UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CURSO DE GRADUAÇÃO EM PSICOLOGIA
Administração de 8-OH-DPAT no septo dorso-lateral de
camundongos não altera a ansiedade no teste do Labirinto em Cruz
Elevado (LCE).
Luciana Previdelli Garavello
Dezembro 2005
Monografia realizada como parte das exigências para obtenção do Grau de Bacharel no Curso de Graduação em Psicologia da UFSCar, sob a orientação do Prof. Azair Liane Matos do Canto de Souza.
Resumo
A ansiedade envolve reações fisiológicas de defesa pelo sistema nervoso, e é desencadeada a partir de percepções inadequadas a estímulos, avaliados como potencialmente ameaçadores. A ansiedade e o medo são respostas emocionais de grande valor adaptativo, funcionando como impulso motivacional em diversas formas de comportamento e advertindo sobre perigos e ameaças à integridade do organismo. Existem hipóteses supondo que a ansiedade seja controlada por regiões específicas do sistema límbico tais como amígdala, matéria cinzenta periaquedutal, hipocampo, septo, entre outros. Estudos têm demonstrado que a microinjeção de 8-OH-DPAT no septo de ratos produz diminuição da ansiedade avaliada no Labirinto em Cruz Elevado (LCE). O objetivo deste estudo foi investigar o papel do 8-OH-DPAT, agonista dos receptores de serotonina do subtipo 5-HT1A, microinjetado no septo dorso-lateral (SDL) de camundongos submetidos ao LCE.
Para tanto, utilizamos a microinjeção central de drogas, através de cirurgia estereotáxica. Cinco dias após implantação de cânula no SDL, camundongos suíços machos (n=29), receberam microinjeção de 8-OH-DPAT (0, 5,6, 10nmol/0,1µl) e foram submetidos ao LCE para o registro de comportamentos convencionais como as porcentagens do número de entradas e tempo gasto nos braços abertos (%EBA, %TBA: índices de ansiedade) e freqüência de entrada nos braços fechados (EBF: atividade locomotora), além do registro de comportamentos etológicos, tais como o total de esticamentos (TEs), mergulhos (TM), levantamentos (TL), as porcentagens de esticamentos (%EsBF), mergulhos (%MBF) e levantamentos (%LBF) nos braços fechados do LCE, e o tempo em que o animal permaneceu em autolimpeza (TA) e em imobilidade (TI). A análise de variância (ANOVA), revelou que não houve diferença significativa em relação ao tratamento com 8-OH-DPAT nas duas doses testadas. Os índices de ansiedade [%EBA (salina: 16,73±8,8; 5,6nmoles: 22,37±6,2; 10nmoles: 27,56±15,4, F(2,26)=0,51, NS); %TBA (salina: 6,64±6,59;
5,6nmoles: 8,56±2,65; 10nmoles: 21,55±14,91, F(2,26)= 1,56, NS)] e a atividade locomotora
[EBF (salina 10,5±3,4; 5,6nmoles: 7,83±2,35; 10nmoles: 7,0±3,0, F(2,26)=0,95, NS)], não
foram alterados. Também não houve alteração quanto aos comportamentos etológicos TEs [(salina: 66,1±9,6; 5,6nmoles: 49,0±7,5; 10nmoles: 66,9±10,1; F(2,26)=1,302, NS)], %EsBF
[(salina: 88,7±6,7; 5,6nmoles: 90,8±2,4; 10nmoles: 75,7± 8,9, F(2,26)=1,838, NS)], TL
[(salina: 16,1±4,4; 5,6nmoles: 11,6±2,8; 10nmoles: 15,7±3,7, F(2,26)=0,514, NS)], %LBF
[(salina: 100,00; 5,6nmoles: 72,9±12,8; 10nmoles: 88,9±11,1, F(2,26)=1,560, NS)], TM
[(salina: 23,1±4,3; 5,6nmoles: 22,9±3,6; 10nmoles: 22,4±2,3, F(2,26)=0,009, NS)], %MBF
[(salina: 85,5±7,7; 5,6nmoles: 72,6±7,7; 10nmoles: 76,5±8,6, F(2,26)=0,740, NS)], TA
[(salina: 22,0±6,0; 5,6nmoles: 18,5±6,5; 10nmoles: 21,1±6,9, F(2,26)=0,079, NS)] e TI
[(salina: 6,2±3,5; 5,6nmoles: 21,8±14,2; 10nmoles: 6,2±5,2, F(2,26)=0,758, NS)]. Este
estudo mostrou que a microinjeção de 8-OH-DPAT (5,6 e 10nmoles/0,1µl) no SLD não produziu alteração da resposta de ansiedade nos camundongos submetidos ao LCE. Entretanto, existe uma tendência ao aumento do tempo de permanência nos braços abertos para aqueles animais que receberam a dose de 10nmol/0,1µl, resultados não confirmados pela estatística. Talvez este efeito ansiolítico não tenha aparecido devido a variabilidade existente neste grupo. Os nossos resultados corroboram dados encontrados na literatura em trabalhos com ratos. Estudos complementares devem ser realizados para esclarecer melhor o papel do SDL na resposta de ansiedade avaliada no LCE em camundongos.
