Proponente: Fátima Maria de Souza Moreira Setor de Microbiologia do solo Departamento de Ciência do solo Universidade federal de Lavras

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Identificação da proposta

Avaliação da eficiência de inoculantes microbianos de leguminosas em

regiões inexploradas e de métodos para

seu controle de qualidade e

inspeção visando à expansão de seu uso na agricultura brasileira

Proponente: Fátima Maria de Souza Moreira

Setor de Microbiologia do solo

Departamento de Ciência do solo

Universidade federal de Lavras

Departamentos e Instituições Parceiras:

Departamento de Agricultura/UFLA

Departamento de Biologia/UFLA

Departamento de Ciências Exatas/UFLA

Universidade Federal Rural de Pernambuco/UFRPE

Universidade Federal de Campina Grande/UFCG

Universidade Federal do Piauí/UFPI

Instituição Colaboradora:

Centro Educacional de Lavras/UNILAVRAS

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Qualificação do principal problema, justificativa e vinculação da proposta a

defesas agropecuária

Nos últimos anos o mundo tem se deparado com novo cenário em relação aos insumos que representaram a grande força motriz da revolução verde. O aumento da demanda de adubos químicos a nível mundial, associado ao descompasso com a sua oferta ocasionou elevação de preços a níveis cada vez mais inacessíveis, não só aos pequenos e médios, mas também aos grandes produtores. Por outro lado, segmentos crescentes da sociedade têm se preocupado com os problemas ambientais, advindos dos sistemas produtivos dentro do paradigma da revolução verde, o que vem ocasionando aumento da demanda pelos chamados “produtos orgânicos”. Neste contexto, torna-se de fundamental importância o incremento da contribuição dos processos biológicos para a produção agrícola, pastoril e florestal, tanto em termos econômicos, como ambientais globais. No Brasil, a soja, é o melhor exemplo de como um processo biológico pode ser manejado eficientemente para aumento da produção, redução expressiva de seus custos e eliminação de impactos ambientais. Nessa cultura, ocorre a substituição total de adubos químicos nitrogenados pela inoculação com bactérias fixadoras de nitrogênio, selecionadas por sua alta eficiência. A seleção de bactérias associada ao melhoramento vegetal gerou variedades de soja altamente responsivas a esse processo biológico. Infelizmente, apesar de estar disponível para cerca de 100 outras espécies das 2.000 espécies de leguminosas nativas, a inoculação é praticamente restrita a soja: 99% dos 26,4 milhões de doses de inoculante consumidos no Brasil em 2003 foram para essa cultura, sendo esta porcentagem praticamente constante em anos posteriores. A não utilização desse processo nos sistemas de produção de outras leguminosas de importância econômica, e que já tem inoculantes disponibilizados pela pesquisa brasileira, se deve a diversos fatores. O primeiro deles é a falta de acesso a informação. Principalmente pequenos, mas até médios e grandes produtores desconhecem a disponibilidade assim como os benefícios dessa biotecnologia. Por outro lado, para as grandes empresas produtoras de inoculante, a venda no atacado (e.g. para grandes produtores de soja) é muito mais vantajosa e viável economicamente do que a venda no varejo (e.g. para pequenos produtores/agricultura familiar no nordeste). Além desses fatores, destaca-se a falta de conhecimento e preparo (deficiência técnica) dos recursos humanos que seriam responsáveis pela sua recomendação, incluindo em sua maioria os graduados de instituições na área agrícola e florestal, devido à formação deficitária

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nessa área. Por outro lado, com exceção da soja, a recomendação das estirpes inoculantes das demais espécies leguminosas foram baseadas em numero reduzido de experimentos restritos a condições edafo-climáticas específicas. Considerando a vasta extensão territorial de nosso país, assim como sua diversidade de solos, climas e aptidões agrícolas e florestais, o projeto parte do principio que a solução desses problemas devem ser regionais, ou seja, considerando as especificidades de cada região, assim, como estimulando a formação de recursos humanos locais. Também procuramos integrar a solução desses diversos fatores dentro de uma abordagem holística em uma micro-empresa dentro de instituição publica cujos objetivos diferem dos de empresa particular, no sentido de que estão direcionadas, não apenas ao seu próprio lucro, mas, principalmente as demandas da sociedade e do seu crescimento econômico sustentado associado à qualidade ambiental e segurança alimentar. As questões econômicas serão consideradas no sentido de avaliar as relações custos/benefícios e nesses últimos avaliar também o impacto dos produtos gerados na economia regional (Figura 1). Considerando ainda a prerrogativa de isenção e imparcialidade de tal empresa, métodos oficiais de controle de qualidade e inspeção (para identificação, quantificação e análise de pureza) em inoculantes, além de estirpes já recomendadas [recomendação baseada em testes efetuados em outra (s) região (ões)], serão testados e validados, auxiliando assim o MAPA na fiscalização desses produtos e de seus similares e na consolidação desses instrumentos.

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Fundamentação técnico científica

Os trechos a seguir, da fundamentação técnico-cientifica, foram extraídos do livro Microbiologia e Bioquímica do solo, 1ª e 2ª edições (Moreira e Siqueira, 2002, 2006, editora UFLA), onde já manifestávamos o interesse e preocupação com o problema nessa área.

Leguminosae: importância e papel nos ecossistemas

As leguminosas são a terceira maior família de plantas com flores, só sendo superada pela Orchidaceae e Asteraceae. Estima-se que a família Leguminosae possua cerca de 20.000 espécies e cerca de 700 gêneros (Lewis et al., 2003b). A Leguminosae se divide em três subfamílias: Caesalpinioideae, Mimosoideae e Papilionoideae, que diferem bastante com relação ao hábito de crescimento de suas espécies, assim como a capacidade de formar simbiose com bactérias fixadoras de nitrogênio nodulíferas (BFNN), entre outras características. Uma quarta subfamília, Cercideae, compreendendo apenas cerca de 10 gêneros (e.g. Cercis, Bauhinia) é também reconhecida atualmente por alguns autores. As Caesalpinioideae possuem cerca de 3.000 espécies, sendo, a maioria, arbórea tropical. As Mimosoideae também têm cerca de 3.000 espécies, em geral arbóreas não só tropicais, mas também subtropicais e temperadas. As Papilionoideae representam o grupo mais numeroso, com cerca de 14.000 espécies, na maioria espécies herbáceas; no entanto, a subfamília compreende também cerca de 4.000 a 5.000 espécies arbóreas, inclusive tropicais.

As leguminosas estão bem representadas nos principais ecossistemas brasileiros, em diversidade de espécies e número de indivíduos. Geralmente, em vários ecossistemas é a família com maior diversidade de espécies e está entre as cinco com maior número de indivíduos. Embora não existam dados sobre o número de espécies de leguminosas na Mata Atlântica, e considerando-se que muitas espécies são endêmicas, ou seja, estão restritas a determinadas regiões, pode-se estimar pelo número de espécies observadas na Amazônia e no Cerrado que cerca de 10% das espécies da família ocorrem no Brasil, ou seja, 2.000 espécies. De modo geral, e mesmo em regiões bastante exploradas, como as regiões Sul e Sudeste, os ecossistemas têm porcentagem significativa de leguminosas nodulíferas.

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Nodulação em Leguminosae

Dentre as simbioses de fixadores de N2 com plantas, as de bactérias fixadoras de nitrogênio nodulíferas (BFNN) com leguminosas certamente se destacam por sua importância econômica, que está relacionada não só à ampla distribuição geográfica e utilização dos hospedeiros como, também, à maior eficiência do processo decorrente de uma parceria vegetal e microrganismo mais evoluída.

A simbiose de leguminosas com BFNN caracteriza-se pela formação de estruturas hipertróficas nas raízes e, excepcionalmente, no caule, denominadas nódulos. A capacidade de formar simbiose com BFNN, ou seja, a capacidade de nodular, não é comum a todas as espécies de leguminosas. Muitas espécies não possuem essa característica; entre elas, podemos citar o jatobá (Hymenae courbaril) e o pau-brasil (Caesalpinia echinata). Além disso, para a maioria das espécies não são disponíveis informações sobre essa característica. Levantamentos intensivos no campo, casa de vegetação e viveiro têm sido realizados para verificar a capacidade de nodulação em leguminosas, principalmente em áreas tropicais. No Brasil, vários gêneros de espécies florestais foram estudados pela primeira vez nos últimos anos; assim, vários gêneros nodulíferos e não nodulíferos foram descobertos. A posição atual é que cerca de 23% de todas as espécies no mundo (considerando o número total de 16.567 espécies na família) já foram estudadas a esse respeito e que, destas, 88% são espécies nodulíferas. A maioria das espécies não nodulíferas são Caesalpinioideae. Nesse grupo, 76% das espécies já examinadas são incapazes de estabelecer simbiose com rizóbio. Nas Mimosoideae e Papilionoideae, o número de espécies não nodulíferas é bem menor; das espécies examinadas até o momento, respectivamente, 13 e 4% são incapazes de nodular.

