Perfil estrutural e molecular do lobo ventral da próstata de ratos senis (Sprague-Dawley) com e sem reposição de hormônios esteróides

D

EDICATÓRIA

Aos meus pais, IZILDA e SÍLVIO:

Hoje completo uma etapa e alcanço mais um de meus objetivos. A vocês, devo não apenas esta, mas todas as minhas conquistas até hoje. Exemplos máximos de doação, muitas vezes abdicaram de si próprios e não pouparam esforços para proporcionar aos seus filhos aquilo que não puderam ter. Nossos desejos foram os seus sonhos; nossas batalhas, sua guerra; nossas realizações, suas vitórias. Vocês merecem toda a minha gratidão. Obrigado por estarem sempre ao meu lado. Obrigado pelas oportunidades que me deram. Obrigado por acreditarem que eu seria capaz. Obrigado por serem meus pais!

Ao meu avô, “JANU”:

A

GRADECIMENTOS

A Deus, por conceder-me o privilégio de estar vivo e saudável para superar obstáculos e lutar por meus ideais.

Aos meus pais, Izilda e Sílvio, e à minha irmã, Sílvia, que constituem o alicerce de todos os meus sucessos e conquistas.

À Profa. Dra. Valéria Helena Alves Cagnon Quitete, por sempre ter me recebido em seu laboratório de portas abertas, por sua contribuição para minha formação como pesquisador desde os primeiros passos e por sua inquestionável conduta ética e acadêmica, que a todo dia incentiva meu crescimento profissional.

Ao Prof. Dr. Wagner José Fávaro, nosso eterno “Papito”, pela amizade, aprendizado e por sua dedicação e prontidão em auxiliar durante todas as etapas de execução deste trabalho.

Aos Professores Dr. Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira, Dr. Edson Rosa

Pimentel e Dr. Paulo Pinto Joazeiro, pela participação e por suas pertinentes

considerações no exame de qualificação.

Aos Professores Dr. Edson Rosa Pimentel, Dr. Luis Antonio Justulin Júnior, Dr.

Marcelo Martinez e Dr. Wagner Eduardo Matheus, pelas valiosas contribuições para a

redação final desta dissertação e pelo aceite do convite para composição da banca examinadora.

Aos Docentes do Departamento de Anatomia, Biologia Celular e Fisiologia e

Biofísica, pelo aprendizado compartilhado durante as disciplinas e pela colaboração para

minha formação como educador.

Aos Funcionários do Departamento de Anatomia, Biologia Celular e Fisiologia e

À Sra. Liliam Alves Senne Panagio, pela competência com que desenvolve seu trabalho e pela atenção dispensada durante todo o curso.

Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural e à sua coordenação, pelo incentivo à pesquisa e ao aprimoramento acadêmico de seus alunos.

À CAPES/PROEX e ao CNPq, pelo auxílio financeiro, e à FAPESP, pela concessão da bolsa de mestrado (2008/56493-7) e do projeto de auxílio à pesquisa (2008/53468-1), os quais foram imprescindíveis para o desenvolvimento e finalização desta dissertação.

Aos atuais e ex-membros do Laboratório de Biologia da Reprodução, Amanda, Cândido,

Gabi, Karol, Larissa Kido, Leslie e Raísa, pela amizade, pelas longas e animadas

conversas, pelos momentos de diversão e pela ajuda e companhia durante tantos e tantos “blottings”.

Aos colegas da Pós-Graduação, pela amizade, convivência e por transformarem o local de trabalho em um ambiente agradável e prazeroso.

Aos amigos do “G8”, Adilson, Carlos, Janice, Karina, Larissa Rizzo, Raffinha e Sílvio, e à Letícia, pelo companheirismo e por compartilharem comigo as mesmas experiências, aflições e alegrias desde a entrada na universidade até o presente.

A todos os meus amigos e familiares, que mesmo de longe acompanharam toda a caminhada até a realização desta conquista.

“Para realizar grandes conquistas, devemos

não apenas agir, mas também sonhar; não

apenas planejar, mas também acreditar.”

Í

6. Artigo científico I “Hormonal therapy in the senescence: prostatic microenvironment structure and adhesion molecules” ...20

7. Artigo científico II “Senescência e reposição hormonal: fatores de remodelação tecidual e angiogênese na próstata” ...53

8. Discussão sucinta e conclusões gerais ...79

1.

R

A reposição androgênica representa uma alternativa para minimizar os efeitos prejudiciais do desequilíbrio hormonal em homens senis, embora seus efeitos sobre o desenvolvimento de doenças prostáticas ainda seja assunto controvertido. Assim, o objetivo deste estudo foi caracterizar aspectos estruturais e moleculares do lobo ventral da próstata de ratos senis frente à reposição de hormônios esteróides, relacionando as alterações decorrentes da terapia hormonal a possíveis condições de lesões prostáticas. Ratos machos (Sprague-Dawley) foram divididos em um grupo Jovem (JOV) (4 meses), que recebeu óleo de amendoim (5 mL/Kg, s.c.), e grupos senis (10 meses), submetidos aos tratamentos: grupo Senil (SEN): óleo de amendoim (5 mL/Kg, s.c.); grupo Testosterona (TEST): cipionato de testosterona (5 mg/Kg, s.c.); grupo Estrógeno (EST): 17β-estradiol (25 µg/Kg, s.c.); grupo Castrado (CAS): castração cirúrgica; grupo Castrado-Testosterona (CT): castração e após 30 dias tratamento similar ao grupo TEST; grupo Castrado-Estrógeno (CE): castração e após 30 dias tratamento similar ao grupo EST. Após 30 dias de tratamento, foram coletadas amostras de sangue, para dosagens hormonais séricas, e do lobo ventral, para análises em microscopias de luz e eletrônica de transmissão, morfométricas, imunohistoquímicas e Western Blotting. As moléculas investigadas foram: distroglicanas α e β (α-DG e β-DG), receptor do fator de crescimento homólogo à insulina tipo I (IGFR-1), metaloproteinase-9 de matriz (MMP-9), fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e endostatina. Redução dos níveis séricos de testosterona foi verificada na senescência, com aumento destes após a reposição hormonal no grupo TEST. O estroma do grupo SEN apresentou hipertrofia e células inflamatórias. Após a reposição hormonal na senescência ou frente à castração, verificou-se atrofia no epitélio, células epiteliais com halo citoplasmático claro ao redor do núcleo, microácinos e manutenção do estroma hipertrófico com células inflamatórias. Diminuição dos níveis das DGs foi verificada na senescência, sendo que após a terapia hormonal ocorreu aumento dos níveis protéicos dessas moléculas, especialmente nos grupos que receberam estradiol. Aumento do IGFR-1 e da MMP-9, bem como distribuição diferencial dessas moléculas no compartimento epitelial, foram observados nos grupos submetidos à reposição hormonal e no grupo CAS. O grupo SEN caracterizou acréscimo dos níveis de VEGF, sendo o inverso observado para a endostatina. A terapia hormonal e a castração levaram à elevação dos níveis de VEGF, sobretudo nos grupos EST, CAS e CE. Em oposição, a endostatina demonstrou-se aumentada especialmente nos grupos

submetidos à reposição de testosterona. Os presentes resultados sugeriram que o desequilíbrio entre andrógenos e estrógenos verificado na senescência foi acentuado após a terapia hormonal e a castração, potencializando as alterações estruturais associadas a esse período e rompendo o equilíbrio das sinalizações parácrinas prostáticas, com aumento simultâneo de IGFR-1 e MMP-9 e geração de fatores pró e anti-angiogênicos em resposta ao tratamento com estrógenos e andrógenos, respectivamente. Assim, concluiu-se que a terapia hormonal, apesar de seus efeitos positivos sobre as DGs, gerou microambiente prostático reativo, caracterizado por aumento de um fator mitogênico e da remodelação tecidual bem como por desequilíbrio da angiogênese, o que possivelmente comprometeu a função do órgão e o predispôs a desordens glandulares.

2.

