic reticulum. However, exposure to high-fat diet did not alter the mitochondrial respiration as evaluated in hypothalamic explants. Thus, we conclude that the consumption of a high-fat diet induces rapid inflammatory response in the hypothalamus of mice, which is followed by ER stress. Although we detected changes in the expression of at least one protein involved in mitochondrial morphology and dynamics and on the number of contacts between mitochondria and the endoplasmic reticulum this was not accompanied by changes in mitochondrial respiration in the hypothalamus.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AgRP – Peptídeo Relacionado ao Gene Agouti ATF4 – Activting transcription fator 4
ATF6 – Activting transcription fator 6
CART – Transcrito Regulado por Cocaína e Anfetamina DDIT3 – DNA damage inducible transcript 3 (CHOP) DNA – Ácido Desoxirribonucléico
Eif2α – Eukaryotic inition fator 2α GRP78 – Glucose-regulated protein 78 HFD – Dieta Hiperlipídica IL10 – Interleucina 10 IL1β – Interleucina 1β IL6 – Interleucina 6 LPS – Lipopolissacarídeo
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IRE1-α – Inositol-Requiring Enzyme 1α
MFN1 – Mitofunisa 1 MFN2 – Mitofunisa 2
MyD88 – Fator de Diferenciação Mielóide 88 NFκB – Fator Nuclear kappa B
NPY – Neuropeptídeo Y
OMS – Organização Mundial da Saúde PBA – Ácido fenil-butírico
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
POMC – Pró-Ópio Melanocortina RNAm – Ácido Ribonucléico Mensageiro TIR – Dominio de Homologia Toll/IL-1R
TIRAP – Proteína Adaptadora Contendo o Domínio TIR TLR4 – Receptor Toll-Like 4
TLRs – Receptores Toll-like
TNFα – Fator de Necrose Tumoral-α IMC - Índice de Massa Corpórea
TRAM – Molécula Adaptadora Relacionada à TRIF TRIF – Proteína Adaptadora Contendo o Domínio TIR UPR – Unfolded Protein Response
SUMÁRIO
Introdução...13
Objetivos...21
Material de Métodos...22
Resultados e Discussão...29
Resumo dos Resultados do Estudo...49
Conclusão...51
Referências...52
INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, a obesidade assumiu uma posição de destaque como fator de risco para as taxas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Segundo dados de 2012 da Organização Mundial de Saúde (OMS), cerca de 65% da população mundial vive em países nos quais o sobrepeso e a obesidade matam mais do que a desnutrição. Os Estados Unidos, líder dessa estatística, apresentou um rápido e alarmante aumento do número de pessoas obesas desde a década de 80 (Flegal et al., 2012).
No Brasil, o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) mostrou em 2015, que o número de pessoas com sobrepeso e obesidade se aproxima de 60%. Cerca de 82 milhões de pessoas apresentam o IMC igual ou maior do que 25kg/m2. De acordo com estes dados, o mais alarmante é o excesso de peso nas mulheres na faixa etária entre 55 a 64 anos com prevalência superior a 70%. Os números mostraram ainda que a obesidade acomete um em cada cinco brasileiros de 18 anos (20%), sendo que o percentual é mais alto entre as mulheres (24% contra 16% dos homens) (IBGE). Na China, país até então com baixa taxa de obesidade, houve um aumente de três vezes no número de pessoas obesas entre 1991 e 2006 (Lu et al., 2010). Esses dados revelam que a obesidade atingiu status de epidemia, acometendo países sem distinção de renda ou desenvolvimento.
O grande problema associado ao crescimento do número de pessoas obesas no planeta é o aumento paralelo do número de pessoas acometidas por doenças associadas ao ganho de peso, tais como, diabetes mellitus do tipo 2 (DM2), hipertensão arterial, doenças cardiovasculares e ainda alguns tipos de câncer (Danaei et al., 2009).
A obesidade é caracterizada pela perda do controle homeostático entre a ingestão alimentar e o gasto calórico. O hipotálamo é o principal centro responsável pela coordenação e organização dos sinais que integram as informações a respeito das reservas de energia no organismo desde o estímulo à busca do alimento até ao gasto energético (Velloso et al., 2011).
Existem grupos particulares de neurônios responsáveis por essa homeostase energética central, sendo eles: NPY e AgRP – responsáveis por sinais orexigênicos – que são estimulados quando há concentrações plasmáticas baixas de insulina e leptina; e os neurônios anorexigênicos POMC e CART, com maior atividade após as refeições, quando os níveis de insulina e leptina apresentam elevados no sangue (Niswender et al., 2004). Estes neurônios são os principais responsáveis por detectar sinais periféricos e gerar as primeiras respostas fisiológicas e comportamentais para adequar o metabolismo energético (Velloso et al., 2008).
Nos últimos anos, demonstrou-se que na obesidade experimental ocorre a ativação de uma resposta inflamatória no hipotálamo, a qual determina o desenvolvimento de um quadro de resistência à ação dos principais hormônios anorexigênicos e pró-termogênicos – leptina e insulina – levando assim, a um distúrbio da homeostase energética (Velloso et al., 2011).
Esta inflamação é oriunda da ativação inicial do sistema imune inato, que é composto por diversas células efetoras circulantes como: neutrófilos, macrófagos, mastócitos, eosinófilos, células dendríticas e Natural Killers (NK); e por proteínas plasmáticas como o complemento, a proteína-C reativa, a lectina de ligação à manose e os fatores de coagulação, que podem ser rapidamente ativadas na presença de microorganismos ou de substâncias produzidas na infecção, e desta forma iniciam a resposta imunológica (Iwasaki et al., 2010; Medzhitov et al., 2000a).
A imunidade inata está por trás da maioria das respostas inflamatórias e é acionada em primeira instância por macrófagos, leucócitos e mastócitos. Essas células se tornam ativadas rapidamente se diferenciando em células efetoras cujo papel principal é eliminar a infecção. Porém, o sistema imune inato pode não ser capaz de eliminar totalmente o agente agressor podendo então participar da ativação do sistema imune adaptativo que responde de forma especifica (Iwasaki et al., 2010; Mogensen et al., 2009; Janeway et al., 2002).
Respostas imunológicas podem ser acionadas por alguns tipos específicos de ácidos graxos saturados, constituintes naturais de alimentos. Tais respostas parecem
ser iniciadas através de um receptor específico, conhecido como Toll Like Receptor (TLRs). Os TLRs são proteínas-transmembrana responsáveis pela detecção da invasão do organismo por patógenos. Os TLRs são expressos em vários tipos de células do sistema imune, incluindo macrófagos, células dendríticas, micróglia, linfócitos B e tipos específicos de linfócitos T. A expressão dos TLRs também é observada em outros tipos de células como adipócitos, células endoteliais e células do epitélio intestinal (Takeda et al., 2003).
Atualmente existem 12 membros da família dos TLRs identificados em mamíferos. TLR 1, 2, 4 e 6 são capazes de reconhecer componentes lipídicos. O TLR4 é um subtipo de TLR que é responsável pelo reconhecimento de lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas. Da mesma forma com que os receptores TLR4 reconhecem estruturas lipídicas presentes em agentes invasores, ácidos graxos oriundos do consumo dietético podem também ser reconhecidos por este sistema, causando a ativação da via do sistema imune, mesmo sem a presença de um microorganismo invasor (Lee et al., 2001).