Taxonomia de bactérias fixadoras de nitrogênio nodulíferas em leguminosas (BFNNL)

As espécies de BFNNL têm sido denominadas, coletivamente, de rizóbio. O nome rizóbio originou-se da primeira espécie descrita – Rhizobium leguminosarum (Frank, 1879, 1889) – de onde também se derivou o nome da primeira família compreendendo, na época, todas as BFNNL conhecidas – Rhizobiaceae Conn 1938. No entanto, como veremos nos tópicos seguintes, a descoberta de novas espécies em outras famílias, além das Rhizobiaceae, e algumas das quais em outros Filos do Domínio Bacteria, tornou esse nome inapropriado para denominação geral das BFNNL. Por isso,

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adotamos a denominação de bactérias fixadoras de nitrogênio que nodulam leguminosas (BFNNL) ou bactérias fixadoras de nitrogênio nodulíferas (BFNN).

A taxonomia das BFNNL avançou muito nos últimos anos. Até 1982, apenas um gênero e seis espécies eram descritos. Desde então, não só os avanços da Biologia Molecular, mas também o estudo de novas simbioses recém descobertas contribuíram para a descrição de 12 novos gêneros e 48 novas espécies, totalizando 13 gêneros e 54 espécies. Apesar disso, considera-se que o número de espécies existentes ainda esteja bastante subestimado, uma vez que a maioria das espécies da família (11.200) ainda não foi pesquisada quanto a sua capacidade de nodular e, conseqüentemente, características das bactérias a elas associadas são também desconhecidas. Além disso, parte significativa das BFNNL isoladas da maioria das espécies nodulíferas conhecidas até o momento, principalmente as tropicais, precisa ser estudada. A maioria das espécies descritas ainda se baseia em isolados de espécies herbáceas (principalmente leguminosas produtoras de grãos como Phaseolus vulgaris e Glicine max de área temperada, onde os laboratórios têm mais recursos financeiros para utilização de técnicas avançadas da Biologia Molecular.

O grupo denominado vulgarmente “rizóbio” são alfa-Proteobactérias gram-negativas, aeróbicas obrigatórias sem endosporos, que produzem hipertrofias corticais em plantas, denominadas nódulos. Além disso, utilizam vários carboidratos e produzem polissacarídeos extracelulares. Essas duas últimas características, no entanto, podem variar inter e intra-gêneros e espécies. Já o tipo de flagelação é característico de cada gênero, podendo apresentar pequena variação com o tipo de meio de cultivo. Em Azorhizobium, surge um flagelo lateral ou flagelação do tipo peritríquea. Esta última ocorre em todos os gêneros, exceto em Bradyrhizobium. Um flagelo subpolar ou polar pode ser encontrado tanto em Bradyrhizobium como em Mesorhizobium, Rhizobium e Sinorhizobium. Apesar de serem bactérias predominantemente quimiorganotróficas, descobriu-se quimiolitotrofia em algumas estirpes de Bradyrhizobium japonicum.

Os gêneros de rizóbio descritos até o momento podem ser diferenciados com base em características culturais e morfológicas em meio 79 (extrato de levedura, manitol, sais e ágar, descrito em Fred & Waksman (1928), também conhecido como YMA (Vincent, 1970). Norris (1965) postulou que em áreas tropicais havia predominância de estirpes de crescimento lento alcalinizantes (atualmente classificadas no gênero Bradyrhizobium) e em áreas temperadas com predominância de estirpes com

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Mesorhizobium e Allorhizobium). Essas características são relacionadas ao crescimento em meio com manitol, mas podem ser generalizadas para outras fontes de carbono, ou seja, estirpes que acidificam meio com manitol também acidificam com outras fontes de carbono, assim como as alcalinizantes, de modo geral, causam esse tipo de reação em todas as fontes de carbono. No entanto, algumas exceções têm sido verificadas. O gênero Azorhizobium é outro tipo de exceção, pois suas estirpes têm crescimento rápido e são alcalinizantes. Mesorhizobium também compreende estirpes de crescimento intermediário. Embora estirpes dos tipos “rápidas acidificantes” e “lentas alcalinizantes” possam ocorrer tanto em regiões tropicais como temperadas, é interessante verificar que a hipótese de Norris ganha mais fundamento quando se verifica que a maior parte das novas espécies e gêneros descritos foi justamente baseada em isolados com crescimento rápido e acidificantes oriundos de áreas temperadas. Já, a maioria de isolados de espécies florestais no Brasil pode ser classificada como Bradyrhizobium..

Outro fato interessante é a afinidade filogenética que existe entre espécies de BFNNL e patógenos vegetais e animais. Já há muito tempo a afinidade entre Rhizobium e espécies patogênicas vegetais do gênero Agrobacterium (e.g. A. tumefasciens) é conhecida. A afinidade filogenética entre as bactérias que nodulam leguminosas e patógenos animais dos gêneros Ochrobactrum, Bartonella, Brucella e Afipia também foi comprovada, indicando que genes simbióticos e patogênicos estão relacionados. Recentemente, foi descoberto que ß-Proteobactéria do gênero Burkholderia, que possui importantes patógenos humanos, e um quarto grupo de alfa-Proteobactéria (Methylobacterium) são também capazes de nodular leguminosas dos gêneros Aspalathus, Machaerium e Macroptilium (Burkholderia) (Moulin et al., 2001) e Crotalaria (Methylobacterium) (Sy et al., 2001). Simultaneamente, espécies do gênero Burkholderia, que apresentam crescimento rápido em meio 79, foram encontradas com alta freqüência em diversos sistemas de uso da terra da Amazônia e nodulando várias espécies de leguminosas florestais (Moreira et al., 2002). Outros trabalhos têm demonstrado que simbioses de leguminosas com ß-Proteobactéria são bastante comuns nos ecossistemas (Vandamme et al., 2002; Chen et al., 2003). Essas descobertas indicam que a diversidade de procariotos, capazes de estabelecer simbiose com leguminosas, pode ser muito mais ampla que o previsto e certamente conduzirão a avanços significativos no conhecimento da origem e evolução da fixação biológica de N2, assim como sua manipulação pelo homem. Além disso, isto indica que deve se ter cuidado adicional com relação a identificação de estirpes inoculantes, pois além do

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beneficio podem apresentar algum grau de patogenicidade animal ou vegetal, por exemplo por transferência vertical e horizontal de genes, o que deve ser verificado.

Estabelecimento da simbiose

No conceito original, simbiose significa vida conjunta de dois organismos dissimilares sem levar em consideração a natureza da relação, isto é, se parasítica ou mutualísta. A simbiose de BFNN com leguminosas é geralmente subentendida como sendo mutualista. No entanto, simbioses de BFNN podem ser parasíticas (quando há formação de nódulos inefetivos) ou mutualistas (nódulos eficientes). Nesse último caso, porém, ocorre um estádio inicial parasítico transitório quando a bactéria está recebendo fotossintatos da planta sem ainda fixar nitrogênio e transferi-lo para a planta.

As etapas fundamentais para o estabelecimento da simbiose são os seguintes:

a) pré-infecção (reconhecimento dos simbiontes e interações entre superfícies das bactérias e da planta);

b) infecção da planta pela bactéria e formação do nódulo; c) funcionamento dos nódulos, i.e., a fixação de nitrogênio.

Todas essas etapas dependem e podem variar em função dos genótipos da planta e da estirpe envolvidos, assim como de fatores ambientais. Em BFNN, já são conhecidos pelo menos 60 genes envolvidos no processo, que interferem desde o reconhecimento da planta hospedeira pela estirpe de bactéria até o transporte de substrato carbonáceo da planta para o bacteróide dentro do nódulo. A maioria dos genes para nodulação e fixação de nitrogênio dos gêneros Bradyrhizobium, Azorhizobium e Mesorhizobium localiza-se no cromossomo; já os gêneros Rhizobium e Sinorhizobium têm os genes localizados em plasmídeos de alto peso molecular denominados de plasmídeos Sym (pSym). Sua localização em plasmídeos torna essas caracterísiticas mais instáveis, uma vez que os plasmídeos podem ser perdidos em condições ambientais adversas, como altas temperaturas, o que dificulta seu manejo. No entanto, a transferência vertical ou horizontal de plasmídeos é fonte importante de diversidade na comunidade microbiana no solo.