A

Androgen replacement is an alternative to minimize the harmful effects of hormonal imbalance in elderly men, even though its influence on the development of prostatic diseases is unclear. Thus, the aim herewith was to characterize structural and molecular features of the ventral prostate of senile rats submitted to steroid hormone replacement, relating the alterations resulting from hormonal therapy to possible prostatic lesions. Male rats (Sprague-Dawley) were divided into Young group (YNG) (4 months old rats), which received peanut oil (5 mL/Kg, s.c.), and senile groups (10 months old rats), submitted to the treatments: Senile group (SEN): peanut oil (5 mL/Kg, s.c.); Testosterone group (TEST): testosterone cipionate (5 mg/Kg, s.c.); Estrogen group (EST): 17β-estradiol (25 µg/Kg, s.c.); Castrated group (CAS): surgical castration; Castrated-Testosterone group (CT): castration and after 30 days treatment similar to TEST group; Castrated-Estrogen group (CE): castration and after 30 days treatment similar to EST group. After 30 days treatment, blood samples were collected for hormonal analysis and ventral prostate samples were processed for light and transmission electronic microscopies, morphometric, immunohistochemical and Western Blotting analysis. The investigated molecules were alfa and beta dystroglycans (αDG and βDG), insulin-like growth factor receptor-1 (IGFR-1), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), vascular endothelial growth factor (VEGF) and endostatin. Decreased serum testosterone levels were verified in senescence, with an increase after hormonal replacement in the TEST group. Hypertrophied stroma with inflammatory cells was seen in the SEN group. After hormonal therapy in the senescence or following castration, atrophic and pale cytoplasmatic epithelial cells, microacini and hypertrophied stroma were observed. Decreased DG levels were verified in senescence, but there was an increase of these levels following hormonal therapy, especially in the groups treated with estradiol. Increased IGFR-1 and MMP-9 protein levels and differential distribution of these molecules were observed in epithelial compartment in those groups which received hormone replacement and in the CAS group. SEN group showed increased VEGF levels in contrast to decreased endostatin levels. Hormonal therapy and castration led to raised VEGF levels, mainly in EST, CAS and CE groups. On the other hand, endostatin was increased especially in those groups submitted to testosterone replacement. The present results suggested that the imbalance between androgens and estrogens in senescence was enhanced after hormone replacement and castration, intensifying structural changes associated with this period. Also,

there was a disruption of prostatic paracrine signaling balance, with simultaneous increase of IGFR-1 and MMP-9 and generation of pro and anti-angiogenic factors in response to treatment with estrogens and androgens, respectively. Thus, it could be concluded that despite its positive effects on DGs levels, hormonal therapy created a reactive prostatic microenvironment, characterized by increase of a mitogenic factor and tissue remodelling as well as prostatic angiogenesis imbalance, which could compromise glandular functions and lead to the emergence of prostatic lesions.

3.

I

3.1. Próstata: morfologia e fisiologia

A próstata é uma glândula acessória do sistema genital masculino, encontrada nas diferentes ordens de mamíferos e com fundamental importância no processo reprodutivo, produzindo secreção formada por ácido cítrico, ácido siálico, espermina, prostaglandinas, fosfatases ácida e alcalina, além do zinco e outros constituintes (Lin & Bissell, 1993; Bull et al., 2001; Marker et al., 2003). Em conjunto esses nutrientes compõem o líquido seminal, fluido que além de proporcionar um ambiente adequado à sobrevivência dos espermatozóides, também fornece elementos estimuladores de sua motilidade, de alguns parâmetros fisiológicos e mesmo da fecundação (Lin & Bissell, 1993; Bull et al., 2001; Flórez & Carvalho, 2005).

Em roedores, a próstata divide-se em pares de lobos: ventral, lateral e dorsal, de acordo com a localização ao redor da uretra prostática; e um par de glândulas coaguladoras ou próstata anterior, localizadas na face côncava das vesículas seminais (Sugimura et al., 1986; Aumüller & Seitz, 1990; Marker et al., 2003). Os diferentes lobos prostáticos diferem quanto à morfologia, aos tipos de produtos secretados e à resposta hormonal (Costello & Franklin, 1994; Colombel & Buttyan, 1995). O lobo ventral é comumente usado em estudos de carcinogênese prostática, devido à sua dependência androgênica primária, embora não possua homologia direta com a próstata humana (Slayter et al., 1994).

A próstata é uma glândula túbulo-alveolar composta por ácinos revestidos por epitélio secretor simples e envoltos por componentes estromais (Niu & Xia, 2009). O epitélio prostático é constituído por camadas basal e luminal, onde se observam três tipos celulares: células luminais ou secretoras, basais e neuroendócrinas; distintos pela expressão diferencial e/ou conjunta de citoqueratinas (CK) e antígenos de superfície (CD) (Berry et al., 2008; Miki, 2009). A membrana basal, por sua vez, está localizada entre o epitélio e o estroma, sendo seus principais componentes a laminina, o colágeno do tipo IV e o proteoglicano heparan sulfato (Knox et al., 1994; Jorcyk et al., 1998). O estroma prostático é um complexo arranjo de fibroblastos, células musculares lisas e matriz extracelular associados a fatores de crescimento ativos e latentes, moléculas reguladoras e enzimas de remodelação (Taipale & Keski-Oja, 1997; Tuxhorn et al., 2001). A matriz extracelular (MEC) é uma rede constituída por proteoglicanos, glicoproteínas adesivas e

proteínas fibrilares, como o colágeno e fibras elásticas, os quais proporcionam rigidez mecânica e flexibilidade ao tecido (Lin & Bissell, 1993; Kreis & Vale, 1999; Tuxhorn et al., 2001). Já os proteoglicanos regulam a estrutura e a permeabilidade da matriz extracelular, ligando-se a fatores de crescimento, proteases e inibidores de proteases, modulando a atividade destes (Taipale & Keski-Oja, 1997; Kreis & Vale, 1999 e Tuxhorn et al., 2001). Além disso, vasos sanguíneos, terminações nervosas e células imunes também constituem partes integrais do estroma (Tuxhorn et al., 2001).

A morfogênese, proliferação, diferenciação e a manutenção da atividade funcional e da morfologia das células da próstata são reguladas por andrógenos (Leav et al., 2001; Cunha et al., 2002; Imamov et al., 2005). Os andrógenos exercem seus efeitos biológicos através da interação com o receptor androgênico (AR) localizado no meio intracelular, sendo que o complexo receptor-hormônio é translocado para o núcleo, onde irá regular a expressão de genes específicos (Prins et al., 1991; Tindall & Rittmaster, 2008). A testosterona e a dihidrotestosterona (DHT) são os principais andrógenos a induzir a diferenciação prostática (Hsing, 2001, Toorians et al., 2003). A DHT é resultante da conversão da testosterona por ação da enzima 5α-redutase, a qual possui duas formas (I e II), sendo a última predominante nos órgãos genitais masculinos, incluindo a próstata (Prins et al., 1991; Hsing, 2001; Toorians et al., 2003). Estudos empregando a castração demonstraram que a deficiência androgênica leva à involução da próstata, com parada na produção e eliminação de secreção, ativação da apoptose nas células epiteliais e intensa remodelação da matriz extracelular desse órgão (Banerjee et al., 2000; Vilamaior et al., 2000; Flórez & Carvalho, 2005).

O desenvolvimento e fisiologia da próstata, tanto em humanos como em roedores, também é sensível a outros hormônios, como os estrógenos, os quais atuam sinergicamente à testosterona, influenciando tanto as funções normais do órgão quanto as alterações patológicas (Weihua et al., 2001; Cunha et al., 2002). Os estrógenos possuem efeitos anti-androgênicos e regulam negativamente o eixo hipotálamo-hipófise-gônadas, com redução da produção de andrógenos pelas células de Leydig e decorrente involução do epitélio prostático e promoção do crescimento estromal em animais adultos (Weihua et al., 2002). A biossíntese de estrógenos ocorre a partir de um substrato androgênico, através da aromatização destes hormônios pela enzima aromatase (Risbridger et al., 2003). Esta enzima é um regulador crítico do balanço entre andrógenos e estrógenos, contribuindo para os níveis circulantes e teciduais destes hormônios (Risbridger et al., 2003).

