UFF – UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE Faculdade de Nutrição Emília de Jesus Ferreiro
CAROLINA ANTUNES TERRA SECA
CAPACIDADE DE FORMAÇÃO DE BIOFILME EM SUPERFICIE DE AÇO INOXIDÁVEL DE CEPAS DE ESCHERICHIA COLI ISOLADAS DE PESCADO
UTILIZADOS NA CULINÁRIA JAPONESA.
Trabalho de Conclusão de Curso Apresentado como requisito parcial Para obtenção do grau de Bacharel em Nutrição.
ORIENTADORA: Prof. Dr. Luciana Maria Ramires Esper CO-ORIENTADORA: MSc. Brigitte Marie Angele Bertin
Niterói 2015
CAROLINA ANTUNES TERRA SECA
CAPACIDADE DE FORMAÇÃO DE BIOFILME EM SUPERFICIE DE AÇO INOXIDÁVELDE CEPAS DE ESCHERICHIA COLI ISOLADAS DE PESCADO
UTILIZADOS NA CULINÁRIA JAPONESA
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de graduação em Nutrição da Faculdade de Nutrição Emília de Jesus Ferreiro da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do título de Nutricionista.
Aprovado em 14 de julho de 2015.
BANCA EXAMINADORA
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Profª Dra Luciana Maria Ramires Esper – Orientadora
Universidade Federal Fluminense – UFF
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Profª Drª Claudete Corrêa de Jesus Chiappini Universidade Federal Fluminense – UFF
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Prof Dr Paulo Gomes de Lima Universidade Federal Fluminense - UFF
Niterói 2015
A Deus por me abençoar com sabedoria e perseverança, aos meus pais, Carlos e Rosângela, aos meus irmãos Fábio e Sophia, ao meu companheiro Vagner por sempre apoiarem as minhas decisões e me incentivarem durante toda minha vida, pelo carinho e palavras amigas.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelas bênçãos, sabedoria, perseverança e força permitindo-me alcançar as metas almejadas até aqui com esforço, dedicação e sem fraquejar.
Aos meus pais Rosângela e Carlos, que sempre foram exemplo de força, caráter, integridade e perseverança, que nunca mediram esforços para que eu completasse meu caminho, pelo carinho, amor, apoio, companheirismo em todos os momentos, principalmente ao longo desta trajetória sempre me incentivando, e acreditando que iria conseguir realizar esse trabalho. Essa vitória é de vocês também! Eu amo muito vocês!
Ao meu marido, Vagner, pela compreensão, carinho, apoio e disposição em ajudar no que fosse necessário e pela paciência nos meus momentos de tensão. Eu te amo!
Aos meus irmãos Fábio e Sophia Victória pelo carinho, incentivo e palavras de conforto e superação. Eu os amo muito!
A todos da minha família, de modo geral, que sempre torceram/torcem por mim. Eu os amo e serei eternamente grata.
A minha orientadora, Profª Drª Luciana Maria Ramires Esper pela paciência, pelo carinho, disposição, incentivo, apoio, também pelas risadas e momentos descontraídos. Contribuiu muito para que esse trabalho fosse realizado desde o planejamento até a execução me passando todo o conhecimento e me incentivando.
A minha Co-orientadora, MSc Brigitte Marie Angele Bertin, por ser paciente, disposta, presente e grande incentivadora. Muito obrigada pelo apoio e ensinamentos. Contribuiu muito para minha formação tanto profissional como pessoal.
Ao Prof. Paulo pela confiança, carinho e disponibilidade em passar seu conhecimento.
A todos do laboratório de Higiene e Microbiologia de Alimentos da Universidade Federal Fluminense, que ajudaram nas pesquisas realizadas para conclusão deste trabalho, em especial a Técnica Lúcia.
Aos meus amigos, pelo carinho e força em todos os momentos. Por entenderem minha ausência e me apoiarem. As minhas amigas de faculdade, com certeza não teria sido a mesma coisa sem vocês!
A minha amiga de madrugadas escrevendo, Renata Alves, pela ajuda, pelos conselhos, por dividir os momentos bons e ruins.
A todos que direta ou indiretamente fizeram parte desta trajetória, que contribuíram para minha formação, vou levar todos em minha memória e coração. Muito obrigada!
“Só se pode alcançar um grande êxito quando nos mantemos fiéis a nós mesmos.”
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Fases, modificações e crescimento microbiano em
pescados... 21 Figura 2 - Etapas de adesão, formação e dispersão do
Biofilme... 25 Figura 3 - Exemplo e detecção de E.coli em placas 3M
Petrifilm™... 23 Figura 4 e 5 - Confirmação da pureza em TSA e crescimento em
EMB... 28 Figura 6 - Inoculação do líquido em placa de
Petrifilm™... 28 Figura 7 - Fluxograma da etapa de diluição seriada para
contagem de células sésseis aderidas ao cupom... 31 Figura 8 - Diluições por hora e diluições
semeadas... 31 Figura 9 - Evolução da população (log UFC/cm2) de células
sésseis aderidas sobre cupom de aço inoxidável por hora de incubação...
35
Figura 10 - Evolução da população (log UFC/cm2) de células sésseis aderidas sobre cupom de aço inoxidável por hora de incubação...
35
Tabela 1 - Contagem de cepas de E.coli padrão, isoladas de alimentos e superfícies...
