Microtrincas dentinárias: um fenômeno experimental pós-extração?

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA

MICROTRINCAS DENTINÁRIAS: UM FENÔMENO EXPERIMENTAL PÓS-EXTRAÇÃO?

Niterói 2018

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA

MICROTRINCAS DENTINÁRIAS: UM FENÔMENO EXPERIMENTAL PÓS-EXTRAÇÃO?

DANIELE MOREIRA CAVALCANTE

Tese apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor, pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia

Área de Concentração: Clínica Odontológica

Orientador: Prof. Dr. Gustavo André De Deus Carneiro Vianna

Niterói 2018

Ficha catalográfica automática - SDC/BNO

Bibliotecária responsável: Lúcia Espogeiro - CRB7/4708 C167 Cavalcante, Daniele Moreira

Microtrincas dentinárias : um fenômeno experimental pós-extração? / Daniele Moreira Cavalcante; orientador: Prof. Dr. Gustavo de Deus Carneiro Vianna. – Niterói, 2018.

56 f.: il. Inclui gráficos.

Tese (Doutorado em Clínica Odontológica) - Universidade Federal Fluminense, 2018.

Bibliografia: f. 49-50.

1. Microtrincas. 2. Dentina radicular. 3. Defeito dentinário. 4. Micro-CT. 5. Resistência a fratura. I. Vianna, Gustavo de Deus Carneiro [orient.] II. Título.

BANCA EXAMINADORA

Prof(o). Dr(o). Gustavo André de Deus Carneiro Vianna

Instituição: Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense Decisão: _________________________Assinatura: _______________________

Prof(o). Dr(o). Emmanuel João Nogueira Leal da Silva

Instituição: Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual do Rio de Janeiro Decisão: _________________________Assinatura: _______________________

Prof(o). Dr(o). Erick Miranda Souza

Instituição: Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Maranhão Decisão: _________________________Assinatura: _______________________

Prof(o). Dr(o). Cresus Vinicius Depes de Gouvêa

Instituição: Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense

Decisão: _________________________Assinatura: _______________________

Prof(o). Dr(o). Henrique Eduardo Oliveira

Instituição: Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense Decisão: _________________________Assinatura: _______________________

DEDICATÓRIA

Dedico esse trabalho

Aos meus filhos Ao meu orientador e amor

Ao meu pai A minha mãe Ao meu irmão

AGRADECIMENTOS

Ao meu marido Gustavo que ao dobrar-se sobre si mesmo, construiu a máquina. A ele todos os predicados.

Gustavo de Deus meu orientador e amor incansável e inspirador. Obrigada por tudo que já não cabe no dizível mas no tempo implacável que compartilhamos na

construção de nossos dias inseparáveis, no gesto simples e despercebido que nos ocupa e encanta como o vento bom que passa e nos faz parar porque já nos demos conta que são essas sensações que queremos colecionar juntos. obrigada.

Agradeço a minha Família e a todos os meus Amigos Professores e colegas da UFF. Alguns deles:

Gilson Tristão Esio Vieira Aristides Cresus Vinicius Raul Feres Henrique Oliveira

Felipe Belladonna Galito Gustavo Oliveira Telma

Eliane Priscila Ronaldo Carol Miller Carlos Alberto Zé Luis Cristiane Maria Elisa Jaime Rosa Anderson Monica Calasans Ricardo Mirian Jordão Oswaldo Carol Maciel

e a todos os demais por estarem sempre por perto e por me ensinarem o conceito de coletivo.

Agradeço a minha banca - por sua disponibilidade e genialidade.

Ao Professor Cresus por seu carinho sempre - e dedicação a odontologia da UFF. obrigada Professor.

Agradeço a todos do grupo de Pesquisa do LEE onde equipe é time e time se reverte em produção para todos. obrigada Felipe Belladonna, Emmanuel Silva, Marco Simões, Renata Perez, Julio Carvalhal.

Na vida acadêmica tem sempre alguém que está ao seu lado como Telma & Luise e Claudinho & Bochecha - e foi como eu e Gilson percorremos nossa trajetória, minha primeira parceria na UFF, meu amigo incondicional, meu afeto para sempre. obrigada.

Agradeço ao Professor Aristides por sua capacidade singular e admirável de olhar a todos nós do Departamento como filhos únicos. Obrigada pela amizade Professor.

Agradeço ao Esio eterno amigo que está sempre ao meu lado, que está sempre ao meu lado, que está sempre ao meu lado ... obrigada.

Ao meu amigo e chefe Gustavo Oliveira que nos surpreende com sua liderança e nos acompanha vigilante. obrigada.

Em especial agradeço ao Henrique que me apontou um caminho e disse “vai” - e se não fossem esses “O Cara” na vida da gente como as coisas se dariam?! Agradeço por ter tido o meu “O Cara” que fez toda a diferença e ainda faz. Obrigada Henrique.

Agradeço aos meus amigos da Arte e aos amigos da Vida dos quais tenho estado tão distante. obrigada.

“Como cada um de nós era vários, já era muita gente. Utilizamos tudo o que nos aproximava, o mais próximo e o mais distante (...) Não chegar ao ponto em que não se diz mais EU, mas ao ponto em que já não tem qualquer importância dizer ou não dizer Eu. Gilles Deleuze e Félix Guattari

RESUMO

CAVALCANTE DM. Microtrincas Dentinárias: um fenômeno Pós-extração? [tese]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2018.

O presente trabalho teve duplo objetivo. O estudo 1 investigou a potencial relação de causa-efeito entre a incidência das microtrincas dentinárias e a resistência a fratura radicular em dentes não-tratados endodonticamente (modelo experimental in vitro). O estudo 2 investigou através da microtomografia computadorizada (micro-CT) a prevalência, localização e o padrão de trincas preexistentes em dentes não-tratados endodonticamente de cadáveres frescos (modelo experimental ex vivo). Metodologia. Estudo 1: No primeiro estudo, 60 dentes com volume de dentina, espessura de dentina semelhantes e canais classificados como circulares foram selecionados e escaneados a uma resolução de 14.16 μm. Os espécimes foram avaliados quanto a frequência das microtrincas radiculares. Em seguida, as 60 raízes foram embutidas em blocos de resina de poliéster onde receberam a simulação de um ligamento periodontal em poliéter. Os espécimes foram então submetidos a um ensaio de fratura à 1,0 mm/min com objetivo de determinar a força necessária a fraturar cada um deles; a fractografia foi realizada a partir da inspeção de um modelo tridimensional considerando-se as fraturas cervicais ou fratura vertical radicular. Estudo 2: No segundo estudo, 33 blocos de maxilas cadavéricas contendo 132 pré-molares e molares, direitos e/ou esquerdos, com rizogênese completa, foram coletados e codificados. A remoção cirúrgica dos blocos cadavéricos utilizou a broca 701 e peça reta. O escaneamento dos blocos contendo os dentes foi realizado com uma resolução de 13.18 µm e foi registrado o surgimento de microtrincas dentinárias nos cortes microtomográficos dos espécimes inseridos em suas estruturas periodontais. Resultados. Estudo 1: nenhuma microtrinca preexistente foi detectada nos dentes inseridos nas peças cadavéricas. Estudo 2: A análise bidimensional de 48.530 de cortes microtomográficos conclui não existirem microtrincas dentinárias no modelo cadavérico como observado pelo micro-CT. 79% dos espécimes apresentaram microtrincas (n=44); o número de microtrincas por amostra variou de entre 6% e 42 com uma média de 412 ± 484. As forças necessárias a produção da fratura durante o ensaio oscilaram entre 227N e 924N, com uma média de 560.3 ± 168.1N. O coeficiente de correlação foi igual a 0.065. Conclusões: (1) não há relação de causa-efeito entre o número de microtrincas e a resistência a fratura em incisivos inferiores não-tratados endodonticamente; (2) não existem microtrincas dentinárias em dentes não tratados endodonticamente em peças cadavéricas frescas. As conclusões nos obrigam a refletir sobre o real papel do fenômeno das microtrincas dentinárias na Endodontia.

