DAS UTOPIAS
Se as coisas são inatingíveis... ora!
Não é motivo para não querê-las...
Que tristes os caminhos, se não fora
A presença distante das estrelas!
Dedico:
AGRADECIMENTOS
Em especial à minha mãe, Terezinha, pelo amor, incentivo e confiança, agradeço principalmente por ter feito que eu acreditasse que era possível. E foi.
À minha irmã, Thayse, aos meus tios, tias, primos e primas e à minha avó, Iracema, pelo carinho e presença constantes.
Ao Lucas e aos seus ouvidos, pelo amor e paciência, que sem reclamar suportaram esses anos de “causos” sobre colunas, proteínas, células e efeitos...
Aos Antônios da minha vida (meu pai e meu avô Toninho), à avó FAB e ao avô Procópio, que se foram sem ver esse momento, mas estão em meu coração.
Aos amigos-estrela, porque posso ver suas luzes, ainda que distantes: Marina, Elias, Dani, Daniel, Fábio e Evelyn.
Aos amigos do CAGB, por rodarem comigo pelas estradas da vida: Codorna, Danilo, Mariana, Didi, Simba, Lucas S/N, Erick e Tezoto.
Aos amigos do laboratório, pelos momentos de alegrias, idéias e soluções: Fernanda, Rebeca, Ana Lopes, Ana Teles, Rogério, Robert, Luciano, Cátia, Luiz, Camila, Maila, Mayara, Gabriel, Stephanie, Carol Francelin e Danilo.
Aos técnicos e biólogos: Stella M. Degrossoli, Sandra S. Martins, Juvani e Shirlei (Fort Dodge), porque sem o trabalho deles o meu trabalho não seria possível.
Aos professores: Profª Dra. Maria Silvia V. Gatti, Prof. Dr. Domingos da Silva Leite, Prof. Dr. Áureo T. Yamada, Prof. Dr. Hernandes Faustino de Carvalho, Prof. Dr. Paulo Joazeiro, Profª. Dra Leonilda M. B. dos Santos e Profª Dra. Liana Verinaud, pela abertura das portas de seus laboratórios em todos os momentos de dificuldades e alegrias.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Tomomasa Yano, pela oportunidade e confiança: arigatô! À Fort Dodge pela doação das culturas de células FEG.
À UNICAMP por ter sido minha segunda casa durante todos esses anos e à CAPES pelo suporte financeiro.
RESUMO
Escherichia coli isoladas de lesões de celulite aviária em frangos de corte produzem uma
citotoxina que causa intensa vacuolização citoplasmática em células de origem aviária, mas não em células de mamíferos. Esta citotoxina foi denominada Vat (vacuolating autotransporter toxin) e apresenta massa molecular de 56 kDa e ponto isoelétrico de 6,37. Estudos preliminares comprovaram que a Vat induz, em frangos de corte, respostas inflamatórias liberando as citocinas TNF-α e IL-10, indicando o seu papel relevante no desenvolvimento da celulite aviária. A dose citotóxica para 50% das células foi determinada em 40 µg.mL-1. A Vat aplicada sobre cultura de células FEG (fibroblasto de embrião de galinha) induz perda da viabilidade em 50% células após 18 horas de ensaio. Ensaios com a toxina indicam que, após 24 horas, os lisossomos mostram-se bastante comprometidos (37% viáveis), a viabilidade mitocondrial decresce e se mantém durante as 24 horas do ensaio em cerca de 55%, havendo uma redução acentuada das mitocôndrias viáveis após 36 horas da aplicação da Vat. A membrana plasmática das células FEG também sofre alterações de integridade, liberando 66,7 unidades de LDH (lactato desidrogenase)/mL, após 12 horas de ensaio (pico máximo de liberação, que corresponde a 51,7% do conteúdo total de LDH em células FEG). A Vat induz alterações no citoesqueleto das células FEG e os ensaios com o marcador fluorescente Acridine Orange indicam que há um aumento de RNA no citoplasma das células. Neste trabalho o gene vat foi detectado em amostras de APEC (filogrupos A e B1), UPEC e SEPEC (ambas em filogrupos B2 e D). Todas as amostras positivas para vat foram examinadas em células, sendo que 54% (27/50) apresentaram atividade vacuolizante em células FEG. Nossos resultados indicam que a Vat é uma toxina que induz diversas ações intracelulares, podendo ser chamada de toxina multifuncional.
ABSTRACT
Escherichia coli isolated from avian cellulitis lesions in broilers produce a cytotoxin that causes
intense vacuolation in avian cells, but not in mammals cells. This cytotoxin, called Vat (vacuolating autotransporter toxin), has a 56 kDa protein and has a isoeletric point of 6.37. Preliminary studies have shown the Vat induce inflammatory response in broilers, by releasing cytokines TNF-α and IL-10, what indicates it can act in the avian cellulitis development. The cytotoxic dose for 50% of the cells was fixed at 40 μg.mL-1. The tests using CEF (chicken embryo fibroblasts) cells indicate Vat leads to cell viability loss in 50% of the cells after 18 hours. The tests with the toxin indicate that after 24 hours the lysosomes are 37% viable, the mitochondrial viability decreases after 24 hours (about 55%), with a remarkable reduction of viable mitochondria after 36 hours of Vat application. The CEF cells’ plasma membrane of also loses integrity, releasing 66.7 units LDH (lactato dehydrogenase)/mL, after 12 hours of test (which is 51.7% of the total LDH content in CEF cells). The CEF cells’ cytoskeleton also changed when exposed to Vat. Essays involving the fluorescent dye Acridine Orange indicate a RNA increase in the cytoplasm of cells. In this work the vat gene was detected in samples of APEC (A and B1 philogroups), UPEC and SEPEC (B2 and D philogroups). All vat positive samples have been tested for Vat in cells, and 54% (27/50) of them have shown vacuolizing activity in CEF cells. The results indicate Vat is a toxin which induces various intracellular actions, therefore it can be called a multifunctional toxin.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Passos para focalização das fitas IPG de 13 cm. Pg. 15
TABELA 2. Soluções para eletroforese bidimensional. Pg. 15
TABELA 3. Sequência dos iniciadores do gene vat Pg. 23
TABELA 4. Sequência dos iniciadores para filogenia Pg. 24
LISTA DE FIGURAS
Fig. 1 Esquema de Clermont et al. (2000) para determinação dos grupos filogenéticos
de E. coli. Pg. 23
Fig. 2 Perfil de eluição da coluna HiTrap Phenyl (low sub) FF em FPLC. Pg. 26
Fig. 3 Perfil de eluição da coluna Superdex 75 HR 10/30 em FPLC. Pg. 27
Fig. 4 SDS-PAGE corado com prata. Pg. 28
Fig. 5 Ensaio citotóxico em células FEG. Pg. 30
Fig. 6 Curva de viabilidade celular obtida através do ensaio com Vermelho Neutro. Pg. 31
Fig. 7 Cinética da viabilidade celular em células FEG tratadas com Vat. Pg. 32
Fig. 8 Cinética da viabilidade mitocondrial em células FEG tratadas com Vat. Pg. 33
Fig. 9 Cinética da atividade da enzima LDH. Pg. 34
Fig. 10 Células FEG tratadas com Vat em diferentes intervalos de tempo e marcadas
com AO. Pg. 35
Fig. 11 Alterações no citoesqueleto das células FEG. Pg. 37
Fig. 12 Análise de células FEG por citometria de fluxo. Pg. 38
Fig. 13 Distribuição filogenética das amostras de APEC, UPEC e SEPEC vat+ entre
LISTA DE ABREVIATURAS
AO – Laranja de Acridina (Acridine Orange)
APEC – E. coli patogênica aviária (avian pathogenic E. coli) bp - pares de base (base pair)
CD50 - dose citotóxica de 50%
CER – Chicken embryo related
CHAPS - 3[(3-colamidopropil) dimetilamonio]-ácido propanosulfonico
CO2 - dióxido de carbono
DNA - ácido desoxirribunocleico DTT – ditiotreitol
EAEC – E. coli enteroagregativa (enteroaggregative E. coli) ECVF - E. coli vacuolating factor
ExPEC – E. coli patogênica extraintestinal (extraintestinal pathogenic E. coli) FEG - fibroblasto de embrião de galinha
FITC - isotiocianato de fluoresceína
FPLC - fast protein liquid chromatography HC - Hospital de Clínicas
HCl - ácido clorídrico
HeLa - célula de carcinoma cervical humano HEp-2 - célula de carcinoma de laringe humana
IB - Instituto de Biologia IL-10 - interleucina 10
IPG - isoelectric point gradient LB - meio Luria-Bertani
LDH - lactato desidrogenase MEM - meio mínimo de Eagle
MTT - brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2)-2,5 difeniltetrazólio NaCl - cloreto de sódio
NADH - nicotiamida adenina dinucleotídeo
NMEC – E. coli causadora de meningite neonatal (newborn meningits-causing by E.