Índice Resumo ... 02 Introdução ... 04 Objetivo ... 10 Material e Método ... 11 1. Sujeitos ... 11 2. Droga ... 11 3. Cirurgia e microinjeção ... 11 4. Equipamento ... 12 5. Procedimento geral ... 12 6. Histologia ... 13 7. Análise estatística ... 14 Resultados ... 15 Discussão ... 17 Bibliografia ... 19
Introdução
Desde o século XIX, têm sido realizados estudos em busca da compreensão do substrato neural da ansiedade, quando fármacos tais como os sais de bromo passaram a ser utilizados no tratamento da ansiedade patológica (Graeff & Guimarães, 1999). Com a evolução dos tratamentos farmacológicos e a descoberta de novas drogas tais como os barbitúricos (fenobarbital e meprobamato), os benzodiazepínicos e, mais atualmente, os compostos não-benzodiazepínicos como a buspirona, novas técnicas de experimentação foram criadas, entre elas pode ser citada a estimulação química do sistema nervoso, em seres humanos e em modelos animais experimentais (Graeff & Guimarães, 1999).
A ansiedade envolve reações fisiológicas de defesa pelo sistema nervoso, e é desencadeada a partir de percepções inadequadas a estímulos, avaliados como potencialmente ameaçadores (Graeff, 1989, Bear et. al. 2002). Estas reações fisiológicas se dão no sistema nervoso como um todo, através das aferências e eferências de sua parte central e da parte periférica. O sistema nervoso central (SNC) se constitui pelas porções de tecido nervoso que são envolvidas por revestimento ósseo, sendo o encéfalo (cérebro, cerebelo e tronco encefálico) revestido pelos ossos do crânio, e a medula espinhal revestida pela coluna vertebral. Já o sistema nervoso periférico (SNP) é formado pelos nervos e gânglios, podendo ser subdividido em somático e autônomo, os quais são responsáveis pela inervação da pele, articulações, musculatura sob controle voluntário e pelo controle dos vasos sanguíneos, as glândulas, e os órgãos internos, ou seja, pelas funções involuntárias, respectivamente (Bear et. al. 2002). A divisão autônoma do sistema nervoso pode ainda ser ainda subdividida em simpática e parassimpática, as quais são muito importantes na mediação dos estados emocionais, na monitoração da homeostase do corpo e exercem funções geralmente opostas umas às outras. Enquanto o simpático, por exemplo, mobiliza os estoques de energia para as emergências, prepara o organismo para a ação, promove aumento da pressão arterial, freqüência cardíaca e respiração, o parassimpático atua na conservação de energia e preparação para o repouso (Brandão, 2001; Bear et. al. 2002).