Os diversos processos biológicos na próstata tais como proliferação e diferenciação celulares, secreção e crescimento tumoral são regulados e/ou influenciados por diferentes fatores de crescimento (Djavan et al., 2001; Konno-Takahashi et al., 2003; Marszalek et al., 2005; Reynolds & Kyprianou, 2006). Fatores de crescimento produzidos em um dos compartimentos glandulares exercem influência parácrina sobre o compartimento adjacente através da ligação com seus receptores específicos (Reynolds & Kyprianou, 2006). Assim, esses polipeptídios e seus receptores atuam como mediadores da interação bidirecional entre epitélio e estroma, a qual tem papel primordial na manutenção da estrutura, função e crescimento da próstata, sendo que o desequilíbrio desta interação na glândula favorece a formação do carcinoma prostático (Cunha et al., 2002; Zhao et al., 2002; Chung et al., 2005).

O fator de crescimento homólogo à insulina tipo I (IGF-1) atua como mitógeno em uma variedade de células e exerce sua ação aumentando a síntese de DNA, acelerando a progressão do ciclo celular e bloqueando a via apoptótica, sendo sua sinalização mediada pelo receptor IGFR-1 (Djavan et al., 2001; Gennigens et al., 2006). Na próstata, o IGF-1 é produzido pelas células estromais e atua como fator de crescimento parácrino no epitélio prostático normal (Djavan et al., 2001). Os IGFs circulantes no soro e nos fluidos extracelulares encontram-se ligados com grande afinidade a proteínas específicas, as IGFBPs, cuja relevância baseia-se em seu potencial de modificar os efeitos metabólicos e mitogênicos dos IGFs através da inibição competitiva da ligação destes com os receptores na superfície celular (Mañes et al., 1999; Pollak et al., 2004; Gennigens et al., 2006). A IGFBP-3 é a proteína ligante de IGF com a maior capacidade carreadora e maior afinidade pelo IGF-1, prolongando a atividade dessa molécula na circulação (Grzmil et al., 2004; Pollak et al., 2004; Meinbach & Lokeshwar, 2006).

O fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) é um dos mais importantes fatores indutores da angiogênese, sendo produzido por uma ampla variedade de tipos celulares (Delongchamps et al., 2006). Existem três receptores quinase de tirosina para o VEGF, mas o principal mediador de suas ações sobre o endotélio vascular é o VEGFR-2 cuja via de sinalização leva à proliferação, diferenciação e migração das células endoteliais, além de promover aumento da permeabilidade vascular (van Moorselaar & Voest, 2002; Delongchamps et al., 2006).

Em adição, o meio extracelular contém numerosas classes de enzimas que regulam a degradação de proteínas da matriz, destacando-se as metaloproteinases de matriz

(MMPs) (Lynch & Matrisian, 2002; London et al., 2003; Brennan et al., 2004). Os substratos tradicionais para as MMPs são os componentes da MEC, mas elas também podem atuar sobre proteínas de membrana e substratos não-matriciais, sendo importantes tanto na ativação de outras MMPs no espaço pericelular, quanto na clivagem de numerosos fatores de crescimento, angiogênicos e reguladores da migração celular (Park et al., 2000; Lynch & Matrisian, 2002; Brennan et al., 2004). As MMPs são produzidas por uma variedade de tecidos e estão envolvidas na remodelação tecidual, tanto em situações fisiológicas, como a cicatrização, quanto patológicas, como a invasão e metástases tumorais (Tuxhorn et al., 2001; London et al., 2003; Kanagaraj et al., 2007).

As distroglicanas (DGs) são moléculas de adesão expressas na interface entre as membranas basal e citoplasmática, promovendo a conexão entre o citoesqueleto e a MEC (Losasso et al., 2000; Winder, 2001; Brennan et al., 2004; Sgambato & Brancaccio, 2005). Inicialmente identificadas como proteínas do complexo da distrofina no músculo esquelético, as DGs foram encontradas posteriormente em todos os tecidos e tipos celulares de vertebrados, sendo responsáveis por funções como adesão celular, organização da membrana basal e do citoesqueleto, polarização e morfogênese dos epitélios, e transdução de sinais extracelulares (Singh et al., 2004; Sgambato & Brancaccio, 2005; Cross et al., 2008). As DGs são formadas por duas subunidades glicoprotéicas, a α -DG e a β-DG (Winder, 2001; Brennan et al., 2004; Sgambato & Brancaccio, 2005; Cross et al., 2008). A porção N-terminal da α-DG está localizada no meio extracelular e é altamente glicosilada, o que é essencial para o estabelecimento de interações com seus ligantes extracelulares, representados sobretudo por componentes da lâmina basal (Losasso et al., 2000; Singh et al., 2004; Sgambato & Brancaccio, 2005). Por outro lado, a extremidade C-terminal da α-DG liga-se de forma não-covalente ao domínio extracelular da β-DG, uma proteína transmembrana que promove a conexão da α-DG com os filamentos de actina do citoesqueleto através de sua porção citoplasmática (Winder, 2001; Brennan et al., 2004; Sgambato & Brancaccio, 2005).

3.2. Senescência e doenças prostáticas

A senescência está associada a mudanças significantes no ambiente hormonal, gerando alterações morfofuncionais na próstata das diferentes espécies animais (Banerjee et al., 2000; Roy-Burman et al., 2004). De maneira geral, o homem apresenta declínio progressivo nos níveis circulantes de testosterona e dehidroepiandrosterona (DHEA), o qual

é acompanhado por acréscimo na conversão de andrógenos em estrógenos, resultando em desequilíbrio em favor destes últimos com a idade (Srinivasan et al., 1995; Morales, 2002). Segundo Krieg et al. (1993), os níveis de DHT no epitélio da próstata humana decrescem com a idade e, inversamente, os níveis de estradiol e estrona apresentam-se elevados na senescência, principalmente no estroma prostático. No animal senil, devido à depleção androgênica, as células epiteliais prostáticas sofrem involução, porém não há desaparecimento total das funções celulares ou secreção glandular (Cavazos, 1975). Além disso, nota-se a presença de infiltrados de células inflamatórias, atipia focal no epitélio e menor taxa de receptores androgênicos em relação à próstata de animais jovens e adultos (Lau et al., 2003; Cordeiro et al., 2008; Bianchi-Frias et al., 2010). Segundo Lau et al. (2003), tais alterações evidenciadas na próstata de ratos senis são similares àquelas verificadas na hiperplasia benigna em humanos. Estes autores também sugeriram a perda de funções na próstata na senescência, com diminuição da expressão de genes relacionados à síntese e checagem de proteínas, inibição do crescimento e metabolismo energético; ao passo que foi observada transcrição aumentada de genes de sobrevivência celular e evasão apoptótica (Lau et al., 2003).

No sexo masculino, a senescência está associada à maior propensão para o desenvolvimento de diversas desordens urológicas, incluindo doenças prostáticas, como a hiperplasia benigna (HBP) e o câncer, sendo a próstata o órgão mais comumente afetado por doenças neoplásicas em homens, especialmente após os 50 anos (Leav et al., 2001; Schulman & Lunenfeld, 2002; Lau et al., 2003; Berry et al., 2008). A HBP caracteriza-se por predominante proliferação estromal e, embora aumento substancial do epitélio também ocorra, a integridade regional da glândula é mantida (Droller, 1997). Por outro lado, o câncer de próstata é considerado uma doença epitelial e freqüentemente estende-se além dos limites normais do órgão (Droller, 1997). O desenvolvimento do carcinoma prostático é de natureza endócrina e ele constitui a segunda maior causa de mortes por câncer na população ocidental masculina, embora sua etiologia não esteja totalmente estabelecida (Wong et al., 2000; Niu & Xia, 2009). Postula-se que a neoplasia intra-epitelial prostática (NIP) seja uma lesão precursora do adenocarcinoma invasivo, podendo precedê-lo por até 10 anos, mas os mecanismos moleculares que suportam essa transição ainda não são conhecidos (Majumder et al., 2008).