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ALA - alfa-linolênico
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária APHA – American Public Health Association
ATCC – American Type Culture Collection BPF – Boas Práticas de Fabricação
BPM – Boas Práticas de Manipulação cm2 – centímetro quadrado
DHA – Docosaexaenoico
DTA – Doenças Transmitidas por Alimentos
EED2 2V - Esteira de Evisceração nº 2 Durante processamento – segunda visita EED2 3V - Esteira de Evisceração nº 2 Durante processamento – terceira visita EMB – Eosin Methylene Blue – ágar Eosina Azul de Metileno
EPA – Eicosapentaenoico g – grama
ICMS – International Commission on Microbiological Specifications for Foods MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
ml – mililitros ºC – grau Celsius
PBS – Phosphate buffered salt
POP´s – Procedimentos Operacionais Padrões RDC – Resolução da Diretoria Colegiada spp - espécies
TRD1 1V - Tanque de Recepção nº 1 Durante o processamento – primeira visita TRD2 1V - Tanque de Recepção nº 2 Durante o processamento – primeira visita TSA – Tryptone Soya Ágar – ágar triptona de soja
TSB – Tryptone Coya Broth – caldo tripitona de soja UFC – Unidade Formadora de Colônia
UFC/cm2 – Unidade Formadora de Colônia por centímetro quadrado
UFC/ml – Unidade Formadora de Colônia por mililitro UFF – Universidade Federal Fluminense
1 - INTRODUÇÃO... 14
2 - OBJETIVOS... 17
2.1 - Objetivo geral... 17
2.2 - Objetivos específicos... 17
3 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 18
3.1 - Importância nutricional do pescado... 18
3.2 - Culinária japonesa... 19
3.3 - Programa de Higienização de Superfícies... 20
3.4 - Pescado... 21 3.5 - Escherichia coli... 24 3.6 - Biofilmes microbianos... 25 4 - MATERIAIS E MÉTODOS... 27 4.1 - Amostra... 27 4.2 - Análises microbiológicas... 27
4.2.1 - Identificação e confirmação de E.coli... 27
4.3 - Formação de Biofilmes Microbianos... 30
5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO... 32
6 - CONCLUSÃO... 36
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 37
O pescado é uma fonte proteica importante e bastante consumido por serem ricos em eicosapentaenoico (EPA), docosaexaenoico (DHA) e ácido alfa-linoleico (ALA) que são precursores do ômega 3. A carne e alguns órgãos internos de pescados sadios e recém-capturados são normalmente estéreis, mas, no intestino, brânquias, pele e muco superficial encontra-se grande concentração de microrganismos. A presença de bactérias patógenas na microbiota dos pescados depende de vários fatores e podem variar de acordo com as boas práticas implementadas. A gastronomia japonesa é conhecida por valorizar o sabor e a pureza de cada ingrediente. A utilização do pescado cru para consumo humano implica em uma série de cuidados visando evitar doenças à população. O pescado ao ser manipulado, em geral, permanece em temperatura ambiente e em contato com diversas superfícies da área de preparo que podem estar previamente contaminadas com microrganismos formadores de biofilmes. A crescente preocupação com a formação de biofilme bacteriano se dá pelo comprometimento da inocuidade dos alimentos. A pesquisa objetivou avaliar a capacidade de formação de biofilme em superfície de aço inoxidável das cepas isoladas de pescados utilizados na culinária japonesa e de superfícies do ambiente de produção na indústria. Este trabalho evidenciou a contaminação de filés de pescado cru, tradicionalmente utilizados na culinária japonesa, comercializado no Estado do Rio de Janeiro e da superfície de ambientes da indústria. Comprovou-se a capacidade das cepas de E.coli oriundas da superfície de indústria de pescados e cepa padrão em formar biofilmes em superfícies de aço inoxidável segundo recomendação do “Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods” da APHA. Estes dados demonstram o risco da utilização dos pescados para o consumo cru e a importância da higienização das superfícies para evitar a formação de biofilmes microbianos, resistência aos agentes de higienização, contaminação cruzada dos alimentos e risco à saúde do consumidor.
Palavras-chave: biofilme, Escherichia coli, superfície, pescado, aço inoxidável.
The fish is a very important protein source and consumed to be rich in eicosapentaenoic (EPA), docosahexaenoic (DHA) and alpha-linolenic acid (ALA) which are the precursors of omega 3 Meat and some internal organs of healthy fish and newly caught are usually sterile, but in the gut, gills, skin and mucous surface is large concentration of microorganisms. The presence of pathogenic bacteria in the microbiota of fish depends on several factors and may vary according to good practices implemented. Japanese cuisine is known to enhance the flavor and the purity of each ingredient. The use of raw fish for human consumption implies a lot of care in order to avoid diseases to the population. The fish to be handled, in general, remain at ambient temperature and in contact with various surfaces of staging area that may be contaminated with previously biofilm-forming microorganisms. The growing concern with the formation of bacterial biofilms is through compromise food safety. The research aimed to evaluate the biofilm formation capacity in stainless steel surface of the isolated strains of fish used in Japanese cooking surfaces and the production environment in the industry. This work showed contamination of raw fish fillets, traditionally used in Japanese cuisine, marketed in the State of Rio de Janeiro and surface industry environments. It demonstrated the ability of E. coli strains originating from the fish industry surface and standard strain to form biofilms on stainless steel surfaces as recommended by the "Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods" of APHA. These data demonstrate the risk of using fish for raw consumption and the importance of cleaning the surfaces to avoid the formation of microbial biofilms, resistance to cleaning agents, cross contamination of food and risk to consumer health.