Estirpes de BFNN e espécies de leguminosas podem variar de altamente específicas até altamente promíscuas, se são capazes de estabelecer simbiose com poucos parceiros ou com vários parceiros. Por exemplo, espécies de gêneros como

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de mais de um gênero de BFNN, sendo consideradas, portanto, promíscuas. Enquanto outras espécies como Sesbania virgata só são noduladas por poucas espécies de BFNN (Moreira et al., 2006), são consideradas específicas. Já com relação às BFNN, a estirpe NGR234, que foi isolada de Lablab purpureus, é considerada, atualmente, a mais promíscua, pois é capaz de nodular hospedeiros de 112 gêneros de Leguminosae, além de Parasponia andersonii (Broughton et al., 2000). Não existe relação entre a filogenia de micro e de macrossimbiontes, uma vez que um mesmo genêro de bactéria pode nodular várias tribos (e até gêneros) de Leguminosae e uma mesma tribo/gênero pode ser nodulada por vários gêneros de bactéria (Moreira et al., 1993, 1998). Apesar dos diversos gêneros de BFNNL já terem sido isolados no Brasil, o gênero Bradyrhizobium destaca-se, uma vez que boa parte das espécies florestais e herbáceas (forrageiras, grãos, adubação verde) nativas tem espécies desse gênero como microsimbionte. Sua ampla ocorrência nessas simbioses conflita com relatos de diversos autores indicando que Bradyrhizobium foi introduzido no Brasil com os primeiros inoculantes vindos dos EUA para a soja.

Como já mencionado, os genes de nodulação e fixação de nitrogênio de Bradyrhizobium são localizados no cromossomo, tornando essas características mais estáveis. Como exemplo, a estirpe INPA 3-11B identificada como Bradyrhizobium, isolada e selecionada para caupi (vasos de Leonard) em 1982 na Amazônia, não perdeu sua superior eficiência simbiótica, mesmo 25 anos após seu armazenamento em culturas liofilizadas, quando foi submetida a outras etapas de seleção que culminaram com sua indicação como inoculante de caupi (Moreira, 2005). O mesmo fato ocorreu com as estirpes inoculantes de soja: SEMIA 587 e BR 29 (SEMIA 5019), pois essas têm sido utilizadas como inoculantes desde 1968 e 1979 respectivamente (Freire & Vernetti, 1999). Já, estirpes de R. leguminosarum recomendadas previamente para feijão, como SEMIA 4064, V-23 e C-05 tiveram que ser substituídas, pois perderam sua característica de eficiência. Assim, a predominância de simbioses com Bradyrhizobium indica que a FBN em parcela significativa das espécies nativas brasileiras é mais promissora com relação ao seu manejo e que, portanto, temos um potencial imenso a ser explorado.

Fatores limitantes a FBN em leguminosas

Diversos fatores biológicos, químicos e físicos, podem interferir nos diversos passos que levam à simbiose mutualista. Assim, a ausência de nodulação ou nodulação

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ineficiente em determinada espécie sob determinadas condições edáficas e ambientais, é decorrente de fatores limitantes ao estabelecimento, desenvolvimento e funcionamento da simbiose. Tanto os fatores bióticos como os abióticos podem atuar sobre a bactéria e/ou sobre o hospedeiro, afetando a simbiose, e seus efeitos também podem variar, dependendo das espécies simbiontes envolvidas.

Os fatores limitantes das simbioses BFNN-leguminosas, podem ser agrupados em:

a) características intrínsecas da espécie hospedeira;

b) edáficos- pH associado ou não a toxicidade por Al e Mn; praticas de manejo como calagem e adubação; antibióticos produzidos pelas comunidades microbianas nativas; deficiências de macro e micronutrientes, exceto N-mineral cujo excesso inibe a FBN; elementos tóxicos; defensivos agrícolas; umidade e salinidade;

c) climáticos- temperatura, pluviosidade, luminosidade; d) população nativa de BFNNL.

Inoculação de leguminosas com BFNNL: a tecnologia e a contribuição

Nem sempre a população nativa do solo é capaz de estabelecer uma simbiose mutualísta com o hospedeiro cultivado, sendo, então, necessária a inoculação de estirpes selecionadas para a espécie vegetal-alvo. A necessidade de inoculação deve então ser verificada. A reinoculação, ou seja, a inoculação em áreas previamente inoculadas, dependerá de alguns fatores. Solos com características físico-químico-biológicas favoráveis e/ou cultivo continuo da espécie vegetal-alvo garantem a sobrevivência das bactérias introduzidas em números elevados que garantem boa nodulação do cultivo posterior e, conseqüentemente, não necessitam ser reinoculados. Como exemplo, Campos & Gnatta (2006) atribuíram a ausência de resposta à reinoculação da soja, em área de plantio direto no Rio Grande do Sul, a números adequados das populações de Bradyrhizobium estabelecidas. Já, o uso contínuo da leguminosa pode diminuir a relação C:N da matéria orgânica e levar a inibição da nodulação em vista do acúmulo de nitrogênio no solo; nesse caso, a cultura não responderá nem à reinoculação nem à adubação nitrogenada. De modo geral, é difícil identificar, a curto prazo, as condições ambientais e biológicas que indiquem a necessidade da reinoculação; assim, como o custo do inoculante é baixo, tem-se recomendado essa prática.

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pesquisa. Além da eficiência, essas estirpes devem apresentar outras características, como ser boas competidoras por sítios de infecção com relação às estirpes nativas e ter boa sobrevivência e adaptação às condições edáficas e climáticas. O processo de seleção de estirpes para determinada espécie vegetal envolve, de modo geral, quatro estádios. No primeiro é verificada, em câmara de crescimento (condições ótimas e controladas de temperatura, umidade, luminosidade e nutrientes), a capacidade de nodular e fixar nitrogênio de um número elevado de estirpes, testadas separadamente em recipientes menores (tubos, sacos plásticos ou outros tipos de frascos de vidro autoclavável) com solução nutritiva livre de nitrogênio na forma mineral, com ou sem ágar em condições estéreis. No segundo estádio, estirpes selecionadas são testadas em recipientes maiores com solução nutritiva livre de N mineral, contendo ou não mistura de areia e vermiculita, ou outro suporte, esterilizados (e.g.vasos de Leonard), em casa de vegetação. Nos estádios seguintes, estirpes selecionadas são testadas em vasos com solo na casa de vegetação e, depois, em experimentos de campo. Estirpes que não tenham bom desempenho nos estádios iniciais de seleção são eliminadas, pois, se não estabelecem simbiose eficiente em condições nutricionais e ambientais adequadas, também não o farão nas condições mais estressantes do solo. Em todos esses estádios, são adicionados três tratamentos controle; 1. sem inoculação; 2. com nitrogênio mineral, e 3. com estirpe eficiente previamente selecionada para a espécie (caso exista) e/ou uma reconhecidamente nodulífera na espécie. O primeiro controle visa verificar se as condições de assepsia foram adequadas e, conseqüentemente, a ausência de contaminação no experimento. Caso ocorram nódulos nesse controle, o experimento está perdido. O segundo controle serve como referência para verificar o grau de eficiência da estirpe (que pode também ser comparada ao controle 1). O terceiro serve também como referência para avaliação da eficiência das estirpes testadas. Além disso, esse indica se as condições experimentais foram adequadas para expressão da nodulação e fixação biológica de N2.

No Brasil, estirpes de BFNN já foram selecionadas para 94 espécies vegetais (Tabela 1). Essa lista de estirpes e sua identificação é um dos documentos sendo revisados pelo grupo de trabalho. A manutenção e o controle da coleção oficial dessas estirpes são feitos pelo FEPAGRO (prefixo SEMIA). A produção de inoculantes é feita por diferentes empresas existentes no mercado brasileiro. No entanto, em 2003, cerca de 26% dos inoculantes foram importados principalmente do Uruguai e da Argentina. A maior parte do inoculante produzido (72%) é uma mistura de turfa com pH neutralizado

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Tabela 1. Estirpes de bactérias fixadoras de nitrogênio recomendadas pela RELARE e autorizadas pelo MAPA para produção de inoculantes para diversas leguminosas no Brasil. Espécie de leguminosa Designação original (Publicação) * Designação SEMIA** Designação BR*** ou LMG**** Base de Recomendação e Instituição***** Identificação******

Leguminosas de grãos, adubação verde e forrageiras

Arachis hypogaea USDA3187 6144 1405 IV – IAC (SMS 400) Bradyrhizobium sp. (9) Cicer arietinum TAL1148 396 4507 IV – FEPAGRO/UFRGS Mesorhizobium ciceri (11) Glycine max SEMIA 587, CNPAB-29W (1) -, 5019 96, 29 IV –FEPAGRO/UFRGS, CNPAB Bradyrhizobium elkanii (2)

CPAC7, CPAC15 (2) 5080, 5079 86, 85 IV – Embrapa Cerrados Bradyrhizobium japonicum (6) Lens esculenta SEMIA344; CPAC-L3; CPAC-L12

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-,3025, 3026 4504, 4505, 4506 II – FEPAGRO/UFRGS, Embrapa Cerrados.