No adenocarcinoma prostático, o microambiente estromal exerce influências indutivas sobre as células tumorais, gerando alterações genéticas e fenotípicas nas

mesmas, as quais garantem maior capacidade de proliferação e sobrevivência (Chung et al., 2005). Assim, a simples ocorrência de mutações não é suficiente para desencadear a tumorigênese, sendo necessário um microambiente permissivo no qual as células transformadas possam progredir para um fenótipo maligno (Sprenger et al., 2008). Essa condição é propiciada pelo envelhecimento, devido ao acúmulo de células senescentes cujo programa de transcrição está alterado, de forma que muitos fatores que comprometem a estrutura e a função tecidual estão supra-regulados, como os de citocinas inflamatórias, MMPs, proteínas da MEC, fatores de crescimento e angiogênicos (Zhao et al., 2002; Sprenger et al., 2008). Assim, verifica-se estreita relação entre a senescência, a angiogênese e o crescimento tumoral (Hosokawa et al., 2002; van Moorselaar & Voest, 2002; Reynolds & Kyprianou, 2006).

A angiogênese constitui um dos mais importantes eventos durante a progressão do câncer, pois após atingirem determinado tamanho crítico os tumores malignos induzem sua própria neo-vascularização, atendendo assim suas necessidades metabólicas, sustentando seu crescimento e proporcionando uma via de disseminação metastática (Tuxhorn et al., 2001; Condon, 2005; Martin & Matrisian, 2007). Essencialmente todas as etapas da angiogênese são reguladas pelo balanço relativo entre indutores e inibidores no microambiente, sendo que no câncer ocorre diminuição dos níveis de inibidores, acréscimo dos indutores ou ainda uma combinação desses eventos no meio extracelular (Doll et al., 2001; Tuxhorn et al., 2001; van Moorselaar & Voest, 2002). No adenocarcinoma prostático, observou-se aumento da reatividade e dos níveis plasmáticos de VEGF, os quais se relacionaram com metástases e piores prognósticos da doença (Duque et al., 1999; Mazzucchelli et al., 2000; Doll et al., 2001; van Moorselaar & Voest, 2002). Embora a senescência esteja associada à redução nos níveis corpóreos de VEGF, evidências a favor da diminuição nos riscos de desenvolvimento do câncer são escassas, provavelmente porque a expressão desse fator pode aumentar no microambiente de órgãos como a próstata em razão do acúmulo de células senescentes (Sprenger et al., 2008). Assim, esse fator pró-angiogênico representa um alvo atraente para abordagens terapêuticas, pois a diminuição de sua expressão com o uso de inibidores resultaria em interrupção do crescimento e da progressão tumoral (Reynolds & Kyprianou, 2006). Um desses inibidores é a endostatina, um fragmento proteolítico da região C-terminal do colágeno XVIII, cuja ação anti-angiogênica ocorre por inibição da migração e proliferação das células endoteliais, além de indução de apoptose nas mesmas (O’Reilly et al., 1997; Schmidt et al.,

2005). Além disso, a endostatina é um potente agente anti-tumoral, exercendo seus efeitos por inibição da vascularização e do fornecimento de sangue aos tecidos neoplásicos (O’Reilly et al., 1997; Schmidt et al., 2005).

O IGF-1 também é um gene supra-regulado nas células senescentes e, embora os níveis séricos desse fator de crescimento diminuam com a idade, dentro da população senil os indivíduos com maior quantidade de IGF-1 no plasma estão mais propensos ao desenvolvimento de cânceres, como o de próstata (Sprenger et al., 2008). Estudos clínicos e epidemiológicos demonstraram que níveis séricos aumentados de IGF-1 representam um potente fator de risco para o início de HBP e de carcinogênese prostática (Djavan et al., 2001; Konno-Takahashi et al., 2003; Pandini et al., 2005).

Na senescência, ocorre elevação na atividade das MMPs, a qual se deve mais à perda de seus mecanismos de regulação do que ao aumento da expressão dessas enzimas (Sprenger et al., 2008). As MMPs são reguladas no nível da transcrição gênica, da ativação enzimática ou por ação dos inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs), os quais se ligam ao sítio catalítico dessas enzimas, inibindo sua atividade proteolítica (Lynch & Matrisian, 2002; Martin & Matrisian, 2007).As MMPs também apresentaram níveis elevados em diferentes tipos de câncer, sendo que os tumores de próstata em particular expressam níveis crescentes das MMPs 2 e 9 conforme progridem para graus mais elevados e aumentam seu potencial metastático (Lynch & Matrisian, 2002; Kanagaraj et al., 2007; Sprenger et al., 2008). Tais enzimas degradam particularmente o colágeno IV e a membrana basal e correspondem às primeiras MMPs cuja associação com a carcinogênese foi relatada (Stearns & Stearns, 1996; Martin & Matrisian, 2007). Embora inicialmente todas as MMPs fossem consideradas favorecedoras da progressão tumoral, evidências recentes demonstraram que muitas dessas enzimas podem exercer papéis anti-tumorigênicos em diversos tipos de câncer (Martin & Matrisian, 2007). A MMP-9, por exemplo, é capaz de exercer ações antagônicas dependendo do estágio do tumor e do balanço entre o recrutamento de células inflamatórias, a promoção de invasão e a liberação de fatores angiogênicos no microambiente tumoral (Martin & Matrisian, 2007; Littlepage et al., 2010).

Em adição, diferentes autores relacionaram a ocorrência de alterações na expressão das DGs a tumores de mama, cólon e próstata, os quais demonstraram heterogeneidade na expressão da β-DG e baixa ou ausente expressão da α-DG quando comparados aos tecidos epiteliais normais (Losasso et al., 2000; Sgambato et al., 2003; Brennan et al., 2004;

Sgambato et al., 2007). Evidências sugerem que essas alterações na detecção das DGs são resultado de modificações na estrutura da proteína, ocorrendo clivagem da β-DG por ação de MMPs (Losasso et al., 2000; Yamada et al., 2001; Sgambato & Brancaccio, 2005). Tal alteração estrutural leva à perda da região de interação com a α-DG, desestabilizando o complexo protéico e prejudicando a função adesiva das DGs, o que poderia favorecer o desenvolvimento e a invasão tumoral (Losasso et al., 2000; Yamada et al., 2001; Sgambato & Brancaccio, 2005).

Em conjunto, tais observações sugerem que mudanças nos níveis endógenos de hormônios esteróides associadas a alterações na expressão gênica das células prostáticas na senescência contribuem fortemente para o desequilíbrio glandular nesse período da vida. Sabe-se ainda que o declínio dos níveis séricos de testosterona está associado ao surgimento de uma série de alterações em homens senis, como depressão, disfunção sexual, diminuição do volume e força musculares, bem como redução da densidade mineral dos ossos (Marks et al., 2006). Tal quadro clínico tem sido referido como andropausa ou hipogonadismo masculino tardio, sendo que a terapia de reposição androgênica vem sendo aplicada no tratamento desse conjunto de sintomas, objetivando a melhoria da qualidade de vida de homens idosos (Morales et al., 2002; Lau et al., 2003; Drewa & Chlosta, 2010). É conhecido que homens com deficiência hormonal tratados adequadamente com andrógenos apresentaram próstata com volume similar ao normal para sua idade (Morales et al., 2002). Além disso, embora a população masculina com potencial para receber esse tratamento esteja aumentando, questões como a possível associação entre a reposição androgênica e o desenvolvimento e/ou progressão de lesões malignas prostáticas ainda não estão totalmente esclarecidas, sendo escassos os estudos abordando os efeitos da reposição hormonal em homens (Drewa & Chlosta, 2010). Diversos autores apontaram que a administração de andrógenos exógenos freqüentemente exacerba lesões malignas pré-existentes, apesar da falta de evidências de que a terapia hormonal promova primariamente o desenvolvimento de tumores (Morales et al., 2002; Marks et al., 2006).

4.