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1 INTRODUÇÃO
O pescado é uma fonte proteica importante e bastante consumido por serem ricos em eicosapentaenoico (EPA), docosaexaenoico (DHA) e ácido alfa-linoleico (ALA) que são precursores do ômega 3. O ômega 3 é importante no auxílio da diminuição dos níveis de triglicerídeos e colesterol ruim (LDL). Possui ainda, importante papel em alergias e processos inflamatórios, pois são necessários para a formação das prostaglandinas inflamatórias, tromboxanos e leucotrienos.
A carne e alguns órgãos internos de pescados sãos e recém-capturados são normalmente estéreis, mas, no intestino, brânquias, pele e muco superficial a microbiota encontram-se grande concentração de microrganismos, tais como: Pseudomonas spp, Alteromonas spp, Moraxella spp, Acinetobacter spp, Flavobacterias spp, Cytophaga spp e Vibrio spp, sendo estes os tipos predominantes, cerca de 80% (ICMS, 1980).
A presença de bactérias patógenas na microbiota dos pescados depende de vários fatores, como, por exemplo, o local de captura. Se o local de captura for de áreas costeiras, há influencia de dejetos humanos, animais ou contaminantes industriais e agrícolas, assim como de rios. Se o local de captura for de mar alto a contaminação é bem reduzida.
Durante a captura o pescado entra em contato com redes, cordas, arpões, mãos e roupas dos pescadores. O contato com as mãos continua durante as demais etapas do processamento. Não é de se surpreender, portanto, que o pescado recentemente capturado, tenha número significativo de bactérias Gram + e Coliformes. Estas bactérias são provenientes do ambiente humano a bordo que se somam às da microbiota dos pescados.
Os tipos e quantidades podem variar de acordo com as boas práticas implementadas desde sua captura até o consumo final.
A utilização do pescado cru para consumo humano implica em uma série de cuidados visando evitar o crescimento exacerbado de microrganismos, principalmente os patogênicos, adquiridos no ambiente aquático e também durante a captura, transporte e distribuição.
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Considerando a grande importância nutricional dos pescados e a tendência da busca por uma alimentação saudável, o consumo dos pescados tem aumentado significativamente.
A gastronomia japonesa é conhecida por valorizar o sabor e a pureza de cada ingrediente. Por isso é comum a adoção de métodos de cocção menos intensos, preservando assim o sabor natural de cada ingrediente (DEMETRIO, 2009).
O pescado é a maior fonte de proteína da culinária japonesa e, na maior parte das preparações, é servido cru.
Além dos cuidados que devem ser seguidos desde a seleção do fornecedor, recebimento até a distribuição, o estabelecimento que oferece o pescado cru como produto final, deve garantir que métodos higiênico-sanitários na manipulação sejam efetivamente cumpridos de acordo com o que está preconizado na RDC nº216/2004. Deve-se é evitar a proliferação dos microrganismos presentes, tanto para que não ocorra alteração sensorial (pela multiplicação dos microrganismos deteriorantes) quanto para que níveis inseguros de patógenos não sejam alcançados e prejudiquem a saúde do consumidor.
Tendo em vista que, na culinária japonesa, o pescado será consumido cru, deve ser mantido em condições de armazenamento seguro, implementando um controle do tempo e da temperatura até o momento do seu consumo.
Outro ponto crucial na segurança para o consumo dos pescados é o cuidado que se deve ter no ambiente da preparação.
O pescado ao ser manipulado, em geral, permanece em temperatura ambiente e em contato com diversas superfícies da área de preparo. Estas superfícies podem estar previamente contaminadas com microrganismos formadores de biofilmes o que aumentaria a carga microbiana e consequentemente acelerando a deterioração do produto. Quanto mais esta superfície for rugosa, mais aderência de microrganismos ocorrerá. Por isso, é fundamental garantir uma higienização eficaz e com a utilização de produtos adequados.
A crescente preocupação com a formação de biofilme bacteriano se dá pelo comprometimento da inocuidade dos alimentos, já que se adere fortemente a superfícies variadas, incluindo o aço inoxidável, sendo focos permanentes de
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introdução de microrganismos patogênicos e deteriorantes, além de aumentar a resistência aos agentes de higienização comumente utilizados.
Essa pesquisa teve como objetivo avaliar a capacidade de formação de biofilmes em superfície de aço inoxidável, de cepas de Escherichia coli isoladas de pescados tradicionalmente utilizados na culinária japonesa e ambiente de produção em indústria de pescado.
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2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Detectar a presença de Escherichia coli em pescados tradicionalmente utilizados na culinária japonesa e avaliar a capacidade de formação de biofilmes em superfície de aço inoxidável dessas cepas e de cepas de ambiente de produção em indústria de pescado.
2.2 Objetivos específicos
- Detectar e isolar E.coli em filés de pescados adquiridos no comércio. Atum (tribo Thunnini), Salmão (Oncorhynchus gorbuscha) e Namorado (Pseudopercis numida).
- Determinar a capacidade de formação de biofilme das cepas de Escherichia coli isoladas de pescados e da superfície de indústria de pescado em superfície de aço inoxidável.
- Comparar a capacidade de formação de biofilmes entre as cepas isoladas dos pescados, isoladas da superfície no ambiente de produção de indústria de pescado e cepa padrão ATCC.