Palavras-chave: microtrincas, dentina radicular, defeito dentinário, micro-CT, resistência a fratura.

ABSTRACT

CAVALCANTE DM. Dentinal Microcracks: a post-extraction phenomenon? [thesis]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2018.

The present study had a two-fold purpose. The study 1 has investigated the potential cause-effect relationship between the incidence of preexisting dentinal microcracks and root fracture resistance in endodontically non-treated lower incisors (in vitro experimental model). The study 2 has investigated the prevalence, location and pattern of preexisting microcracks in endodontically untreated teeth of fresh cadavers (ex vivo experimental model) using Micro-computed tomography (micro-CT). Methodology. In the first study, 60 teeth with a dentinal volume varying between 107.46 and 187.33 mm³, similar dentinal thickness and having circular-shaped canals were selected and scanned at a resolution of 14.16 μm. All cross-sections produced were screened to determine the frequency of dentinal microcracks (%). Afterwards, the 60 roots were embedded with polyester resin receiving an artificial simulation of the periodontal ligament in polyether. The specimens were then subjected to a 1.0 mm / min load fracture test to establish the force required to fracture; the fractography analysis was performed by the visual inspection of the 3D models considering 2 modes of fracture: (i) cervical fractures or (ii) vertical root fracture. Study 2: 33 cadaveric bone blocks containing 132 right and / or left premolars and molars, with complete apex formation, were collected and coded. Surgical removal of the cadaveric bone blocks were done using a low-speed saw drill (701 JET, Morrisburg, Ontario, Canada). The scanning of the bone blocks containing the teeth was performed with a resolution of 13.18 μm and the cross-section imagens produced were screened for dentinal microcracks. Results. Study 1: The results showed that 79% of the specimens had dentinal microcracks (n = 44); the number of microcracks per sample varied from 0 to 1605 (between 6% and 42%) with a mean of 412 ± 484 (median = 221 and 25% IQR = 15/75% = 658). The forces required to produce the fracture during the test ranged from 227N to 924N, with a mean of 560.3 ± 168.1N (median 561 and 25% IQR = 458/75% = 694). The correlation of the Spearman's coefficient (rho) was equal to 0.065. Study 2: The evaluation of 48,530 cross-sectional images from teeth inserted in the cadaver bone-blocks reveled no preexisting microcracks. Conclusions: (1) there is no cause-and-effect relationship between the number of micro-fractures and fracture resistance in endodontically untreated lower incisors, and therefore the presence and quantity of micro-cracks does not determine which roots are more susceptible to fracture; (2) there are no microcracks in tooth non-endodontically treated teeth in fresh cadaveric bone blocks. The conclusions induce us to reflect on the real role / existence of the dentin microcracks phenomenon in Endodontics.

Keywords: microcracks, root dentin, dentinal defects, micro-CT, resistance to fracture.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Classificação do formato anatômico do canal radicular 18 Figura 2. Classificação do formato anatômico do canal radicular 19 Figura 3. Modelos 3D da amostragem por canais circulares 20

Figura 4. Recobrimento da raiz dentária com cera 7 21

Figura 5. Raiz dentária posicionada para o embutimento a frio 22 Figura 6. Amostra posicionada para o ensaio de fratura 23 Figura 7. Modelos 3D ilustrando a análise fractográfica 25 Figura 8. Imagens representativas dos padrões de microtrincas 26

Figura 9. Peça cadavérica da maxila direita 28

Figura 10. Peça cadavérica no porta-amostras do micro-CT 29 Figura 11. Processo de extração atraumática do 3º molar 31 Figura 12. 1ª Sequencia de validação do método 33 Figura 13. 2ª Sequencia de validação do método 34 Figura 14. Corte microtomográficos ilustrando a ausência de microtrincas 35 Figura 15. Corte microtomográficos ilustrando a ausência de microtrincas 36

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

NiTi - Níquel Titânio

mL - mililitro

micro-CT - micro-tomografia computadorizada

mm - milímetro

% - por cento

VRF - fratura vertical radicular

3D - tridimensional

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 12

2. METODOLOGIA 16

2.1 Experimento 1 16

2.1.1 Seleção dos espécimes 16

2.1.2 Simulação do ligamento periodontal e osso alveolar 21 2.1.3 Teste de resistência à fratura 22 2.1.4 Fractografia 23 2.1.5 Análise estatística 27

2.2 Experimento 2 27

2.2.1 Obtenção e seleção das peças cadavéricas 27

2.2.2 Escaneamento das peças cadavéricas 28

2.2.3 Análise da presença de trincas 29 2.2.4 Validação do método 30 3. ARTIGOS PRODUZIDOS 37 3.1. Artigo 1 37 3.2. Artigo 2 46 4. CONCLUSÕES 54 5. ANEXOS 55

Anexo A: Comprovação artigo 1 55 Anexo B: Comprovação artigo 2 56 Anexo C: Parecer consubstanciado do comitê de ética em pesquisa 57 Anexo D: TCLE 58

1 – INTRODUÇÃO

O estudo das microtrincas dentinárias vem trazendo uma série de discussões a respeito de seus resultados científicos. O primeiro estudo publicado em 2009 provocou questionamentos relevantes na medida em que demonstrou que um procedimento endodôntico de rotina como a instrumentação automatizada de NiTi poderia gerar defeitos radiculares em até 80% dos casos. 1/1, 1/14, 1/15, 1/16