J

Após revisão bibliográfica, confirmou-se a importante função da glândula prostática no processo reprodutivo masculino. Além disso, constatou-se a complexidade estrutural e molecular desse órgão bem como as diferentes interações parácrinas que nele ocorrem, tanto no funcionamento normal como no desenvolvimento e progressão de doenças. Ainda, verificou-se que durante a senescência ocorrem relevantes alterações nos diferentes compartimentos prostáticos. Em adição, é fato que o desequilíbrio hormonal é elemento decisivo para a diminuição da atividade prostática e ocorrência de patogênese nesse órgão.

As terapias de reposição hormonal são preconizadas na tentativa de minimizar os efeitos prejudiciais do desequilíbrio hormonal sobre o sistema genital masculino. Contudo, tais procedimentos ainda são assunto controvertido na clínica urológica. Assim sendo, baseando-se em todas as considerações acima mencionadas, o objetivo geral desse estudo foi caracterizar aspectos estruturais e moleculares do lobo ventral da próstata de ratos senis frente à reposição de hormônios esteróides, relacionando as alterações decorrentes da terapia hormonal a possíveis condições de lesões prostáticas. Tal objetivo geral foi alcançado através dos seguintes objetivos específicos:

a) Imunolocalização das subunidades alfa e beta do complexo das distroglicanas (α -DG e β-DG), do receptor do fator de crescimento homólogo à insulina tipo I (IGFR-1), da metaloproteinase-9 de matriz (MMP-9), do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e da molécula anti-angiogênica endostatina na próstata ventral de ratos senis e sob a influência da reposição de estrógeno e testosterona;

b) Quantificação por Western Blotting dos níveis protéicos de α-DG, β-DG, IGFR-1, MMP-9, VEGF e endostatina no lobo ventral da próstata de ratos senis frente a diferentes situações de reposição hormonal, bem como estabelecer comparações com ratos senis castrados também submetidos à terapia similar;

c) Caracterização da estrutura e da ultra-estrutura e análise morfométrica do lobo ventral da próstata de ratos senis submetidos ou não à terapia de reposição hormonal, comparando os achados à análise de ratos senis castrados frente à reposição de hormônios esteróides;

d) Avaliação dos níveis séricos de testosterona e estrógeno de ratos senis com e sem administração de hormônios esteróides, bem como em senis castrados submetidos ou não à terapia hormonal;

e) Comparação estrutural e de aspectos moleculares do lobo ventral da próstata de animais senis frente à reposição de estrógeno e testosterona, relacionando esses resultados à possível condição patogênica da próstata.

5.

M

5.1. Animais e procedimento experimental

Neste trabalho foram utilizados 63 ratos machos da linhagem Sprague-Dawley obtidos no Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). Os animais foram divididos em um grupo jovem (4 meses de idade) e seis grupos senis (10 meses de idade), com 9 animais por grupo:

A) Grupo Jovem (JOV): recebeu injeções subcutâneas de óleo de amendoim (5

mL/Kg de peso corpóreo) em dias alternados por 30 dias;

B) Grupo Senil (SEN): recebeu injeções subcutâneas de óleo de amendoim (5 mL/Kg

de peso corpóreo) em dias alternados por 30 dias;

C) Grupo Testosterona (TEST): recebeu injeções subcutâneas de cipionato de

testosterona (5 mg/Kg de peso corpóreo) (Deposteron-Novaquímica, São Paulo, SP, Brasil) diluídos em 5 mL de óleo de amendoim em dias alternados por 30 dias (Franck-Lissbrant et al., 1998; Sáttolo et al., 2004);

D) Grupo Estrógeno (EST): recebeu injeções de 17β-estradiol (25 µg/Kg de peso corpóreo) (Sigma Chemical Co., St. Louis, EUA) diluídos em 25 µL de óleo de amendoim em dias alternados por 30 dias (Prins et al., 2001);

E) Grupo Castrado (CAS): os animais foram anestesiados com Francotar/Virbaxyl

(Vibra, Roseira, SP, Brasil) (1:1) na dosagem de 0,25 mL para cada 100 gramas de peso corpóreo e posteriormente castrados por incisão cirúrgica, com retirada dos testículos;

F) Grupo Castrado-Testosterona (CT): 30 dias após a castração, os animais

receberam tratamento com cipionato de testosterona na mesma concentração do grupo TEST em dias alternados por 30 dias;

G) Grupo Castrado-Estrógeno (CE): 30 dias após a castração, os animais receberam

tratamento com 17β-estradiol na mesma concentração utilizada no grupo EST em dias alternados por 30 dias.

Todos os animais receberam água e a mesma dieta sólida ad libitum (Nuvilab, Colombo, PR, Brasil). Após o período de tratamento, os animais foram pesados em balança semi-analítica (Marte AS 5500), anestesiados com Francotar/Virbaxyl (Vibra, Roseira, SP, Brasil) (1:1) na dosagem de 0,25 mL para cada 100 gramas de peso corpóreo e sacrificados. Amostras do lobo ventral da próstata foram coletadas para análises de microscopias de luz e eletrônica de transmissão, morfométricas, imunohistoquímicas e de Western Blotting. Para as dosagens hormonais séricas, o sangue foi obtido através de punção cardíaca, 24 horas após a administração das últimas doses de cada um dos hormônios esteróides.

O protocolo de experimentação animal foi aprovado pela Comissão de Ética na Experimentação Animal da instituição (CEEA/Unicamp, protocolo nº 1748-1).

5.2. Dosagens hormonais séricas

Após 24 horas da última administração de hormônios sexuais esteróides, amostras

de sangue foram obtidas de cinco ratos de cada grupo experimental através de punção cardíaca no ventrículo esquerdo. O plasma foi separado por centrifugação (10000 rpm, 4°C, 10 minutos) e armazenado a -20ºC para subseqüe ntes análises. As concentrações de testosterona (ng/mL) e estradiol (pg/mL) foram mensuradas por radioimunoensaio usando os kits Coat-a-Count total testosterone/estrogen (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, EUA).

5.3. Microscopia de luz

Amostras do lobo ventral da próstata foram coletadas de cinco animais de cada grupo e fixadas em solução de Bouin por 24 horas. Após a fixação, os tecidos foram lavados em álcool etílico 70%, com posterior desidratação em série crescente de alcoóis. A seguir, os fragmentos foram diafanizados com xilol por 2 horas e inclusos em parafina e polímeros plásticos (Paraplast Plus, St. Louis, EUA). Os materiais foram então seccionados com espessura de 5 µm em micrótomo (Zeiss Hyrax M60), corados com Hematoxilina-Eosina, Tricrômico de Masson (Junqueira et al., 1979) e Prata Amoniacal (Vilamaior et al., 2000) e fotografados no fotomicroscópio (Nikon Eclipse E-400).

5.4. Análises morfométricas

Para o estudo morfométrico foram utilizados cinco animais de cada grupo, os mesmos destinados à microscopia de luz e corados com Hematoxilina-Eosina. As imagens celulares foram obtidas no fotomicroscópio (Nikon Eclipse E-400) e submetidas às mensurações das áreas: celular total, nuclear e citoplasmática; além da área ocupada pelo epitélio, lúmen e estroma glandular, por meio do programa Nis-Elements: Advanced Research (EUA).

Para quantificação das áreas celulares, nucleares e citoplasmáticas foram utilizadas células epiteliais contidas em dez campos aleatoriamente definidos por animal, fixando-se as observações com a objetiva de 100X. Já para a determinação da área ocupada pelo epitélio, lúmen e estroma glandular também foram utilizados dez campos por animal, com observações sob a objetiva de 20X.