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3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Importância nutricional do pescado
Os peixes são compostos basicamente por água, lipídios e proteínas, e as quantidades variam de acordo com as espécies. A fração lipídica é a que mais oscila durante o ciclo de vida e a fração de carboidratos no músculo dos peixes é baixa.
O pescado é uma fonte proteica importante, tanto quantitativa, quanto qualitativamente. Considerando uma variação entre as espécies, o teor sobre a composição total é alto – entre 15% e 25% (SARTORI, 2012).
Na composição proteica dos pescados encontramos todos os aminoácidos essenciais e alto valor biológico. Em geral são boas fontes de vitaminas do complexo B, vitaminas A e D que também podem variar de acordo com determinadas espécies como, por exemplo, sardinha e salmão.
A carne de pescado também é fonte de cálcio, ferro, fósforo, cobre e selênio além de iodo particularmente nos peixes de água salgada. Contudo, para os peixes oriundos da aquicultura o conteúdo dessas vitaminas e minerais é equivalente ao recebido através da ração (KIRSCHNIK, 2007).
O consumo de pescado, particularmente de peixes gordurosos, uma ou duas vezes por semana é recomendado, por serem ricos em EPA e DHA. Essa recomendação é especialmente importante para gestantes e para mulheres que planejam engravidar, pois, a partir do terceiro trimestre até o segundo ano de vida, uma criança necessita de um suprimento constante de DHA para a formação do cérebro e de outras partes do sistema nervoso (SARTORI, 2012).
Os três ácidos graxos ômega-3 mais importantes para a dieta humana são: o eicosapentaenoico (EPA) e docosaexaenoico (DHA), provenientes principalmente de peixes marinhos e, ainda, o alfa-linolênico (ALA).
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As evidências mais fortes de um efeito benéfico dos ácidos graxos ômega-3 estão relacionadas com doenças cardíacas (SANTOS, 2013).
3.2 Culinária japonesa
A culinária japonesa é comumente associada a pratos feitos com peixe cru. Porém, ela é rica em ingredientes e rituais milenares.
A refeição comum no Japão é um verdadeiro ritual, segundo ditames da tradição milenar. Toda a refeição é feita com o hashi, conhecidos como “palitinhos” (ORNELLAS, 2003).
A sequência dos alimentos é de extrema importância, porque os japoneses acreditam que a boa digestão depende da combinação e da ordem correta dos alimentos ingeridos (ORNELLAS, 2003).
A filosofia desta culinária visa limitar ao mínimo possível a interferência da tecnologia industrial na produção de seus alimentos, que devem ser consumidos na forma mais natural possível (SALZER, 2001).
Os alimentos oriundos da culinária japonesa, mais difundidos no mundo, são o sushi e o sashimi. O sushi é preparado com fatias finas de peixe cru, em bolinho de arroz temperado com molho de vinagre, açúcar e sal, envolto por alga, preparado manualmente. Já o sashimi consiste de peixe cru, cortado em fatias finas e servido com molho shoyu (molho de soja) e raiz forte, também preparado manualmente (MARTINS, 2006).
Estes tipos de alimentos (sushi e sashimi) possuem risco sanitário devido à grande manipulação e ausência de cocção, mas, há fatores de proteção que são utilizados para reduzir este risco, como a acidificação do arroz que mantêm o pH a níveis inferiores a 4.5 impedindo a proliferação dos patógenos no sushi e a manutenção sob refrigeração para os sashimis.
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Estes pratos requerem elevado padrão de higiene e um manipulador bem treinado uma vez que possuem altos riscos de contaminação por agentes biológicos, físicos e químicos considerados um risco a saúde dos consumidores (VASCONCELOS et al., 2010).
3.3 Programa de Higienização de Superfícies
De acordo com a RDC 216 de 15 de setembro de 2004 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA, o processo de higienização de superfícies compreende duas etapas, a limpeza e a desinfecção, obedecendo a essa ordem.
A limpeza consiste na remoção de substâncias minerais e/ou orgânicas indesejáveis, como terra, poeira, gordura, resíduo de alimentos, já a desinfecção consiste reduzir o número de microrganismos ao nível que não comprometa a qualidade higiênico-sanitária do alimento por método físico e/ou agente químico.
Todo agente químico utilizado deve ser registrado na ANVISA e usado de acordo com as instruções contidas nos rótulos respeitando a concentração a ser utilizada, forma de diluição caso necessário e a utilização ou não de força mecânica e agentes físicos.
As operações de higienização devem ser realizadas por funcionários comprovadamente capacitados e com frequência que garanta a manutenção dessas condições e minimize o risco de contaminação do alimento.
O plano de limpeza e os procedimentos operacionais padrões (POP´s) de higienização, contidos no Manual de Boas Práticas do estabelecimento, precisam estar descritos de acordo com a realidade do local. Nesse documento deve conter a natureza da superfície a ser higienizada, o método de higienização, o princípio ativo do agente químico selecionado e a sua concentração, tempo de contato dos agentes químicos e/ou físicos utilizados na operação de higienização.
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Habitualmente, o método de limpeza é manual e simples, feito com esponjas, escovas etc. Os detergentes utilizados apresentam baixa alcalinidade com temperatura de no máximo 45 °C.
Para a etapa de desinfecção há diversas opções de agentes químicos e a escolha depende da finalidade de cada princípio ativo, as características da superfície e a frequência de utilização. Os mais utilizados nos serviços de alimentação são: álcool 70º, quaternário de amônio, liberadores de cloro ativo, peróxido de hidrogênio, ácido peracético e a combinação dos dois últimos.
