Análise Estatística

A análise estatística comparativa dos níveis protéicos de IGFR-1, MMP-9, VEGF e endostatina entre os diferentes grupos experimentais foi realizada pelo Test-T e análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey. Todas as análises foram realizadas com nível de significância de 5% (Montgomery, 1991; Zar, 1999).

7.4.R

Grupo Jovem (JOV)

Fracas reatividades para IGFR-1, MMP-9 e VEGF foram observadas nos animais jovens, tanto no epitélio como no estroma prostático (Figs. 1A, 1B e 1C; Tabela 1), sendo os respectivos níveis protéicos de 84,4%, 70,7% e 70,0%, considerando o padrão β-actina (Fig. 3). Já a endostatina apresentou imunolocalização intensa no epitélio e no estroma prostático, com níveis protéicos de 138,8% (Figs. 1D e 3; Tabela 1).

Grupo Senil (SEN)

O IGFR-1 e a MMP-9 apresentaram fracas reatividades epitelial e estromal, com níveis protéicos de 82,3% e 69,4%, respectivamente, sendo estes estatisticamente similares aos do grupo JOV (Figs. 1E, 1F e 3; Tabela 1). O VEGF demonstrou reatividade

moderada no epitélio e fraca no estroma, com significativo aumento dos níveis protéicos (94,0%) em relação aos jovens (Figs. 1G e 3; Tabela 1). Diminuição dos níveis de endostatina, representando 86,8%, foi verificada em comparação ao grupo JOV, com moderada reatividade epitelial e fraca reatividade estromal para essa molécula (Figs. 1H e 3; Tabela 1).

Grupo Testosterona (TEST)

Reatividade intensa no ápice das células epiteliais e moderada no estroma foi observada para o IGFR-1, verificando-se níveis protéicos de 171,5%, os quais foram estatisticamente maiores em relação aos animais jovens e senis (Figs. 1I e 3; Tabela 1). A MMP-9 apresentou reatividade moderada no epitélio e fraca no estroma, sendo os níveis protéicos de 99,9% e significativamente aumentados em relação aos grupos JOV e SEN (Figs. 1J e 3; Tabela 1). Para o VEGF, a imunolocalização foi intensa no ápice das células epiteliais e fraca no estroma, observando-se significativo aumento dos níveis protéicos (113,6%) em comparação com os animais jovens e senis (Figs. 1K e 3; Tabela 1). Intensa reatividade para endostatina foi verificada tanto no epitélio como no estroma, caracterizando-se níveis protéicos estatisticamente similares ao do grupo JOV (Figs. 1L e 3; Tabela 1).

Grupo Estrógeno (EST)

O IGFR-1 apresentou intensa reatividade no ápice das células epiteliais e moderada reatividade estromal, com níveis protéicos aumentados (170,8%) em relação aos do grupo SEN e estatisticamente iguais aos do grupo TEST (Figs. 1M e 3; Tabela 1). A MMP-9 demonstrou imunolocalização epitelial intensa e estromal fraca, com níveis protéicos de 163,7% e significativamente aumentados em relação aos grupos JOV e SEN (Figs. 1N e 3; Tabela 1). Analogamente, aumento significativo dos níveis protéicos de VEGF foi verificado, caracterizando reatividade intensa no ápice das células epiteliais e moderada no estroma (Figs. 1O e 3; Tabela 1). Níveis protéicos de 121,5% foram observados para a endostatina, sendo estes superiores aos do grupo SEN, porém estatisticamente menores em relação a JOV e TEST, caracterizando intensa imunolocalização epitelial e fraca reatividade estromal (Figs. 1P e 3; Tabela 1).

Grupo Castrado (CAS)

Reatividade moderada para IGFR-1 e MMP-9 foi verificada tanto no epitélio como no estroma prostático, sendo seus respectivos níveis protéicos de 101,4% e 126,2%, caracterizando aumento significativo em relação aos jovens e senis (Figs. 2A, 2B e 3; Tabela 1). O VEGF caracterizou-se por intensa reatividade no epitélio e no estroma, com níveis protéicos de 248,9%, os quais foram similares aos do grupo EST (Figs. 2C e 3; Tabela 1). Reatividades fracas no epitélio e no estroma foram verificadas para a endostatina, caracterizando significativa redução dos níveis dessa molécula em comparação com os grupos JOV e SEN (Figs. 2D e 3; Tabela 1).