A associação dos TLRs com seus ligantes ativa duas vias de sinalização distintas, a via dependente do fator de diferenciação mielóide 88 (MyD88) e uma via independente do MyD88 (Takeda et al., 2003). Após sua ativação, os TLRs dimerizam e sofrem mudanças conformacionais necessárias para o recrutamento de moléculas adaptadoras contendo um domínio TIR. Há quatro moléculas adaptadoras que exercem esta função: o MyD88, TRIF, TICAM e TRAM (Yamamoto et al., 2002). O MyD88 e o TRIF, são responsáveis pela ativação de diferentes vias de sinalização, que acarretam na produção de citocinas pró-inflamatórias e interferons (IFNs), respectivamente.
Depois da ativação do TLR, o MyD88 liga-se ao domínio citoplasmático dos TLRs, o que facilita a associação da quinase 4 associada ao receptor de IL-1 (IRAK4) com o receptor. A ligação do MyD88 com a IRAK4 permite a fosforilação de resíduos na quinase 1 associada ao receptor de IL-1 (IRAK1), induzindo a atividade quinase da IRAK1. A IRAK1 ativada autofosforila resíduos na sua região N-terminal, o que possibilita a ligação do fator 6 associado ao receptor de TNF (TRAF6) ao complexo (Takeda et al., 2004). O complexo IRAK1-TRAF6 desliga-se do receptor e interage na
membrana plasmática com outro complexo pré-formado que inclui a quinase1 ativada por fator de crescimento transformador β (TAK1), a proteína 1 ligadora da TAK1 (TAB1) e a proteína 2 ligadora da TAK1 (TAB2) ou a proteína 3 ligadora da TAK1 (TAB3). Esta interação induz a fosforilação da TAB2/TAB3 e da TAK1, que se desloca em conjunto com o TRAF6 e TAB1 para o citoplasma. A TAK1 é ativada por fosforilação no citoplasma, possibilitando a ativação de proteínas pertencentes a diferentes vias como as do IKK/IκB/NFκB. A potência da resposta inflamatória pode ser ainda maior quando outras quinases são ativadas pela TAK1, de forma paralela à sinalização do NFκB, como as proteínas decorrentes da via da JNK e da proteína 38 (P38) (Verma et al., 2010).
O principal fator ambiental responsável pela indução da inflamação hipotalâmica é o consumo de dietas ricas em gorduras saturadas. Ácidos graxos saturados de cadeia longa, bastante comuns na dieta ocidental, sinalizam através de TLR4 a transdução de sinais através de vias inflamatórias, o que resulta no estímulo à produção de citocinas tais como TNF-α e IL-1-β. Acredita-se que células da micróglia sejam o principal alvo da ação inflamatória dos ácidos graxos saturados. As citocinas produzidas neste contexto agem de forma parácrina sobre neurônios do hipotálamo, levando a ativação de vias inflamatórias de resposta, principalmente através de JNK e IKK, as quais induzem resistência à ação da leptina e insulina, sendo este o evento que melhor ilustra a disfunção hipotalâmica na obesidade (Milanski et al., 2009; Thaler et al., 2012).
A inibição da inflamação hipotalâmica por mecanismos farmacológicos ou genéticos previne ou reverte o fenótipo de obesidade, colocando a inflamação hipotalâmica numa posição de destaque na patogênese da obesidade (Velloso et al., 2011).
Um estudo realizado pelo nosso grupo foi o primeiro a demonstrar que animais submetidos a uma dieta rica em lipídios de cadeia saturada, exibiam um processo inflamatório central, com a presença de citocinas pró-inflamatórias no hipotálamo. Além disso, através da técnica de macroarray, demonstrou-se que a dieta hiperlipídica promoveu a modulação positiva ou negativa de 170 especificidades de mRNA. Houve regulação de mRNAs codificadores de proteínas de várias categorias, variando desde
hormônios e receptores de hormônios até enzimas, proteínas envolvidas com sinalização celular, fatores de transcrição entre outros. Entretanto, citocinas e proteínas participantes de resposta pró-inflamatórias, como IL-1β, IL-6 e TNF-α foram aquelas que sofreram maior modulação (De Souza et al., 2005). Além disso, outro trabalho do grupo demonstrou que apenas alguns tipos de ácidos graxos saturados são capazes de induzir uma resposta inflamatória no hipotálamo, levando a resistência a ação catabólica da insulina e da leptina (Milanski et al., 2009).
Outro mecanismo envolvido com a ativação de inflamação no hipotálamo de modelos animais de obesidade é o estresse de retículo endoplasmático (ER stress) (Coope et al., 2012; Zhang et al., 2008; Hosoi et al., 2008; Ozcan et al., 2008). Ao serem sintetizadas no citosol, pelos ribossomos, as proteínas de membrana e as proteínas secretórias atravessam a membrana do retículo endoplasmático (ER) ganhando sua luz. É nessa organela que as proteínas adquirem sua conformação secundária para, a seguir, adquirir a forma tridimensional e finalmente, em alguns casos, interagirem com outras proteínas para formar complexos quaternários (Ozcan et al., 2009). Quando há um processamento inadequado das proteínas, pode ocorrer o acúmulo de formas proteicas disfuncionais no ER. Infecção viral, toxinas, presença de lipídios, privação ou excesso de glicose ou nutrientes são algumas das situações que podem desencadear esse processo (Kim et al., 2007; Kaufman et al., 2002; Ma et al., 2001), e com certa frequência, podem levar ao desenvolvimento de doenças, como o acúmulo de beta-amilóide na doença de Alzheimer e de agregados de rodopsina na retinite pigmentosa (Almeida et al., 2006).
O grande risco ocasionado por esse acúmulo de formas proteicas levou ao desenvolvimento de mecanismos de salvaguarda celular, dentre eles as chaperonas cumprem importante papel na organização funcional do ER, ligando-se às proteínas e protegendo-as de ligações danosas (Brodsky et al., 2012). Quando permanecem por longos períodos no ER, as proteínas malformadas são direcionadas à degradação num processo denominado ERAD (ER-associated degradation) (Brodsky et al., 2012).
A funcionalidade do ER, e, por conseguinte, a homeostase celular, são dependentes do equilíbrio entre a síntese, a liberação proteica e a degradação de
proteínas anômalas. Caso ocorra um desequilíbrio nesse processo, ocorrerá acúmulo de proteínas no ER gerando uma condição conhecida como estresse de retículo (ER
stress) (Brodsky et al., 2012).