O substrato neural da ansiedade é basicamente análogo ao do medo, porém ocorre uma ativação inapropriada de comportamentos defensivos face a uma avaliação errônea de perigo (Graeff, 1989; Rodgers et. al., 1997). Assim, se um roedor se depara com um
predador natural, por exemplo, um gato, sua reação de medo poderá incluir sintomas como urgência na micção e defecação (reações autonômicas do simpático), congelamento, exibição dos dentes, atacar ou fugir (reações que incluem o SNC), dependendo da distância do predador, ou seja, da avaliação que o roedor faz do risco ao qual está sendo submetido. Gray e McNaughton (2004) fazem uma revisão da literatura a respeito das bases neurais do medo e da ansiedade, propondo uma simplificação em apenas duas dimensões de análise da situação: a distância defensiva e a direção defensiva. Direção defensiva se refere ou à evitação categórica da ameaça, o que ativaria circuitos neurais do medo, ou a uma aproximação da fonte de perigo, podendo acionar redes neuronais de ansiedade. A distância defensiva, por sua vez, indica o nível de ativação neural do sistema nervoso, no qual as menores distâncias em relação à fonte de perigo corresponderiam à ativação de níveis mais sub-corticais do encéfalo, tais como a matéria cinzenta periaquedutal, e as maiores distâncias, poderiam corresponder a uma ativação de níveis mais elevados do funcionamento neural, tal como o córtex pré-frontal.
A ansiedade e o medo são respostas emocionais de grande valor adaptativo, pois funcionam como impulso motivacional fundamental em diversas formas de comportamento e advertem sobre perigos e ameaças à integridade da pessoa, estimulando, assim, o organismo a tomar medidas necessárias para impedi-los (Brandão 2001). Porém, podem ocorrer condutas não adaptativas em resposta à ansiedade, como por exemplo, as doenças psicossomáticas, que são devidas a uma estimulação inadequada do SNA, provocando prejuízos funcionais a diversos órgãos do corpo (Graeff, 1999, Ballone, 2002).
Pelo fato de ser uma emoção, supõe-se que a ansiedade seja controlada por regiões específicas do sistema límbico — estruturas sub-corticais que fazem parte do tronco encefálico, além do córtex pré-frontal — tais como amígdala, matéria cinzenta periaquedutal (MCP), hipocampo, septo, entre outros (Graeff, 1999). Estudos têm mostrado que estas estruturas límbicas contêm grande número de receptores benzodiazepínicos (BZD) e serotoninérgicos (5-HT) (Pesold & Treit, 1996). O sistema límbico, descrito inicialmente por Paul Broca, é uma região de suma importância para o processamento das emoções pela ativação de áreas sub-corticais do tronco encefálico, que se conectam às fibras autonômicas simpáticas e parassimpáticas (Graeff, 1999; Bear et. al. 2002). Quando um estímulo aversivo se apresenta, informações das áreas sub-corticais e do córtex
promovem uma alteração radical na homeostase do organismo, pela liberação de neurotransmissores e hormônios da hipófise, que irão ativar outros locais de produção de hormônios, tais como as glândulas supra-renais, que liberam adrenalina na corrente sanguínea. A presença de adrenalina acelera os batimentos cardíacos, eleva a pressão sanguínea, dilata as pupilas dos olhos, pode causar tremores, sudorese, sensação de falta de ar, hipersecreção gástrica, entre outros em humanos (Bear et. al., 2002, Graeff, 1999).
Em níveis elevados, a ansiedade pode vir a prejudicar o desempenho do organismo, dessa forma, perdendo sua função adaptativa. Esse é o ponto que distingue a ansiedade normal da patológica, onde se justifica a procura por tratamentos tanto farmacológicos quanto psicológicos, em humanos (Graeff, 1989, 1999). Existem vários tipos de ansiedade patológica, que foram descritos e agrupados pelo DSM-IV (Manual de Diagnóstico e Estatística, elaborado pela Associação Americana de Psicologia). Na categoria transtornos de ansiedade, encontramos: transtorno de pânico com ou sem agorafobia, agorafobia sem ataques de pânico, fobia específica, fobia social, transtorno obsessivo-compulsivo, transtorno de estresse pós-traumático, transtorno de estresse agudo, transtorno de ansiedade generalizada, transtorno orgânico de ansiedade, transtorno de ansiedade devido a uma condição médica geral, transtorno de ansiedade induzido por substância e transtorno de ansiedade não especificado (Hetem e Graeff, 1997; Graeff e Guimarães, 1999).