coli)
NR - vermelho neutro (Neutral red) ON – overnight
PAGE - eletroforese em gel de poliacrilamida (polyacrylamide gel electrophoresis) PAI – ilha de patogenicidade (pathogenic island)
PBS - tampão salina-fosfato
PCR - reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction) Pet - Plasmid-enconded toxin
pH - potencial hidrogênionico PI - iodeto de propídeo
pI - ponto isoelétrico
SDS – sódio dodecil sulfato
SEPEC – E. coli associada à sepse (sepsis E. coli)
SPATE - Serine protease autotransporter of the Enterobacteriaceae TNF-α - fator de necrose tumoral alfa
UNICAMP - Universidade Estadual de Campinas UPEC – E. coli uropatogênica (uropathogenic E. coli) VacA - toxina vacuolizante de Helicobacter pylori Vat - Vacuolating autotransporter toxin
VCF - Vacuolating cytotoxin factor
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 1
1.1 Escherichia coli 2
1.2 Celulite aviária 3
1.3 Vat (vacuolating autotransporter toxin) 4
1.3.1 Vacúolos 5 1.4 Morte celular 6 2. OBJETIVOS 8 2.1 Objetivos gerais 9 2.2 Objetivos específicos 9 3. MATERIAL E MÉTODOS 10 3.1 Amostras bacterianas 11
3.2 Produção e purificação da Vat 11
3.2.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS 13 3.2.2 Eletroforese bidimensional (2D-PAGE) 14
3.2.2.1 Focalização isoelétrica 14
3.2.2.2 SDS-PAGE (segunda dimensão) 16
3.2.3 Dosagem de proteínas 16
3.3 Cultura celular e teste de citotoxicidade 17
3.4 Atividades intracelulares da Vat 18
3.4.1 Determinação da CD50 (dose citotóxica 50%) 18
3.4.2 Viabilidade celular pela incorporação do NR pelos lisossomos 18 3.4.3 Viabilidade celular pela redução do MTT à formazana 19 3.4.4 Liberação da Lactato desidrogenase (LDH) 19
3.4.5 Marcação com Acridine orange (AO) 20
3.4.6 Detecção de alterações no citoesqueleto 21
3.5 Detecção do gene vat 22
3.5.1 Amostras e extração do DNA 22
3.5.2 Reação de amplificação 23
4. RESULTADOS 25
4.1 Purificação da Vat 26
4.1.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS 28 4.1.2 Eletroforese bidimensional (2D-PAGE) 29
4.2 Teste de citotoxicidade em células FEG 29
4.3 Atividades intracelulares da Vat 31
4.3.1 Determinação da CD50 (dose citotóxica 50%) 31
4.3.2 Viabilidade celular pela incorporação do NR pelos lisossomos 32 4.3.3 Viabilidade celular pela redução do MTT à formazana 33 4.3.4 Liberação da Lactato desidrogenase (LDH) 34
4.3.5 Marcação com Acridine orange (AO) 35
4.3.6 Detecção de alterações no citoesqueleto 36
4.3.7 Detecção de apoptose 38
4.4 Detecção do gene vat 39
5. DISCUSSÃO 40
6. CONCLUSÕES 46
1.1 Escherichia coli
Escherichia coli é um bacilo Gram-negativo, anaeróbico facultativo e membro da família
Enterobacteriaceae. A maioria desses bacilos não são patogênicos e fazem parte da microbiota normal de humanos, outros mamíferos e aves. As linhagens de E. coli patogênicas podem causar infecções intestinais e extra-intestinais em animais e no homem.
As linhagens relacionadas às infecções extra-intestinais são denominadas ExPEC (extraintestinal pathogenic E. coli). Elas causam diversas doenças em humanos, como sepse (Ananinas & Yano, 2008), meningite em recém-nascidos (Headings & Overral, 1977) e infecções do trato urinário (Rodriguez-Siek et al., 2006). As ExPEC também causam infecções em outros animais, e quando agem causando doenças em aves, são denominadas APEC (avian pathogenic
E. coli).
As APEC podem causar doenças em ovos embrionados até aves adultas. Infecções no saco da gema são observadas no período final de incubação do ovo e levam à morte do embrião e de aves com até duas semanas de idade (Campos et al., 2005). APEC podem atuar também como agentes infecciosos secundários quando a ave está debilitada e apresenta infecções iniciais por outros patógenos (como vírus de Newcastle, vírus da bronquite infecciosa e Mycoplasma
gallisepticum). As E. coli podem se instalar na cavidade abdominal e causar peritonites e
pericardites ou ainda levar a um quadro de sepse aguda. Aves de postura podem ser acometidas por salpingite, uma infecção do oviduto que causa perda de capacidade de postura de ovos. Em frangos de corte, infecções por APEC são responsáveis por doenças como a Síndrome da cabeça inchada e celulite aviária. (Dho-Moulin & Fairbrother, 1999).
1.2 Celulite aviária
Celulite refere-se a um processo inflamatório do tecido subcutâneo, tipicamente observada na região abdominal e na coxa de aves e mamíferos. Esta enfermidade foi descrita pela primeira vez em aves por Randall et al., (1984) na Inglaterra e consiste em uma das maiores causas de perda econômica para a avicultura mundial (Fallavena et al., 2000). Este problema só é detectado na inspeção, durante o abate, e ocorre mesmo em aves provenientes de lotes com bom desempenho. A manifestação dessa afecção está relacionada a múltiplos fatores, que incluem condições de produção, tais como: nutrição, manejo e saúde (Norton et al., 1997). A E. coli tem sido o microrganismo mais comumente associado à celulite (Brito & Vidotto, 2003), entretanto, outros patógenos podem estar associados à manifestação das lesões (Norton & Hess, 1999).
Em países com altas taxas de produção de carne de frango, essa afecção é responsável por aproximadamente 30% dos descartes (Brito & Tagliari, 2007). No Brasil, a celulite é causa crescente de condenação de carcaças. Numa estimativa do governo brasileiro, dos 3,63 bilhões de frangos abatidos em 2002, 0,9% foram condenados (total ou parcialmente), sendo 30% desses devido à celulite. De acordo com Brito et al. (2002), as perdas brasileiras devido à celulite aviária ultrapassam a soma de 10 milhões de dólares anuais.
O papel da E. coli na celulite tem sido investigado em detalhes. Estudos demonstram que a infecção por E. coli leva à produção de lesões de celulite em frangos de corte sadios (Norton et al, 1997). Entretanto, os fatores de virulência da E. coli que causariam a celulite ainda não são conhecidos. Segundo Ewers et al., (2004) vários fatores de virulência podem ser associados às
doenças extra-intestinais de aves, tais como: adesinas, sistemas de aquisição de ferro (como aerobactinas), hemolisinas, produção de cápsula de polissacarídeos e secreção de toxinas.