Os trabalhos pioneiros de Shemesh e Bier foram realizados através de inspeção visual direta da superfície dentinária após secção transversal das raízes em três cortes. 1/1, 1/14 _{A dinâmica metodológica obedeceu a seguinte sequência: o}

espécime recebia a intervenção endodôntica para então ser seccionado transversalmente e levado ao microscópio óptico de reflexão para observação direta do tecido dentinário radicular; um grupo controle constituído de dentes hígidos foi responsável por demonstrar que o processo isolado de corte transversal das raízes não produzia nenhum tipo de defeito dentinário. O modelo de secção transversal reproduzido desde então estabeleceu uma extensa base de conhecimento capaz de desenvolver uma reflexão sobre o atual paradigma do preparo mecânico dos canais radiculares, uma vez que parecia existir uma correlação positiva entre o surgimento das microtrincas dentinárias e o uso de instrumentos de NiTi. 21/2, 22/2, 3/2

Em 2014, De-Deus et al. iniciaram uma série de trabalhos sobre esse tema, utilizando entretanto uma nova proposta metodológica com base na utilização da micro-tomografia de raio X de alta resolução (micro-CT) 2/1, 3/1, 4/1 _{; o método, por sua}

característica não-destrutiva quanto a preservação do espécime é, capaz de realizar de forma inovadora uma observação longitudinal das amostras. Os trabalhos de De-Deus et al. submetiam portanto os espécimes a micro-tomografia computadorizada capaz de inspecionar o interior de corpos sólidos e opacos em sua substância de modo tridimensional e não-destrutivo. 2/1, 3/1, 4/1, 5/1, 6/1 _{A analise micro-tomográfica}

produz centenas de imagens de cortes transversais do espécime possibilitando assim identificar a presença de novas trincas que possivelmente pudessem ocorrer após os procedimentos endodônticos. Como método não-destrutivo a micro-tomografia apresenta a possibilidade de re-observação da imagem inicial intacta do dente submetido ao experimento após qualquer intervenção executada permitindo a avaliação e comparação das imagens iniciais e subsequentes, indicando possíveis modificações.

Essa nova perspectiva metodológica permitiu um melhor entendimento quanto aos trabalhos iniciados em 2009 desvelando que um método que seccionava suas amostras produzia de fato um grupo controle que embora parecesse demonstrar-se eficiente, não cumpria seu papel em controlar o experimento e portanto não correspondia a real correlação entre trincas e instrumentação. 1/1, 1/14

Apesar dos claros avanços no conhecimento especifico dessa questão, o interesse em investigar o fenômeno das microtrincas dentinárias ainda existe e tem sido desenvolvido por ambas as metodologias destrutiva e não destrutiva, não obstante os resultados longitudinais dos estudos com micro-CT persistirem na direção de afastar o preparo mecânico dos canais, da ocorrência de novos defeitos dentinários.

9/1, 6/1, 10/1, 11/1

O fato é que a produção científica ao redor do desenvolvimento das microtrincas radiculares construiu um corpo de evidências composto por cerca de 60 estudos científicos publicados. A fratura vertical radicular por exemplo tem sido apontada como a principal consequência que as microtrincas dentinárias poderiam desenvolver. Ou seja, no ímpeto de investigar o surgimento de microtrincas, os estudos a partir de 2009 vem sistematicamente assumindo que esses defeitos dentinários são fatores que predispõe à fratura vertical radicular, apesar de não existirem evidências experimentais que comprovem essa relação de causa e efeito.

1/1, 1/14, 9/1, 6/1, 10/1, 11/1, 5/1, 6/1 _{Um estudo de 2014, ainda utilizando o método de secção}

da amostra, objetivou avaliar o efeito de diferentes sistemas de instrumentação mecânica sobre as paredes de dentina de canais ovais, além de propor observar, embora com menor entusiasmo, a potencial relação entre a presença de microtrincas dentinárias e a resistência a fratura dessas mesmas raízes 12/1 _;

considerando-se a fragilidade do método de corte usado, juntamente ao momento em que o estudo foi realizado quando as discussões e o interesse concentravam-se apenas no entendimento a respeito da formação de novos defeitos dentinários, não houve ênfase quanto as questões de resistência a fratura e a ideia levantada nesse estudo não foi reproduzida experimentalmente. Ou seja é seguro afirmar que o real papel dos defeitos dentinários observados tanto nos estudos de corte quanto nos estudos não-destrutivos de micro-CT encontra-se limitado a uma hipótese praticamente não testada cientificamente até o momento.

O primeiro objetivo deste trabalho foi portanto buscar uma melhor compreensão se de fato a fratura radicular vertical e as microtrincas dentinárias são

fenômenos ligados por uma relação causal ou meramente entidades independentes. Para tornar o entendimento do presente texto mais claro, nomeamos as microtrincas investigadas a partir de 2009 como microtrincas experimentais ou defeitos dentinários experimentais e, sublinhamos que em dentes endodonticamente tratados, a fratura vertical radicular tem origem nas paredes internas do canal enquanto que, a quase totalidade dos defeitos dentinários experimentais observados nos estudos de microtomografia e de corte são microtrincas incompletas que partem da face externa da raiz. 19/1 _{Ou seja, VRF e microtrincas parecem}

apresentar diferentes padrões quanto a sua propagação, o que contribui à compreensão de que não há relação etiológica entre os dois fenômenos.

Uma análise cuidadosa dos trabalhos envolvidos na construção desse corpo de evidência, nos aponta outro aspecto relevante – as imagens inicias das inspeções microtomográficas tanto quanto as imagens provenientes dos grupos controle dos estudos de raízes seccionadas, revelam a existência de microtrincas preexistentes nos dentes ainda não-tratados endodonticamente. 3/2, 2/1, 3/1, 4/1 _{E ainda,}

os procedimentos experimentais in vitro e cadavéricos que compõe esse mesmo corpo de evidência, tanto pelo método de secção quanto microtomografados, tem demonstrado ora convergência nos resultados, 13/2, 15/2 _{ora conclusões que se opõe}

quanto as microtrincas preexistentes 3/2, 7/2, 2/1, 3/1, 4/1, 5/1_.

Inicialmente, os trabalhos de 2009 que seccionavam suas amostras indicavam não existirem microtrincas nos dentes hígidos designados ao grupo controle. 1/1, 1/14 _{Por outro lado, estudos posteriores que utilizaram o modelo}

cadavérico, mas que ainda seccionavam as amostras analisadas, revelaram a presença de trincas nos dentes não-tratados endodonticamente do grupo controle.

3/2, 7/2.