Rhizobium sp. (9) Phaseolus vulgaris PRF81 (4), CIAT 899, 4080, 4077 520, 322 IV – Embrapa Soja/CIAT,IAPAR Rhizobium tropici (1, 6) Pisum sativum B-11A; CPAC-EV6 (5) 3007, 3012 619, 618 IV – FEPAGRO/UFRGS,

Embrapa Cerrados

Rhizobium sp. Vigna unguiculata UFLA 3-84 e INPA3-11B (6)

BR3267 (7)

6461, 6462 6463

3302, 3301 IV-UFLA, Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium sp. (10) Cajanus cajan CPAC-IJ,CNPAB-11a 6156, 6157 2003, 2801 IV – Embrapa Cerrados

II – Embrapa Agrobiologia

Bradyrhizobium var.k72, k8, Peru (9)

Centrosema spp. CNPAB-C100 e CNPAB-C106, CPACL36(8), CIAT2380 690, 6146, 6424, 6425 1804, 1808, 1836, 1837 IV – Embrapa Agrobiologia, CPAC/FEPAGRO/UFRGS Bradyrhizobium sp.(9)

Desmodium canum TAL569 6028 2207 II Bradyrhizobium sp. (9)

D. intortum SEMIA656 1010 II Bradyrhizobium sp. (9)

D. ovalifolium CIAT2372, CIAT4099 6208, 6209 2212, 2214 III Bradyrhizobium sp. (9) Galactia striata CB627 = SMS138, SMS300 6149, 6150 3101, 3102 II Bradyrhizobium sp. (9) Indigofera hirsuta CPAC-IJ, CPAC-42 6156, 6158 2003, 2811 III Rhizobium sp. (9) Lablab purpureus CB-188, QA-922 662, 695 2404, 2405 II

Lotononis balnesii CB756 658 3001 III Rhizobium sp. (9)

Macroptilium

atropurpureum SEMIA656 - 1010 II Bradyrhizobium sp. (9)

Macrotyloma axilares SMS138 = CB627 6149 3101 II

Neonotonia wigthii SEMIA656, SMS303 idem, 6148 1010, 1009 III Bradyrhizobium sp. (9) Stylosanthes sp. CNPAB-H8, CNPAN-365 6154, 6155 446, 502 III Bradyrhizobium sp.

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Continuação… Espécie de leguminosa Designação original (Publicação)* Designação SEMIA** Designação BR*** ou LMG**** Base de Recomendação e Instituição***** Identificação****** Adesmia latifolia 6437, 6438

Lathyrus odoratus TAL364, SEMIA3018 388 4508, 4503 II Rhizobium sp. (9) Lotus corniculatus SEMIA806, SEMIA 816 7802, 7803 IV – FEPAGRO/UFRGS Mesorhizobium sp. (9)

L. pedunculatus SEMIA839 7804 Mesorhizobium sp. (9)

L. subflorus 848, 849 Mesorhizobium sp. (9)

L. tenuis SEMIA830 7805 Mesorhizobium sp. (9)

Medicago polymorpha 103 Sinorhizobium sp. (9)

M. sativa USDA1088; SEMIA134 e 135 116, -, - 7407, 7408, 7409 IV – FEPAGRO/UFRGS Sinorhizobium sp. (9)

Ornithopus sativus 905, 929 Bradyrhizobium sp. (9)

Trifolium pratense TA-1, U-26 222, 265 7601, 7602 IV Rhizobium leguminosarum (9) T. repens TA-1; U-26 222, 235 7601, 7602 IV – FEPAGRO/UFRGS Rhizobium leguminosarum (9)

T. semipilosum 2002 Rhizobium leguminosarum (9)

T. subterraneum 222,265 7601, 7602 Rhizobium leguminosarum (9)

T. vesiculosum SEMIA2050, SEMIA2051 2050, 2051 7603, 7604 II Rhizobium leguminosarum (9)

Vicia sativa SEMIA384 610 II Rhizobium leguminosarum (9)

Calopogonium spp. CNPAB-CM7 6152 1602 IV – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium sp. (9) Canavalia ensiformis CPAC-IJ, CPAC-42 6156, 6158 2003, 2811 III Bradyrhizobium sp. (9) Crotalaria juncea CNPAB-CJI,CPAC-IJ 6145, 6156 2001, 2003 II, IV Bradyrhizobium sp. (9) C. spectabilis CPAC-IJ; CPAC-42 6156, 6158 2003, 2811 IV – Embrapa Cerrados Bradyrhizobium sp. (9) Cyamopsis

tetragonoloba CNPAB-CJ1; SMS561 6145, 6319 2001, 1404 II

Lupinus sp. W-72, SEMIA938 928, - 9076, 9077 III Rhizobium sp. (9) Pueraria phaseoloides DF-Q1 6175 2613 III – Embrapa Cerrados Bradyrhizobium sp. (9) Stizolobium

aterrimum CPAC-42 6158 2811 IV – Embrapa Cerrados

Bradyrhizobium sp. (9) Leguminosas florestais

Acacia angustissima BR3629, BR3630 (9) 6429, 6430 III – Embrapa Agrobiologia A. auriculiformis BR3609, BR3624 (9) 6387, 6391 LMG9961,

LMG9968

III – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium japonicum, B. elkanii (3)

A. decurrens BR3608, BR3614 (9) 6164, 6390 LMG9960, LMG9964

II – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium japonicum, BurkholderIa (3,10)., Continua...

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Continuação... Espécie de leguminosa Designação original (Publicação)* Designação SEMIA** Designação BR*** ou LMG**** Base de Recomendação e Instituição***** Identificação******

A. farnesiana BR3630, BR9002 (9) 6430, 6436 III – Embrapa Agrobiologia Burkholderia sp.(10)

A. mearnsii BR3607, BR3608 (9) 6163, 6164 -,LMG9960 II – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium japonicum (3) A. mangium BR3609, BR 3617 (9) 6387, 6420 LMG9961,

LMG9965

III – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium japonicum, B. elkanii (3,4)

A. podalyriaefolia BR3611, BR3612 (9) 6388, 6389 LMG9962, MG9963 II – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium japonicum, B. elkanii (3)

A. salicina BR3804, BR5005 (9) 6392, 6400 LMG9970 III – Embrapa Agrobiologia Mesorhizobium plurifarium (3, 4, 5)

A. saligna BR3628, BR8601 (9) 6096, 6428 II – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium elkanii (10) Acosmium nitens BR4901, BR4902 (9) 6443, 6444 III – Embrapa Agrobiologia

Albizia lebbeck BR5610, Br5611 (9) 6160, 6432 LMG9998 II – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium elkanii (3,4) Balizia pedicellaris BR6815, BR6816 (9) 6396, 6408 LMG10008-10009 II – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium/Rhizobium

sp.(3)

Bowdichia virgiloides BR8603, BR8604 (9) 6096,6414 III – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium sp.******* Calliandra callothirsus

e C.surinamensis BR4301, BR4302 (9) 6395, 6423 LMG9978 III – Embrapa Agrobiologia Rhizobium sp. (3,10) Chamaecrista

ensiformis

BR3804 (9) 6392 LMG9970 II – Embrapa Agrobiologia Mesorhizobium plurifarium (3, 4, 5)

Clitoria farchildiana BR8003, BR8005 (9) 6411, 6412 LMG10011, LMG10012

III – Embrapa Agrobiologia Rhizobium sp. Burkholderia sp. (3, 10) Dalbergia nigra BR8402, BR8404 (9) 6413, 6101 LMG10015;

LMG10017

III – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium elkanii (3,4) Dimorphandra jorgei BR5004, Br5005 (9) 6099, 6400 LMG9989 II – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium elkanii (3,10) Enterolobium

contortsiliquum

BR4406 (9) 6159 LMG9980 III – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium elkanii (3,4) E. cyclocarpum BR4406, BR6205 (9) 6159, 6403 LMG9980 II – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium elkanii (3,4) E. timbouva BR4406

BR4407 (9)

6159, 6397 LMG9980 LMG9981

III – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium elkanii (3,4) Bradyrhizobium japonicum (3) Erythrina poeppiginna BR3611 (9) 6388, 6426 LMG9962 II – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium japonicum (3) E. verna BR5609 (9) 6388, 6100 LMG9997 III – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium elkanii (3,4)

. Continua...