1.3 Vat (vacuolating autotransporter toxin)
Salvadori et al. (2001) descreveram que E. coli isoladas de lesões de celulite aviária produzem uma citotoxina que causa intensa vacuolização citoplasmática em células de origem aviária, mas não em células de linhagens mamíferas. Esta citotoxina foi inicialmente denominada de ECVF (E. coli vacuolating factor) mas, em estudo molecular posterior, Parreira & Gyles (2003) observaram que numa ilha de patogenicidade (PAI) de APEC é codificada uma proteína autotransportadora que induz formação dos vacúolos intracelulares, e a denominaram Vat. A Vat é exportada para o meio extracelular através do mecanismo de autotransporte, também denominado sistema de secreção tipo V. Esse mecanismo é capaz de direcionar a secreção da proteína através da membrana externa da bactéria. A proteína precursora é formada por 3 domínios: um pepitídeo sinal N-terminal, um domínio passageiro (efetor) e um domínio C-terminal. Durante a translocação, os domínios N-terminal e C-terminal são clivados, sendo o domínio passageiro quem irá atuar sobre a célula alvo (Henderson et al., 1998; Kostakioti & Stathopoulos, 2004; Jain et al., 2006; Maroncle et al., 2006 e Restieri et al., 2007).
A Vat é classificada como uma serino protease autotransportadora de Enterobacteriaceae (SPATE), uma subfamíla de proteínas autotransportadoras (Parham et al., 2005), que são caracterizadas pelo motivo GDSGS, localizado em seus domínios passageiros (Dutta et al., 2002 e Kostakioti & Stathopoulos, 2004).
A citotoxina Vat foi purificada (Salvadori, 2003) anteriormente, sua massa molecular foi estimada em aproximadamente 60 kDa e caracterizada como termo-lábil. Quando inoculada em frangos de corte, a Vat purificada estimulou a produção de citocinas pró-inflamatórias, TNF-α, e anti-inflamatória IL-10 (Salvadori, 2003). O tempo de curso de liberação do TNF-α em frangos foi similar ao requerido para o desenvolvimento das lesões de celulite em aves inoculadas com E.
coli, em modelos experimentais do processo inflamatório (Gomis et al, 1997; Norton et al, 1997;
Peighambari et al, 1995). Esses resultados sugerem que a Vat pode desempenhar um papel relevante no desenvolvimento da celulite, assim como a VacA produzida pela Helycobacter
pylori tem um papel significante na patogenia da inflamação gástrica (Salama et al., 2001). No
entanto, em amostras de E. coli produtoras de Vat, não foi detectado o gene responsável pela codificação de VacA, portanto a vacuolização citoplasmática induzida por Vat é diferente da induzida por VacA.
1.3.1 Vacúolos intracelulares
A Vat e outras toxinas bacterianas induzem a formação de vacúolos em cultura de células. É possível associar um efeito biológico (vacuolização) com a patogenicidade (Ludovico, 2008), visto que a quantidade e o tamanho dos vacúolos formados não estão de acordo com as condições de homeostase.
Os vacúolos são estruturas citoplasmáticas com tamanhos variados e revestidos por membrana, formados a partir do retículo endoplasmático ou do complexo de Golgi. Nas células animais de organismos unicelulares são encontrados vacúolos contráteis com a função específica
de manter o equilíbrio osmótico. Os vacúolos das células vegetais são bem maiores, ocupam um grande volume e geralmente estão associados a três funções principais: armazenamento de substâncias, controle da pressão osmótica e degradação. Vacúolos de células vegetais e de fungos apresentam várias características que permitem associá-los a lisossomos, porém são muito mais versáteis (Carvalho & Recco-Pimentel, 2001).
Células animais apresentam pequenos vacúolos distribuídos de modo preferencial pelo citoplasma, denominados lisossomos. Essas organelas são sacos membranosos que contêm várias enzimas hidrolíticas utilizadas principalmente nos processos de digestão intracelular. Em geral os lisossomos são locais de convergência de diferentes processos celulares de tráfego: as vias de saída do retículo endoplasmático e do complexo de Golgi; as vias de entrada pela endocitose e fagocitose e processos intrínsecos de degeneração celular, formando autofagossomos (Alberts et
al., 1997).
A intensa vacuolização nas células é vista como uma alteração dos processos de tráfego interno e por isso trata-se de um estado patológico, que precisa ser investigado.
1.4 Morte celular
As células de todos os organismos vivos podem sofrer, principalmente, duas formas de morte celular: necrose ou apoptose. Morte rápida, degeneração de extensas populações celulares por aumento do citoplasma, perda de integridade da membrana com liberação do conteúdo celular e destruição de organelas são características da morte celular por necrose, processo em que há liberação de citocinas que desencadeiam o processo inflamatório, entretanto, na
apoptose, há retração celular, as organelas mantêm-se integras e há condensação e fragmentação do DNA (Ventura, 2006).
A apoptose é um modo de morte celular, programada fisiologicamente, importante para a homeostase dos tecidos. Ventura (2006) enfatiza que as alterações morfológicas na apoptose são muito importantes e são desencadeadas por caspases iniciadoras (caspase-2, 8, 9 e 10) e por caspases efetoras (caspase-3, 6 e 7). Essas caspases ativam uma série de reações, responsáveis pelas mudanças bioquímicas e morfológicas da célula em apoptose.
De acordo com Wang et al. (1999), a apoptose pode ser induzida por mecanismos intrínsecos ou extrínsecos. O mecanismo intrínseco envolve estresse celular, com degradação das mitocôndrias, levando à ativação das caspases responsáveis pelo acionamento da via apoptótica. A liberação desses fatores pró-apoptóticos do espaço intermembrana das mitocôndrias, como é o caso do citocromo c, induz a ativação das caspases iniciadoras, que ativam as caspases efetoras. A via extracelular de morte acontece por receptores de morte, como a família de proteínas do fator de necrose tumoral.
A perda de assimetria dos fosfolipídeos da membrana é um evento inicial do processo apoptótico. Independentemente do tipo celular, há exposição de resíduos de fosfatidilserina. Mudanças no núcleo, como condensação e fragmentação do DNA, ocorrem nos estágios tardios da apoptose. (Van Engeland et al., 1998).
Desse modo, a Vat (vacuolating autotransporter toxin) produzida por E. coli pode ser um importante fator de virulência envolvido na patogenia da celulite. Acreditamos que o estudo das atividades intracelulares da Vat usando o modelo de células FEG (fibroblasto de embrião de galinha) pode contribuir para elucidar o mecanismo de ação que leva ao desenvolvimento da
2.1 Objetivos gerais
Caracterizar os efeitos intracelulares induzidos pela Vat produzida por E. coli isoladas de celulite aviária, visando esclarecer o papel desta bactéria neste processo infeccioso e estudar a presença do gene vat em amostras de ExPEC (Extraintestinal pathogenic E. coli).
2.2 Objetivos específicos
Determinar a CD50 (dose citotóxica 50%) de Vat em FEG;
Determinar a viabilidade celular de FEG quando tratada com Vat; Determinar a viabilidade mitocondrial de FEG frente à ação de Vat;
Verificar a alteração da integridade da membrana celular de FEG quando exposta à Vat; Verificar alterações no citoesqueleto das células pela ação da Vat;
Verificar se Vat induz morte celular em FEG pela via apoptótica;
Verificar a presença do gene vat e a produção de toxina em E. coli patogênicas extra-intestinais de animais e humanos.
3.1 Amostras bacterianas
Escherichia coli AC53 (Peighambari et al., 1995), originalmente isolada de lesões de
celulite aviária, gentilmente cedida pelo Department of Veterinary Microbiology and Immunology, University of Guelph, Ontário, Canadá, foi utilizada para a produção e purificação da citotoxina Vat.