Com o objetivo de preservar a integridade funcional do ER, uma complexa resposta celular, conhecida como unfolded protein response (UPR), é ativada na célula em ER stress (Hetz et al., 2013). O objetivo biológico principal da UPR é garantir que, por um determinado período de tempo, a célula possa ampliar sua capacidade de fluxo de proteínas através do ER. Para tal, ocorre um aumento da síntese de proteínas estruturais e funcionais do ER, as quais contribuem para permitir que o ER se adapte às necessidades momentâneas e reduza o acúmulo de proteínas malformadas na sua luz. No entanto, em razão da magnitude do distúrbio que leva ao ER stress, ou mesmo pelo tempo excessivo de sua manutenção, esses mecanismos podem não ser suficientes e, neste caso, serão ativadas vias apoptóticas (Hetz et al., 2013). As principais proteínas da membrana do RE envolvidas na indução da UPR são PERK, ATF6 e Ire1 (Shen et al., 2004). No estado basal, estas três proteínas são inibidas pela ligação da chaperona Grp78 (BIP) (Bertolotti et al., 2000). O recrutamento da Grp78 pelas proteínas desdobradas libera a atividade da PERK, ATF6 e Ire1, que desencadeiam eventos distintos que se relacionam inicialmente à adaptação da célula à situação que gerou o distúrbio no funcionamento do RE, mas que também podem desencadear a execução da apoptose.
A proteína PERK, na resposta ao estresse, é ativada quando há o desacoplamento da GRP78 de seu sítio específico na PERK e por meio de oligomeriazação e transfosforilação a PERK fosforila e inativa a subunidade alfa do eIF2α (eukaryotic translational iniciation factor 2 α) levando à redução da tradução de proteínas, e por conseguinte, o aporte proteico para o interior do retículo é reduzido (Yoshida et al., 2007; Hotamisligil et al., 2010). A ativação da PERK, pode ainda, aumentar a síntese de ATF4 (Activating transcription fator 4) e este promove a regulação de vários genes envolvidos na UPR (Herbert et al., 2007). A IRE1 possui um domínio no lúmen do RE sensível às proteínas mal formadas e uma porção citoplasmática que possui um domínio quinase e um domínio RNAse. Uma vez ativa, a
IRE1α converte o RNA mensageiro imaturo da proteína XBP-1 (x-box binding protein) em RNA mensageiro maduro por um mecanismo não convencional de splicing. A proteína traduzida a partir deste RNA maduro ativa a transcrição de genes que compõem o ERAD, induz a expressão de proteínas envolvidas na síntese de lipídeos, a biogênese do RE e também a produção de chaperonas, tais como a GRP78 (Hotamisligil et al., 2010). Se o estresse for crônico, o domínio citoplasmático pode interagir com a TRAF2 e promover o aumento de síntese de NFkB e de proteínas inflamatórias (Rasheva et al., 2009). O ATF6 é um fator de transcrição presente na membrana do RE e, quando liberado da GRP78, é ativado e encaminhado para o aparelho de Golgi onde sofre clivagem por atividade das enzimas: S1P (site-1 protease) e S2P (site-2 protease), produzindo um fator de transcrição no citosol que se transloca para o núcleo e promove a produção de chaperonas e XBP-1. (Hotamisligil et al., 2010).
Estas respostas da UPR promovem a regulação da homeostase celular, porém, sob ativação crônica, a resposta de estresse pode ativar a via de apoptose. Embora pouco conhecido, a resposta à apoptose pelo estresse de retículo envolve diferentes mecanismos, por exemplo, ativação direta da via das caspases e de fatores de transcrição mediadores da apoptose (CHOP) (Momoi et al., 2004; Kadowaki et al., 2004; Oyadomari et al., 2004)
Um interessante avanço na caracterização da disfunção hipotalâmica na obesidade (considerando a participação da inflamação e do ER stress) foi estabelecido recentemente, em um estudo que avaliou a conexão entre o ER stress e a função de mitocôndrias em neurônios do hipotálamo. De acordo com este estudo, durante etapas iniciais da instalação da obesidade induzida por dieta, desenvolve-se um defeito no processo de fusão e fissão de mitocôndrias em neurônios do hipotálamo. Tal defeito tem por base a redução na associação física ente mitocôndrias e o ER. Assim, este estudo expandiu o valor do defeito funcional do ER em células do hipotálamo durante a obesidade (Schneeberger et al., 2013).
Além dessas duas vias – inflamação e ER stress – outras vias e proteínas foram recentemente relacionadas com o processo de desenvolvimento da obesidade (Dietrich et al., 2013). Embora já descrito em meados do século XX mudanças
morfológica em mitocôndrias, apenas em 2007 foi demonstrado que as mitocôndrias apresentam um alto dinamismo morfológico regulado pelos processos da fusão e fissão mitocondrial (Cerveny et al., 2007) e para que isso ocorra, é preciso da ação de diversas proteínas presentes na membrana mitocondrial, por exemplo, mitofunisa 1 (MFN1), mitofusina 2 (MFN2) (Chen et al., 2003; Santel et al., 2001), OPA1 (Cipolat et al., 2004) e Drp1 (Reddy et al., 2011; Cipolat et al., 2004; Smirnova et al., 1998).
Um estudo demostrou que as mitocôndrias em neurônios AgRP apresentam um dinamismo morfológico dependente do estado de alimentação do animal. Quando o animal é privado de alimento, as mitocôndrias presentes nesta população de neurônios apresentam um tamanho reduzido, formato mais circular e em maior número, indicando processos de fissão mitocondrial. Por outro lado, quando o animal é submetido à dieta hiperlipídica, as mitocôndrias passam a apresentar um tamanho maior, mais alongadas e em menor número, evidenciando o processo de fusão mitocondrial (Dietrich et al., 2013).
Estudos mostram que animais alimentados por dieta hiperlipídica apresentam uma redução no número de contato de mitocôndrias com o retículo endoplasmático acompanhado por um ER stress em neurônios POMC. Este fenômeno foi reproduzido em animais knockout para MFN2 em neurônios POMC (Cerveny et al., 2007).
Desta forma, de acordo com os principais estudos realizados nesta área, existem três mecanismos envolvidos com o desenvolvimento da disfunção hipotalâmica na obesidade, quais sejam: inflamação, ER stress e alterações mitocondriais. Entretanto, nenhum estudo até o momento avaliou qual destes mecanismos é o mais precoce. Assim sendo, investigamos a relação temporal entre eles, para definir a sequência de eventos que culmina com a instalação da disfunção hipotalâmica na obesidade. Consideramos que ao definir adequadamente a sequencia de eventos que culmina com a disfunção hipotalâmica na obesidade, forneça substrato para que se progrida no desenvolvimento de métodos profiláticos e terapêuticos mais eficientes para a prevenção e tratamento da obesidade.
OBJETIVOS
Geral
Definir o perfil temporal de deflagração da inflamação, do estresse de retículo endoplasmático e de alterações mitocondriais no hipotálamo de animais alimentados com dieta hiperlipídica.
Específicos
Avaliação da evolução temporal entre os parâmetros de inflamação, estresse de retículo e alterações mitocondriais.
Inibição do TNF-α por infliximab e avaliação do conteúdo proteico dos três mecanismos estudados.
Inibição do ER stress por PBA (ácido fenil-butírico) e avaliação do conteúdo proteico dos três mecanismos estudados.