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Continuação... Espécie de leguminosa Designação original (Publicação)* Designação SEMIA** Designação BR*** ou LMG**** Base de Recomendação e Instituição***** Identificação****** E. speciosa BR4101, 4301 (9) 6393, 6395 LMG9978 LMG9974

II – Embrapa Agrobiologia Ochrobactrum sp. , Rhizobium sp., (3,10) Falcataria molucana (Paraserianthes fal-cataria,Albizia falcata) BR5609 BR5611 BR5612 (9) 6100, 6432, 6169 LMG9997, LMG9998

III – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium elkanii (3,4)

Gliricidia sepium BR8801

BR8802 (9) 6168, 6435

LMG10132, LMG10020

III – Embrapa Agrobiologia Rhizobium leguminosarum (3,4,11)

Inga marginata BR6609, BR 6610 (9) 6433, 6434 III – Embrapa Agrobiologia Leucaena diversifolia BR827

BR3608 (9) 6153, 6164

LMG9956 LMG9960

III – Embrapa Agrobiologia Sinorhizobium fredii (3,4) Bradyrhizobium japonicum (3,4) L. leucocephala var.

k72, k8, Peru

BR827, BR814 (9) 6153, 6069 LMG9956 LMG9952

III – Embrapa Agrobiologia Sinorhizobium fredii (3,4) Rhizobium sp. (3, 4) L. leucocephala var. cunningham DF-10 BR827 (9) 6069, 6153 814/ LMG9952 LMG9956

III – Embrapa Cerrados e Agrobiologia

Rhizobium sp. (3, 4) Sinorhizobium fredii (3,4) Lonchocarpus costatus BR6009, BR6010 (9) 6399, 6404 LMG10001

LMG10002

II – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium elkanii (3,4,10) Melanoxylon brauna BR3901 (9) 6381 LMG9971 II – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium japonicum(3,10) Mimosa acutistipula BR3407, BR3446 (9) 6383, 6384 II – Embrapa Agrobiologia Burkholderia sp.(7,10)

M. bicromata BR3460, BR3461 (9) 6386, 6421 III – Embrapa Agrobiologia Burkholderia gladioli (7,10) M. caesalpiniifolia BR3405, BR3451 (9) 6382, 6410 III – Embrapa Agrobiologia Burkholderia caribensis (7,10) M. floculosa BR3462, BR3463 (9) 6417, 6422 III – Embrapa Agrobiologia Burkholderia sp.(7,10)

M. scabrella BR3454 (9) 6165 III – Embrapa Agrobiologia Burkholderia mimosarum(7, 12) Ormosia nítida BR4101, BR4103 (9) 6393, 6394 LMG9974 II – Embrapa Agrobiologia Ochrobactrum sp (3,10) Parapiptadenia rígida BR827, BR9002 (9) 6153 II – Embrapa Agrobiologia Sinorhizobium fredii,

Burkholderia sp.( (3, 4,10) P. pterosperma BR9001, BR9004 (9) 6415, 6416 II – Embrapa Agrobiologia Burkholderia tropica (10)****** Piptadenia

gonoagantha

BR3452, UFC-832.55 (9) 6385 (= 6167), 6398

-, BR4812 III – Embrapa Agrobiologia Pithecellobium tortum BR6812, BR6813 (9) 6406, 6407 II – Embrapa Agrobiologia

Continua...

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...Conclusão Espécie de leguminosa Designação original (Publicação)* Designação SEMIA** Designação BR*** ou LMG**** Base de Recomendação e Instituição***** Identificação******

Poecilanthe parviflora BR8205 (9) 6403 LMG10014 II – Embrapa Agrobiologia Bradyrhizobium japonicum (3) Prosopis juliflora CNPAB4002; UFC-933.52 (9) 6161, 6162 4002, 4007

LMG9972

III – Embrapa Agrobiologia Sinorhizobium sp. (3,4) Pseudosamanea (syn.

Albizia) guachapele

BR6205, BR6821 (9) 6403, 6409 III – Embrapa Agrobiologia B. elkanii (3) ****** Samanea saman BR6205, BR6212 (9) 6403, 6405 III – Embrapa Agrobiologia B. elkanii (3) ****** Sclerolobium

paniculatum

BR3617, BR5610 (9) 6420, 6160 LMG9965 II – Embrapa Agrobiologia B. elkanii (3,4), ****** Sesbania virgata Sm 1, Sm 5 (9) 6401, 6402 5401, 5404

LMG9993,MG9994

III – Embrapa Agrobiologia Azorhizobium doebereinerae (3,4,8)

Tipuana tipu SEMIA6192 - II – FEPAGRO/UFRGS Bradyrhizobium sp. (9)

*(1) Peres & Vidor (1980); Vargas & Suhet, 1981); (2) Peres et al. (1993); (3) Vargas et al. (1994); (4) Hungria et al. (2000); (5) Peres et al. (1984,1989); (6) Lacerda et al. (2004);) (7) Martins et al. (2003);.(8) Vargas et al (1993); (9) Faria (1997), Faria & Melo (1998), Faria & Guedes (1999), Faria (2000), Faria (2002), Faria & Franco (2002). **Acrônimo para a coleção de culturas do MIRCEN/FEPAGRO/UFRGS; ***Acrônimo para a coleção de culturas da EMBRAPA-Agrobiologia; ****Acrônimo para Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent, Bélgica, estirpes publicadas em Moreira et al. (1993)*****I - Em tubos; II - Vasos de Leonard; III - Vasos com solo; IV - Experimentos de campo; ****** Estirpes assinaladas em negrito na primeira coluna indicam a existência de publicações sobre sua identificação: (1) Martinez-Romero et al. (1991); (2) Rumjanek et al. (1993); (3) Moreira et al. (1993); (4) Moreira et al. (1998); (5) De Lajudie et al. (1998); (6) Chueire et al., (2003); (7) Chen et al. (2005); (8) Moreira et al. (2006), (9)-Moreira ( 2006); (10)- Moreira- seqüências apresentadas em congressos; (11) provisoriamente baseada em espécies hospedeiras específicas listadas na tabela 18.3 até confirmação.(12) Chen et al. (2006) *******Identificação baseada em dados sobre estirpes homólogas( i.e. isoladas da mesma espécie e com mesma origem e característica cultural) publicados nas referências (3) e/ou (4).Outros acrônimos e abreviações para códigos das estirpes:

B= México; CB= CSIRO, Div. Of Tropical Crops and Pastures, Brisbane, Austrália; CIAT= Centro Internacional de Agricultura Tropical - Cali, Colômbia; CNPAB= EMBRAPA/CNPAB - Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia - Seropédica, RJ, Brasil; CPAC= EMBRAPA/CPAC - Centro de Pesquisa Agropecuária dos Cerrados - Planaltina, DF, Brasil; DF = ver CPAC; QA = Plant Pathology Culture Collection-Quensland, Austrália; IAC= Instituto Agronômico de Campinas, SP, Brasil; INPA= Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, AM, Brasil; Sm = Ver Embrapa agrobiologia; TA = Bacteriology Laboratory, Dept. of Agriculture - Launceston, Tasmânia, Austrália; TAL= Nitrogen fixation in tropical agriculture legumes project (NiffTAL)´Hawaii-EUA; UFLA= Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG, Brasil; U = Ministerio de Granaderia y Agricultura – Montevideo, Uruguai; UFC = Universidade Federal do Ceará - Fortaleza, CE, Brasil; UMR = University of Minnesota, EUA; USDA= United State Dept. of Agriculture - Beltsville, Maryland, USA; w = Wait Agricultural Research Institute, Adelaide, Austrália.

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e cultura líquida de estirpes de rizóbio recomendadas (3:1 V/V). De acordo com padrões estabelecidos pelo MAPA, a turfa deve ser esterilizada para evitar propagação de outros organismos indesejáveis ou que possam afetar a sobrevivência de BFNNL. Em virtude do grande volume de inoculantes produzido, o método empregado é o de radiação gama proveniente do 60CO. Os outros tipos de inoculante são o líquido e o pó molhável, representando, respectivamente, 18 e 10% da produção total. A instrução normativa no 5 (de 6 de agosto de 2004), publicada no Diário Oficial da Uniâo (IN e sua retificação

nos links: http://www.agricultura.gov.br/pls/portal/docs/PAGE/MAPA/LEGISLACAO/PUBLICA COES_DOU/PUBLICACOES_DOU_2004/PUBLICACOES_DOU_AGOSTO_2004/D O1_10.08.2004.PDF http://www.agricultura.gov.br/pls/portal/docs/PAGE/MAPA/LEGISLACAO/PUBLICA COES_DOU/PUBLICACOES_DOU_2004/PUBLICACOES_DOU_AGOSTO_2004/D O1_13.08%5B1%5D), estabeleceu, entre outros, que:

1- todos os inoculantes devem apresentar 1,0 X 109 células viáveis por grama ou mililitro do produto, até a data de seu vencimento;

2- ser elaborados em suporte estéril e estar livres de microrganismos não especificados em fator de diluição 1 X 10-5_;

3- o suporte ou veículo deverá fornecer todas as condições de sobrevivência ao microrganismo;

4- o inoculante deverá ser elaborado em suporte sólido, fluido ou com outra característica, desde que atendam aos requisitos anteriores;

5- o prazo de validade dos inoculantes será de 6 meses a partir da data de fabricação. O controle de qualidade nos inoculantes utilizados no País é feito por órgão competente ligado ao MAPA. Em termos de números de células, a qualidade dos inoculantes brasileiros se iguala aos produzidos na França, no Canadá, na Austrália e no Uruguai, onde também são controlados por agências governamentais (Sadowsky & Graham, 2000).