O álcool etílico em uma concentração de 70% do princípio ativo é o mais utilizado por apresentar ação antimicrobiana mais eficiente, desnaturando a proteína e removendo o lipídeo na membrana celular dos microrganismos (ANDRADE, 2008). Atua também, como bactericida contra formas vegetativas de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, fungos, vírus e micobactérias, no entanto, não são esporicidas e perde a eficácia em presença de matéria orgânica, o que exige uma eficiente etapa de limpeza (PAULINO, 2010).
3.4 Pescado
Pescado compreende peixes, crustáceos, moluscos, anfíbios, quelônios e mamíferos de água doce ou salgada, usados na alimentação humana (BRASIL, 1997).
Os peixes são alimentos altamente perecíveis, e se forem estocados, processados, embalados e/ou distribuídos inadequadamente, deterioram-se rapidamente e tornam-se inseguros para o consumo devido ao crescimento microbiano (MALAVOTA, 2008).
A deterioração do peixe depende de diversos fatores externos tais como, BPF dos barcos pesqueiros, condições da água e BPM. No entanto, um desses fatores, produção de mucina, é intrínseco ao pescado. Mucina é uma glicoproteína liberada
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por glândulas subcutâneas como reação do organismo ao entrar em contato com um ambiente adverso. É um excelente meio de desenvolvimento de microrganismos o que contribui para deterioração acelerada (FERREIRA et al., 2012).
A grande concentração de compostos nitrogenados não proteicos em sua musculatura, principalmente moléculas pequenas e soltas nos líquidos tissulares são muito utilizadas pelas bactérias durante a alteração do pescado. Além disso, a musculatura dos peixes frescos são um excelente substrato para o desenvolvimento microbiano devido a sua grande atividade de água, pH neutro e nutrientes solúveis (ICMS, 1980).
A partir do rigor mortis as alterações bioquímicas que ocorrem também influenciam o crescimento de diversos microrganismos como mostrado na Figura 1.
Fase Modificações nos tecidos Contagem bact.
Fase I (0 a 5 dias em gelo) ● Rigor Mortis ● Modificações em tipos de bactérias ● Oxidação de compostos orgânicos (odor) 102 – 103 UFC/cm2 Fase II (5 a 10 dias em gelo) ● Aparente crescimento microbiano ● Aumenta NH3 103 – 106 UFC/cm2 Fase III (10 a 14 dias em gelo) ● Crescimento microbiano rápido ● Penetração tissular ● Aumento da oxidação de compostos orgânicos ● Ácidos e Bases voláteis aumentam
106 – 108 UFC/cm2
Fase IV
(mais de 14 dias em gelo)
● Carga bacteriana estabiliza ● Modificações de espécies
Acima de 108
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bacterianas
● Bases e ácidos voláteis aumentam rapidamente ● Oxidação de compostos orgânicos aumenta ou estabiliza ● Proteólise
● Formação de H2S e outros
produtos
Figura 1. Fases, modificações e crescimento microbiano em pescados.
Fonte: ICMS, 1980.
A legislação brasileira atual, RDC nº12, de 02 de janeiro de 2001, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA – exige a análise de Salmonella spp, Coliformes a 45°C.
O principal representante dos Coliformes a 45ºC de importância em saúde coletiva é a E.coli e Estafilococos coagulase positiva, os quais são comumente associados a Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA).
O Brasil constitui um dos grandes importadores de pescado no mercado internacional, portanto, parte dos pescados utilizados em restaurantes brasileiros especializados em culinária japonesa chega ao restaurante congelado, principalmente o salmão. Algumas espécies, porém, são comercializados frescos, como por exemplo, o namorado e atum. Para garantir a qualidade do alimento faz-se necessário a utilização de métodos que desacelerem as reações enzimáticas naturais e a deterioração microbiana após a captura pelo fornecedor. (MACEDO, 1993)
Além do momento da captura e distribuição, o estabelecimento que fornece o pescado como produto final precisa atender as Boas Práticas de Fabricação
preconizadas em Portaria 326/97 (MAPA) e resolução (RDC 275/2002) para indústria de alimentos e RDC 216/2004 para Serviços de Alimentação, como os restaurantes garantindo que o produto final atinja os padrões aceitáveis para o consumo humano.
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3.5 Escherichia coli
Foi descrita em 1885 por Theodore Escherich, pediatra alemão, como Bacillus coli comune. Após revisão, foi denominada Escherichia coli referindo-se ao pesquisador que a descobriu.
A bactéria é um bacilo Gram-negativo facultativo, pertence à família Enterobacteriaceae, é mesófilo capaz de se desenvolver entre 7 e 46º C, tendo temperatura ótima de 37º C. É um dos microrganismos mais comum no trato gastrointestinal humano e animal (FRANCO et al., 2005).
Apesar de serem membros da microbiota humana/animal, algumas delas podem causar doenças, devido à aquisição de fatores de virulência por transferência horizontal (NATARO et al., 1998).
Essas cepas capazes de causar doenças são denominadas patogênicas e podem causar infecções intestinais e extra intestinais. Por isso, essa bactéria é de grande importância em análises de alimentos.