O surgimento e avanço da microtomografia possibilitou o mapeamento interno de centenas de imagens transversais por amostra e consagrou a presença desses danos dentinários também em dentes não-tratados endodonticamente. 2/1, 3/1, 4/1, 5/1, 6/1, 7/1, 8/1 _{Nessa direção, um trabalho relevante sobre microtrincas preexistentes}

utilizou 633 dentes recém extraídos avaliados por microtomografia e demonstrou surpreendentemente uma incidência bastante reduzida de trincas preexistentes (7.1%).15/2 _{O mesmo panorama foi encontrado no estudo com modelo cadavérico por}

preexistentes nas imagens microtomográficas iniciais dos espécimes designados a priori para a investigação dos efeitos da instrumentação mecanizada. 13/2

Considerando-se microtrincas preexistentes como um fator de provocação capaz de impulsionar a reflexão sobre o real papel clínico (do status original da dentina) desses defeitos dentinários, o presente trabalho pretendeu investigar através da microtomografia computadorizada a prevalência, localização e o padrão de trincas preexistentes em dentes não-tratados endodonticamente de cadáveres frescos (modelo experimental ex vivo), assim como investigar a potencial relação de causa-efeito entre a incidência das microtrincas dentinárias e a resistência a fratura vertical radicular em incisivos inferiores não tratados endodonticamente (modelo experimental in vitro).

2. Material e Métodos

2.1 Experimento 1 2.1.1 Seleção dos espécimes

Uma amostra de 800 incisivos inferiores foi submetida a um escaneamento inicial com baixa resolução (micro-CT, SkyScan 1173; Bruker micro-CT, Kontich, Bélgica) para se obter um esboço inicial da anatomia dos canais radiculares. Os seguintes parâmetros foram utilizados: tamanho de pixel de 14.16 µm, 70 kV e 114 mA de energia, 180º de rotação ao redor de um eixo vertical, média de 5 frames, passo de rotação de 0.7º e filtro de alumínio de 1,0 mm. A correção do parâmetro de flat-field foi realizada antes dos escaneamentos para corrigir as variações de sensibilidade dos pixels da câmera. Posteriormente, as imagens aquisitadas foram reconstruídas com o software NRecon v.1.7.1.6 (Bruker micro-CT) utilizando correção de artefato de anel entre 3 e 5, correção de beam hardening entre 35% e 45%, valores iguais dos limites máximo e mínimo do histograma, e limites de contraste entre 0 e 0.05 com objetivo de reduzir o ruído e otimizar a qualidade final da imagem.

Após a reconstrução, o canal radicular de todas as amostras foi segmentado usando o software imageJ (Fiji v.1.51n; Fiji, Madison, WI). Com a ferramenta de aspect ratio, disponível nos descritores de forma, esses canais radiculares foram classificados como circulares, oval e oval/longo. A ferramenta de aspect ratio fornece o valor da razão entre o maior e o menor eixo da elipse instalada para imagem de cross-section reconstruída, permitindo a análise da forma ao longo de todo o canal radicular. Para o presente trabalho, apenas canais circulares foram selecionados a partir dos resultados extraídos - os canais radiculares que apresentavam valores de aspect ratio próximos a um, e em grande parte do canal radicular foram considerados circulares.

Todos os dentes circulares selecionados, em um total de 155, foram escolhidos para a próxima etapa de análise que considerou o volume de dentina e sua largura mesio-distal maior para a seleção de amostras semelhantes. Na sequência, uma nova segmentação foi feita, no entanto, agora a região de interesse era apenas o tecido dentinário da raiz. Com os conjuntos de imagens segmentadas, novas ferramentas de medição foram utilizadas. A medida MinFeret foi adotada para

verificar o diâmetro mesio-distal da dentina e seus valores foram plotados em um gráfico que posteriormente foi utilizado para agrupar dentes com espessuras semelhantes (Figura 1). Para medição de volume, foi usada a ferramenta de contagem de objetos 3D. Com estes resultados, foram selecionados 60 dentes com volume de dentina variando de 107,46 a 187,33 mm³ e espessura de dentina com curvas gráficas semelhantes (Figura 2). As coroas foram removidas à junção cemento-esmalte mantendo as raízes equilibradas em relação às características anatômicas da rede como comprimento (12 ± 1mm em média) da raiz e o diâmetro vestíbulo-lingual caracterizando uma amostragem homogênea.

Figura 1: Representação visual da classificação do formato anatômico do canal radicular: circular, oval e muito oval. (A1) imagens transversais reconstruídas. (A2) Segmentação do canal radicular. (A3) Gráfico mostrando o aspect ratio ou seja, o comportamento bidimensional de toda a extensão do canal radicular. (B) Modelos 3D: 1 circular; 2 oval e 3 muito oval.

Figura 2: Representação visual da classificação do formato anatômico do canal radicular: circular, oval e muito oval. (A) Modelos 3D de dentes com canais circulares. (B1) Imagens transversais reconstruídas. (B2) Segmentação do canal radicular. (B3 e C) Gráfico mostrando o aspect ratio ou seja, o comportamento bidimensional de toda a extensão do canal radicular.

2.1.2 Simulação do ligamento periodontal e osso alveolar

As superfícies das raízes foram cobertas com uma fina camada de material de impressão de poliéter (Impregum F, 3M-Espe, Seefeld, Alemanha) para simular a função do ligamento periodontal como descrito anteriormente por Soares et al. (2005). Para isso, as superfícies das raízes foram mergulhadas em cera fundida; como consequência, uma camada de cera de 0,2-0,3 mm permaneceu sobre a superfície da raiz (Figura 4). As raízes cobertas de cera foram então fixadas individualmente em cilindros plásticos e embutidas em resina de poliestireno (Cristal, Piracicaba, SP, Brasil) de tal forma que a resina recobrisse a raiz até 5 mm abaixo da junção cemento-esmalte (CEJ) – Figura 5. Após a polimerização da resina, as raízes cobertas de cera foram removidas do cilindro e a cera foi destacada da superfície da raiz tanto quanto do espaço correspondente a raiz + cera, criado no interior do cilindro. O material de impressão polyeter foi misturado e inserido com seringa no espaço criado e as raízes foram reinseridas no cilindro removendo-se o excesso do material de impressão com uma lâmina de bisturi.

Figura 4: Recobrimento da raiz dentária com cera 7 aquecida para a criação do espaço do ligamento periodontal artificial.

2.1.3 Teste de resistência à fratura

As raízes embutidas foram acomodadas em um suporte de metal e submetidas à carga compressiva axial usando-se uma haste de metal de 2,2 mm de diâmetro (cúspide metálica antagônica) em uma máquina de teste universal (Galdabini Sun 500, Cardano al Campo, VA, Itália) com velocidade à 1 mm/min até a fratura ser detectada - Figura 6. O limiar de fratura foi definido como a carga que revelou a primeira fratura (queda súbita de carga durante a compressão), resultando em uma formação de pico na curva de extensão. Uma célula de carga de 100 kgf foi usada e os valores foram registrados em Newton (N).

Figura 5: Raiz dentária devidamente posicionada dentro do molde de teflon para o embutimento a frio com resina de poliéster cristal.