A prevalência do gene vat foi estudada em quarenta e quatro (44) amostras de E. coli isoladas de lesões de celulite aviária, gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Domingos da Silva Leite, Departamento de Microbiologia e Imunologia, IB, Unicamp; quarenta e uma (41) amostras de UPEC isoladas de pacientes com Cistite e quarenta e cinco (45) amostras de SEPEC, isoladas de pacientes do Hospital de Clínicas (HC) da Unicamp, que foram à óbito devido ao quadro de sepse (Ananias & Yano, 2008).
3.2 Produção e purificação da Vat
A produção da Vat seguiu a metodologia descrita por Salvadori (2003). Foram semeados pré-cultivos em tubos de 5 mL de meio LB, por 6 horas a 37ºC sob agitação, em seguida 200 µL da cultura bacteriana foram adicionados a erlenmeyers contendo 500 mL do meio LB, pH 7,4. As culturas foram incubadas por 18 horas, sob agitação a 37ºC. Em seguida a cultura bacteriana foi centrifugada a 10000 rpm durante 20 min (Centrífuga Beckham, rotor JA14) a 4ºC. O sulfato de amônio [(NH4)2SO4] (Merck) foi adicionado ao sobrenadante de cultura bacteriana para 50%
(Centrífuga Beckham, rotor JA14) e dispensado. O sobrenadante resultante foi saturado para 60% de (NH4)2SO4 (Merck) e a etapa de centrifugação foi repetida. O precipitado (50-60% de
sulfato de amônio) foi ressuspendido em tampão Tris-HCl 0,06 M pH 7,4 e dialisado contra o mesmo tampão.
A esse material foi adicionado 1M de (NH4)2SO4 (Merck) e então 1 mL do material com
o sal foi submetido à cromatografia de interações hidrofóbicas, utilizando-se a coluna HiTrap Phenyl Fast Flow (low sub) em FPLC (Amershan, Pharmacia). A coluna foi equilibrada em tampão Tris-HCl 0,06 M pH 7,4 com 1M de (NH4)2SO4 (Merck) e o material foi eluído em
gradiente linear inverso de 1–0 M de (NH4)2SO4 (Merck). O fluxo utilizado foi de 1,0 mL/min e
a eluição foi monitorada a 280 nm. As frações foram coletadas, dialisadas e verificadas quanto à atividade vacuolizante em cultura de células de origem aviária. Após sucessivas cromatografias, as frações com atividade vacuolizante foram coletadas, dialisadas, concentradas em liofilizador, ressuspendidas em tampão Tris-HCl 0,06 M pH 7,4 e então submetidas à 2ª etapa cromatográfica.
Este material com atividade vacuolizante foi aplicado em cromatografia de exclusão molecular, coluna Superdex 75 HR 10/30 (Pharmacia) em sistema FPLC (Amershan, Pharmacia). O fluxo utilizado foi de 0,5 mL/min e o tampão de eluição foi Tris-HCl 0,06 M pH 7,4 com 0,15 M de NaCl. As frações foram coletadas, dialisadas e examinadas quanto à sua atividade vacuolizante. Foram realizadas sucessivas cromatografias e as frações com atividade foram coletadas e reunidas para em seguida serem dialisadas, concentrados em liofilizador e ressuspendidas em tampão Tris-HCl 0,06 M pH 7,4. A toxina Vat obtida foi conservada a -20ºC até o momento do uso.
3.2.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE)
A eletroforese foi realizada segundo a metodologia proposta por Laemmli (1970), com gel de concentração a 4% e gel de resolução a 12%. As amostras e também os marcadores de massa molecular foram combinados com o tampão de amostra (v/v) (0,125 M Tris-HCl pH 6,8; 4% SDS; 20% de glicerol; 5% de 2-mercaptoetanol; 0,02% de Azul de Bromofenol). Em condições não-redutoras, foi utilizado tampão de amostra sem o 2-mercaptoetanol. A corrida foi realizada com voltagem de 80V até o corante atingir o gel de resolução, passando para 100V até o final.
O gel foi corado por impregnação de sais de prata, seguindo-se a técnica descrita por Blum et al. (1987). O gel foi imerso em solução fixadora de 50% de etanol e 12% de ácido acético glacial, por 60 min e lavado 3 vezes em etanol 50% por 20 min. Descartado o etanol, o gel foi imerso em solução de 0,02% de Na2S2O3.5H2O durante 1 min e lavado 3 vezes com água
Milli-Q®. A impregnação por prata foi realizada pela solução de 0,2% de AgNO3 e 0,075% de
formaldeído, por 20 min. com agitação moderada e posteriormente lavado 3 vezes com água Milli-Q® e revelado com solução de 6% de Na2CO3, 0,4% de Na2S2O3.5H2O e 0,05% de
formaldeído. Após a revelação das bandas de proteínas a reação foi interrompida com solução de 50% de etanol e 12% de ácido acético glacial.
3.2.2 Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE)
3.2.2.1 Focalização Isoelétrica (primeira dimensão)
A Vat purificada, obtida diretamente da cromatografia de exclusão molecular foi solubilizada na Solução C (tabela 2), seguindo as instruções do fabricante (GE-Healthcare). As fitas IPG de 13 cm com gradiente de pH 3-10 foram reidratadas no aparato para focalização isoelétrica (IPGphor3®) durante 18 horas, em temperatura ambiente, cobertas com óleo mineral para evitar a evaporação dos reagentes. A focalização isoelétrica foi realizada em diferentes passos, conforme protocolo do programa Ettam-IPGphor3® (GE Healthcare) de acordo com a tabela 1.
Após o processo de focalização as fitas foram equilibradas em Solução E + DTT por 30 min e em seguida em Solução E + iodoacetamida por mais 30 min. As soluções C e E estão descritas na tabela 2 e foram preparadas de acordo com o manual do fabricante (GE Healthcare)
TABELA 1. Passos para focalização das fitas IPG de 13 cm. Passo U [V] Tempo Vh 1 500 1h 500 2 1000 1h04 800 3 8000 2h30 11300 4 8000 21 min 2900 5* 200 19 min 1300 6* 100 ∞ 3000
* Passos adicionais para deixar as fitas focalizando O.N.
TABELA 2. Soluções para eletroforese bidimensional
Solução C
Uréia 8 M CHAPS 2% Tampão IPG 2% Sol. Azul de Bromofenol 0,002% Dissolver em H2O Milli-Q®
DTT (7mg a cada 2,5 mL – momento do uso)
Solução E Tris-HCl 50 mM pH8,8 Uréia 6 M Glicerol 30% SDS 2% Azul de bromofenol 0,002% Dissolver em H2O Milli-Q®
3.2.2.2 SDS-PAGE (segunda dimensão)
O gel foi preparado conforme descrito por Laemmli (1970) com modificações. O gel foi formulado a 12,5% de poliacrilamida e sobre ele foi colocada a fita IPG e aplicado, e uma das extremidades, o padrão de massa molecular preparado com uma solução de azul de bromofenol a 0,02%. A fita foi coberta com uma solução de agarose a 0,5%. A eletroforese ocorreu a 4ºC em duas etapas, durante os primeiros 30 min com intensidade de corrente elétrica de 15 mA e depois até o final da corrida a 45 mA. Em seguida as proteínas foram coradas por impregnação com prata (conforme descrito no item 3.1.1).
Os géis foram digitalizados (ImageScanner III, GE) e as imagens foram analisadas no software ImageMaster 2D Platinum 6.0® (GE Healthcare) para determinação do ponto isoelétrico (pI) e da massa molecular (PM).