Grupo Castrado-Testosterona (CT)

Intensa reatividade para o IGFR-1 foi verificada, tanto no epitélio como no estroma, com níveis protéicos de 211,9%, os quais foram significativamente aumentados em relação aos grupos JOV e SEN (Figs. 2E e 3; Tabela 1). A MMP-9 apresentou reatividade epitelial moderada e estromal fraca, já o VEGF caracterizou moderada imunolocalização tanto no epitélio como no estroma (Figs. 2F, 2G; Tabela 1). Os respectivos níveis protéicos para essas moléculas foram de 109,8% e 125,7%, sendo estes estatisticamente superiores aos dos animais jovens e senis, porém similares a TEST (Fig. 3). Intensa reatividade epitelial e moderada reatividade estromal para endostatina foram observadas, com níveis protéicos de 138,6%, similares aos dos grupos JOV e TEST (Figs. 2H e 3; Tabela 1).

Grupo Castrado-Estrógeno (CE)

Intensa reatividade de IGFR-1 foi observada tanto no epitélio como no estroma prostático, com níveis protéicos de 221,9%, caracterizando significativo aumento em relação aos animais jovens e senis bem como similaridade estatística com o grupo CT (Figs. 2I e 3; Tabela 1). Reatividade epitelial intensa e estromal moderada foram observadas para a MMP-9 e para o VEGF, sendo que este demonstrou imunolocalização no ápice das células epiteliais (Figs. 2J e 2K; Tabela 1). Níveis protéicos de 190,5% e 322,6% foram verificados para essas moléculas, respectivamente, sendo estes significativamente aumentados em relação aos demais grupos (Fig. 3). A reatividade da endostatina foi fraca no epitélio e moderada no estroma prostático, sendo os níveis protéicos de 69,1% menores em relação aos grupos JOV e SEN e similares a CAS (Figs. 2L e 3; Tabela 1).

7.5.D

Os presentes resultados demonstraram aumento dos níveis protéicos de IGFR-1 e MMP-9 nos animais submetidos à reposição hormonal e nos castrados em relação aos jovens e senis, os quais apresentaram fraca reatividade para as duas moléculas. O IGFR-1 demonstrou intensificação da reatividade tanto no epitélio como no estroma glandular, em especial nos grupos CT e CE, nos quais os maiores níveis protéicos desse fator de crescimento foram caracterizados. Por outro lado, a MMP-9 apresentou imunolocalização intensa principalmente no compartimento epitelial, sendo os maiores níveis protéicos verificados nos grupos tratados com estradiol. O VEGF e a endostatina apresentaram reatividade inversa entre si na senescência, com aumento dos níveis protéicos de VEGF e diminuição da endostatina nos animais senis em relação aos jovens. Além disso, após a terapia hormonal e a castração, verificou-se aumento dos níveis protéicos de VEGF, especialmente nos grupos EST, CAS e CE. Em oposição, a endostatina demonstrou-se elevada principalmente nos grupos TEST e CT.

Wang & Wong (1998) verificaram fraca reatividade de IGFR-1 no ápice das células epiteliais na próstata de ratos controles. Segundo os autores, a reatividade de IGF-1 e de seu receptor mostrou-se aumentada no epitélio prostático após administração de testosterona e estradiol, indicando a atuação autócrina desse fator de crescimento sobre o epitélio e sua provável associação com a emergência das lesões glandulares observadas após a terapia hormonal (Wang & Wong, 1998). Posteriormente, outros estudos demonstraram que tanto andrógenos como estrógenos, isoladamente, são capazes de supra-regular a expressão de IGFR-1 em linhagens celulares de câncer prostático (Plymate et al., 2004; Pandini et al., 2009). Assim, o estímulo hormonal resultou em elevação dos efeitos biológicos do IGF-1 sobre células epiteliais prostáticas, com provável aceleração da progressão tumoral para um fenótipo andrógeno-independente (Wu et al., 2006; Pandini et al., 2009). A existência de intercâmbio de sinalização entre as vias de atuação do IGFR-1 e do receptor androgênico (AR) é sugerida na literatura, na qual o IGF-1 poderia induzir a trans-ativação e a translocação do AR para o núcleo, iniciando sua sinalização mesmo na ausência de andrógenos. Desse modo, ocorreria a criação de um ambiente propício para a progressão do câncer com independência hormonal (Gennigens et al., 2006; Wu et al., 2006). Segundo Ohlson et al. (2006), os andrógenos estimularam a síntese de IGF-1 na próstata ventral de camundongos, sobretudo no estroma, sendo que a castração reduziu