Lima et al. (2010) realizaram análises de 40 amostras de sushis e sashimis comercializados na cidade de Recife, sendo vinte delas provenientes de estabelecimentos especializados na culinária japonesa e vinte de estabelecimentos não especializados. Das amostras oriundas dos estabelecimentos não especializados, 40% apresentaram valores acima do permitido para Coliformes Termotolerantes (45 ºC) pela Legislação vigente (102 UFC/g) e 20% provenientes
dos estabelecimentos especializados apresentaram contaminação com E.coli.
Martins (2006) demonstrou um alto número de amostras contaminadas. Do total de vinte amostras analisadas, 45% (nove amostras) apresentaram contagem de E. coli acima do limite aceitável, apontando o risco deste produto à população.
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Os biofilmes são complexos conglomerados de células envoltos em uma matriz de exopolissacarídeo (EPS), formados nos mais variados tipos de superfície, inclusive as utilizadas na produção de alimentos (BOARI, 2008).
A adesão das células planctônicas (células livres) se inicia pelo acúmulo de material orgânico e inorgânico em uma superfície sobre as quais pode se desenvolver conglomerados bacterianos. Essa adesão inicial pode ser reversível (OLIVEIRA, 2009).
Posteriormente, essa interação torna-se cada vez mais forte entre a superfície e as células, com a produção da matriz EPS. Esta fase é irreversível. As células fortemente aderidas à superfície, constituindo o biofilme são denominadas células sésseis. Após a formação do biofilme, a aplicação de força mecânica é necessária para romper sua estrutura e permitir a ação dos agentes de higienização para sua eliminação (OLIVEIRA, 2009).
A matriz protege as células do biofilme contra a ação de biocidas e outros produtos tóxicos garantindo a coesão das células no interior do biofilme e a associação de outros microrganismos – biofilmes mono ou multiespécies -(COSTERTON et al., 1994).
Além dessa proteção as bactérias que estão crescendo desenvolvem diferenças fenotípicas, bioquímicas e morfológicas comparado com as planctônicas (ITO et al., 2009). Essas diferenças possibilitam que bactérias como E.coli possam viver fora do hospedeiro por certo tempo (PAWAR et al., 2005)
Posteriormente, as células maduras podem se desprender e contaminar outros alimentos e superfícies, como as de utensílios. Essa habilidade de transferência independe da quantidade de células e é denominada potencial de biotransferência (COSTA, 1999).
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Figura 2. Etapas de adesão, formação e dispersão do Biofilme.
Fonte: Stoodley et al., 2002.
A biotransferência permite, também, a formação de novos pontos de aderência celular e a formação de um novo biofilme tornando um ciclo de contaminação cada vez maior (MIDELET et al., 2004).
Já foi observado que amostras de E.coli que apresentam padrão de adesão agregativa produzem biofilme regularmente (SHEIK et al., 2001) e estão
relacionadas com infecções persistentes, as vezes por mais de 14 dias (CRAVIOTO et al., 1991). De acordo com Poulsen (1999) Pseudomonas, Alcaligenes,
Enterobacter, Staphylococcus, Bacillus, Flavobacterium e Escherichia coli tem maior tendência em formar biofilme.
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4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Amostras
Foram analisadas amostras de filé de peixe fresco sem pele das espécies de peixe Namorado, Salmão e Atum, adquiridos em mercados variados localizados no Estado do Rio de Janeiro.
Foram retirados 25g de cada filé com auxílio de colher estéril adicionados em 225ml de Água peptonada em seguida foram colocado em stomacher por 10 minutos seguindo as análises microbiológicas descritas abaixo.
4.2 Análises Microbiológicas
4.2.1 Isolamento
A pesquisa foi realizada utilizando-se placas 3M Petrifilm™, segundo recomendação do “Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods” da APHA (KORNACKI;JOHNSON, 2001). Nesta pesquisa realizou-se a determinação E.coli.
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4.2.2 Identificação e confirmação de E.coli
Este grupo de bactérias foi detectado a partir de placas 3M Petrifilm™.
As Placas 3M Petrifilm™ para Contagem de E.coli e Coliformes contêm nutrientes do meio Vermelho Violeta Bile, um agente geleificante solúvel em água fria, um indicador de atividade glicuronidásica e um indicador que facilita a enumeração da colônia. A maioria das E.coli (cerca de 97%) produz beta-glicuronidase cuja presença é indicada pela formação de precipitado azul associado a colônia. O filme superior retém o gás formado pelos coliformes e E.coli que são fermentadores de lactose. Cerca de 95% das E.coli produzem gás e esta produção é indicada pela coloração azul a vermelho azulada das colônias, associadas ao gás retido na Placa Petrifilm (dentro de, aproximadamente, o diâmetro de uma colônia).
Foi pipetados 1 mL do inóculo homogeneizado em placas de Petrifilm™, incubadas a 35ºC por 48 horas. As colônias típicas de E.coli foram isoladas e semeadas em ágar Eosina Azul de Metileno (EMB). As placas foram incubadas a 35°C por 48 horas e após apresentando colônias verdes brilhantes. A partir das placas de EMB, as colônias foram semeadas em TSA para verificação da pureza e em TSB para congelamento a -80ºC com glicerol.
Figura 3. Exemplo e detecção de E.coli em placas 3M Petrifilm™.
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Figura 4 e 5. Confirmação da pureza em TSA e crescimento em EMB.
Figura 6. Inoculação do líquido em placa de Petrifilm™.