MATERIAL E MÉTODOS
Modelo animal
Foram utilizados camundongos Swiss, machos, obtidos do Centro de Bioterismo da UNICAMP com cinco semanas de vida e mantidos em gaiolas individuais, climatizadas, em ciclo claro-escuro de 12 horas e com ração e água ad libitum. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FCM – UNICAMP (Projeto CEUA: 3233-1).
Protocolos experimentais
Ao atingirem 5 semanas de vida os camundongos foram pesados, numerados e separados em 8 grupos. Um grupo recebeu dieta padrão e os outros 7 receberam dieta rica em ácidos graxos saturados (HFD), em diferentes tempos, a saber: 3, 6 e 12 horas e 1, 3, 5 e 7 dias. Após completar o tempo determinado de dieta, os animais foram submetidos a anestesia e eutanásia e em seguida o hipotálamo foi extraído e utilizado nos experimentos. Para a separação dos animais, foi utilizada a “separação em Z”, (para as médias serem iguais entre os grupos). A composição das dietas está na Tabela 1.
O grupo de camundongos ao qual ofertamos HFD em equivalência calórica com o grupo ração foi denominado pair feeding. Para isso, calculamos o consumo diário de ração pelos animais e mensuramos a quantidade calórica e igualamos essa quantia com a HFD.
Os animais que receberam tratamento com inflixmab e PBA receberam as doses nas concentrações de 10mg/kg ou 80mg/kg respectivamente. A primeira dose foi administrada 12 horas antes da introdução à HFD, a segunda dose concomitante a introdução da HFD e a terceira e última dose 12 horas depois. Assim, submetemos os animais à 24 horas com HFD e todos os animais foram eutanasiados sempre no mesmo horário (entre 9 e 10 horas da manhã).
Dissecção do hipotálamo.
Os animais foram anestesiados através de injeção intraperitoneal de tiopental sódico (15 mg.kg-1). A perda dos reflexos pedioso e corneano foram utilizadas para avaliação da eficiência da anestesia. Confirmada a eficácia anestésica, os animais foram submetidos a eutanasia por decapitação. Após a abertura do crânio, o hipotálamo foi retirado e homogeneizado para quantificação de proteínas por western
blot ou para quantificação de RNA mensageiro por RT-PCR em tempo Real.
Tabela 1. Composição das dietas controle e hiperlipídica ou rica em gordura saturada, utilizadas nos experimentos.
Controle Hiperlipídica rica em saturados
Amido (Q.S.P) 467,5 115,5
Caseína 200 200
Amido de Milho Dextrinizado 132 132
Sacarose 100 100
Óleo de Soja 40 40
Banha 0 312
Celulose microfina (Fibra) 50 50
Mix Minerais 35 35 Mix Vitaminas 10 10 L-Cistina 3 3 Bitartarato de colina 2,5 2,5 Total 1000 1000 Western Blot
As amostras foram homogeneizadas em aproximadamente 10 volumes de tampão de solubilização contendo 1% Triton X-100, 100 mM Tris (pH 7,4), 100 mM de pirofosfato de sódio, 100 mM de fluoreto de sódio, 10mM de EDTA, 10 mM de vanadato de sódio; 2 mM PMSF e 0,1 mg/mL de aprotinina a 4 °C em “Polytron PTA 20S Generator” (Brinkmann Instruments mode PT 10/35) com velocidade máxima por 30 segundos. O homogeneizado foi centrifugado a 11.000 rpm a 4 °C em um rotor
“Beckman 70,1”, por 40 minutos para remoção de material insolúvel. A proteína total do sobrenadante foi determinada por meio do método colorimétrico pela reação do biureto com leitura 540 ηM por ELISA. O sobrenadante foi utilizado para o ensaio de imunoprecipitação e/ou preparação de extrato total proteico (ET). Os extratos totais proteicos ou os imunocomplexos ressuspensos em tampão de Laemmli, foram aplicados em gel de poliacrilamida para separação por eletroforese (gel não desnaturante). As proteínas separadas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose em aparelho de transferência da BIO-RAD banhadas com tampão de transferência durante aproximadamente 40 minutos a 19 Volts. A ligação do anticorpo às proteínas não específicas foi minimizada pela pré-incubação das membranas de nitrocelulose com tampão de bloqueio (5 % de leite em pó desnatado; 10 mmol/L de Tris, 150 mmol/L de NaCl, 0,02 % de Tween 20) por 1 hora. Então, as membranas de nitrocelulose são incubadas de 12 horas a 3 dias com um anticorpo específico. A detecção do complexo antígeno-anticorpo fixo à membrana de nitrocelulose foi obtida por quimiluminescência utilizando um kit da Amersham e seguindo as orientações do fabricante. Após a revelação das auto-radiografias as bandas identificadas foram quantificadas por meio de densitometria óptica.
Para mensurar a quantidade proteica das citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias, utilizamos os anticorpos primários: anti-TNF- α (policlonal de coelho, SC -8301), anti-IL-1β (anticorpo policlonal de cabra, SC- 8481), anti-IL-6 (policlonal de coelho, SC- 7920) e IL-10 (anticorpo policlonal de cabra, SC -1783). Para mensurar as proteínas relacionadas ao estresse de retículo endoplasmático foram utilizados: anti-eIf2a (policlonal de coelho, SC-11386), anti-EIF2S1 (phospho S51) (policlonal de coelho ab-3215), anti-XBP 1 (policlonal de coelho –61950), anti-IRE 1α (policlonal de coelhoSC-20790), anti-IRE 1 (phopho S724) (policlonal de coelho ab-48187), anti-PERK (policlonal de coelho sc-13073), anti-pPERK (policlonal de coelhoSC-32577R), anti-ATF4 (monoclonal de camundongo ab50546), anti-GRP78 BIP (monoclonal de coelho ab21685) e anti-DDIT3 (monoclonal de coelho ab11419). Para verificar os níveis de Mfn2 na mitocôndria, utilizamos o anticorpo anti-Mitofusin 2 (monoclonal de coelho ab-50843).
Extração de RNA
As amostras foram homogeneizadas em reagente de Trizol (Invitrogen, São Paulo, Brasil) por 30s usando um homogeneizador de tecidos (Polytron-Agregate, Kinematica, Littau/Luzern, Switzerland) na velocidade máxima. Em seguida foram centrifugadas a 6.000 rpm, e o conteúdo total de RNA foi isolado de acordo com as instruções do fabricante e quantificado por espectrofotometria. A integridade do RNA foi verificada por eletroforese em gel de agarose. A síntese de cDNA foi realizada com 2μg do total de RNA usando o Hight-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems).
