Atividades intracelulares da Vat

3.4.1 Determinação da CD50 (dose citotóxica 50%)

A determinação da dose citotóxica 50% foi realizada em células FEG, tratadas com concentrações pré-determinadas da Vat purificada (100, 80, 60, 40, 10 e 1 µg.mL-1). Após 18h de incubação, a dose capaz de reduzir a viabilidade celular em 50% foi obtida através da metodologia de Borenfreund & Puerner (1984), que mede a incorporação do corante Vermelho Neutro (NR) pelos lisossomos das células viáveis.

3.4.2 Viabilidade celular pela incorporação do NR pelos lisossomos

Viabilidade das células FEG tratadas com Vat (CD50) foi determinada como descrito por

Borenfreund & Puerner (1984). Após 2, 4, 7, 18 e 24h de tratamento com Vat, o meio de cultura foi removido e 0,2 mL de MEM contendo 50g de vermelho neutro foi adicionado em cada orifício. A microplaca foi incubada por mais 3h a 37°C. As células foram então lavadas em solução de formol-cálcio [formaldeído 40% (v/v), cloreto de cálcio anidro 10% (p/v)], e subsequentemente foi adicionado 0,2 mL de solução de ácido acético-etanol [1 mL de ácido acético glacial em 100 mL de etanol 50% (v/v)] em cada orifício. As microplacas foram mantidas a temperatura ambiente por 15 min e a leitura foi realizada em espectrofotômetro (Labsystems Multiskan Biochromatic) a 540 nm. A viabilidade celular foi expressa em relação à absorbância do controle positivo (sem Vat), considerado como 100%. Células tratadas com SDS

10% foram utilizadas como controle negativo. Todos os tratamentos foram realizados em triplicatas.

3.4.3 Viabilidade celular pela redução do MTT à formazana

A ação da citotoxina vacuolizante na respiração mitocondrial das células de cultura foi avaliada segundo a metodologia de Borenfreund et al. (1988). A toxina Vat foi inoculada em células FEG na concentração de 40µg.mL-1 (CD50), em intervalos de tempo de 2, 4, 6, 12, 24,

36 e 48h. O meio de cultura foi descartado e o MTT (sal de tetrazólio) foi adcionado à concentração final de 0,8 mg.mL-1, e incubado por 3h a 37C. A solução de MTT foi descartada e a seguir adicionou-se 0,1 mL da solução de extração de HCl 1 N – isopropanol (1:24 v/v). A microplaca ficou sob agitação por 10 min à temperatura ambiente até a leitura em 550 nm (referencia a 700 nm) em espectofotômetro (Soft Max Pro, Molecular devices). A viabilidade mitocondrial foi expressa em relação à redução do MTT pelo controle positivo (sem Vat), considerado 100%. Células tratadas com SDS 10% foram utilizadas como controle negativo. Foram realizadas triplicatas de cada tratamento.

3.4.4 Liberação da Lactato dehidrogenase (LDH)

A LDH é uma enzima citoplasmática comumente encontrada em diferentes tipos celulares, podendo ser utilizada como indicadora de injúria celular. A alteração da integridade da membrana celular de FEG, expostas à Vat (CD50), foi determinada como descrito por

Mitchell et al. (1980). Resumidamente, as células FEG, crescidas até a confluência em placas de 96 poços, foram tratadas com Vat (CD50) e, em diferentes intervalos de tempo (2, 4, 6 e 12h), o

sobrenadante celular foi coletado e centrifugado (1500 rpm/5 min, centrífuga Herolab, rotor TF 24.2). Uma alíquota de 0,1 mL desse sobrenadante foi colocado em uma cubeta contendo 2,5mL de tampão fosfato aquecido (37º) combinado com 0,2 mL de solução de NADH (2,5 mg/mL) e 0,2 mL de solução de piruvato de sódio (1 mg/mL), ambas mantidas em banho de gelo até o momento do uso. Leituras da absorbância (Ultrospec 2100pro Amersham Biosciences) a 340nm foram realizadas em cubetas de plástico em intervalos de 30 segundos durante 3 minutos e a solução de SDS 10% foi usada como controle positivo para a dosagem de LDH. Todos os tratamentos foram realizados em triplicatas.