Figura 6: Amostra posicionada no aparato de fixação para o ensaio de fratura.

2.1.4 Fractografia

Os dentes fraturados foram reescaneados usando os mesmos parâmetros microtomográficos acima descritos. A análise fractográfica - que identifica os aspectos fractográficos e sugere a relação entre a presença ou ausência desses aspectos com a sequência de eventos da fratura - foi realizada por inspeção de modelos 3D construídos sendo assim verificada a extensão das fraturas. O modo de fratura foi classificado baseado em Barcellos et al. 2013, do seguinte modo:

Tipo I - fratura no terço cervical / médio do canal radicular

Tipo II - fratura da raiz vertical. Tipo I foi considerado como fratura reparável, permitindo a restauração, enquanto o tipo II foi considerado uma fratura catastrófica que definitivamente comprometeu a integridade do dente.

Figura 7: Modelos 3D ilustrando a análise fractográfica realizada. As setas indicam o local e a extensão. Tipo I: Fratura cervical / elemento restaurável. Tipo II: fratura da raiz vertical. Tipo I foi considerado como fratura reparável, permitindo a restauração, enquanto o tipo II foi considerado uma fratura catastrófica que definitivamente comprometeu a integridade do dente.

Figura 8: Imagens transversais representativas das amostras com diferentes padrões de microtrincas e até mesmo com tecido dentinário íntegro (2º de cima para baixo) ilustrando a falta de correlação com a resistência a fratura.

2.1.5 Análise estatística

A análise preliminar indicou que os dados de microtrincas não aderiram a uma distribuição gaussiana (teste de normalidade omnibus d'Agostino & Pearson). Assim, uma análise estatística não paramétrica (correlação de Spearman) foi utilizada para verificar a correlação entre as variáveis estudadas (número de microtrincas e força necessária para a fratura). A frequência dos modos de falha foi comparada usando testes qui-quadrado. O erro do tipo alfa foi fixado em 0,05 e o Prisma 5.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA) e o Origin 6.0 (Microcal Software Inc., Northampton, MA, EUA) foram usados como ferramentas analíticas.

2.2 Experimento 2

2.2.1. Obtenção e seleção das peças cadavéricas

A obtenção das peça cadavéricas utilizadas no presente estudo foi viabilizada pela colaboração com a Perícia Forense do Estado do Ceará (PEFOCE) sendo o comitê de ética aprovado do Hospital Geral de Fortaleza sob o parecer 931.732 (Anexo I). Os cadáveres incluídos no presente estudo foram selecionados a partir de dados morfológicos como a presença de dentes em ambas as arcadas, limite de idade acima de 18 anos e causa mortis sem traumas na cavidade oral. Além disso, cadáveres de ambos os sexos foram escolhidos e com bom estado de conservação (até 48hs após o óbito). Os cadáveres não identificados (desconhecidos) foram devidamente autorizados pela Coordenação da PEFOCE para manipulação.

Foram realizados plantões semanais regulares na PEFOCE para coleta das amostras sendo estas selecionadas somente após autorização formal escrita dos familiares responsáveis pelos cadáveres através do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) – Anexo II.

Um total de 33 blocos de maxilas cadavéricas contendo pré-molares e molares, direitos e/ou esquerdos, com rizogênese completa, foram coletados e codificados. A remoção dos blocos ósseos (osteotomia) foi realizada cirurgicamente usando brocas 701 (JET, Morrisburg, Ontário, Canadá) e peça reta. Os blocos ósseos das maxilas dentadas foram acondicionados no freezer da PEFOCE em temperatura de - 20ºC. Após a coleta total das peças cadavéricas, as mesmos foram

transportados em caixa térmica especial UN3373 (Medicalbox, Agaraí, São Paulo, Brasil) imerso em gelo seco (-78,5º C) para o Laboratório de Instrumentação Nuclear (LIN) da COPPE-UFRJ no Rio de Janeiro, onde foram conservadas em freezer a -24 º C.

2.2.2. Escaneamento das peças cadavéricas

O escaneamento dos blocos ósseos contendo os dentes foi realizado através de um aparelho de micro-tomografia computadorizada (micro-CT, SkyScan 1173; Bruker micro-CT, Kontich, Bélgica) utilizando parâmetros pré-selecionados como: 90 kV e 88 mA de energia, resolução de 13.18 µm, passo de rotação de 0.5°, 7000 milisegundos, 5 frames por segundo, utilização de movimento randômico (30), e filtro de 1 mm de alumínio. A correção de flat-field foi realizada antes dos procedimentos de aquisição das amostras para corrigir as variações na sensibilidade do pixel do detector (câmera CCD). As imagens foram reconstruídas utilizando o software NRecon v.1.6.9 (Brucker micro-CT) com correção de endurecimento de feixe de 20% e correção de artefato de anel de 5, resultando na aquisição de 800-900 imagens transversais por dente em um formato bitmap (BMP). Após o escaneamento das amostras, as peças cadavéricas foram reacondicionadas no freezer do LIN.

2.2.3. Análise da presença de trincas

O conjunto de imagens dos espécimes isolados (132 dentes, n = 48,530) foi analisado individualmente por 3 examinadores pré-calibrados que identificaram a presença das trincas dentinárias. O software DataViewer (Bruker-microCT) foi utilizado na visualização das imagens transversais reconstruídas. Num primeiro momento, as imagens foram analisadas sendo então gravado o número representativo do slice em relação ao longo eixo da raiz que apresentava trincas. Em seguida, objetivando validar o processo, as análises das imagens foi repetida duas vezes em intervalos de 2 semanas. Em caso de divergência, as imagens foram examinadas em conjunto até que se chegasse a um consenso.

Figura 10: Peça cadavérica adaptada num suporte de isopor e levada ao porta-amostras do micro-CT 1172.

2.2.4. Validação do método de observação das microtrincas nas imagens produzidas pelo micro-CT

A validação do método microtomográfico para observação das microtrincas dentinárias em dentes escaneados de modo individualizado – ou seja, dentes extraídos – foi realizada por De-Deus et al. (2016), onde foi demostrado que os defeitos dentinários visualizados através da microscopia ótica por observação direta da dentina são também visualizados nas imagens transversais reconstruídas obtidas pela micro-tomografia computadorizada de alta-resolução. No entanto, o mesmo poderia não ser válido para os escaneamentos dos dentes inseridos no bloco ósseo. Portanto, devido ao ineditismo da observação das microtrincas dentinárias no modelo experimental cadavérico, se fez necessária a validação do método.

A metodologia desenvolvida no presente trabalho (modelo cadavérico) foi validada a partir da analise de uma sequencia de 4 imagens transversais produzidas pelo escaneamento de alta resolução (microCT) de uma única amostra selecionada. A sequência de escaneamento seguiu a seguinte sequencia: (i) peça cadavérica inteira com os dentes, (ii) dente removido, (iii) dente removido e desidratado e (iv) peça cadavérica inteira com dente desidratado e reposicionado no alvéolo radicular.