A IN de 2004 também fornece a relação das estirpes de microrganismos autorizadas para produção de inoculantes no Brasil. Desde então, novas estirpes foram incorporadas e, outras, substituídas, como as de caupi. Além disso, nessa relação, a identificação ao nível de espécie ou genêro de muitas estirpes recomendadas para espécies florestais, não estava correta, na época de acesso do site (janeiro, 2006). Essa lista está atualmente sendo revisada por grupo de trabalho do MAPA e com algumas

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exceções (algumas estirpes foram retiradas e a identificação atualizada). Na tabela 1 várias estirpes estão indicadas com a identificação correta, assim como o número das coleções de onde se originaram e/ou onde foram selecionadas, além do número da coleção oficial. Deve-se considerar, também, que novas estirpes eficientes e adaptadas para condições locais podem ainda ser selecionadas, uma vez que, até o momento houve pouca difusão da tecnologia de inoculação para outras espécies que não a soja, fato esse que as tornou relativamente pouco testadas em ampla faixa de condições. Adicione-se, a isso, a diversidade de condições edáficas e climáticas existentes em nosso País que podem requerer estirpes adaptadas específicas.

A inoculação no momento do plantio pode ser simples ou com peletização. Na simples, faz-se uma pasta do inoculante com o mesmo volume de água ou solução açucarada (10 ou 15%) e mistura-se às sementes de acordo com as proporções indicadas pelos fabricantes. Na inoculação com peletização, junta-se o adesivo ao inoculante, formando uma pasta homogênea que é misturada às sementes, em seguida, adiciona-se calcário e/ou micronutrientes, ou fosfato de rocha. Em ambos os casos, as sementes inoculadas são secas à sombra e plantadas imediatamente, uma vez que as bactérias são sensíveis ao calor excessivo e perderão a viabilidade mais rapidamente se expostas à pressão parcial de oxigênio da atmosfera e se não forem expostas ao estímulo do efeito rizosférico, entre outros.

O uso de inoculantes de rizóbio em diversas culturas, substituindo total ou parcialmente os adubos nitrogenados, propicia uma economia significativa nos custos de produção. Quantidades significativas de nitrogênio são fixadas biologicamente em diversas espécies.

No Brasil, o melhor exemplo é a soja. A área plantada com essa cultura foi de 21,376 milhões de hectares (englobando as cinco regiões do Brasil) em 2003, resultando na segunda maior produção entre as lavouras temporárias em 2004: 49.793 mil toneladas de grãos com produção média de 2,329 t/ha (http://www.agricultura.gov.br). Considerando que os grãos apresentam 87% de matéria seca, obtiveram-se 43.320 mil toneladas de grãos secos, que, com 6% de N, continham 2.600 mil toneladas de N que foram então exportadas da lavoura. Como o N nos grãos representa em média, 80% do N total da planta, o conteúdo total de N na planta foi de 3.249 mil toneladas. A contribuição da FBN em soja, calculada por técnicas isotópicas, é relatada como sendo de no mínimo, 70 % (Urquiaga & Zapata, 2000); assim, foram fixados, pelo menos,

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fornecida por fertilizantes nitrogenados teríamos que considerar a eficiência do adubo nitrogenado de 60%, sendo então necessárias 3.790 mil toneladas de N-fertilizante. Como a uréia contém 46% de N, o total de fertilizante nitrogenado requerido seria de 8.240 mil toneladas, que, a 170 dólares/tonelada (F & P, frete e porto-outubro de 2003), custariam, aproximadamente, 1,4 bilhão de dólares. Esse valor representou uma economia significativa para o País, proporcionada pela inoculação com estirpes de rizóbio selecionadas que substituíram os fertilizantes nitrogenados.

Em 2003, a dose do inoculante custou, em média, R$4,00. O peso da dose e a concentração de células variam de acordo com o fabricante (instruções de uso são indicadas em cada produto), mas geralmente é de 200 g; o importante é que resulte, no mínimo, em 600.000 células por semente. Esse número é obtido pela fórmula: concentração de células no inoculante (no g-1) X dose (g)/350.000 (número médio de sementes por saca de 50 kg). Uma dose é geralmente suficiente para inocular 50 kg de sementes que, de modo geral (dependendo da cultivar), são suficientes para semear 1 hectare. Dados do MAPA mostram que, em 2003, utilizaram-se 26,4 milhões de doses (sendo 99% para soja). Foram gastos, então, cerca de 106 milhões de reais (cerca de 37 milhões de dólares) com inoculantes que substituíram a adubação nitrogenada, indicando uma economia considerável no custo de produção da cultura. Ressalte-se ainda, que, em 2003, consumiram-se em todas as culturas no Brasil 2.295 mil toneladas de N na forma de fertilizantes nitrogenados (dos quais cerca de 75% importados) (www.anda.org.br). Essa quantidade foi quase igual ao N fixado biologicamente na soja (ver cálculos do parágrafo anterior), o que também ressalta a importância da biotecnologia de inoculação com organismos diazotróficos e, conseqüentemente, da FBN na agricultura brasileira.

Considerando a imensa diversidade de leguminosas no Brasil e sua utilização econômica, além da disponibilidade de inoculantes para parte significativa das espécies de importância econômica, verifica-se que o uso dessa biotecnologia na agricultura poderia ser ampliada, uma vez que apenas 1% dos inoculantes produzidos foi aplicado em outras culturas. Para tal, é necessária maior difusão dessa biotecnologia de baixo custo, principalmente para os pequenos agricultores, que são os principais responsáveis pela produção de culturas como o feijão-comum (Phaseolus vulgaris) e feijão-caupi (Vigna unguiculata), entre as mais consumidas na dieta dos brasileiros. A área colhida destas culturas foi de 4,091 milhões de hectares (IBGE) em 2003, com produção de 3.302 mil toneladas. A baixa produtividade média (807 kg ha-1), devida ao uso de

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poucos insumos, poderia ser aumentada pela FBN, que embora no feijão-comum ainda tenha algumas limitações que impedem uma eficiência similar à da soja, no feijão-caupi, tais limitações parecem não ocorrer. Isso, principalmente porque, apesar de ser bastante promíscuo, o caupi nodula e responde bem à inoculação com estirpes de Bradyrhizobium, cujos genes de nodulação e FBN se situam no cromossomo e, portanto, têm maior estabilidade. Ademais, é uma espécie bastante tolerante a temperaturas elevadas, incluindo sua simbiose com bactérias fixadoras de N2. Pouco conhecido, no Sul e no Sudeste do Brasil, essa espécie é bastante consumida no Norte e Nordeste. Seus nomes populares são feijão-de-corda, feijão-miúdo e feijão-macáçar, e é com ele que se faz o acarajé da Bahia. Experimentos de eficiência agronômica com inoculação das estirpes INPA3-11B e UFLA 3-84 testadas nas variedades BR14-Mulato, BR08-Caldeirão e Poços de Caldas foram desenvolvidos no Sudeste, com aplicação relativamente baixa de insumos (apenas adubação de 70 kg ha-1 de P2O5 e 40 kg ha-1

K2O usando como fontes o superfosfato simples e o cloreto de potássio), e em solos com pH variando de 4,9 a 5,9. Nessas condições, os tratamentos com inoculação aumentaram significativamente a produção para 950 a 1.340 kg ha-1 de grãos, equivalendo a adubação nitrogenada de 70 a 80 kg ha-1 N-uréia (Lacerda et al., 2004, Soares et al., 2004, Moreira, 2005). Essas estirpes estão entre aquelas aprovadas pelo MAPA.

O aumento da FBN pela prática de inoculação pode contribuir direta (e.g. soja, caupi) ou, indiretamente, no aumento de produção para outras culturas não fixadoras, pois leguminosas fixadoras de nitrogênio podem-se empregar como adubo verde. O nitrogênio fixado é transferido para elas de diferentes formas. O conceito clássico dessa prática é a incorporação ao solo de massa vegetal, não decomposta, oriunda de plantas cultivadas no local ou importada, com a finalidade de preservar e/ou restaurar a produtividade das terras agricultáveis. Esse conceito foi ampliado (Calegari et al., 1993) e engloba, atualmente, o uso de plantas em rotação, sucessão ou consorciação, incorporando-as ou deixando-as na superfície, visando ao seguinte:

a) cobertura e proteção superficial do solo;

b) manutenção e/ou melhoria das características físicas, químicas e biológicas; c) aração biológica e introdução de microrganismos em profundidade;

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Estudos utilizando técnicas empregando o isótopo 15N mostram que leguminosas usadas como adubação verde, no Brasil, podem ter entre 52 e 96% de todo o nitrogênio fornecido pela FBN. Mesmo leguminosas de grãos podem contribuir com N fixado para outras culturas consorciadas. Caupi contribuiu com 48 kg N ha-1 para o milho tanto em cobertura como incorporado (Urquiaga & Zapata, 2000). A poda de leguminosas, em sistemas consorciados com leguminosas arbóreas ou arbustivas (aléias), pode adicionar ao solo nitrogênio em quantidades maiores que 50 kg ha-1. Espécies de crescimento rápido, biomassa abundante e adequado rebrotamento são indicadas para tal prática; entre essas, destacam-se Leucaena spp. e Gliricidia sepium (Dommergues, 1995). Além da decomposição do material vegetal rico em N, outras contribuições significativas são pela decomposição dos nódulos, que tendem a se soltar das raízes após a poda, e exsudação das raízes e nódulos não destacados durante a poda, podendo a excreção de N por raízes e nódulos também ocorrer em outras condições, além da poda. A contribuição indireta do processo da FBN, através de todos esses mecanismos, pode representar a adição ao solo de 160 kg N ha-1. Hifas de fungos micorrízicos podem promover a transferência de nutrientes, incluindo o N, entre espécies vegetais.