O cálculo das unidades de LDH/mL liberadas pelas células FEG durante o tratamento com a Vat foi realizado obtendo-se os quatro ΔA por minuto (90s-30s; 120s-60s; 150s-90s; 180s-120s), calculou-se a média de cada ΔA e em seguida os valores de unidades por mililitro foram obtidos a partir da fórmula:

Unidades LDH/mL = ΔA x D x F, onde D = fator de diluição (10000) e F = fator de temperatura a 30ºC (1,16)

3.4.5 Marcação com Acridine Orange (AO)

Foi seguida a metodologia de Catrenich & Chestnut (1992) para determinar o pH intravacuolar dos vacúolos das células FEG quando tratadas com a citotoxina Vat na concentração de 50µg.mL-1. As células FEG foram crescidas em placa de 24 cavidades, sobre lamínulas de vidro. As lamínulas sofreram um tratamento prévio com meio MEM acrescido de

10% de soro fetal bovino 24 horas antes de receberem a cultura de células. A FEG foi tratada com a Vat por 6, 18 e 24 h e as placas foram incubadas a 37ºC e 5% de CO2. Após os tempos de

incubação, as células foram lavadas com PBS e foi adicionado o marcador fluorescente Acridine orange (AO) a 5µg/mL por 2 min em temperatura ambiente. O excesso do corante foi retirado por sucessivas lavagens com PBS, as lamínulas foram montadas em lâminas e observadas em microscopia de fluorescência (Nikon Eclipse E800). O AO em pH ácido é laranja e em pH alcalino é verde. Todos os tratamentos foram realizados em duplicatas.

3.4.6 Detecção de alterações no citoesqueleto

Faloidina é produzida pelo fungo Amanita phalloides. Esta toxina tem a capacidade de se ligar a F-actina das células, resultando em uma forte estabilidade desses filamentos. A faloidina não pode se ligar aos monômeros de actina, ligando-se somente aos polímeros de actina, possibilitando a detecção de alterações no citoesqueleto celular.

Neste experimento, utilizou-se faloidina conjugada com FITC (Phalloidin-FITC, Sigma) na concetração final de 5 µg/mL. Primeiramente as células foram tratadas com a toxina Vat purificada (100µg/mL) durante 6 horas, em seguida seguiu-se o protocolo do fabricante para a coloração com a faloidina. As lâminas foram montadas em 90% de glicerol e mantidas no escuro até o momento da visualização em microscópio de fluorescência (LEICA DM 2500). Todos os tratamentos foram realizados em duplicatas.

3.4.7 Detecção de apoptose

A detecção de apoptose foi realizada utilizando-se citometria de fluxo através do protocolo contido no kit Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmigen). O kit permite determinar quantitativamente a porcentagem de células que se encontravam em apoptose dentro de uma população ativa. Em células apoptóticas, o fosfolipídio de membrana (fosfatidilserina) é translocado para o exterior, sendo exposto para o meio externo. A anexina é uma proteína Cálcio-dependente que possui uma alta afinidade pela fosfatidilserina. O iodeto de propídeo (PI) tem afinidade pelo DNA, corando o núcleo celular. Células viáveis com a membrana plasmática intacta excluem o PI, enquanto células danificadas ou mortas são permeáveis ao PI que penetra nas células e liga-se ao DNA.

O experimento foi realizado em duplicata, utilizando-se células FEG tratadas com a toxina Vat purificada (2 CD50) por 2, 6 e 8 horas. Células sem tratamento com a toxina Vat e

coradas com anexina e iodeto de propídeo foram utilizadas como controle negativo. Células sem tratamento e sem os corantes foram utilizadas como branco.