Real Time PCR
Alíquotas de 2μg de RNA foram submetidas à transcrição reversa utilizando-se
primers hexaméricos randômicos e Superscrit Maloney MLV transcriptase reversa. A
avaliação de resultados foi realizada por eletroforese em gel de agarose 3 %. As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando-se o sistema TaqMan TM (Applied Biosystems), que é constituído por um par de primers e uma sonda marcada com um fluoróforo. Os genes que avaliamos foram: TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, fractalkine, XBP-1s, CHOP e eIF2α. O gene GAPD (TaqManTM - Applied Biosystems) foi escolhido como controle endógeno da reação, o qual serviu para normalizar a expressão do gene de interesse nas diferentes amostras. A sonda GAPD é marcada com o fluoróforo VIC. Antes de iniciar o experimento de quantificação relativa da expressão dos genes acima foi realizada a validação do sistema para os mesmos e para o controle endógeno (GAPD), para verificar se as eficiências de amplificação são semelhantes e próximas a 100%. Esse passo é essencial para que o controle endógeno possa ser utilizado para normalizar os valores de expressão relativa do gene de interesse. A validação consiste na amplificação dos cDNAs em triplicatas de 7 concentrações diferentes (diluições seriadas de 3 vezes) de uma amostra escolhida aleatoriamente, tanto com os oligonucleotideos do gene de interesse quanto do controle endógeno. Em seguida, foi construída uma curva padrão a partir do logaritmo da concentração das amostras pelo Ct (Threshold Cycle: ciclo em que cada curva de amplificação atravessa o limiar de detecção (Threshold), o qual e definido
arbitrariamente). Nessa curva, foram obtidos os valores da inclinação (slope) da curva e da confiabilidade das replicas. Dessa forma, a eficiência de um sistema é calculada através da formula: E = 10 (-1/slope) - 1. Para a placa de validação dos genes foram feitas triplicatas da amostra de cDNA dos tecidos referentes aos tratamentos citados acima em 7 concentrações diferentes. Após o cálculo da eficiência de amplificação do gene de interesse e do controle endógeno foi construído um gráfico de dispersão com a finalidade de definir a amplitude de concentrações para as quais o sistema será eficiente. Para a construção do gráfico foram utilizados os mesmos valores de logaritmo da concentração das amostras no eixo X e a diferença entre as medias dos Cts do controle endógeno e as medias dos Cts do gene de interesse para cada concentração no eixo Y. Em seguida, foi obtida uma linha de tendência para estes valores, a qual possui uma equação de reta na qual foi possível verificar o valor da inclinação desta reta. Para que um o sistema fosse considerado eficiente, o valor da inclinação teve que ser menor que 0,1 (quanto mais próximo de zero for este valor, menor e a inclinação da curva e, portanto, mais constante é a diferença entre as medias dos Cts do gene de interesse e do controle endógeno). Os pontos no gráfico, correspondentes às concentrações, que estiveram mais próximos à linha de tendência foram considerados validados (o sistema tem próximo de 100% de eficiência nestas concentrações). Para a quantificação relativa do gene em estudo, as reações de PCR em tempo real foram realizadas em triplicata a partir de: 3 μL de TaqMan Universal PCR Master Mix 2x, 0,25 μL da solução de oligonucleotideo e sonda, 2,75 μL de agua e 4,0 μL de cDNA, sendo que o controle negativo foi realizado com 4,0 μL de água, ao invés do cDNA. Os ciclos utilizados no termociclador foram: 50 oC por 2 minutos, 95 oC por 10 minutos, 40 ciclos de 95 oC por 15 segundos e 60 oC por 1 minuto. Os valores da expressão gênica relativa foram obtidos pela analise dos resultados no programa 7500 System SDS Software (Applied Biosystems).
Microscopia eletrônica de transmissão
Os camundongos foram perfundidos com solução fixadora (paraformaldeído a 4%, 0,125% de glutaraldeído, em tampão de fosfato [PB] 0,06 M [ pH = 7,4 ]). Após a perfusão, foi realizada a extração do cérebro. Foi utilizado o osteótomo entre o osso e a dura-máter para quebrar e retirar pequenos pedaços de osso até chegar ao bulbo olfatório. A dura-máter e a foice do cérebro foram rebatidas com delicadeza para evitar que as mesmas não danificassem o encéfalo; o arco zigomático foi removido e os ossos temporais afastados. Em seguida, foi realizado um corte no nível do bulbo olfatório e elevando-se o encéfalo e expondo o nervo trigêmeo. Os nervos foram cortados e suavemente o encéfalo foi removido da cavidade craniana. Após a extração, foi feita a crioproteção do encéfalo, imergindo-o em uma solução de sacarose (C12H22011 PM 342,3) à 30% em PB 0,1 M pH 7,4 a 4 ºC durante 48h.
Para avaliação morfológica das mitocôndrias do tecido nervoso do núcleo arqueado do hipotálamo, o tecido foi dissecado e pré-fixado em solução de 2,5% glutaraldeido e 2% paraformaldeído em tampão de cacodilato 0,05M (pH 7,2) com 0,001M de cloreto de cálcio por 2h, pós-fixados em tetróxido de ósmio no mesmo tampão por 1h, e então corados com solução aquosa 0,5% de acetato de uranila por 18h. As amostras foram desidratadas em acetona e embebidas em meio de baixa viscosidade. Os blocos foram seccionados em ultramicrotomo, corados com solução aquosa 3% de acetato de uranila e acetato de chumbo e examinados com microscópio eletrônico de transmissão Tecnai G2 Spirit Twin (FEI, Hillsboro, OR). Para verificar o número do contado entre a mitocôndria e o retículo endoplasmático rugoso (mitocôndria-RE), foi utilizado o teste duplo cego, e foram consideradas positivas (contato mitocôndria-RE) aquelas mitocôndrias nas quais as cristas fossem facilmente identificáveis e que tangenciassem o retículo.
Análise da respiração mitocondrial hipotalâmica
Os animais foram eutanasiados e o cérebro retirado com muito cuidado para não perder as referências anatômicas, retiramos o hipotálamo do cérebro e cortamos um fragmento cerca de 2 a 3 mg da região inferior do hipotálamo. Em seguida, este tecido foi colocado no interior da câmera do equipamento Oroborus. O consumo de O2 foi monitorado em suspensões com concentrações proteicas de 0,125 mg/ml sob as mesmas condições tamponantes usadas na medida de H2O2 mitocondrial, valendo-se de um eletrodo de Clark que opera sob agitação contínua a 37oC, acoplado a um sistema Oroboros de respirometria de alta resolução (Hütter et al., 2006). O tampão utilizado contém KCl 150 mM, Hepes 10 mM, fosfato inorgânico 2 mM, MgCl2 2 mM, 0,1% BSA e pH ajustado para 7,2 com adição de KOH. Após as amostras serem colocadas na câmara do equipamento, esperamos cerca de 15 minutos para obter a calibração adequado do sistema. Em seguida adicionamos Saponina 50 μM para permeabilizar as células, piruvato 5 mM e malato 3 mM em concentrações saturantes para servir como substrato do complexo I. Após 6 minutos, adicionamos ADP 5 mM também em concentração saturante. Seis minutos depois, foi adicionado oligomicina 2 μg/ml; e, finalmente, pós 6 minutos adicionamos rotenona 1 μM.