5.5. Microscopia eletrônica de transmissão (MET)

Quatro animais de cada grupo experimental foram perfundidos com solução de Karnovsky (Graham & Karnovsky, 1965), através do ventrículo esquerdo do coração (Sprando, 1990). Amostras do lobo ventral foram coletadas e fixadas por imersão no mesmo fixador, com posterior pós-fixação em tetróxido de ósmio a 1% por duas horas. Os materiais foram então desidratados em série crescente de acetona e incluídos em resina plástica (Araldite, Polysciences, Niles, EUA). Secções com 0,5 µm de espessura foram obtidas, coradas com azul de Toluidina e preparadas para microscopia de luz, visando à escolha de áreas específicas para a análise de MET. Posteriormente, os blocos foram trimados e seccionados no ultramicrótomo (Ultracult UCT 020 Leica). Os cortes obtidos foram montados em telas de cobre (200 “Mesh”), contrastados pelo acetato de uranila (Watson, 1958) e pelo citrato de chumbo (Reynolds, 1963), examinados e fotografados no microscópio eletrônico de transmissão LEO 906 no Laboratório de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biologia/Unicamp.

5.6. Imunohistoquímica

Amostras do lobo ventral foram coletadas de cinco animais de cada grupo experimental, os mesmos utilizados para microscopia de luz. Os materiais foram então seccionados (5 µm) em micrótomo (Zeiss Hyrax M60), sendo os cortes coletados em lâminas silanizadas, desparafinizados em xilol, hidratados em série decrescente de alcoóis

e lavados em água destilada. A recuperação antigênica foi realizada por incubação dos cortes em tampão citrato 10 mM (pH 6,0) durante três ciclos de 5 minutos em microondas (potência de 750 W). O bloqueio das peroxidases endógenas foi obtido com H2O2 (0,3% em

metanol) por 15 minutos. Para diminuir as ligações inespecíficas proteína-proteína, os cortes foram incubados em solução bloqueadora com albumina soro bovino (BSA 3% em tampão TBS-T) por 1 hora em temperatura ambiente. Posteriormente, os antígenos α-DG, β-DG, IGFR-1, MMP-9, VEGF e endostatina foram localizados, respectivamente, através dos anticorpos: rabbit policlonal H-300 (sc-28534) (Santa Cruz Biotechnology, Califórnia, EUA), mouse monoclonal (NCL-b-DG) (Novocastra Laboratories, Newcastle, Inglaterra), rabbit policlonal N-20 (sc-712) (Santa Cruz Biotechnology, Califórnia, EUA), mouse monoclonal Ab-3 (IM37) (Calbiochem, EUA), mouse monoclonal VG-1 (sc-53462) (Santa Cruz Biotechnology, Califórnia, EUA) e mouse monoclonal 4i37 (ab64569) (Abcam, EUA). Os cortes foram incubados com os anticorpos primários diluídos em BSA 1% (1:50 ou 1:100, conforme a indicação do fabricante) e armazenados overnight a 4ºC. Após lavagem com tampão TBS-T, foram incubados com anticorpo secundário HRP conjugado proveniente do kit Envision (Dako Cytomation Inc., Carpenteria, EUA) por 40 minutos e posteriormente revelados com diaminobenzidina (DAB). Para a contra-coloração destes, foram utilizados Verde-metil e Hematoxilina de Harris, conforme distribuição dos antígenos no tecido prostático. As lâminas foram desidratadas, montadas e avaliadas no fotomicroscópio (Nikon Eclipse E-400). Para controle negativo foram realizadas reações similares sem a adição do anticorpo primário. A intensidade da imunorreatividade nos compartimentos epitelial e estromal foi graduada em intensa (+++), moderada (++) e fraca (+), de acordo com a distribuição dos antígenos nos tecidos (Markopoulos et al., 2000). Devido ao fato da β-DG localizar-se na região da interface epitélio-estroma, esses compartimentos foram considerados em conjunto na avaliação de sua imunorreatividade.

5.7. Western Blotting

Amostras do lobo ventral de cinco animais de cada grupo experimental, os mesmos destinados às análises imunohistoquímicas, foram coletadas e congeladas. As amostras de tecido foram homogeneizadas com auxílio do Polytron em tampão de extração contendo Triton-x-1%; NaCl 150 mM; Tris 10 mM pH 7,4; EDTA 1 mM; Hepes 1mM pH 7,6; PMSF 0,2 mM e 10 µL/mL de coquetel inibidor de proteases (Sigma, St. Louis, EUA). Os extratos dos tecidos foram obtidos por centrifugação (14000 rpm, 4oC, 20 minutos). O conteúdo total de

proteínas foi mensurado pelo método de Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, EUA). Os sobrenadantes foram misturados (1:1) com tampão de amostra (3x) e transferidos para banho seco a 100ºC por 5 minutos. Alíquotas contendo 75 µg de proteína foram aplicadas no gel de SDS-poliacrilamida. Após eletroforese, o material foi transferido eletricamente (Sistema Hoefer) para membranas de nitrocelulose (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, EUA) a 70V durante 3 horas. As membranas foram então bloqueadas com BSA 3% em TBS-T por uma hora e incubadas com os anticorpos primários rabbit policlonal H-300 (sc-28534) (Santa Cruz Biotechnology, Califórnia, EUA) para α-DG, mouse monoclonal (NCL-b-DG) (Novocastra Laboratories, Newcastle, Inglaterra) para β-DG, rabbit policlonal N-20 (sc-712) (Santa Cruz Biotechnology, Califórnia, EUA) para IGFR-1, mouse monoclonal Ab-3 (IM37) (Calbiochem, EUA) para MMP-9, mouse monoclonal VG-1 (sc-53462) (Santa Cruz Biotechnology, Califórnia, EUA) para VEGF, mouse monoclonal 4i37 (ab64569) (Abcam, EUA) para endostatina e mouse monoclonal ACTBD11B7 (sc-81178) (Santa Cruz Biotechnology, Califórnia, EUA) para β-actina, na diluição 1:500 em BSA 1%. A seguir, as membranas foram lavadas em tampão de lavagem (50 mM Na2PO4, 150 mM

NaCl e 0,05% de Tween 20) por 3 vezes de 5 minutos e incubadas à temperatura ambiente por 1 hora em anticorpo secundário HRP conjugado (Promega Corporation, EUA) na diluição de 1:2500 em BSA 1%. Após lavagens, a atividade da peroxidase foi revelada com diaminobenzidina (DAB) (Sigma Chemical Company, St Louis, EUA) por 10 minutos. A quantificação de β-actina foi utilizada como controle endógeno para comparação entre os grupos. A intensidade das bandas de cada antígeno nos diferentes grupos foi determinada por densitometria através do programa Nis-Elements: Advanced Research (EUA) e expressa como a porcentagem média em relação à intensidade das bandas de β-actina.

5.8. Análise estatística

O estudo da comparação entre grupos foi realizado através das variáveis: concentrações de testosterona (ng/mL) e estradiol (pg/mL) totais no plasma sanguíneo; áreas nuclear, citoplasmática e celular total (µm²); área do epitélio, lúmen e estroma (µm²); e comparação dos níveis protéicos de α-DG, β-DG, IGFR-1, MMP-9, VEGF e endostatina determinados por Western Blotting. A análise estatística foi realizada pelo Test-T e a análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey. Todas as análises foram realizadas com nível de significância de 5% (Montgomery, 1991; Zar, 1999).

6.

A

I

“Hormonal therapy in the senescence: prostatic microenvironment

structure and adhesion molecules”

Aceito para publicação no periódico Micron.

Fábio Montico1; Amanda Cia Hetzl1; Eduardo Marcelo Cândido1; Wagner José Fávaro2; Valéria Helena Alves Cagnon1.

1- Department of Anatomy, Cell Biology, Physiology and Biophysics, Institute of Biology, State University of Campinas (UNICAMP), Campinas, São Paulo, Brazil.

2- Department of Anatomy, Institute of Biosciences, State University of São Paulo ”Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), Botucatu, São Paulo, Brazil.

Correspondence to: Valéria H. A. Cagnon PhD, Department of Anatomy, Cell Biology, Physiology and Biophysics, Institute of Biology, State University of Campinas (UNICAMP), P.O. Box 6109, 13083-865, Campinas, São Paulo, Brazil. Telephone: (+55) (19) 3521-6103. Fax: (+55) (19) 3289-3124. E-mail: quitete@unicamp.br.

6.1.