não apenas a secreção de IGF-1 pelas células estromais, mas também a resposta glandular aos sinais biológicos gerados por esse fator de crescimento. Também, os autores demonstraram que a castração induziu discreto aumento da reatividade epitelial de IGFR-1, resultado semelhante ao do presente estudo (Ohlson et al., 2006).

Os IGFs circulam associados a proteínas específicas (IGFBPs), as quais se ligam a eles com alta afinidade e apresentam múltiplas funções essenciais para a regulação das atividades biológicas desses fatores de crescimento, como transporte, proteção contra degradação e regulação de sua interação com o IGFR-1. Dentre essas proteínas ligantes, a IGFBP-3 possui a maior capacidade carreadora e afinidade pelo IGF-1 (Gennigens et al., 2006; Meinbach & Lokeshwar, 2006). Nas neoplasias prostáticas, a disponibilidade de IGF- 1 para interação com o receptor está aumentada devido à maior taxa de clivagem das IGFBPs, considerando os níveis aumentados das proteases dessas moléculas no microambiente tumoral, como o antígeno específico da próstata (PSA) e principalmente as MMPs (Pollak et al., 2004; Gennigens et al., 2006; Sprenger et al., 2008). Ainda, é conhecido que o próprio IGF-1 pode supra-regular a expressão das MMPs, demonstrando que o aumento da biodisponibilidade desse fator de crescimento acelera a progressão tumoral não somente através de suas ações proliferativas, mas também aumentando a degradação da matriz e conseqüentemente o potencial invasivo dos tumores (Lynch & Matrisian, 2002). Saikali et al. (2008) verificaram que o IGF-1, através da interação com seu receptor, é um importante regulador do potencial invasivo de células tumorais prostáticas, dada sua capacidade de modulação da atividade das MMPs 2 e 9.

De acordo com Sprenger et al. (2008), as MMPs apresentaram atividade elevada na senescência, a qual foi atribuída à perda dos mecanismos de regulação das mesmas, divergindo dos resultados do presente estudo. Também, diversos estudos demonstraram que os hormônios sexuais esteróides desempenharam importante papel na alteração dos níveis de expressão das MMPs na próstata (Li et al., 2001; Kanagaraj et al., 2007). Li et al. (2001) verificaram que o tratamento prolongado com andrógenos e estrógenos resultou em aumento da reatividade e da atividade proteolítica das MMPs 2 e 9 nos diferentes lobos prostáticos (Li et al., 2001). Tais autores identificaram intensa reatividade das MMPs, principalmente no estroma adjacente a regiões de neoplasia epitelial induzida pelo tratamento hormonal, sugerindo o envolvimento destas enzimas no processo de invasão tumoral em direção ao estroma (Li et al., 2001). Já Kanagaraj et al. (2007) verificaram redução dos níveis protéicos e da atividade das MMPs 2 e 9 em células tumorais

prostáticas submetidas ao tratamento com estrógeno. Ainda, sabe-se que os efeitos da manipulação androgênica sobre as MMPs na próstata são controversos, registrando-se aumento dos níveis de transcrição, da imunolocalização e da atividade destas enzimas tanto frente à ablação androgênica como após reposição de testosterona (Wilson et al., 1991;Limaye et al., 2008;Delella et al., 2010; Justulin et al., 2010).