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4.3 Formação de biofilmes microbianos
Foram utilizados cupons de aço inoxidável AISI 304 # 4. Este material é o mais utilizado na construção de equipamentos para o processamento de alimentos. Cada cupom tem dimensões de 10 x 10 x 1 mm de espessura e foram limpos e descontaminados individualmente com acetona pura, lavados com água destilada e finalmente limpos e secos com álcool 70%. Após esta etapa os cupons foram esterilizados em autoclave a 121°C por 30 minutos.
Para a determinação da capacidade de formação de biofilmes microbianos, foram utilizadas 1 cepa isolada de salmão, 1 isolada de atum, 4 cepas isoladas da superfície da indústria de pescado (EED2 2V, EED2 3V, TRD1 1V e TRD2 1V) (JOSÉ, 2014), e uma cepa ATCC de E.coli 29222.
Os cupons limpos foram colocados em tubos Falcon contendo 9 ml de TSB que foi previamente inoculado com suspensão de E.coli. O número de células iniciais foi de 103 UFC/ml. Os tubos foram incubados por 25°C (mimetizar a
temperatura ambiente) por 48 horas e avaliados imediatamente para confirmar a contagem inicial, e após 4 horas (4h), 8 horas (8h), 24 horas (24h) e 48 horas (48h).
Após os períodos estabelecidos, o cupom foi retirado com o auxílio de uma pinça estéril e adicionado em tubo com 10 ml de PBS e agitado levemente por 1 minuto para retirar as células planctônicas. Em seguida o cupom é retirado novamente com pinça e adicionado a um tubo com 5 ml de PBS e por 2 minutos no vórtex. Diluições decimais sucessivas foram realizadas a partir deste último tubo de PBS conforme a Figura 8.
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Figura 7. Fluxograma da etapa de diluição seriada para contagem de células sésseis aderidas ao cupom.
As diluições foram semeadas por spread plate em TSA e posteriormente incubadas a 35ºC por 48 horas.
Hora Diluição Diluição Semeada
4h 100 – 10-1 100 – 10-1
8h 10-1 – 10-4 10-2 – 10-4
24h 10-1 – 10-5 10-3 – 10-5
48h 10-1 – 10-5 10-3 – 10-5
Figura 8. Diluições por hora e diluições semeadas
4.4 Análise Estatística dos Dados
Todos os experimentos foram realizados em duas repetições independentes em duplicata. Os resultados das médias aritméticas foram expressos em UFC/cm2. O tratamento estatístico dos resultados obtido foi realizado pela análise de variância (ANOVA) em delineamento inteiramente casualizado, com nível de significância de
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5% (p>0,05). Para comparação entre as médias foi utilizado o teste de comparação múltipla de Tukey. Para tal, foi utilizado o programa GraphPad Prism, versão 5.01.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram isoladas E.coli da amostra de atum e de Salmão. A amostra de Namorado não apresentou o microrganismo em questão.
Diferente dos resultados obtidos do presente estudo no isolamento de E.coli de pescados nas amostras de salmão e atum, Farias e Freitas (2008) verificaram em estudo da qualidade microbiológica de pescado beneficiado em indústrias, que não foi confirmada a presença de E.coli entre os coliformes termotolerantes em amostras de peixe eviscerado, filé de peixe congelado peixe inteiro congelado.
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Uddin et al. (2013) e Basti et al. (2006) em pesquisa com peixes recém-capturados demonstraram que tal microrganismo não faz parte da microbiota natural de peixes e aparece, em decorrência de falhas no processo de higiene durante a manipulação.
Na avaliação da capacidade de formação de biofilmes a 25 °C houve formação de biofilme por todas as cepas de E.coli em cupom de aço inoxidável a partir das primeiras 4 horas (Figura 9).
Foi observada uma tendência exponencial de aumento de células sésseis ao longo das 48 horas pesquisadas. Esses resultados corroboram com Stoodley et al. (2002), que demonstraram que este aumento de células faz parte do próprio processo de maturação do biofilme, podendo acontecer em até dez dias após a adesão inicial das células planctônicas.
A evolução do número de células sésseis aderidas à superfície do cupom de aço inoxidável após remoção das células planctônicas, caracterizando a formação de biofilmes de E.coli é apresentada na Tabela 1 e Figuras 9 e 10.
De uma forma geral, a contagem média de células de E.coli sobre superfícies de aço inoxidável atinge valores superiores a 4 log UFC/cm2 após 24 horas de
contato atingindo no máximo 5 log UFC/cm2 após 48 horas.
Tempo
/cepas ATCC SALMÃO ATUM EED2 2V EED2 3V TRD1 1V
TRD2 1V
Contagem (log UFC/cm2 *± DP**) 4 h 2,021aA ± 0,091 2,146aB ± 0,157 2,070aC ± 0,013 2,021aAC ± 0,361 1,860aBD ± 0,247 2,051aA ± 0,247 2,011aA ± 0,354 8 h 2,3520,064bA ± 2,7200,091bB ± 2,9030bC ± 2,1760bD ± 2,2430bE ± 2,4390,057bF ± ± 0,0572,439bF 24 h 4,0510,106cA ± 4,2040,177cB ± 4,2730,195cC ± 4,4470,071cD ± 4,0610,078cA ± 4,1140cA ± 4,495± 0,042 cD 48 h 5,0210,029dA ± 4,7960,125dB ± 4,9540,069dC ± 4,7200,085dC ± 4,6770,099dD ± 4,4770dE ± 4,778C ± 0dB Tabela 1. Contagem de cepas de E.coli padrão, isoladas de alimentos e superfícies.