Análise estatística
Os resultados foram apresentados em média e desvio padrão da média. Para análise estatística, primeiramente aplicamos o teste de Levene para verificar as homogeneidades das variâncias. Para a comparação de médias entre dois grupos, aplicamos o teste t de Student para amostras independentes. Quando necessário, foi utilizada análise de variância (ANOVA) e quando indicado, o teste de Tukey HSD para comparação múltipla de médias. Em todos os casos o nível de significância para rejeição da hipótese de nulidade será de 5% (p<0,05). Os dados foram analisados utilizando o programa "Statistic for Windows", versão 7.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para definir a evolução temporal entre a inflamação, o ER stress e as alterações mitocondriais, durante o desenvolvimento do distúrbio funcional do hipotálamo em animais alimentados com dieta hiperlipídica, submetemos os camundongos a diferentes períodos (3, 6 e 12 horas e 1, 3, 5 e 7 dias) de ingestão de dieta preparada com 35% (massa/massa) de gordura, predominantemente saturada. Camundongos do grupo controle foram alimentados com ração convencional pelos mesmos períodos de tempo. Ao final do tempo estipulado para cada subgrupo, os camundongos foram utilizados nos procedimentos experimentais.
O impacto do consumo da HFD na inflamação hipotalâmica
A primeira análise foi realizada pelo método de Western Blot, assim pudemos mensurar a quantidade de proteínas específicas relacionadas à inflamação, em seguida fizemos também a análise por PCR e mensuramos a quantidade de transcritos relacionados a inflamação.
A Figura 1 apresenta os resultados obtidos com a mensuração da expressão proteica de citocinas pro- e anti-inflamatórias no hipotálamo. Houve um aumento da expressão de todas as proteínas avaliadas após 24 horas de consumo de HFD. Com 3 e 5 dias de dieta apenas o TNF- α se manteve elevado, sendo que com 5 e 7 dias ocorreu uma diminuição no conteúdo de IL-6 quando comparado ao controle. Após 7 dias de consumo da dieta rica em gordura saturada a quantidade das citocinas TNF-α e IL-1β voltou a aumentar. A proteína IL-10 apresentou um significativo aumento nas 12 primeiras horas da ingestão de dieta hiperlipídica.
Figura 1: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de citocinas. Normalização por α-tubulina. (n≥6; *p<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).
A Figura 2 apresenta os resultados obtidos em ensaios de RT-PCR nos quais mensuraram-se transcritos codificadores de proteínas envolvidas na resposta inflamatória em hipotálamo de camundongos alimentados com ração ou HFD nos tempos de 3, 6, 12, 24 horas e 3, 5 e 7 dias. Por este método, podemos notar um aumento precoce da expressão gênica das citocinas pró-inflamatórias. Thaler já havia descrito em 2012 um aumento da expressão gênica hipotalâmica das citocinas IL-6 e TNF-α 24 horas após o início de consumo de dieta hiperlípica (Thaler et al., 2012). Seu estudo mostrou que a diminuição na expressão da IL-6 ocorreu após 7 dias de consumo de dieta e voltou a subir no 28º dia de exposição a dieta hiperlipídica. Já a citocina TNF-α, apresentou uma diminuição após 3 dias de consumo e um posterior aumento da expressão também no 28º dia de consumo da dieta (Thaler et al., 2012). Nossos resultados mostram que a atividade inflamatória em resposta a HFD é ainda mais precoce, sendo detectada apos 6 horas.
Citokines (mRNA) 0 1 2 3 4 IL-1 TNF- IL-6 IL-10 Fractalkina CTL 3H 6H 12H 24H 3D 5D 7D * * * * * * * * Tempo m R N A ( re la ti v o a o c o n tr o le )
Figura 2: Avaliação quantitativa por real-time PCR de transcritos envolvidos na inflamação, normalização por GAPDH. (n≥6; *P<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).
A elevação precoce e a persistência no incremento da expressão do transcrito da fractalkina nos levou a realizar novo experimento com tempos mais curtos de exposição à HFD. A Figura 3 mostra, por Western blot, que a expressão proteica de fractalkina se eleva a partir de 3 horas apos o início do consumo de HFD.
Figura 3: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de fractalkina em camundongos alimentados com ração (CTL) ou dieta hiperlipídica por 3 horas, 6 horas, 5 dias ou 7 dias. Normalização por α-tubulina. (n≥3; *p<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).
Portanto, o conteúdo de proteínas inflamatórias foi aumentado em camundongos Swiss após horas de exposição à dieta hiperlipídica, sendo a fractalkina a mais precoce – 3 horas. Porém, para esclarecer se a modulação da expressão de
proteínas inflamatórias se deve a uma maior proporção de ácido graxo na dieta ou a um aumento na ingestão calórica, pois nos primeiros dias de oferta de HFD, os camundongos apresentam um aumento na ingestão calórica (Figura 4), fizemos um experimento em que foi oferecido somente a quantidade calórica de HFD igual àquela consumida pelos camundongos controle alimentados com ração. O grupo de camundongos alimentados somente com HFD sem limite de ingestão calórica foi denominado ad libitum. Enquanto o grupo ao qual ofertamos HFD em equivalência calórica com o grupo ração foi denominado pair feeding. O experimento teve sub-grupos avaliados após 12 e 24 horas e 3 dias de exposição a HFD (Figura 5).
Raç ão 1º D ia-H FD 2º D ia-H FD 3º D ia-H FD 7º D ia-H FD 14º D ia-H FD 21º D ia-H FD 0 10 20 30 40 HFD Ração * * * * * C o n s u m o d e d ie ta ( k c a l/ d ia )
Figura 4: Ingestão calórica em 24 h de camundongos com oferta ilimitada de ração ou dieta hiperlipídica (HFD) (n=20; *p<0,05 vs. controle – linha tracejada).
Este experimento revelou que algumas proteínas eram moduladas positivamente principalmente em decorrência da quantidade de calorias ingeridas (IL-10 e TNF-α), enquanto, pelo menos uma, IL-6, era estimulada pela simples presença de proporções mais elevadas de ácidos graxos na dieta (Figura 5).
Figura 5: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de IL-10 (a), TNF-α (b) e IL-6 (C) em camundongos alimentados com dieta hiperlipídica (HFD) sem restrição quantitativa (ad
libitum) ou com quantidade igual aquela consumida por camundongos alimentados com ração (pair feeding). Os tempos de oferta de ração foram 12 horas para 10, 3 dias para TNF-α e 24 horas para
IL-6. Normalização por α-tubulina (n=4; *p<0,05 vs. HFD ad libitum).
O impacto do consumo da HFD no desenvolvimento da resposta a proteínas mal enoveladas
Estudos pregressos haviam demonstrado que o consumo de excesso de ácidos graxos na dieta pode causar o acúmulo de proteínas mal enoveladas no retículo endoplasmático e gerar uma condição conhecida como estresse do retículo endoplasmático (ER stress) (Brodsky et a., 2012). Numa tentativa de restabelecer a integridade funcional do ER, uma resposta celular, conhecida como unfolded protein
response (UPR) é ativada na célula em ER stress (Schönthal et al., 2012). E as principais
proteínas da membrana do RE envolvidas na indução da UPR são PERK, ATF6 e Ire1 (Lumeng et al., 2007) (Figura 6).
Figura 6: Vias de sinalização em resposta ao ER stress (Adaptado de Axel H. Schönthal et al., 2012).