Portanto, a expansão do uso de leguminosas inoculadas com bactérias fixadoras de nitrogênio representa uma ferramenta importante para o aumento da produção agrícola, florestal e pastoril brasileira, não só de leguminosas, mas também de espécies não leguminosas em sistemas onde elas estejam associadas.

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Organização e composição da equipe, perfil e qualificação e envolvimento no projeto

A maior parte dos pesquisadores listados abaixo faz parte dos grupos de pesquisa do CNPq: Microbiologia e Bioquímica do Solo, BIOSBrasil e Manejo e Produção de Leguminosas.

Nome Título e Instituição Atividade no Projeto Fátima Maria

de Souza Moreira

Eng° Agrônomo - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro - UFRRJ - BRASIL

Msc: Ciencias Biológicas – Convênio INPA/UFAM PhD. UFRRJ/Ghent University (Bélgica).

Professora Associada da Universidade Federal de Lavras

Bolsista de Produtividade em Pesquisa Nível 1C do CNPq

-Coordenação

-Desenvolvimento e avaliação de técnicas de amostragem e controle de qualidade em indústria de produção de inoculantes, utilizando a unidade piloto a ser implantada inicialmente na UFLA. Esta linha de pesquisa visa principalmente definição de técnicas de amostragem e análise de dados mais repetíveis e com menor chance de ocorrência de erros, com definição de procedimentos mínimos de avaliação estatística dos dados.

-Realização e coordenação de experimentos de campo em diversas áreas, testando estirpes recomendadas e potencialmente recomendadas para caupi, leguminosas forrageiras e adubos verdes. Além disto, estes experimentos servirão de base para avaliação de efeitos de

armazenamento e outros procedimentos ligados ao inoculante, inclusive de formulações para o mesmo

-Realização de dias de campo sobre a técnica de inoculação,

-Orientação de alunos de Iniciação Científica, Mestrado e Doutorado em temas relacionados com as duas linhas de pesquisa acima citadas.

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Rosane Freitas Schwan

Eng° Agrônomo - Universidade Federal do Espírito Santo - UFES - BRASIL

Msc: Microbiologia Agricola - Universidade Federal de Viçosa - UFV

PhD. University of Bath (UK).

Professora Associada da Universidade Federal de Lavras

Bolsista de Produvidade em Pesquisa Nível 2 do CNPq

Produção de inoculantes em bioreatores/fermentadores

Messias José Bastos de Andrade

Eng° Agrônomo - Universidade Federal do Lavras - UFLA - BRASIL

MSc: Fitotecnia - Universidade Federal de Viçosa - UFV - BRASIL

Dout.: Fitotecnia - Universidade Federal de Viçosa - UFV - BRASIL

Professor Associado Universidade Federal de Lavras Bolsista de Produtividade em Pesquisa 1D, CNPq.

Manejo e produção de leguminosas nos experimentos de campo

Daniel Furtado Ferreira

Eng° Agrônomo - Universidade Federal do Lavras - UFLA - BRASIL

MSc: Agronomia( Génetica e Melhoramneto de Plantas - UFLA-Brasil

Dr: Agronomia( Génetica e Melhoramneto de Plantas - USP -Brasil

Pós Doutorado: USP - Brasil Professor Associado da UFLA

Bolsista de Produtividade em Pesquisa 1C – CNPq

-Desenvolvimento e avaliação de técnicas de amostragem e controle de qualidade em indústria de produção de inoculantes, utilizando a unidade piloto a ser implantada inicialmente na UFLA, e nas demais instituições, como unidade de testes. Esta linha de pesquisa visa principalmente definição de técnicas de amostragem e análise de dados mais repetíveis e com menor chance de ocorrência de erros, com definição de

procedimentos mínimos de avaliação estatística dos dados.

Mario de Andrade Lira Junior

BS em Agronomia – UFRPE, 1990

MSc em Agronomia – Ciência do Solo, UFRPE, 1994

PhD em Plant Science, McGill University, Canadá, 2001

-Desenvolvimento e avaliação de técnicas de amostragem e controle de qualidade em indústria de produção de inoculantes, utilizando a unidade piloto a ser implantada inicialmente na UFLA, e eventualmente na UFRPE, como unidade de testes. Esta linha de pesquisa visa

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Professor associado Universidade Federal Rural de

Penambuco principalmente definição de técnicas de amostragem e análise de dados _{mais repetíveis e com menor chance de ocorrência de erros, com definição} de procedimentos mínimos de avaliação estatística dos dados.

-Realização e coordenação de experimentos de campo em diversas áreas dos estados de Pernambuco, testando estirpes recomendadas e

potencialmente recomendadas para caupi, leguminosas forrageiras e adubos verdes. Além disto, estes experimentos servirão de base para avaliação de efeitos de armazenamento e outros procedimentos ligados ao inoculante, inclusive potencialmente diferentes formulações para o mesmo -Realização de dias de campo sobre a técnica de inoculação, incluindo em Escolas Agrotécnicas Federais, como as de Crato – CE e Vitória de Santo Antão – Pernambuco

-Orientação de alunos de Iniciação Científica, Mestrado e Doutorado em temas relacionados com as duas linhas de pesquisa acima citadas. Parte das atividades destes orientados será desenvolvida na UFLA, no âmbito do projeto.

Rafaela Simão Abrahão Nóbrega

Eng° Agronomo- Universidade Federal de Lavras MSc: Agronomia( Solos e Nutrição de Plantas) UFLA

Dr: Agronomia( Solos e Nutrição de Plantas) UFLA Professora Adjunta da Universidade Federal do Piauí, Campus Cinobelina Elvas

- Realização e coordenação de experimentos de campo em diversas áreas do Piauí, testando estirpes recomendadas e potencialmente recomendadas para caupi, leguminosas forrageiras e adubos verdes. Além disto, estes experimentos servirão de base para avaliação de efeitos de

armazenamento e outros procedimentos ligados ao inoculante, inclusive potencialmente diferentes formulações para o mesmo

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temas relacionados com as duas linhas de pesquisa acima citadas. Parte das atividades destes orientados será desenvolvida na UFLA, no âmbito do projeto.

Adriana Silva Lima

Eng° Agronomo- Universidade Federal de Lavras - Realização e coordenação de experimentos de campo em diversas áreas da Paraíba, testando estirpes recomendadas e potencialmente

recomendadas para caupi, leguminosas forrageiras e adubos verdes. Além disto, estes experimentos servirão de base para avaliação de efeitos de armazenamento e outros procedimentos ligados ao inoculante, inclusive potencialmente diferentes formulações para o mesmo

-Realização de dias de campo sobre a técnica de inoculação,

-Orientação de alunos de Iniciação Científica, Mestrado e Doutorado em temas relacionados com as duas linhas de pesquisa acima citadas. Parte das atividades destes orientados será desenvolvida na UFLA, no âmbito do projeto.

MSc: Agronomia ( Solos e Nutrição de Plantas – UFLA

Dr: Ciência do Solos –UFLA

Professor adjunto da Universidade Federal de Campina Grande , Centro de Ciência e Tecnologia Agroalimentar Pombal - PB Brasil

Disney Ribeiro Dias

Graduação em Farmácia- Universidade Federal de Alfenas- UNIFAL

MSc: Ciência do Alimentos- UFLA Dr: Ciência dos Alementos-UFLA

Professor Titular do Centro Educacional de Lavras-UNILAVRAS

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Cláudio Roberto Fonsêca Sousa Soares

Eng° Agrônomo - Universidade Federal do Viçosa - UFV - BRASIL

MSc: Agronomia( Solos e Nutrição de Plantas)-UFLA

Dr: Agronomia( Solos e Nutrição de Plantas)-UFLA Bolsista PNPD – Capes

-Realização e coordenação de experimentos de campo em diversas áreas dos estados, testando estirpes recomendadas e potencialmente

-Realização de dias de campo sobre a técnica de inoculação

-Orientação de alunos de Iniciação Científica, Mestrado e Doutorado.