3.2.3 Dosagem de proteínas
Neste trabalho utilizou-se a metodologia de Bradford, onde um corante, o comassie brilliant blue G-250, liga-se às proteínas. O complexo formado pode ser lido em um espectrofotômetro. Foi utilizada uma curva padrão de albumina bovina (BSA – Sigma). A curva padrão foi preparada com as seguintes concentrações pré-determinadas: 0,015mg/mL, 0,031mg/mL, 0,062mg/ml, 0,125mg/mL, 0,250mg/mL, 0,5mg/mL e 1mg/mL. Aplicou-se, em triplicatas, 10µL da albumina bovina, para determinar os pontos da curva padrão, e 10µL das amostras de toxina Vat em orifícios de uma placa de 96 poços com fundo chato. Logo após foram adicionados 200µL do comassie brilliant blue G-250 (Bio-Rad), diluído na razão de 1:4 em água destilada, de acordo com as instruções do fabricante. Após 15 minutos em temperatura
ambiente, a placa foi colocada em leitor de Elisa (Soft Max Pro, Molecular devices) e os pontos da curva e das amostras foram lidos à 595nm.
3.3 Cultura celular e teste de citotoxicidade
FEG (Fibroblastos de embrião de galinha), gentilmente cedidos pelo Fort Dodge Laboratories (Campinas, SP) foram utilizados nos testes com cultura de células. A suspensão de células (2,5 x 105mL células/mL) foi distribuída em placas de 96 ou 24 orifícios (Corning Costar), adicionando-se 0,1 ou 1 mL da suspensão celular por cavidade, respectivamente. Em seguida as placas foram incubadas à 37C e 5% de CO2 por 24 horas. Após a formação da
monocamada celular o meio de cultura das placas foi dispensado e substituído por MEM ausente de soro fetal bovino e antibiótico.
Alíquotas do material dialisado, obtido nos processos de produção e purificação da toxina foram aplicados às culturas celulares, em triplicata, para avaliar a preservação da atividade biológica da Vat. As placas foram incubadas em estufa a 37C em 5% de CO2 pelo
período de 24 horas, durante as quais procedeu-se à leitura e visualização das alterações morfológicas esperadas, com auxílio do microscópio invertido (NIKON TE300).
Amostras bacterianas positivas para o gene vat (7 APEC, 16 UPEC e 28 SEPEC) também foram examinadas quanto à atividade vacuolizante de seus sobrenadantes de cultura sobre células FEG e Vero (células epiteliais de rim de macaco verde africano). As culturas bacterianas foram preparadas de acordo com a metodologia descrita para a amostra AC53, sem os passos de saturação com sulfato de amônio e as etapas de purificação.
3.4 Atividades intracelulares da Vat
3.4.1 Determinação da CD50 (dose citotóxica 50%)
A determinação da dose citotóxica 50% foi realizada em células FEG, tratadas com concentrações pré-determinadas da Vat purificada (100, 80, 60, 40, 10 e 1 µg.mL-1). Após 18h de incubação, a dose capaz de reduzir a viabilidade celular em 50% foi obtida através da metodologia de Borenfreund & Puerner (1984), que mede a incorporação do corante Vermelho Neutro (NR) pelos lisossomos das células viáveis.
3.4.2 Viabilidade celular pela incorporação do NR pelos lisossomos
Viabilidade das células FEG tratadas com Vat (CD50) foi determinada como descrito por
Borenfreund & Puerner (1984). Após 2, 4, 7, 18 e 24h de tratamento com Vat, o meio de cultura foi removido e 0,2 mL de MEM contendo 50g de vermelho neutro foi adicionado em cada orifício. A microplaca foi incubada por mais 3h a 37°C. As células foram então lavadas em solução de formol-cálcio [formaldeído 40% (v/v), cloreto de cálcio anidro 10% (p/v)], e subsequentemente foi adicionado 0,2 mL de solução de ácido acético-etanol [1 mL de ácido acético glacial em 100 mL de etanol 50% (v/v)] em cada orifício. As microplacas foram mantidas a temperatura ambiente por 15 min e a leitura foi realizada em espectrofotômetro (Labsystems Multiskan Biochromatic) a 540 nm. A viabilidade celular foi expressa em relação à absorbância do controle positivo (sem Vat), considerado como 100%. Células tratadas com SDS
10% foram utilizadas como controle negativo. Todos os tratamentos foram realizados em triplicatas.
3.4.3 Viabilidade celular pela redução do MTT à formazana
A ação da citotoxina vacuolizante na respiração mitocondrial das células de cultura foi avaliada segundo a metodologia de Borenfreund et al. (1988). A toxina Vat foi inoculada em células FEG na concentração de 40µg.mL-1 (CD50), em intervalos de tempo de 2, 4, 6, 12, 24,
36 e 48h. O meio de cultura foi descartado e o MTT (sal de tetrazólio) foi adcionado à concentração final de 0,8 mg.mL-1, e incubado por 3h a 37C. A solução de MTT foi descartada e a seguir adicionou-se 0,1 mL da solução de extração de HCl 1 N – isopropanol (1:24 v/v). A microplaca ficou sob agitação por 10 min à temperatura ambiente até a leitura em 550 nm (referencia a 700 nm) em espectofotômetro (Soft Max Pro, Molecular devices). A viabilidade mitocondrial foi expressa em relação à redução do MTT pelo controle positivo (sem Vat), considerado 100%. Células tratadas com SDS 10% foram utilizadas como controle negativo. Foram realizadas triplicatas de cada tratamento.
3.4.4 Liberação da Lactato dehidrogenase (LDH)
A LDH é uma enzima citoplasmática comumente encontrada em diferentes tipos celulares, podendo ser utilizada como indicadora de injúria celular. A alteração da integridade da membrana celular de FEG, expostas à Vat (CD50), foi determinada como descrito por
Mitchell et al. (1980). Resumidamente, as células FEG, crescidas até a confluência em placas de 96 poços, foram tratadas com Vat (CD50) e, em diferentes intervalos de tempo (2, 4, 6 e 12h), o
sobrenadante celular foi coletado e centrifugado (1500 rpm/5 min, centrífuga Herolab, rotor TF 24.2). Uma alíquota de 0,1 mL desse sobrenadante foi colocado em uma cubeta contendo 2,5mL de tampão fosfato aquecido (37º) combinado com 0,2 mL de solução de NADH (2,5 mg/mL) e 0,2 mL de solução de piruvato de sódio (1 mg/mL), ambas mantidas em banho de gelo até o momento do uso. Leituras da absorbância (Ultrospec 2100pro Amersham Biosciences) a 340nm foram realizadas em cubetas de plástico em intervalos de 30 segundos durante 3 minutos e a solução de SDS 10% foi usada como controle positivo para a dosagem de LDH. Todos os tratamentos foram realizados em triplicatas.
O cálculo das unidades de LDH/mL liberadas pelas células FEG durante o tratamento com a Vat foi realizado obtendo-se os quatro ΔA por minuto (90s-30s; 120s-60s; 150s-90s; 180s-120s), calculou-se a média de cada ΔA e em seguida os valores de unidades por mililitro foram obtidos a partir da fórmula:
Unidades LDH/mL = ΔA x D x F, onde D = fator de diluição (10000) e F = fator de temperatura a 30ºC (1,16)
3.4.5 Marcação com Acridine Orange (AO)
Foi seguida a metodologia de Catrenich & Chestnut (1992) para determinar o pH intravacuolar dos vacúolos das células FEG quando tratadas com a citotoxina Vat na concentração de 50µg.mL-1. As células FEG foram crescidas em placa de 24 cavidades, sobre lamínulas de vidro. As lamínulas sofreram um tratamento prévio com meio MEM acrescido de
10% de soro fetal bovino 24 horas antes de receberem a cultura de células. A FEG foi tratada com a Vat por 6, 18 e 24 h e as placas foram incubadas a 37ºC e 5% de CO2. Após os tempos de
incubação, as células foram lavadas com PBS e foi adicionado o marcador fluorescente Acridine orange (AO) a 5µg/mL por 2 min em temperatura ambiente. O excesso do corante foi retirado por sucessivas lavagens com PBS, as lamínulas foram montadas em lâminas e observadas em microscopia de fluorescência (Nikon Eclipse E800). O AO em pH ácido é laranja e em pH alcalino é verde. Todos os tratamentos foram realizados em duplicatas.