A indução de ER stress muitas vezes é precedida pela modulação da expressão de chaperonas do retículo. Neste estudo utilizamos PCR em tempo real para avaliar o impacto do consumo de HFD na expressão de transcritos de duas chaperonas do retículo, GRP78 e GRP94. A Figura 7 mostra que ambas as chaperonas apresentam aumento de expressão de seus transcritos entre 3 horas e 3 dias após o início do consumo de HFD. A seguir utilizamos a técnica de Western blot para avaliar a dinâmica temporal da expressão de GRP78. Para tal, camundongos foram alimentados com ração convencional ou HFD por diferentes períodos de tempo e extratos proteicos do hipotálamo foram utilizados nos experimentos. O conteúdo proteico da chaperona GRP78 apresentou um aumento significativo a partir de 6 horas de exposição à HFD, sugerindo uma resposta a proteínas mal enoveladas no interior do retículo endoplasmático (Figura 8).
CHAPERONAS 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 GRP94 GRP78 * * * * p=0,066 * * * * CTL 3H 6H 12H 24H 3D 5D 7D Tempo m R N A ( re la ti v o a o c o n tr o le )
Figura 7: Avaliação quantitativa por real-time PCR de transcritos de GRP78 e GRP94, normalização por GAPDH. (n≥6; *P<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).
Figura 8: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de GPR78 em camundongos alimentados com ração (CTL) ou dieta hiperlipídica por 6, 12 ou 24 horas, 3, 5 ou 7 dias. Normalização por α-tubulina. (n=8; *p<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).
Após a liberação da Grp78 do ATF6, um mecanismo de ativação é disparado. Então o ATF6 desligado da Grp78 transloca-se para o aparelho de Golgi, onde proteases residentes o clivam e liberam o fator de transcrição ativo no citosol. Um dos alvos do ATF6 ativo é o gene do XBP-1 (Ye et al., 2000). Num segundo momento, a IRE-1α desempenha um papel essencial na reparação celular que visa adaptar a célula ao acúmulo de proteínas mal enoveladas. Após sua ativação, esta enzima processa uma região do mRNA do fator de transcrição XBP-1, que foi transcrito pela ação do ATF6. O XBP-1, induz a expressão de genes relacionados ao aumento do processamento de proteínas acumuladas no RE, na tentativa da retomada da homeostasia do RE. Ao analisar proteínas da via de sinalização da IRE-1α, identificamos uma modulação positiva desta proteína a partir do 3°dia de consumo de HFD, assim como um aumento do XBP-1s no 7º dia de exposição à HFD (Figura 9). Se a ativação da IRE-1α persistir, o XBP-1 produzido pelo seu processamento alternativo induz, tardiamente, a transcrição do gene da proteína p58kip. Esta última exibe notável atividade inibidora sobre a PERK, liberando, desta forma, a tradução de diversos mRNAs que se acumularam na célula durante a UPR, inclusive CHOP, a qual tem um papel determinante na apoptose desencadeada pela UPR (Rao et al., 2004).
Figura 9: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de IRE1a (a) e XBP1s (b) em camundongos alimentados com ração (CTL) ou dieta hiperlipídica por 6, 12 ou 24 horas, 3, 5 ou 7 dias. Normalização por α-tubulina. (n=6; *p<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).
Ao analisarmos a via da PERK, verificamos diferenças no conteúdo proteico da CHOP apenas com 12 horas de exposição à HFD (Figura 10). O perfil de modulação proteica da proteína ATF4 foi tardio, pois houve apenas uma tendência no aumento de sua expressão proteica no 7º dia de exposição à HFD.
O aumento da expressão proteica de ATF6 ocorreu a partir do 7º dia de exposição à HFD, embora já apresentasse uma tendência de aumento com 5 dias (p=0,08) (Figura 11). Portanto, dentre as 3 proteínas presentes na membrana do retículo endoplasmático, envolvidas da UPR e estresse de retículo, a ATF6 apresentou um aumento mais tardio, sugerindo que com 7 dias de exposição à HFD a célula apresenta um sinal consistente de indução de estresse de retículo endoplasmático, uma vez que neste mesmo período de tempo, várias outras proteínas também se apresentam com conteúdo aumentado.
Diante destes resultados fica claro que a inflamação precede o estresse de retículo após a exposição à dieta hiperlipídica.
Figura 10: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de pPERK (a), eif2a (b), ATF4 (c) e CHOP (d) em camundongos alimentados com ração (CTL) ou dieta hiperlipídica por 6, 12 ou 24 horas, 3, 5 ou 7 dias (em a e c) ou 12 horas, 24 horas ou 3 dias (em b e d). Normalização por α-tubulina. (n≥3; *p<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).
Figura 11: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de ATF6 em camundongos alimentados com ração (CTL) ou dieta hiperlipídica por 6, 12 ou 24 horas, 3, 5 ou 7 dias. Normalização por α-tubulina. (n=8; *p<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).
O impacto do consumo da HFD no desenvolvimento de alterações mitocondriais no hipotálamo
Na última parte do estudo avaliamos o impacto do consumo da HFD em aspectos morfológicos e funcionais das mitocôndrias no hipotálamo. A proteína mitofusina 2 (MFN2) está envolvida, juntamente com as proteínas OPA-1 e mitofusina 1 (MFN1), na regulação da fusão de mitocôndrias (Parra et al., 2011). Além disso, a MFN2 desempenha um papel importante na conexão entre a mitocôndria e o retículo endoplasmático rugoso (Boland et al., 2013). As mitocôndrias têm quatro compartimentos: a membrana mitocondrial externa (OMM), o espaço intermembranar (IMS), a membrana mitocondrial interna (IMM), e a matriz mitocondrial (Scheffler et al., 2001). MFN1 e MFN2 estão localizadas na OMM, onde participam da regulação da fusão da OMM enquanto OPA-1 localiza-se na IMM, onde participa da regulação da fusão de IMM (Zorzano et al., 2010). A região C-terminal das proteinas MFN1 e MFN2 tem uma conformação espiral enrolada e desempenha papel importante ao estabelecer a comunicação entre mitocôndrias através de complexos homo ou heterotípicos formados entre mitocôndrias adjacentes. Essa interação medeia a fusão da OMM e participa da fixação e fusão de IMM (Chiong et al., 2014). A Figura 12 ilustra a participação de MFN1, MFN2 e OPA-1 no processo de fusão de mitocôndrias.
Figura 12: Representação esquemática da participação das proteínas mitofusina-1 (MFN-1), mitofusina-2 (MFN2) e OPA-1 na dinâmica da fusão mitocondrial (Adaptado de Chiong et al., 2014).
Por meio de Western blot (Figura 13), observamos que a MFN2 sofre uma redução da sua quantidade proteica no hipotálamo após 24 horas de exposição à HFD. Após 3 e 5 dias seus níveis proteicos retornam ao normal e, finalmente, com 7 dias há aumento da expressão hipotalâmica de MFN2 em camundongos alimentados com HFD.
Figura 13: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de MFN2 em camundongos alimentados com ração (CTL) ou dieta hiperlipídica por 6, 12 ou 24 horas, 3, 5 ou 7 dias. Normalização por α-tubulina. (n=8; *p<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).