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*Média de duas repetições em duplicata. **Desvio Padrão (DP). Diferença entre letras minúsculas nas colunas indica presença de diferença estatística (p>0,05) entre os tempos analisados. Diferença entre letras maiúsculas na mesma linha indica presença de diferença estatística (p>0,05) entre as
amostras.
Em todas as cepas analisadas houve diferença significativa (p>0,05) entre os tempos analisados, demonstrando uma progressão constante no crescimento microbiano do biofilme (Figura 9)
Em uma avaliação de formação de biofilmes em aço inoxidável por cepas de E.coli, Rivas et al. (2007), observou que a capacidade de adesão teve diferença significativa entre as cepas, tanto para 24 horas como para 48 horas de incubação, não tendo sido constatada diferença significativa após 48 horas. As contagens variam de <3 log UFC/cm2 a 5 log UFC/cm2 para 24 e 48 horas, respectivamente. As
contagens de UFC/cm2 são similares ao do presente trabalho.
Em relação à diferença de comportamento entre as cepas no mesmo tempo de incubação, ocorreram diferenças significativas (p>0,05) entre diferentes cepas analisadas, embora em alguns casos esta diferença não foi observada (Tabela 1). As diferenças entre as cepas demonstram que podem ocorrer adaptações de acordo com as fontes de isolamento, evidenciando a importância de pesquisa dos microrganismos encontrados no ambiente de estudo e não generalização do gênero e espécie microbiana, para que assim o programa de higienização seja mais eficiente.
Observa-se um aumento na formação de biofilme pelas cepas isoladas de pescados em comparação com a cepa padrão (ATCC) até 24 horas de contato. Até 8 horas de contato evidencia-se que as cepas isoladas da superfície de indústria de pescado e a ATCC apresentaram menor formação de biofilme do que as demais cepas. No tempo de 48 horas somente a cepa ATCC alcançou 5 log UFC/cm2, como
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Figura 9. Evolução da população (log UFC/cm2) de células sésseis aderidas sobre cupom de
aço inoxidável por hora de incubação. Cada barra corresponde à média aritmética de duas repetições em duplicata. 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 0.0 0.8 1.6 2.4 3.2 4.0 4.8 ATCC Salmao Atum EED2 EED2 3V TRD1 1V TRD2 tempo (horas) lo g U FC /c m 2
Figura 10. Evolução da população (log UFC/cm2) de células sésseis aderidas sobre cupom de
aço inoxidável por hora de incubação.
O maior número médio de células sésseis de E.coli foi encontrado na cepa ATCC após 48 horas, sendo este de 5 log UFC/cm2, e o menor número foi
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Individualmente verificamos que há um aumento maior da formação de biofilme até 24 horas do que entre 24 a 48 horas, como mostra as figuras 8 e 9. Segundo alguns autores esse fenômeno pode ser observado em biofilmes maduros e pode ocorrer em algumas horas até semanas, quando passam a apresentar padrões de crescimento alterados, as células podem se desprender e contaminar o que entrar em contato, tanto alimento como outras superfícies (KASNOWSKI et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2010).
Em um estudo, Ortega et al. (2010) avaliou o comportamento da adesão de cepas de Escherichia coli em superfície de aço inoxidável e observou que as células sésseis atingiram a fase estacionária com 3 a 4 horas de incubação, tempo menor do que o evidenciado nesse estudo.
Este estudo foi realizado com biofilmes mono–especies (E.coli), porém os comportamentos dos microrganismos podem variar conforme a associação com outros microrganismos, fato este comum na produção de alimentos. Sasahara e Zottola (1993) verificaram que a formação de biofilmes por Listeria monocytogenes foi aumentada na presença de Pseudomonas fragi. Os resultados neste trabalho evidenciam que mesmo biofilmes mono-espécies são preocupantes em uma indústria de alimentos, porém é importante para trabalhos futuros, estudar a associação com outros microrganismos.
É de suma importância estudar especificamente os microrganismos presentes nas superfícies de indústrias e restaurantes e como reagem a diferentes princípios ativos dos agentes químicos, tempo de ação, modo de aplicação, frequência de uso e a necessidade de ação mecânica para que a higienização seja eficaz evitando a formação de biofilme bacteriano e a contaminação dos alimentos, garantindo a qualidade higiênico-sanitária das preparações que chegam ao consumidor.
O presente trabalho evidenciou que a frequência da higienização das superfícies de aço inoxidável em que são manipulados pescados, precisa ser menor que 4 horas, tendo em vista que a partir de 4 horas, verificamos a aderência de E.coli a temperatura ambiente.
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Este trabalho evidenciou a presença de E.coli, importante indicador de qualidade higiênico sanitário, em pescado comercializado no Estado do Rio de Janeiro, demonstrando contaminação. Comprovou-se a capacidade destas cepas e de E.coli oriundas da superfície de indústria de pescados e cepa padrão em formar biofilmes em superfícies de aço inoxidável AISI 304 #4.
Estes dados demonstram o risco da utilização dos pescados para o consumo cru e que sua manipulação sem a correta higienização pode levar a formação de biofilmes microbianos, com a contaminação crônica das superfícies de equipamentos e instalações utilizadas no processamento de pescados, com maior resistência aos agentes de higienização, acarretando em contaminação cruzada dos alimentos e risco à saúde do consumidor.
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