Um segmento posterior de uma peça cadavérica da maxila superior contendo 3 dentes (um pré-molar, um primeiro molar e um 2º molar) foi selecionado e escaneado em alta-resolução (Figura 11A e 1B). A análise da presença de microtrincas foi realizado de acordo com o padrão descrito no item 2.2.3 e revelou a integridade dos tecido dentinário (ausência de microtrincas) (Figuras 12A, 12B, 13A, 13B – 1º escaneamento).

O segundo molar foi removido de seu bloco cadavérico (Figura 11 C-E). Para isso, uma técnica atraumática através do uso de periótomos (Figura 11C) garante a remoção cuidadosa do elemento dentário através do rompimento de 2/3 dos tecidos periodontais ao redor das raízes até que o processo de luxação ocorra por completo (Figura 11D); o fórceps foi utilizado apenas para a remoção final do dente protegendo os tecidos de suporte do estresse usualmente gerado pelo procedimento convencional da extração.

Figura 11: (A) Reconstrução 3D do bloco ósseo usado na validação do método. (B) Fotografia do bloco ósseo. (C) Processo de extração atraumática do 3º molar por meio do uso do periótomo. (D) 3º molar solto do alvéolo dentário. (E) 3º molar extraído do bloco ósseo.

O molar extraído (Figura 11E) foi então imediatamente escaneado isoladamente e os cortes microtomográficos examinados como descrito no item 2.2.3. Nenhuma trinca foi observada (Figuras 12C e 13C – 2º escaneamento). Os parâmetros utilizados durante os procedimentos de escaneamento foram: tamanho do pixel da imagem - 13.18 µm, 90 kV e 88 mA de energia, rotação de 360º ao redor do eixo vertical - passo de rotação de 0.5º com 5 frames por segundo. Foi utilizado um filtro de alumínio de 1-mm de espessura.

Em seguida o segundo molar foi submetido a um processo de desidratação objetivando a indução de defeitos dentinários (Hagay et al. 2017). Inicialmente foi utilizado a técnica de desidratação pela imersão em série crescente de álcool etílico (50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100%); em uma segunda etapa o dente foi submetido a um auto-dissecador (Bel-Art automatic desiccator clear 2.0, Wayne, NJ, USA) e escaneado semanalmente para verificação do surgimento de algum defeito dentinário. Após um período de 3 meses, a observação de microtrincas no molar extraído foi claramente possível (Figuras 12D e 13D – 3º escaneamento).

O espécime foi então cuidadosamente reinserido em seu alvéolo original e o bloco ósseo foi escaneado mais uma vez (4º escaneamento). O processo de análise das imagens foi concluído e as microtrincas detectadas nos cortes transversais do dente extraído foram também visualizadas nas imagens dos escaneamentos realizados quando o espécime estava reposicionado no bloco ósseo (Figuras 12E, 12F, 13E e 13F). Isso significa que pelo processo descrito foi possível a observação da presença das mesmas microtrincas dentinárias nas 2 condições experimentais: (i) estando o 2º molar fora da peça cadavérica (extraído) e (ii) estando este reinserido no alvéolo do bloco cadavérico. Portando, assim o modelo de observação das microtrincas dentinárias através do escaneamento dos dentes inseridos no bloco ósseo foi validado, assim como o presente resultado reafirmada a influencia do processo de desidratação na produção dos defeitos dentinários. Todos os procedimentos e resultados estão ilustrados na sequência das Figuras X e Y.

Figure 12: A) Imagem de um corte microtomográfico típico de um bloco posterior cadavérico fresco de maxila. O 2º molar superior pode ser visualizado ainda no interior de seu alvéolo. Nenhuma microtrinca radicular é detectada no espécime. Detalhe da raiz disto-vestibular. B) Detalhe ampliado da raiz disto-vestibular do 2º molar ressaltando a ausência de defeitos dentinários. C) ) Imagem de um corte microtomográfico do 2º molar da peça cadavérica imediatamente antes de sua extração. Nenhuma microtrinca é observada. D) Imagem de um corte microtomográfico do 2º molar extraído da peça cadavérica, escaneado semanalmente por 3 meses desde sua extração onde é possível observar o início do processo de indução da desidratação do espécime – uma trinca foi induzida e pode ser observada claramente na imagem microtomográfica da raíz disto-vestibular removida de seu alvéolo ósseo (seta). E) Imagem de um corte microtomográfico do 2º molar extraído após sua reinserção no alvéolo ósseo da peça cadavérica. A microtrinca induzida pode ser claramente observada na raíz disto-vestibular do 2º molar reinserido em seus tecidos periodontais (seta). F) Detalhe ampliado da raiz disto-vestibular do 2º molar sublinhando a presença de nova microtrinca (seta) ausente nas imagens A e B.

Figure 13: A) Imagem de um corte microtomográfico típico de um bloco posterior cadavérico fresco de maxila. O 2º molar superior pode ser visualizado ainda no interior de seu alvéolo. Nenhuma microtrinca radicular é detectada no espécime. Detalhe da raiz disto-vestibular. B) Detalhe ampliado da raiz disto-vestibular do 2º molar ressaltando a ausência de defeitos dentinários. C) ) Imagem de um corte microtomográfico do 2º molar da peça cadavérica imediatamente antes de sua extração. Nenhuma microtrinca é observada. D) Imagem de um corte microtomográfico do 2º molar extraído da peça cadavérica, escaneado semanalmente por 3 meses desde sua extração onde é possível observar o início do processo de indução da desidratação do espécime – uma trinca foi induzida e pode ser observada claramente na imagem microtomográfica da raíz disto-vestibular removida de seu alvéolo ósseo (seta). E) Imagem de um corte microtomográfico do 2º molar extraído após sua reinserção no alvéolo ósseo da peça cadavérica. A microtrinca induzida pode ser claramente observada na raíz disto-vestibular do 2º molar reinserido em seus tecidos periodontais (seta). F) Detalhe ampliado da raiz disto-vestibular do 2º molar sublinhando a presença de nova microtrinca (seta) ausente nas imagens A e B.

Figure 14: Corte microtomográficos típicos de blocos ósseos de cadáveres frescos da porção posterior da maxila ilustrando a ausência total de defeitos dentinários.

Figure 15: Corte microtomográficos típicos de blocos ósseos de cadáveres frescos da porção posterior da maxila ilustrando a ausência total de defeitos dentinários.