A

Hormonal replacement has been utilized to minimize the harmful effects of hormonal imbalance in elderly men. The development and progression of prostatic diseases and their relation to hormone therapy is still unclear. Thus, the aim herewith was to characterize the structure and dystroglycan molecule (DGs) reactivities in the ventral prostatic lobe from elderly rats submitted to steroid hormone replacement. Male rats (Sprague-Dawley) were divided into one Young group and six senile groups. The Young group (YNG) (4 months old) received peanut oil (5 mL/kg, s.c.). The senile rats (10 months old) were submitted to the following treatments: Senile group (SEN) (5 mL/kg peanut oil, s.c.); Testosterone group (TEST) (5 mg/kg testosterone cipionate, s.c.); Estrogen group (EST) (25 µg/kg 17β -estradiol, s.c.); Castrated group (CAS) (surgical castration); Castrated-Testosterone (CT) (surgical castration and treatment similar to TEST group); and Castrated-Estrogen (CE) (surgical castration and treatment similar to EST group). After 30 days treatment, blood samples were collected for hormonal analysis and ventral prostate samples were processed for light and transmission electron microscopies, morphometrical analysis, immunohistochemistry and Western Blotting. The results showed decreased serum testosterone levels in the senescence and increased testosterone and estrogen plasmatic levels after hormone administration in the TEST and EST groups, respectively, highlighting the therapy efficiency. Hypertrophied stroma and inflammatory cells were verified in the SEN group. After hormone replacement in the senescence or following castration, atrophic epithelium, epithelial cells with clear cytoplasmic halo around the nucleus, microacini and maintenance of hypertrophied stroma were seen. Decreased DG levels were verified in the senescence. After hormonal therapy, increased protein levels of these molecules were observed, especially in those groups which received estradiol. Thus, the occurrence of inflammatory cells, stromal hypertrophy and presence of cells with clear halo around the nucleus after hormonal therapy probably indicated prostatic paracrine signaling imbalance, suggesting a stromal reactive microenvironment favorable to the development of glandular lesions. However, the increase of DG levels characterized positive effect of steroid hormone replacement on the prostate in the senescence. Thus, it could be concluded that despite having positive effects on important molecules involved in the maintenance of epithelial-stromal interaction and glandular cytoarchitecture, such as DGs, hormonal therapy

enhanced structural changes associated with senescence, probably due to increased hormonal imbalance between androgens and estrogens in the prostatic tissue.

Key-words: Prostate, senescence, steroid hormones, ultrastructure, dystroglycans.

6.2.

I

The prostate is a male accessory sex gland with important role in the reproductive process, secreting different nutrients that compose the seminal fluid, which is essential to motility and nutrition of the spermatozoids (Marker et al., 2003). In rodents, the prostate comprises pairs of lobes: ventral, lateral and dorsal, according to their relation to the urethra, in addition to an anterior lobe or coagulating gland, localized in the concave face of the seminal vesicle (Sugimura et al., 1986; Marker et al., 2003). The ventral prostate is often utilized in carcinogenesis experimental studies due to its primary androgen-dependence, despite having no direct homology to the human prostate (Slayter et al., 1994). The prostate shows acini covered by simple epithelium presenting luminal cells, basal cells and neuroendocrine cells which can be distinguished by differential expression of cytokeratins (CK) and surface antigens (CD) (Berry et al., 2008; Miki, 2009; Niu & Xia, 2009). The epithelium rests in a basal membrane, which is composed by laminin, collagen IV and heparan sulfate (Knox et al., 1994; Jorcyk et al., 1998). The prostatic stroma is a complex arrangement of fibroblasts, smooth muscle cells and extracellular matrix associated with growth factors, regulatory molecules and remodelling enzymes (Taipale & Keski-Oja, 1997; Tuxhorn et al., 2001). In addition, blood vessels, nerves and immune cells are integral parts of the stroma (Tuxhorn et al., 2001; Bianchi-Frias et al., 2010).

Adhesion molecules, such as dystroglycans (DGs), make the connection between epithelial cells and basal membrane, promoting cytoskeleton organization and its link to extracellular milieu (Losasso et al., 2000; Brennan et al., 2004; Sgambato & Brancaccio, 2005). Initially, DGs were identified as proteins of the dystrophin glycoproteic complex in the skeletal muscle, having a role in the sarcolemma stabilization during muscle contraction (Winder, 2001; Singh et al., 2004; Sgambato & Brancaccio, 2005). Currently, it is known that these adhesion molecules occur in all tissues and cellular types of vertebrates and are responsible for functions such as cellular adhesion, organization of basal membrane and cytoskeleton, epithelial morphogenesis and extracellular signal transduction (Singh et al.,

2004; Cross et al., 2008). The DGs are composed by two glycoproteic subunits, α-DG and β-DG (Brennan et al., 2004; Sgambato & Brancaccio, 2005). α-DG is linked to basal lamina components and interacts in a non-covalent manner with the extracellular domain of β-DG, a transmembrane protein which promotes the connection between α-DG and cytoskeletal actin filaments (Losasso et al., 2000; Winder, 2001; Brennan et al., 2004; Sgambato & Brancaccio, 2005).

The prostate is an androgen-dependent organ and the main circulating androgens responsible for inducing glandular differentiation and regulating its morphology are testosterone (T) and dihydrotestosterone (DHT) (Cunha et al., 2002; Hsing, 2001; Imamov et al., 2005; Leav et al., 2001; Toorians et al., 2003). The castration is one of the most utilized methods for studying the mechanisms involving testosterone in prostatic structural and functional maintenance. Thus, different studies showed that androgen deficiency led to prostatic involution, apoptosis activation in epithelial cells and extracellular matrix remodelling in this organ (Banerjee et al., 2000; Vilamaior et al., 2000; Flórez & Carvalho, 2005). In addition to androgens, other hormones such as estrogens act synergistically to testosterone, influencing both normal and pathological prostatic processes (Weihua et al., 2001; Cunha et al., 2002). Estrogens have anti-androgenic effects and regulate negatively the hypothalamus-pituitary-gonadal axis, reducing androgen production by Leydig cells and leading to prostatic epithelial involution and stromal growth in adult animals (Weihua et al., 2002).

Senescence is a period of life in which important changes occur in the hormonal environment, with functional and morphological alterations on the prostate of various species, resulting in higher propension for developing urological disorders such as benign prostatic hyperplasia (BPH) and prostate cancer (PC) (Banerjee et al., 2000; Krtolica & Campisi, 2002; Schulman & Lunenfeld, 2002; Lau et al., 2003). According to Krieg et al. (1993), DHT levels in prostatic epithelium decrease during aging and, on the contrary, estradiol levels increase.

Nowadays, androgen replacement therapy has been used clinically with the aim of attenuating the harmful effects of hormonal imbalance in the senescence, improving the quality of life of the elderly (Morales et al., 2002; Lau et al., 2003). On the other hand, there are doubts about the effects of hormonal therapy on the development and progression of prostatic malignant lesions. Different authors pointed that exogen androgen administration frequently exacerbates pre-existing lesions (Morales et al., 2002; Marks et al., 2006).

However, there is no direct evidence that hormonal therapy is able to promote tumor development (Morales et al., 2002; Marks et al., 2006).

Thus, the aim of this work was to characterize the glandular structure and the immunoreactivity of α and β dystroglycans in the prostatic ventral lobe of senile rats submitted to steroid hormone replacement, relating the alterations resulting from hormonal therapy to possible prostatic lesions.

6.3.

M

6.3.1. Animals and experimental procedures

A total of 63 male rats (Sprague-Dawley) were used and divided into one Young group and six senile groups (9 animals per group). The Young group (YNG), 4 months old, received a 5 mL/kg dose of peanut oil subcutaneously (s.c.). The rats in the senile groups (10 months old) were submitted to the treatments: Senile group (SEN): 5 mL/kg of peanut oil (s.c.); Testosterone group (TEST): 5 mg/kg of testosterone cipionate (Deposteron-Novaquímica, São Paulo, SP, Brazil) diluted in 5 mL of peanut oil (s.c) (Franck-Lissbrant et al., 1998; Sáttolo et al., 2004); Estrogen group (EST): 25 µg/kg of 17β-estradiol (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) diluted in 25 µL of peanut oil (s.c.) (Prins et al., 2001); Castrated group (CAS): rats were anesthetized with a 0.25mL/100g body weight dose of Francotar/Virbaxyl (1:1, Vibra, Roseira, SP, Brazil) and castrated by surgical incision; Castrated-Testosterone group (CT): surgical castration and after 30 days the rats received the same treatment as the TEST group; Castrated-Estrogen group (CE): surgical castration followed by the same treatment as EST group after 30 days.