Questionamos a seguir, se as alterações de expressão hipotalâmica de MFN2 se devem à ingestão calórica ou à presença de uma proporção maior de ácidos graxos na dieta. Para responder a esta pergunta, repetimos o protocolo de pareamento de ingestão calórica, como na Figura 5, e avaliamos a expressão hipotalâmica de MFN2 por Western blot. A Figura 14 mostra que não existem diferenças significativas no padrão de expressão proteica da MFN2 quando limitamos a quantidade de Kcal ingeridas por dia, sugerindo que a modulação de MFN2 se deve predominantemente a presença do ácido graxo na dieta e não à quantidade calórica ingerida.
Figura 14: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de mitofusina 2 (MFN2) em camundongos alimentados com dieta hiperlipídica (HFD) sem restrição quantitativa (ad
libitum) ou com quantidade igual aquela consumida por camundongos alimentados com ração (pair feeding). Os tempos de oferta de ração foram 12 horas, 24 horas ou 3 dias. Normalização por
α-tubulina (n≥4).
As alterações de níveis proteicos de MFN2 nos levaram a aventar a hipótese que a HFD pudesse alterar aspectos funcionais das mitocôndrias hipotalâmicas. Para explorar esta hipótese utilizamos o equipamento Oroboros para determinar aspectos da respiração mitocondrial em fragmentos de hipotálamo obtidos de camundongos alimentados com ração ou com HFD por 24 horas ou 7 dias. Os fragmentos de hipotálamo foram inicialmente tratados com saponina, que é um detergente utilizado para permeabilizar as células fazendo com que os compostos químicos utilizados no experimento possam ter acesso às mitocôndrias. A primeira etapa, após a permeabilização, foi a adição dos substratos para o complexo 1 da membrana interna mitocondrial – malato e piruvato (MP). A segunda etapa foi a adição de ADP ao sistema. A terceira etapa consistiu na adição de oligomicina, um inibidor da ATP-sintase. A quarta e última etapa consistiu na adição da rotenona, um inibidor do complexo 1 da cadeia fosforilativa mitocondrial. A Figura 15 mostra que o consumo de HFD não resultou em modificações da respiração mitocondrial no hipotálamo de camundongos.
Figura 15: Respiração mitocondrial em fragmentos do hipotálamo de camundongos alimentos com ração (CTL) ou pro 1 ou 7 dias com HFD (n=6). PM, piruvato e malato; ADP, difosfato de adenosina; OLIG, oligomicina; ROT, rotenona.
Como a nossa hipótese de que alteração dos níveis proteicos de MFN2 poderia se associar a alteração funcional da mitocôndria se revelou nula, decidimos, a seguir avaliar por meio de microscopia eletrônica de transmissão, o número de contatos entre mitocôndrias e o retículo endoplasmático rugoso. Estudos anteriores haviam demostrado que tais contatos podem ser afetados em neurônios hipotalâmicos de animais obesos (Schneeberger et al., 2013). Assim camundongos foram alimentados com ração ou HFD por 1, 3, 5 ou 7 dias e o hipotálamo foi obtido para as respectivas análises. A Figura 16 mostra com pequeno aumento que os contatos podem ser facilmente identificados em neurônios de camundongos de diferentes grupos.
Figura 16: Microscopia eletrônica de transmissão mostrando os contatos entre as mitocôndrias e o retículo endoplasmático (seta vermelha) em camundongos submetidos a 24 horas e 3 dias de HFD e no grupo controle alimentado com ração.
A Figura 17 mostra com maior detalhe um contato entre mitocôndria e o retículo endoplasmático rugoso.
Figura 17: Microscopia eletrônica mostrando detalhes do contato entre a mitocôndria e o retículo endoplasmático (seta vermelha) em camundongos submetidos à 3 dias de HFD.
A Figura 18 ilustra múltiplos contatos de uma forma mais clara. Para tal, mitocôndrias foram preenchidas com a cor púrpura e o retículo endoplasmático rugoso marcado em amarelo. As mitocôndrias que fazem contato com o retículo são marcadas com um asterisco vermelho.
Figura 18: Microscopia eletrônica de transmissão mostrando uma representação dos contatos entre as mitocôndrias e o retículo endoplasmático em camundongos submetidos a 3 dias de HFD e grupo controle com ração. Mitocôndria (púrpura), Retículo endoplasmático (amarelo) e contatos de mitocôndria com retículo (asterisco vermelho).
A seguir contabilizamos o número de contatos relativo ao número total de mitocôndrias em neurônios hipotalâmicos de camundongos alimentados com ração ou com HFD por 1, 3, 5 ou 7 dias. A Figura 19 mostra que houve uma redução significativa de contatos a partir de 3 dias de alimentação com HFD.
CTL 1 D ia H FD 3 D ias HFD 5 D ias HFD 7 D ias HFD 0 10 20 30 40 50 * * * % M it o c ô n d ri a -R E / M it o c ô n d ri a t o ta l
Figura 19: Proporção do número de contatos entre a mitocôndria e o retículo endoplasmático em neurônios hipotalâmicos de camundongos alimentados com ração ou com HFD por 1, 3, 5 ou 7 dias (n=3; *p<0.05 vs. respectivo controle alimentado com ração - linha tracejada).
O impacto da inibição de TNF-α e ER stress na expressão de MFN2, GPR78, IL-6 e IL-10 no hipotálamo de camundongos alimentados com HFD
A avaliação de variação temporal de marcadores de inflamação, ER stress e anomalias mitocondriais revelou que os eventos hipotalâmicos mais precoces que decorrem do consumo de HFD são as elevações nas expressões proteicas de fractalkina e GPR78, sugerindo que distúrbios inflamatórios e alterações do retículo endoplasmático sejam os primeiros a serem afetados pelo consumo de quantidades elevadas de ácidos graxos. Para avaliar o impacto da resposta inflamatória e do ER
stress no distúrbio hipotalâmico induzido pelo consumo de HFD, camundongos foram
tratados com um inibidor de TNF-α, o anticorpo monoclonal imunoneutralizador, infliximab, na concentração de 10mg/kg (Araújo et al., 2007), ou com uma chaperona química capaz de inibir o ER stress, PBA, com concentração de 80mg/kg (Ayala et al.,
2012), e as expressões proteicas de MFN2, GPR78, IL-6 e IL-10 foram determinadas por
Western blot.
A Figura 20 mostra que o tratamento com infliximab aumentou a quantidade proteica de MFN2 no hipotálamo de camundongos alimentados com HFD por 24 horas. Houve ainda uma tendência a aumento da expressão de GPR78.
Figura 20: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de MFN2 e GPR78 em camundongos tratados com salina ou infliximabe (inflix) e a seguir alimentados por 24 h com dieta hiperlipídica. Normalização por α-tubulina. (n=7; *p<0,05 vs. salina + 1D HFD).
A Figura 21 mostra que o tratamento com PBA apresentou um aumentou na quantidade proteica de MFN2 no hipotálamo de camundongos alimentados com HFD por 24 horas.
Figura 21: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de MFN2 e GPR78 em camundongos tratados com salina ou PBA e a seguir alimentados por 24 h com dieta hiperlipídica. Normalização por α-tubulina. (n=7; *p<0,05 vs. salina + 1D HFD).