3.4.6 Detecção de alterações no citoesqueleto
Faloidina é produzida pelo fungo Amanita phalloides. Esta toxina tem a capacidade de se ligar a F-actina das células, resultando em uma forte estabilidade desses filamentos. A faloidina não pode se ligar aos monômeros de actina, ligando-se somente aos polímeros de actina, possibilitando a detecção de alterações no citoesqueleto celular.
Neste experimento, utilizou-se faloidina conjugada com FITC (Phalloidin-FITC, Sigma) na concetração final de 5 µg/mL. Primeiramente as células foram tratadas com a toxina Vat purificada (100µg/mL) durante 6 horas, em seguida seguiu-se o protocolo do fabricante para a coloração com a faloidina. As lâminas foram montadas em 90% de glicerol e mantidas no escuro até o momento da visualização em microscópio de fluorescência (LEICA DM 2500). Todos os tratamentos foram realizados em duplicatas.
3.4.7 Detecção de apoptose
A detecção de apoptose foi realizada utilizando-se citometria de fluxo através do protocolo contido no kit Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmigen). O kit permite determinar quantitativamente a porcentagem de células que se encontravam em apoptose dentro de uma população ativa. Em células apoptóticas, o fosfolipídio de membrana (fosfatidilserina) é translocado para o exterior, sendo exposto para o meio externo. A anexina é uma proteína Cálcio-dependente que possui uma alta afinidade pela fosfatidilserina. O iodeto de propídeo (PI) tem afinidade pelo DNA, corando o núcleo celular. Células viáveis com a membrana plasmática intacta excluem o PI, enquanto células danificadas ou mortas são permeáveis ao PI que penetra nas células e liga-se ao DNA.
O experimento foi realizado em duplicata, utilizando-se células FEG tratadas com a toxina Vat purificada (2 CD50) por 2, 6 e 8 horas. Células sem tratamento com a toxina Vat e
coradas com anexina e iodeto de propídeo foram utilizadas como controle negativo. Células sem tratamento e sem os corantes foram utilizadas como branco.
3.5 Detecção do gene vat
3.5.1 Extração do DNA
O DNA bacteriano foi extraído pelo método de fervura, por 10 min. A amostra AC 53 foi utilizada como padrão positivo.
3.5.2 Reação de amplificação
Os iniciadores foram sintetizados de acordo com as sequências descritas no trabalho de Restieri et al. (2007) (Tabela 3).
TABELA 3. Sequência dos iniciadores do gene vat
Gene sequência dos iniciadores (5´-3´) tamanho dos amplificados nº Acesso (GenBank)
vat AACGGTTGGTGGCAACAATCC 420bp AY151282
AGCCCTGTAGAATGGCGAGTA
As condições para a amplificação em termociclador automático (PCR System 2400 Applied Biosystems) foram: incubação a 94ºC por 5 minutos, seguidos de 30 ciclos de denaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento a 59,8ºC por 1 minuto e extensão a 72ºC por 1 minuto. O passo final de extensão foi de 7 minutos a 72ºC. Os produtos da amplificação foram analisados por eletroforese em gel de agarose (2%) e corados com brometo de etídio.
As amostras positivas para vat foram classificadas nos filogrupos A, B1, B2 e D, seguindo a metodologia de Clermont et al. (2000).
Fig. 1 - Esquema de Clermont et al. (2000) para determinação dos grupos filogenéticos de E. coli usando resultado da PCR para os genes chuA e yjaA e o fragmento TspE4.C2.
TABELA 4. Sequência dos iniciadores para filogenia
Gene sequência dos iniciadores (5´-3´) tamanho dos amplificados Referência
ChuA GACGAACCAACGGTCAGGAT 279 bp Clermont et al., 2000 TGCCGCCAGTACCAAAGACA
YjaA TGAAGTGTCAGGAGACGCTG 211 bp Clermont et al., 2000 ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC
TspE4.C2 GAGTAATGTCGGGGCATTCA 152 bp Clermont et al., 2000 CGCGCCAACAAAGTATTACG
4.1 Purificação da Vat
O sobrenadante de cultura da amostra de E. coli AC53, precipitado com a fração de 50-60% de sulfato de amônio foi aplicado em cromatografia de interações hidrofóbicas, coluna HiTrap Phenyl (low sub), em sistema de FPLC, utilizando-se um gradiente linear inverso de sulfato de amônio 1-0 M. O pico 1, eluído no tempo de retenção de 0,75 min, apresentou atividade citotóxica (figura 2).
Fig. 2 - Perfil de eluição da coluna HiTrap Phenyl (low sub) em FPLC, com gradiente linear inverso de 1-0 M de sulfato de amônio e fluxo de 1 mL/min O pico nº 1 (0,75min) apresentou atividade vacuolizante em células FEG.
A fração cromatográfica com atividade citotóxica foi liofilizada e então cromatografada em coluna de exclusão molecular Superdex 75 HR 10/30, em sistema FPLC, sendo eluída com tampão Tris-HCl 0,06M pH 7,4 com 0,15M de NaCl. O pico que apresentou atividade citotóxica em células FEG foi eluído no tempo de retenção de 26,82min (figura 3).
Fig. 3 - Perfil de eluição da coluna Superdex 75 HR 10/30 em FPLC, com gradiente linear 0,15M de cloreto de sódio e fluxo de 0,5 mL/min. O pico eluído em 26,82 min apresentou atividade vacuolizante em células FEG.
4.1.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE)
Após a Vat ser eluída na coluna Superdex 75, observou-se a formação de apenas 1 banda em SDS-PAGE sem e com condições redutoras (5% de β-mercaptoetanol, fervido por 3 min).
Fig. 4 - SDS-PAGE corado com prata. PM: padrão de peso molecular Pharmacia. A. pico eluído em HiTrap Phenyl FF (low sub) com atividade vacuolizante. B. pico eluído em Superdex 75 HR 10/30 com atividade vacuolizante. banda correspondente à Vat.
4.1.2 Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE)
A análise do spot da proteína Vat gerou os dados apresentados na tabela 5. A Vat apresenta peso molecular de 56 kDa e ponto isoelétrico de 6,37.
TABELA 5. Dados gerados pelo ImageMaster 2D Platinum 6.0®
pI PM Intensidade Área Volume
6,36977 56 22 2,17013 15,7535
4.2 Teste de citotoxicidade em células FEG
O efeito vacuolizante foi considerado positivo quando as amostras induziram a vacuolização intracelular em pelo menos 50% das células. O efeito vacuolizante é mostrado na Figura 5.
Escherichia coli patogênicas extra-intestinais (ExPEC) com presença do gene vat
tiveram seus sobrenadantes de cultura testados sobre células FEG e Vero. Todas as APEC vat+ (7/7), 62,5% das UPEC vat+ (10/16) e 37% das SEPEC vat+ (10/27) induziram atividade vacuolizante em células FEG. Os sobrenadantes de cultura das SEPEC foram examinadas sobre células Vero e 14,8% (4/27) induziram alterações morfológicas nas células, mas não formação de vacúolos.
A
C
B
Fig. 5 - Ensaio citotóxico em células FEG.
A- Fotomicrografia do controle celular de células FEG. Aumento 200x.
B- Fotomicrografia da vacuolização citoplasmática induzida pelo sobrenadante de cultura da amostra AC53 de E.
coli, isolada de celulite aviária.