All rats received water and solid ration ad libitum (Nuvilab, Colombo, PR, Brazil). After 30 days of treatment every other day, the animals were weighed on a semi-analytical scale (Marte AS 5500) and sacrificed. Samples from ventral lobe of prostate were collected and processed for light and transmission electron microscopies and for morphometrical, immunohistochemical and Western Blotting analysis. Steroid hormone concentrations on blood samples were also determined.

This study was approved by the institutional Committee for Ethics in Animal Research (State University of Campinas - Unicamp, protocol nº. 1748-1) and the

experiments were done in agreement with the Ethical Principles for Animal Research established by the Brazilian College for Animal Experimentation (COBEA).

6.3.2. Serum hormone levels

After 24 hours following the last steroid hormone administration, experimental animals were anesthetized with a 0.25mL/100g body weight dose of Francotar/Virbaxyl (1:1, Vibra, Roseira, SP, Brazil). Blood samples were collected from five animals of each group by cardiac puncture in the left ventricle. Plasma was isolated by centrifugation (10000 rpm, 4ºC, 10 min) and stored in -20ºC for subsequent analysis. The serum concentrations of testosterone (ng/mL) and estradiol (pg/mL) were determined by radioimmunoassay using Coat-a-Count total testosterone/estradiol kits (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, USA).

6.3.3. Light microscopy

Samples of the ventral prostate were collected from five animals in each group and then fixed by immersion in Bouin's solution from each one of animals during 24 hours. After dehydratation in an increasing alcohol series, the tissues were diaphanized and embedded in paraplast (Paraplast Plus, St. Louis, USA), cut into 5 µm thick sections and submitted to the following staining procedures: Hematoxylin-eosin, Masson’s trichrome (Junqueira et al., 1979) and Ammoniacal silver (Vilamaior et al., 2000). The slides were photographed with a Nikon Eclipse E-400 photomicroscope (Nikon, Tokyo, Japan).

6.3.4. Morphometrical procedures

Samples of the ventral lobe from five animals per group, the same used in light microscopy and stained with Hematoxylin-eosin, were submitted to morphometrical analysis. To quantify epithelial, luminal and stromal areas, ten microscopic fields were taken at random and analyzed per animal, resulting in 50 fields per group, using a Nikon Eclipse E-400 photomicroscope (Nikon, Tokyo, Japan) with an X20 objective. Cellular, cytoplasmic and nuclear areas were measured (10 microscopic fields were taken at random per animal), using a Nikon Eclipse E-400 photomicroscope (Nikon, Tokyo, Japan) with an X100 objective. All the areas were measured using the NIS-Elements: Advanced Research (USA) computerized image analysis system.

6.3.5. Transmission electron microscopy

Four animals from each experimental group were anesthetized and perfused with Karnovsky's solution through the left ventricle (Graham & Karnovsky, 1965; Sprando, 1990). The ventral lobe of the prostate was collected and fixed by immersion in the same fixative, followed by post-fixation in 1% osmium tetroxide for 2 hours. The material was then dehydrated in an increasing acetone series, embedded in resin (Polysciences, Niles, USA) and 0.5 µm thick sections were stained with Toluidine blue and prepared for light microscopy in order to choose specific areas for transmission electron microscopy analysis. Ultra-thin sections were obtained with an ultramicrotome (Ultracult UCT 020 Leica), mounted on 200 “Mesh” copper grids (Sigma Chemical Company, St. Louis, USA), and contrasted with uranyl acetate (Watson, 1958) and lead citrate (Reynolds, 1963). The specimens were then examined and photographed with a LEO 906 transmission electron microscope.

6.3.6. Immunohistochemistry

The samples of the ventral prostate were collected from five animals in each group, the same used in light microscopy analysis. The sections were deparaffinized in xylene, hydrated in a decreasing alcohol series and rinsed under distilled water. Antigens were retrieved by boiling the sections in 10 mM citrate buffer (pH 6.0) three times for 5 min in a microwave oven. After that, the sections were incubated in 0.3% H2O2 for 15 min to block

endogenous peroxidase. Nonspecific binding was blocked by incubating the sections in a blocking solution (3% BSA in TBS-T buffer) for 1h at room temperature. Primary rabbit H-300 (sc-28534) (Santa Cruz Biotechnology, California, USA) for α-DG and mouse (NCL-b-DG) (Novocastra Laboratories, Newcastle, UK) for β-DG antibodies were diluted in 1% BSA (1:50) and applied to the sections overnight at 4ºC. The sections were washed for 15 min with TBS-T and secondary labeled polymer fromthe Envision HRP Kit (Dako Cytomation Inc., Carpenteria, USA) was applied for 40 min at room temperature. After washing in TBS-T, peroxidase activity was detected using a diaminobenzidine (DAB) chromogen from Envision HRP Kit (Dako) for 10 min. Sections were lightly counterstained with Methyl Green, dehydrated in an increasing ethanol series and xylene, mounted in Entellan (Merck, Darmstadt, Germany) and photographed in the photomicroscope (Nikon Eclipse E-400). Sections from ventral prostate that were not stained with primary antibody for α-DG and β -DG were used as negative controls. The intensity of antigen immunoreactivity in epithelial

and stromal compartments was graded as intense (+++), moderate (++), and weak (+), according to the antigens distribution in the sectioned tissue (altered Markopoulos et al., 2000). Because β-DG immunolabelling occurs in the epithelium-stroma interface, these compartments were considered together in the evaluation of its reactivity.

6.3.7. Western Blotting analysis

Ventral prostate samples from five animals in each experimental group were collected and frozen. The samples were weighed and homogenized in a Polytron homogenizer (Kinematica Inc., Lucerne, Switzerland) for 1 min in a 50 µL/mg lysis buffer. The tissue homogenates were centrifuged at 14000 rpm for 20 min at 4°C and a sample of each extract was used for protein quantification with Bradford reagent (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA). The supernatants were mixed (1:1) with 3x sample buffer and transferred to a dry bath at 100ºC for 5 min. Aliquots containing 75 µg of protein were separated by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels under reducing conditions. After electrophoresis, proteins were transferred to Hybond-ECL nitrocellulose membranes (Amersham, Pharmacia Biotech, Arlington Heights, USA) at 70V for 3h. The membranes were blocked with TBS-T containing 3% BSA for 60 min, rinsed in TBS-T and incubated at 4ºC overnight with the following primary antibodies: rabbit H-300 (sc-28534) (Santa Cruz Biotechnology, California, USA) for α-DG, mouse (NCL-b-DG) (Novocastra Laboratories, Newcastle, UK) for β-DG and mouse ACTBD11B7 (sc-81178) (Santa Cruz Biotechnology, California, USA) for β-actin diluted in 1% BSA (1:500). The membranes were then incubated for 2h with rabbit or mouse secondary HRP-conjugated antibody (Promega Corporation, USA) diluted 1:2500 in 1% BSA. After washing in TBS-T, peroxidase activity was detected by incubation with a diaminobenzidine (DAB) chromogen (Sigma Chemical Company, St Louis, USA) for 10 min. β-actin quantification was used as an endogenous control for the comparison among groups. The intensity of antigen bands in each experimental group was determined by densitometry using the software Nis-Elements: Advanced Research (USA) and was expressed as the mean ratio in relation to β-actin band intensity.

6.3.8. Statistical analysis

Average data for total testosterone (ng/mL) and estradiol (pg/mL) serum concentrations; cellular, cytoplasmic, nuclear, epithelial, luminal and stromal areas (µm²)