3 - ARTIGOS PRODUZIDOS

3.1. Artigo 1: Submetido ao Journal of Endodontics, Qualis A1, Fator de impacto: 2.88.

Do pre-existing microcracks play a role in the resistance to root fracture? Gustavo De-Deus(UFF)

Daniele Cavalcante (UFF)

Felipe Gonçalves Belladonna (UFF) Marco Simões-Carvalho (UFF) Renata Perez (UFF)

Erick Miranda Souza (UFMA) Ricardo Tadeu (UFRJ)

Emmanuel João Nogueira Leal Silva (UNIGRANRIO) Matthias Zehnder (University of Zurich)

Key Words: fracture resistance, microcracks, root fracture.

Introduction

Since 2009, an important concern has been raised in Endodontics, and a knowledge base has been created pointing to a questionable conclusion: there could be a positive correlation between dentinal microcracks and NiTi instrumentation (1). Destructive-sectioning studies on extracted human teeth have suggested that root dentinal tissue can be critically damaged by mechanical root canal preparation. In contrast, starting from 2014, non-destructive micro-CT studies have questioned these conclusions (2-7). It was demonstrated that the mechanical preparation using either rotary or reciprocating systems is unable to induce the formation of microcracks. Nevertheless, studies on such root dentinal

defects, using either destructive or non-destructive methods are still published in endodontic journals (8-10).

It is important to draw attention to the fact that this body of questionable evidence – about 60 peer-reviewed published studies on the dentinal microcracks formation versus mechanical canal preparation – embraced the very same assumption: dentinal microcracks, observable in cross-sections and micro-CT images, may play a role in the development of vertical root fractures (VRF). This means that the published studies on microcracks have plainly accepted the role of such dentinal defects on the development of VFRs, despite a complete absence of evidence to support a

cause-effect relationship in this context. Oddly enough, to the best of the authors knowledge, there has been no experimental study other than the work by Nasr & Kader from 2014 (12) specifically designed to investigate this potential relationship. These authors investigated the fracture resistance of oval-shaped canals and also observed the effect of different kinematics and systems on the dentinal walls. However, at that time, the attention was still on instrumentation-induced dentinal defects, and roots were sectioned to assess the presence of microcracks. Sectioning studies have suggested that canal instrumentation using nickel-titanium rotaries could cause microcracks in a range of 40-80% (13). However, as indicated above, it is more than unlikely that common endodontic procedures could cause microcracks in such high incidence in the clinical setting (3, 14, 15, 16). Hence, VRFs may represent a phenomenon that is entirely non-related to the dentinal microcracks described in experimental bench-top studies. Almost all experimental dentinal defects observed in the micro-CT studies are incomplete microcracks running from the external root surface towards the canal lumen (2, 17, 18). This finding is not in line with the current understanding on VRFs in endodontically-treated teeth, which suggests that VRFs originate at the canal wall (19). Thus, there is a high likelihood that such microcracks are not involved in the triggering of VRFs in vivo.

The purpose of the current study was to investigate a potential cause-effect relationship between dentinal microcracks and fracture resistance of lower incisors that had not been endodontically treated. The null hypothesis tested was that the

amount of dentinal microcracks in their roots does not turn these human teeth more prone to fracture.

Material and Methods Sample selection

After approval by the local ethics committees, a sample of 800 mandibular incisors was selected from a tooth bank. These teeth had been stored at 8º C for variable periods of time. This sample was pre-scanned in a micro-CT device (SkyScan 1173; Bruker microCT, Kontich, Belgium) operated at 70 kV and 114 mA, with an isotropic resolution of 14.25 μm, 180° rotation around the vertical axis, rotation step of 0.7°, camera exposure time of 250 milliseconds and frame average of 5 and reconstructed using the NRecon v 1.7.1.6 software (Bruker microCT), each under individualized parameters of beam hardening correction; ranging from 35% to 45%, ring artifact correction from 3 to 5, and contrast limits ranging from 0 to 0.05, in order to reduce noise and to increase the quality of the images.

After reconstruction, the root canal of all samples were segmented using ImageJ software (Fiji v.1.51n; Fiji, Madison, WI) and, by the use of the aspect ratio tool available in shape descriptors plugin, categorized as circular, oval and long oval (Supplementary file 1). The aspect ratio tool provides the major axis/minor axis ratio value of an ellipse fitted to each cross section of the reconstructed sample, allowing the analysis of the shape, along the entire root canal. Circular canals were selected from the results extracted from this tool. Thus, root canals that had values of aspect ratio close to one, in a large part of the root canal,

were considered as circular (20).

All teeth containing circular canals, totaling 155, were chosen for the next step analysis that considered the volume of dentin and its mesiodistal width, which was considered paramount for the selection of mechanically similar samples. Hence a new segmentation was done, however, now the region of interest was only the root dentin. In this way, with the segmented image sets, new measuring tools were used. The MinFeret measurement was adopted to verify the dentin mesiodistal diameter and its values were plotted on a graph that was later used to group teeth with similar thicknesses (Fig. 1). For volume measurement the 3D objects counter tool was used. With these results, 60 teeth were finally selected with their dentin volume varying from 107 to 187 mm3 and dentin thickness with similar graphical curves (Fig. 2). Teeth were decoronated to standardize the roots that were now similar with respect to their main anatomical features: root length and the buccolingual diameter, creating a homogeneous sample.

Microcracks assessment

After selection, two pre-calibrated examiners screened the cross-section images of the specimens to identify and quantify the presence of dentinal defects per root (around 800 slices per tooth). To validate the screening process, image analyses were repeated twice at 2 weeks intervals; in case of divergence between the examiners, the image was examined jointly until an agreement was reached.

Simulated periodontal ligament and alveolar bone

The root surfaces were covered with a thin layer of polyether impression material (Impregum F, 3M-Espe, Seefeld, Germany) to simulate the function of the periodontal ligament as described previously (21). In brief, root surfaces were dipped into molten wax and then removed, so that a layer of 0.2-0.3 mm of the wax remained on the root surface. The wax-covered roots were then mounted individually in plastic cylinders and embedded in polystyrene resin up to 5 mm below the cementoenamel junction (CEJ). After resin polymerization, wax-covered roots were detached from the cylinder, and the wax removed from the root surface creating a space in the resin cylinder. The polyether impression material was mixed and placed in the space created in the resin cylinders. Roots were re-inserted into the cylinder and the excess material removed using a scalpel blade.

Fracture resistance test

The embedded roots were mounted in a metal holder and subjected to axial compressive loading using a 2.2-mm-diameter metal sphere (antagonistic metallic tooth) in a universal testing machine (Galdabini Sun 500, Cardano al Campo, VA, Italy) at a crosshead speed of 1 mm min until fracture was detected. Fracture threshold was defined as the load which revealed the first fracture (any sudden load drop during compression), resulting in a peak formation on the extension curve. A 100-kgf load cell was used and values were recorded in Newton (N).

Fractography

After they fractured, roots were re-scanned using the parameters described above.