Aumento 200x.
C- Fotomicrografia da vacuolização citoplasmática induzida por Vat purificada após 18h. Aumento 200x. Setas indicam vacúolos.
4.3 Atividades intracelulares da Vat
4.3.1 Determinação da CD50 (dose citotóxica 50%)
Através da metodologia dos ensaios de viabilidade celular foi padronizada a CD50 de Vat
em função do tempo de 18 horas de exposição das células à toxina. Utilizando-se concentrações definidas de Vat, obtivemos os resultados apresentados na figura 6. A CD50 foi determinada em
40µg.mL-1, através da dosagem de proteínas, realizada como descrito no item 3.2.3.
Fig. 6 - Curva de viabilidade celular obtida através do ensaio com Vermelho Neutro em células FEG tratadas com diferentes concentrações de Vat, durante 18 horas.
Determinação CD50 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 100 80 60 40 10 1 [ ] Vat µg/mL c é lu la s v iá v e is (% )
4.3.2 Viabilidade celular pela incorporação do NR pelos lisossomos
Os resultados de viabilidade celular obtidos em células FEG estão apresentados na figura 7, expressos como a porcentagem de células viáveis em função do tempo frente à Vat purificada (40µg.mL-1). A viabilidade celular apresentou-se comprometida a partir das 4 primeiras horas de inoculação de Vat, com perda de viabilidade mais acentuada após 18 horas de teste, com diminuição de mais de 50% das células viáveis.
Fig. 7 - Cinética da viabilidade celular em células FEG tratadas com Vat. A viabilidade foi expressa como o percentual de células viáveis frente à ação da Vat em diferentes intervalos de tempo. Experimento realizado em triplicata. tempo % C élul as v iáve is Viabilidade Celular - NR
4.3.3 Viabilidade celular pela redução do MTT à formazana
A capacidade da mitocôndria de reduzir o MTT em formazana, em relação ao tempo de incubação com a toxina, está demonstrado na figura 8. A atividade mitocondrial foi reduzida a 62% a partir de 2h de ensaio e a 52% com 36h de ensaio. Após 48h, as mitocôndrias sofreram uma acentuada perda de atividade, restando somente 5% dessas organelas viáveis.
Fig. 8 - Cinética da viabilidade mitocondrial em células FEG tratadas com Vat. Redução de MTT à formazana medida em diferentes intervalos de tempo. O controle está representado na 0h e indica a total redução de MTT por células FEG viáveis.
% mi tocôndr ias viáve is Viabilidade Celular - MTT tempo
4.3.4 Liberação da Lactato dehidrogenase (LDH)
Este ensaio permite demonstrar que a perda de integridade da membrana plasmática das células se inicia com 2 horas do tratamento com a toxina. Podemos observar na figura 9 que as células FEG apresentam o pico máximo de liberação da enzima LDH após 12 horas de tratamento com Vat (40µg.mL-1).
Fig. 9 - Cinética da atividade da enzima LDH em função do tempo de exposição das células FEG à Vat. Experimentos realizados em triplicata para o cálculo dos valores de unidades de LDH/mL. C+: controle positivo, células FEG tratadas com SDS 10% para liberação total do LDH.
Liberação da LDH 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0h 2h 4h 6h 12h C+ tem po u n id a d e s L D H /m L
4.3.5 Marcação com Acridine Orange (AO)
As células FEG foram tratadas com Vat e marcadas com AO após diferentes intervalos de tempo. A figura 10 mostra os resultados. O AO marca o DNA do núcleo em verde e o citoplasma aparece corado em vermelho. Após 18 horas de ensaio há um aumento da intensidade de coloração do citoplasma, provavelmente, devido ao aumento da quantidade de RNA. Os vacúolos aparecem sem marcação.
Fig. 10 – Células FEG tratadas com Vat em diferentes intervalos de tempo e marcadas com AO. A. Controle celular. B. Tratamento com Vat por 6h. C. Tratamento com Vat por 18h. D. Tratamento com Vat por 24h.
A B
D C
4.3.6 Detecção de alterações no citoesqueleto
Alterações no citoesqueleto das células tratadas com Vat podem ser percebidas após 6h de tratamento com a toxina. Células FEG coradas com faloidina podem ser observadas na figura 11. As células tratadas com Vat apresentam contração do citoesqueleto, mostrando células arredondadas em processo de morte celular.
Fig. 11 - Alterações no citoesqueleto das células FEG corado com Phalloidin-FITC. A e B. Controle celular. C, D, E e F Tratamento com Vat - 6h. Pontas de seta indicam as fibras de actina e setas indicam contração dos filamentos de actina.
4.3.7 Detecção de apoptose
A Citometria de Fluxo mostrou que as células FEG, tratadas com Vat por diferentes intervalos de tempo, foram preferencialmente marcadas pela Anexina-V. A marcação pelo iodeto de propídeo não foi muito evidente, com apenas 6,7% da população de células marcadas com PI ao final de 8h de tratamento com a Vat. Os dados nos mostram que ao final do experimento 58% da população de células ficou marcada com Anexina-V, indicando que há exposição de fosfatidilserina na membrana, porém a apoptose não pode ser confirmada.
Fig. 12 - Análise de células FEG por citometria de fluxo. A. Controle Celular. B, C e D. Tratamento com Vat após 2, 6 e 8h, respectivamente. FL2 – marcação com PI. FL6 – marcação com Anexina-V.
A B
4.4 Detecção do gene vat
O gene vat apresentou um produto de amplificação de 420 bp e foi encontrado em 15,9% das amostras de APEC (7/44), 39% das amostras de UPEC (16/41) e em 60% das amostras de SEPEC (27/45).
As amostras positivas para vat foram classificadas nos filogrupos A, B1, B2 e D, conforme apresentado na figura 14.
Fig. 13 - Distribuição das amostras de APEC, UPEC e SEPEC vat+ entre os grupos filogenéticos A, B1 B2 e D, pela
metodologia de Clermont et al. (2000).
0 2 4 6 8 10 12 14 n º d e a m o s tr a s A B1 B2 D Filogenia
APEC
UPEC
SEPEC
Inúmeras doenças aviárias são causadas por Escherichia coli, dentre elas infecções do saco vitelino, síndrome da cabeça-inchada, sepse, onfalite e celulite. A celulite aviária é detectada somente após o abate, pois as penas cobrem as lesões e os lotes contaminados apresentam bom desempenho de produção. Os frangos de corte que apresentam lesões características de celulite têm suas carcaças descartadas, gerando perdas econômicas. As E. coli têm sido comumente isoladas de lesões de celulite aviária (Messier et al., 1993) e sua relevância nesta doença já foi sugerida por vários autores, como Gomis et al. (1997) e Norton et al. (1997). Segundo o trabalho de Ghanbarpour et al. (2009) os fatores de virulência que prevalecem nas APEC isoladas de lesões de celulite são os genes csgA, fimH e iucD. Segundo Ewers et al. (2004) a presença de aerobactinas, fímbrias e citotoxinas podem aumentar a habilidade das E.
coli colonizarem tecidos subcutâneos de frangos. Dessa maneira, nosso grupo sugere que a Vat
pode exercer um papel importante no desenvolvimento da celulite.
O processo de purificação da Vat empregado foi adaptado da metodologia desenvolvida por Salvadori (2003). Anteriormente nosso grupo descreveu o efeito vacuolizante desta citotoxina sobre células de origem aviária, FEG e CER (chicken embryo related), porém a Vat não demostrou atividade sobre linhagens celulares de mamíferos. Além do efeito vacuolizante, característico desta toxina em células de origem aviária, outros efeitos intracelulares foram detectados no presente trabalho pela ação da Vat em cultura de células FEG.