A influência das MMPs na propagação de tumores resulta tanto de mecanismos diretos quanto indiretos. Os efeitos diretos ocorrem por meio da degradação da matriz, gerando um ambiente mais permissivo para a migração celular e invasão, sendo que a inibição da expressão da MMP-9 levou ao decréscimo do potencial invasivo, da angiogênese e da progressão tumoral em enxertos de câncer prostático (London et al., 2003; Sprenger et al., 2008). Já os efeitos indiretos das MMPs incluem a ativação de outras pró-MMPs, a clivagem de precursores de moléculas reguladoras na superfície celular e a ativação enzimática de quimiocinas, fatores de crescimento e angiogênicos recém- sintetizados (Sprenger et al., 2008). Mañes et al. (1999) apontaram a existência de uma interação molecular entre a MMP-9 e a sinalização dos IGFs no câncer de próstata, demonstrando que a clivagem de IGFBP-3 por ação da MMP-9 constitui um importante mecanismo regulador do crescimento de tumores prostáticos. Ainda, diversos estudos destacaram o envolvimento da MMP-9 na angiogênese tumoral, podendo esta enzima exercer efeitos protetores, através da clivagem de elementos da matriz com geração de moléculas inibidoras, como a endostatina; bem como efeitos pró-angiogênicos, por meio da solubilização do VEGF a partir de um reservatório extracelular (Bergers et al., 2000; Nilsson & Dabrosin, 2006; Bendrik et al., 2010).

O VEGF na próstata é secretado por células epiteliais e musculares lisas, sendo que vários estudos demonstraram fraca reatividade desse fator angiogênico sob condições normais (Wang & Wong, 1998; Mazzucchelli et al., 2000; Doll et al., 2001; Richard et al., 2002). Richard et al. (2002) observaram que a secreção de VEGF pelas células epiteliais prostáticas ocorre especialmente na região apical em direção ao lúmen glandular, tornando- o indisponível para os vasos sanguíneos estromais e sugerindo que o principal estímulo angiogênico na próstata provém das células musculares lisas. Ainda, segundo Rivard et al. (1999), a senescência comprometeu a habilidade das células produzirem fatores pró- angiogênicos, como o VEGF. Entretanto, Coppé et al. (2006) verificaram em cultura celular que fibroblastos senescentes expressavam maiores níveis dessa molécula, conferindo a essas células maior capacidade de estimular a vascularização e o crescimento tumoral in

vivo. Assim, embora a senescência esteja associada à redução nos níveis corpóreos de VEGF, a expressão desse fator pode aumentar no microambiente de órgãos como a próstata, assim como nos presentes resultados, em razão do acúmulo de células senescentes (Sprenger et al., 2008).

Diferentes autores identificaram que o tratamento com DHT estimulou a expressão de VEGF em fibroblastos da próstata fetal in vitro e que a reposição de testosterona em ratos castrados induziu a síntese desse fator angiogênico no epitélio prostático, indicando a regulação dessa molécula por andrógenos (Levine et al., 1998; Haggström et al., 1999). Ainda, é possível que tal regulação ocorra indiretamente através dos efeitos androgênicos sobre outros fatores de crescimento, como o IGF-1, o qual já se demonstrou capaz de supra-regular a expressão de VEGF em diferentes tipos celulares (Warren et al., 1996; Levine et al., 1998; Miele et al., 2000). Analogamente, estudos em tecido mamário normal e neoplásico indicaram que os estrógenos também são capazes de regular positivamente os níveis de VEGF, atuando não apenas sobre a transcrição gênica, mas também aumentando a biodisponibilidade dessa molécula no microambiente glandular (Nakamura et al., 1996; Nakamura et al., 1999; Dabrosin et al., 2003; Garvin et al., 2005).

Na próstata de roedores, a administração combinada de testosterona e estradiol levou à intensificação da reatividade do VEGF nas lesões prostáticas progressivas induzidas pelo tratamento hormonal, incluindo o câncer, principalmente no epitélio secretor e no músculo liso da parede vascular (Wang & Wong, 1998). Desse modo, em lesões prostáticas pré-malignas, o VEGF produzido pelo epitélio e pelo músculo liso dos vasos sanguíneos atuaria de forma parácrina sobre as células endoteliais, positivas para o seu receptor, estimulando a angiogênese necessária para a progressão em direção ao carcinoma prostático (Wang & Wong, 1998). Ainda, aumento da reatividade do VEGF foi observado na hiperplasia benigna, na NIP de alto grau e no câncer, tanto nas células tumorais como no estroma (Ferrer et al., 1997; Jackson et al., 1997; Mazzucchelli et al., 2000; Doll et al., 2001).