Fractography analysis was performed by inspection of 3D models to verify crack propagation. Mode of failure was classified (22) - as follows: type I – fracture at the cervical third of the root canal and type II – vertical root fracture. Types I was considered as repairable fracture, allowing restoration, while type II was considered catastrophic fracture that definitely compromised tooth integrity.

Statistical analysis and data presentation The preliminary analysis indicated that the microcracks data did not adhere to a Gaussian distribution (D’Agostino & Pearson omnibus normality test). Thus, a nonparametric statistical analysis (Spearman’s rank correlation) was used to assess the correlation between the number of microcracks and force required to fracture. The alpha-type error was set at 0.05 and Prisma 5.0 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA) and Origin 6.0 (Microcal Software Inc., Northampton, MA, USA) were used as analytical tools. Non-parametric data are shown as median values and inter-quartile ranges (IQRs), whilst normally distributed counterparts are presented as means and standard deviations.

Results

Four specimens were lost due to problems in embedding process. Thus, the experiment ran with a total of 56 specimens. Dentinal microcracks were detected in 79% of the specimens (n = 44). The incidence of microcracks varied between teeth from 6% to 42% of the total slices per sample, with an average of 14 ± 17%. The number of microcraks per sample varied from 0 to 1605, with an average of 412 ± 484 (median = 221 and

IQR 25% = 15 / 75% = 658). The data distribution of the amount of microcracks is shown in Figure 1A.

The load at failure values varied from 227N to 924N, with an average of 560.3 ± 168.1N (median 561 and IQR 25% = 458 / 75% = 694). The data distribution of force values is shown in Figure 1B.

The Spearman correlation test was unable to identify dependence between the two variables analyzed (P=0.636), which is clearly demonstrated in the scatter plot X-Y graph in Figure 1C. The Spearman correlation coefficient (rho) equaled 0.065. The fracture analysis showed that catastrophic failure (type I) was the predominant fracture type at 71.4% while cervical fracture was 28.6%. Typical fractures are presented by 3D models in Figure 2.

Discussion

In the current study, the potential relationship between dentinal microcracks and the resistance to fracture of extracted human tooth roots was assessed. The incidence and the amount of dentinal microcracks in non-endodontically treated teeth was thus determined by micro-CT imaging and correlated to the load required to fracture the respective roots. According to the present results, the amount of dentinal microcracks was able to explain only 0.65% of the root fractures, (Spearman’s rho = 0.065), which was far away from significant (P > 0.05). These results, for the first time, provide some in vitro evidence that the amount of microcracks observed in cross-sectional images in no way renders roots more prone to fracture. This means that the so-called dentinal microcracks (showed in almost all

destructive and non-destructive studies around root dentinal defects over the last decade) cannot be associated, without further experimental and theoretical foundation, as trigger points for VRFs.

At a first glance, the current finding may seem rather controversial and peculiar, since the body of the respective studies performed since 2009 has used precisely the rationale that VRFs could be the endpoint of such dentinal defects. This was done to justify the study of dentinal microcracks as surrogate outcomes, e.g. regarding their relationship with endodontic procedures. However, the present conflicting result can be regarded as sound considering the systematic lack of experimental studies specifically designed to evaluate the causality between microcracks and root fractures. Thus, at least to some measure, it is fair to say that the endodontic scientific community has been assigning an unproven importance to such dentinal microcracks.

VRFs originate from regions with excessive stress concentration and propagate from that area (23). Logic would thus dictate that a VRF is likely caused by the propagation of a microcrack observed in either a sectioning or a micro-CT study. Clinical investigations have shown that indeed, vertical root fractures appear to be extensions of formerly incomplete dentinal defects (24). These defects, however, are macroscopic and usually appear in the middle of the root or at the root tip (25). Indeed, it is important to highlight that not rarely science disobeys seemingly logical reasoning. It is worthwhile to call attention to the fact that the endodontic scientific community has been guilty of overestimating the relationship between

logic - deductive reasoning - and reliable scientific evidence before. For example, in 2012 and 2017, De-Deus et al. (26, 27) called attention that besides the lack of experimental evidence, tubular dentinal sealer penetration has been used as an indication of superiority of a given root-filling technique or one root-root-filling material over another; a rationale that has also been used to launch new root-filling materials. Other systematic errors include the purported causes and effects of in vitro microleakage (28) and, classically, the hollow tube theory by Rickert and Dixon (29). In the context of the present subject, it is fair to say that this was what happened after the first studies on dentinal microcracks appeared in 2009. Therefore, the assumption that the dentinal microcracks are trigger points for the VRFs is indeed the so-called working hypothesis, which means a provisionally accepted hypothesis that requires further scrutinization by sound scientific methods in order to either confirm or disprove it. A given working hypothesis without proper experimentation, however, is an unsubstantiated and speculative guess.

Based on the present results, it is also important to realize that the state of the root dentinal tissue of stored extracted teeth, specifically regarding the presence and/or the amount of microcracks, appears not to significantly affect the resistance to fracture in a laboratorial set-up. In other words, the present result validates the experimental resistance to fracture results published over the last years using teeth that had been stored for sometimes non-defined periods of time.

For the purpose of the present study, a single large experimental group

was used. There is no rationale to justify the use of two or three groups when the main purpose was limited to verify a potential cause-and-effect relationship between two variables that affect the same root. The current correlation analysis gained power by using a single large experimental group as it assumed that random factors affect only individual subjects. The teeth used here were collected from a tooth bank, which means that there was only limited control regarding some variables able to play a role in the resistance to fracture as well as the frequency of the preexisting dentinal microcracks. These variables include the age of the patients when the teeth were extracted and storage time. On the other hand, teeth selection obeyed strict micro-CT guided inclusion criteria regarding the anatomical features, counterbalancing the other cited uncontrolled variables, which is confirmed by the acceptable standard deviation of the fracture assay and also, the average values that is in line with the previous studies on resistance to fracture (30-32). Regarding the incidence of dentinal microcracks, tooth selection seems to be in line with the previous micro-CT based studies using stored teeth from a collection (3, 4, 33).

The application of a direct load over the root with no crown was an experimental feature that does not mimic the clinical situation; however, it enables better specimen standardization excluding the effect of important variables present in fully restored models. Moreover, static loading assays use an overestimation of the strength value when compared to the oral cavity forces, which is a condition necessary to assess fracture resistance in a laboratory setting (34).

Future work should focus on providing theoretical and experimental understanding of fracture mechanics and fracture pathways in order to see if and how these microcracks may or may not contribute to the development of in vivo VRFs.

Conclusions

It can be concluded that there is no cause-effect relationship between the amount of dentinal microcracks and fracture resistance of nonendodontically treated lower incisors in the sense that the presence and quantity of microcracks did not turn these roots more prone to fracture. Future research is awaited to provide a better understanding of causes for vertical root fractures.

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