Dentre as atividades intracelulares observadas, destacam-se: a perda de integridade da membrana, danos às mitocôndrias e aos lisossomos e desarranjo do citoesqueleto. A Vat aplicada sobre cultura de células FEG (fibroblasto de embrião de galinha) induz perda da viabilidade em metade das células após 18 horas de ensaio. Ensaios com a toxina indicam que,
a viabilidade mitocondrial decresce e se mantém durante as 24 horas do ensaio, em cerca de 55%, havendo uma redução acentuada da atividade mitocondrial após 36 horas da aplicação da Vat, restando somente 5% de atividade após 48 horas do ensaio. A membrana plasmática das células FEG também sofre alterações de integridade, liberando 66,7 unidades de LDH/mL, após 12 horas de ensaio (pico máximo de liberação, que corresponde a 51,7% do conteúdo total de LDH em células FEG). Através do ensaio de marcação com AO foi possível observar que há um aumento de RNA no citoplasma celular (figura 10), indicado pela coloração vermelha, enquanto o núcleo permanece marcado em verde. Porém nossos resultados são diferentes dos obtidos por Catrenich & Chestnut (1992) com células HeLa e VacA. Os vacúolos induzidos em células HeLa tratadas com a toxina de H. pylori são fortemente marcados pelo AO, sendo a intensidade da fluorescência inversa ao tamanho dos vacúolos. Nossos resultados com Vat e células FEG mostram que os vacúolos não são marcados pelo corante. Sugerimos que a redução da viabilidade lisossomal e sua possível ruptura, leve à acidificação do citoplasma das células, devido à liberação do conteúdo enzimático ácido dos lisossomos. Além disso, o aumento do RNA citoplasmático pode ser uma tentativa de resposta celular frente à ação da toxina Vat, que ainda precisa ser estudada em detalhes.
Navarro-García e colaboradores (1999) descreveram que Pet (plasmid-encoded toxin), uma serino protease produzida por EAEC (enteroaggregative E. coli), também causou alterações no citoesqueleto de células HEp-2 e HT29. Vat e Pet fazem parte da família das serino proteases autotransportadoras de Enterobacteriaceae (SPATE) e apresentam identidade de 35% dos aminoácidos.
A morte celular por apoptose é caracterizada pela retração celular, perda da integridade da membrana, condensação e fragmentação do DNA e manutenção da integridade das
organelas. Danos à atividade mitocondrial podem ser relacionados com o mecanismo de morte celular por apoptose, visto que a liberação de fatores pró-apoptóticos do espaço intermembrana dessas organelas, como o citocromo c, leva a ativação de caspases que desencadeiam uma cascata de eventos, culminando na apoptose (Ventura, 2006). Detectamos por citometria de fluxo e marcação com Anexina V e PI que as células FEG, quando expostas à Vat, apresentam exposição de fosfatidilserina em cerca de 70% das células após as primeiras 2 horas de tratamento. Porém a marcação com PI, que confirmaria a apoptose (marcação de eventos tardios), apresentou níveis muito baixos durante as 8 horas do ensaio (figura 12), o que não permite afirmar que a população de células FEG esteja em apoptose induzida pela toxina Vat.
Outras bactérias também são responsáveis pela produção de citotoxinas vacuolizantes.
H. pylori, causadora de infecções gástricas e úlcera péptida, Aeromonas veronii biovar sobria e Vibrio cholera, causadores de gastrointerite e outras infecções diarreiogenicas, produzem as
toxinas VacA (Cover & Blaser, 1992), VCF (Martins et al., 2007) e uma hemolisina (Figueroa-Arredondo et al., 2001), respectivamente.
VacA é incluída entre as SPATE, mesma família de proteínas da qual Vat faz parte. VCF, assim como Vat, é uma serino protease. Danos intracelulares às mitocôndrias, aos lisossomos e perda de integridade da membrana plasmática também foram observados pela ação da toxina VacA em células HeLa (Cover & Blanke, 2005) e do VCF sobre células Vero (Martins et al., 2007).
O desenvolvimento de alterações mitocondriais em resposta à ação intracelular de VacA leva à liberação de citocromo c e ativação de caspases, porém são requeridos tempos maiores de exposição à toxina e doses mais altas que àquelas responsáveis pelo aparecimento de vacúolos
diferentes dos de Willhite & Blanke (2004) quanto ao tempo de exposição das células FEG frente à Vat, visto que resultados anteriores (Salvadori, 2003) indicam que o aparecimento dos vacúolos ocorre às 2h de ensaio, mesmo tempo requerido para o início da perda de viabilidade mitocondrial (figura 8). Diferentemente da Vat, VacA induz apoptose em diversas linhagens celulares (Cover & Blanke, 2005).
Comparando nossos resultados com as várias ações descritas para VacA, temos que a Vat também é uma toxina multifuncional. Toxinas bacterianas funcionam modulando células eucarióticas do hospedeiro e devem promover a colonização e manutenção da bactéria nos tecidos que colonizam. De acordo com Cover & Blanke (2005) bactérias que produzem toxinas multifuncionais podem usar uma única proteína para obter uma gama de ações em diferentes tecidos e células do hospedeiro, capacitando esses patógenos para remodelação dos tecidos do hospedeiro, permitindo que escapem das defesas do Sistema Imune.
Parreira & Gyles (2003) observaram que o gene vat está codificado numa ilha de patogenicidade (PAI) de APEC, esta ilha é um hotspot de recombinação para as ExPEC. Foi observado por Pahram et al. (2005), que vat está sempre codificado na mesma orientação, estando conservado em amostras de APEC, UPEC e NMEC (new born meningits-causing by E.
coli), o que sugere vat como importante fator para que as E. coli causem doença. As linhagens
de ExPEC de humanos e de aves compartilham carcaterísticas comuns, como sorogrupos e alguns fatores de virulência. Desse modo, Moulin-Schouleur et al. (2007) observaram letalidade em aves ao testarem frangos frente às amostras de ExPEC isoladas de humanos. Skyberg et al. (2006) se utilizaram de modelos experimentais de infecção em camundongos, mostrando que APEC podem ser patogênicas para mamíferos.
Utilizando a classificação filogenética de Clermont et al. (2000) foi possível determinar que as amostras analisadas de APEC estavam distribuídas entre os grupos A e B1, grupos normalmente associados à bactérias comensais e patógenos oportunistas (Boyd & Hartl, 1998; Picard et al., 1999; Bonacorsi et al., 2000) e que as amostras de UPEC e SEPEC encontravam-se dentre os grupos B2 e D, geralmente relacionados como grupos de E. coli causadoras de infecções em humanos e outros primatas.
Os dados apresentados nesse trabalho mostram que o gene vat foi encontrado nos grupos descritos por Pahram e colaboradores (2005) e também foi detectado em 60% das amostras de SEPEC. É importante ressaltar que encontramos atividade vacuolizante do sobrenadante de cultura dessas ExPEC em células FEG e também que os sobrenadantes de cultura das SEPEC foram examinadas sobre células Vero e 14,2% (4 amostras) induziram alterações morfológicas nestas células, mas não induziram formação de vacúolos. Salvadori (2003) demonstrou que a Vat purificada não induz alterações em células Vero, o que reforça a idéia de que outros fatores do sobrenadante de cultura das SEPEC estejam causando as alterações celulares nessa linhagem de células de mamíferos.
Os resultados apresentados permitem as seguintes conclusões:
A toxina Vat leva à perda de viabilidade celular em células FEG, causando danos às mitocôndrias, aos lisossomos, à membrana plasmática e ao citoesqueleto (filamentos de actina);
A toxina Vat induz um aumento da presença de RNA no citoplasma celular, após 18 horas de ensaio;
O gene vat foi encontrado em diversos grupos de E. coli extraintestinais: APEC, UPEC e SEPEC;
A Vat é funcionalmente diferente da toxina VacA produzida por H. pylori; A Vat é uma toxina multifuncional.
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