Marlene Aparecida de Sousa

Licenciatura pela em Matemática

Pós-Graduação “Especialização”. Nutrição Humana e Saúde e Plantas Medicianais

Técnico em laboratório: Microbiologia e Bioquímica do Solos

Auxilio nas técnicas de laboratório

Manoel Aparecido da Silva

Licenciatura plena em Biologia

Pós Graduação “Especialização” Cultura de Tecidos Vegetais: Tecnologia e Aplicações

Técnico em laboratório. Microbiologia e Bioquímica do Solo-UFLA

Auxilio nas técnicas de laboratório

Pedro Martins Sousa

Gradução: Licenciatura em Ciências Biológicas - Universidade do Estado do Mato Grosso - UNEMAT

Professor Efetivo: Escola Estadual 29 de Julho. Orgão: Secretária de Estado de Educação - MT MSc: Microbiologia Agricola - Universidade Federal de Lavras - UFLA

Doutorando: Microbiologia Agrícola - UFLA

-Realização e coordenação de experimentos de campo em diversas áreas dos estados, testando estirpes recomendadas e potencialmente

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Bruno Lima Soares

Eng° Agrônomo - Universidade Federal de Viçosa - UFV

Mestrando em Ciência do Solo - UFLA

-Realização e coordenação de experimentos de campo em diversas áreas dos 4 estados, testando estirpes recomendadas e potencialmente

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Objetivos e metas a serem alcançados:

Considerando o exposto na justificativa e na fundamentação técnico cientifica e ainda que:

- no cumprimento de sua missão o MAPA formula e executa políticas para o desenvolvimentos do agronegócio, integrando aspectos mercadológicos, tecnológicos, científicos, organizacionais e ambientais, na busca do atendimento as exigências dos consumidores brasileiros e do mercado internacional;

-o SDA em parceria com o CNPq visam o aumento do numero de instituições e da massa critica de cientistas especializados em temas afetos a defesa agropecuária, alem de contribuir para a formação profissional nessa área, mediante a concessão de bolsas de estudos em temas de interesse do SDA.

Considerando também as seguintes demandas especificas no anexo 1 do edital 64 CNPq/SDA:

2.1. Fiscalização de insumos agropecuários

2.1. f- Desenvolvimento de metodologia analítica e amostral para avaliação da conformidade e da inocuidade de ... inoculantes....;

2.1.w. Desenvolvimento de requisitos técnicos aplicáveis as boas praticas de fabricação e APPCC de produtos ....;

2.1.z Desenvolvimento tecnológico de ferramentas para analise de risco aplicado aos insumos agropecuários;

2.1.bb Desenvolvimento tecnológico de metodologias analíticas e amostrais para avaliação de conformidade de ...inoculantes...;

2.1.cc Desenvolvimento tecnológico para embasamento de definição de padrões de identidade, qualidade e inocuidade de insumos agropecuários;

2.5 Capacitação de recursos humanos

2.5.c. analise de risco (avaliação, gerenciamento e comunicação) em ...insumos....;

2.5.g. avaliação de ensaios em experimentos agrícolas;

2.5.m Boas praticas de fabricação-BPF e analise de perigos e pontos críticos de controle-APPCC na fabricação de qualquer insumo agropecuário;

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2.5.bb metodologia de controle de qualidade de qualquer dos insumos agropecuários;

2.5.dd métodos estatísticos aplicados ao controle de qualidade de qualquer dos insumos agropecuários;

2.5.nn validação de metodologias analíticas para controle de qualidade de qualquer dos insumos agropecuários;

2.5.oo validação de processos em estabelecimentos fabricantes de qualquer dos insumos agropecuários;

Os objetivos gerais dessa proposta de projeto de pesquisa são:

1- Avaliar a eficiência de inoculantes em espécies de leguminosas cultivadas nos sistemas agrícolas, florestais e pastoris no sul de Minas Gerais, e em regiões selecionadas no Piauí, Pernambuco e Paraíba, para difundir e ampliar seu uso.

2. Testar e validar métodos oficiais de controle de qualidade e inspeção (quantificação, análise de pureza e identificação), incluindo amostragem e níveis de tolerância sobre os resultados analíticos, de inoculantes contendo estirpes recomendadas aprovadas e recomendados pelo MAPA para todas as leguminosas, exceto a soja, cujo uso é muito pouco difundido.

3- Capacitar recursos humanos nos diversos métodos empregados nos itens 1 e 2.

Metas:

1- Implantar na UFLA, uma micro empresa associada ao setor de microbiologia do solo para ampliar a capacidade do setor em produzir inoculantes em pequena e média escala dentro dos padrões de qualidade estabelecidos pelo MAPA

2-Ajustar os recursos do laboratório para obtenção de credenciamento nos métodos analíticos, que constituem métodos padrões oficiais, para análise de inoculantes sujeitos a inspeção e fiscalização previstas na legislação.

Obs.:as metas 1 e 2 serão acompanhadas por colaboradores das outras instituições participantes do projeto, que deverão implantar o mesmo sistema em suas regiões. 3- Auxiliar na implantação de microempresas do mesmo tipo nas instituições participantes do projeto

4- Capacitar pessoal nesses diversos métodos por meio de concessão de bolsas e cursos de treinamento

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5-fazer um levantamento das principais espécies de leguminosas cultivadas nos sistemas agrícolas, florestais e pastoris no sul de Minas Gerais, em Pernambuco, na Paraíba e no Piauí, assim como as práticas culturais associadas a elas, incluindo adubação nitrogenada, e seu potencial econômico na região, estabelecendo critérios para seleção de espécies e locais nos quais possa ser aplicada a biotecnologia de inoculação. Observação: serão selecionadas somente espécies de leguminosas que já possuam estirpes recomendadas pelo MAPA

6-selecionar agricultores interessados no uso da biotecnologia de inoculação para implantação de experimentos demonstrativos

7-Implantar experimentos demonstrativos do efeito da inoculação de estirpes selecionadas com manejo adequado e seguindo os protocolos aprovados pelo MAPA. 8- Dias de campo durante a condução dos experimentos para demonstração dos benefícios da tecnologia e difusão de seu uso

9-elaborar folders demonstrativos do uso de inoculantes para a espécie, incluindo fotos dos experimentos na área e distribuir em dias de campo para demonstração dos resultados do experimento

10- criar site onde serão disponibilizados os resultados de experimentos e fotos dos mesmos além de outras informações.

11- criar banco de dados com resultados de todos os experimentos de laboratório e campo, além de descrição detalhada dos recursos da micro-empresa de modo que outras instituições possam implantá-la.

12- evento no final do projeto integrando agricultores, pesquisadores, representantes do MAPA para discussão, divulgação e compartilhamento dos resultados, alem de planejamento de atividades futuras.

Metodologia e mecanismos de interação com o MAPA

A proponente faz parte do grupo de trabalho, constituído por especialistas de diversas instituições e instituído pela portaria 552 de 18/6/2008 (ver abaixo) que teve as seguintes atribuições:

I – Avaliar a adequação dos dispositivos legais publicados por meio da Instrução Normativa no 05 de 06 de agosto de 2004; necessidade de ajustes ou ampliações.

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II – Avaliar os métodos oficiais para identificação, quantificação e análise de pureza em inoculantes à base de Rhizobium e Bradyrhizobium, publicados por meio da Portaria nº 31, de 08 de junho de 1982 e propor as adequações necessárias.

III - Identificar e selecionar métodos para análise de identificação quantificação e análise de pureza em inoculantes à base de Azospirillum, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas sp; Frauteria aurantia com fins de oficialização.

Os trabalhos do grupo se encerram em 18/12/2008, quando então o resultado final será encaminhado à consulta publica que deverá ter prazo de 3 meses. Decorrido este período, os documentos serão revisados e publicados. Esses trabalhos constaram de:

1) Métodos para análise de inoculantes à base de rizóbios (concentração, pureza e identidade) e de bactérias associativas (concentração e identidade);

2) Revisão do anexo à IN de métodos contendo a descrição morfofisiológica das estirpes aprovadas para uso

3) Estabelecimento do nível de tolerância sobre o resultado analítico para concentração de células no produto inoculante com base nos dados de análise aportados pelo laboratório credenciado;

4) Protocolos para avaliação de estirpes, produtos e tecnologias relacionados a bactérias fixadoras de nitrogênio em leguminosas e a bactérias associativas, e requisitos mínimos para avaliação de produtos contendo microorganismos promotores de crescimento;

5) Revisão da Instrução Normativa SARC 05/2004.

6)Revisão do anexo II à IN SARC 05/2004(estirpes autorizadas).

Documentos relacionados com a Portaria 552/2008:

Art. 4º O Grupo de Trabalho de que trata o art. 1º será coordenado pela FFA Adriana Claudia Chagas e pelo FFA João Guimarães Tanajura Filho e terá o prazo de 180 (cento e oitenta) dias, a contar da data de publicação desta Portaria, para a conclusão dos seus estudos e apresentação do relatório pertinente ao Diretor do Departamento de Fiscalização dos Insumos Agrícolas (DFIA/SDA).