Em concordância com a regulação da expressão de VEGF por andrógenos, a castração foi capaz de promover redução significativa dos níveis desse fator na próstata normal e em enxertos de tumores andrógeno-dependentes, sendo que neste caso também levou ao decréscimo do volume tumoral, apontando a redução do VEGF como um dos mecanismos pelo qual a castração pode induzir apoptose (Joseph et al., 1997; Haggström et al., 1998). Por outro lado, Burchardt et al. (2000) verificaram padrão de resposta bifásico

dessa molécula frente à ablação androgênica, caracterizado por diminuição da expressão de VEGF somente no segundo dia subseqüente à castração, com retorno a níveis similares ou mesmo superiores aos controles no terceiro dia. Tais resultados foram concordantes com os do presente estudo, no qual se caracterizou elevação do VEGF após a castração. Segundo os autores, que também utilizaram ratos Sprague-Dawley, as diferenças observadas em relação a estudos anteriores poderiam ser atribuídas à variação genética entre linhagens de roedores distintas (Burchardt et al., 2000). Ainda, foi concluído que a redução da expressão de VEGF após a castração foi tardia, indicando não ser este o único responsável pelas drásticas mudanças degenerativas no sistema vascular prostático nesse período. Por outro lado, o aumento subseqüente nos níveis de VEGF poderia ser considerado uma resposta ao microambiente de hipóxia gerado por essas alterações vasculares (Burchardt et al. 2000).

Estudos abordando os efeitos da senescência sobre a expressão de moléculas anti- angiogênicas, como a endostatina, são escassos na literatura especializada. Isayeva et al. (2009) verificaram a existência de um intercâmbio entre as sinalizações envolvendo o AR e a endostatina, demonstrando que células com elevada expressão de AR foram mais sensíveis aos efeitos anti-tumorais da endostatina do que células andrógeno- independentes. Também, estudos realizados em tumores de mama e ovário demonstraram que o tamoxifeno, uma droga anti-estrogênica, levou ao aumento dos níveis de endostatina, com conseqüente redução da vascularização e crescimento tumorais, sendo que a administração isolada de estradiol teve efeitos opostos (Nilsson & Dabrosin, 2006; Bendrik et al., 2010). Ainda, estes autores verificaram que o aumento na geração de endostatina foi decorrente de maiores níveis de expressão e atividade das MMPs 2 e 9, apontando papel anti-angiogênico dessas enzimas mediante o bloqueio de vias estrogênicas no microambiente tumoral (Nilsson & Dabrosin, 2006; Bendrik et al., 2010).

Os presentes resultados demonstraram aumento do IGFR-1 e da MMP-9, bem como distribuição diferencial dessas moléculas no compartimento epitelial prostático, frente à reposição de hormônios esteróides e a depleção androgênica imposta pela castração na senescência, podendo-se concluir que o desequilíbrio do balanço hormonal entre andrógenos e estrógenos, e não somente a presença de um ou outro hormônio, resultou em perturbação da dinâmica molecular prostática. Ainda, verificou-se aumento de VEGF na senescência, com desequilíbrio entre esse fator pró-angiogênico e a endostatina, a qual apresentou diminuição de seus níveis, indicando um microambiente prostático favorável à

neovascularização. A terapia hormonal não levou à reversão dos níveis aumentados de VEGF caracterizados na senescência, sugerindo a desordem do equilíbrio molecular glandular, caracterizada pelo aumento de IGFR-1 e MMP-9, como possível fator potencializador dessa molécula pró-angiogênica. Também, foi possível concluir que vias ativadas por estrógenos sinalizaram positivamente a reatividade do VEGF. Por outro lado, a endostatina foi mais responsiva à reposição de testosterona, apontando sua sensibilidade à ação desse hormônio e a possível geração dessa molécula por ação anti-angiogênica da MMP-9 na presença de andrógenos, considerando que esta enzima também estava aumentada no tecido prostático. Assim, pode-se concluir que a terapia hormonal na senescência criou microambiente reativo caracterizado por aumento de um fator mitogênico e da remodelação tecidual bem como por desequilíbrio da angiogênese prostática, com ocorrência de fatores pró e anti-angiogênicos. Tais alterações certamente refletem a perturbação das sinalizações parácrinas da próstata, sugerindo o comprometimento da função do órgão e predispondo-o a desordens glandulares. Ainda, é possível sugerir que a regulação da angiogênese na próstata é um fenômeno complexo, no qual o balanço relativo entre andrógenos e estrógenos deve ser considerado, assim como os níveis de moléculas capazes de interferir na dinâmica do órgão, como o IGFR-1 e a MMP-9.