Vários estudos foram realizados com o propósito de esclarecer quais estruturas do sistema nervoso central e autônomo estão diretamente envolvidas na produção/modulação da ansiedade e, desde a descoberta de receptores cerebrais para ansiolíticos do tipo benzodiazepínico (BZD) em 1977, tem havido um maior interesse por essa área, em localizar os efeitos de drogas ansiolíticas em regiões específicas do cérebro (Menard e Treit, 1999).
Nesse sentido, o estudo da ansiedade tem sido realizado com modelos animais, e o modelo mais utilizado atualmente é o labirinto em cruz elevado (LCE) com roedores, por avaliar comportamentos naturais ao organismo (inatos), sem que haja necessidade de privar o animal de água ou comida, sendo assim, evitando variáveis intervenientes que poderiam dificultar análise de dados (Rodgers et al., 1997). Ele foi desenvolvido por Handley e Mithani (1984), baseados no trabalho de Montgomery (1955) sobre a aversão natural dos roedores a lugares altos e abertos, e validado para ratos (Handley & Mithani, 1984; Pellow
et al. 1985) e para camundongos (Lister, 1987). O LCE consiste de dois braços abertos e dois braços fechados, unidos ortogonalmente a uma plataforma central, elevado do solo. Este aparato tem a propriedade de quantificar a ansiedade em número de explorações e tempo de permanência nos braços abertos, as quais são consideradas medidas espaço-temporais, além de medir o nível de atividade locomotora, dado pelo número de entradas nos braços fechados. Quanto menor a ansiedade, maiores escores no número e porcentagem de entradas nos braços abertos, assim como na porcentagem de tempo de permanência nos braços abertos. Em uma situação natural, o roedor evita locais abertos e elevados, tendendo a permanecer por mais tempo nos braços fechados. Experimentos para analisar as bases neurais da ansiedade foram realizados, utilizando diferentes técnicas neurofisiológicas associadas à exposição ao labirinto. A estimulação elétrica ou química, ablação de partes do sistema nervoso são algumas dessas técnicas (Graeff, 1999).
Estudos utilizando lesões de estruturas límbicas cerebrais em ratos, como por exemplo, o septo, encontraram efeitos análogos aos efeitos de drogas ansiolíticas nos testes do LCE, aumentando a exploração dos braços abertos e diminuindo a freqüência do comportamento de esquiva em outro modelo experimental de ansiedade, o “esconder defensivo” (shock-probe) (Menard & Treit, 1996). Esta evidência pode significar que a estrutura septal, de alguma forma, influencia no processamento da ansiedade.
O septo é uma estrutura límbica dividida em porção rostral ao fórnix, e núcleos lateral e medial. Cada uma dessas regiões é subdividida em outras partes, que realizam diferentes tipos de conexões aferentes e eferentes. Há evidências de estudos animais que as diferentes regiões do septo (lateral e medial) podem ter diferentes papéis na modulação de comportamentos de medo (Pesold & Treit, 1996). Lesões no septo posterior diminuíram índices de ansiedade, enquanto lesões no septo anterior não produziram diferenças estatisticamente relevantes quanto a essa medida, destacando a importância do septo posterior no controle da ansiedade no rato (Treit & Pessold, 1989). O septo lateral, localizado na região rostrodorsal do septo, recebe informações descendentes do hipocampo, que convergem em envio de informações para muitas partes do hipotálamo e mesencéfalo (Risold & Swanson, 1997).
Estudos com ratos têm mostrado que as estruturas límbicas, tais como o septo, são abundantes em receptores benzodiazepínicos (BZD), (Pesold & Treit, 1996) e
serotonérgicos (Graeff et. al., 1997; Menard & Treit, 1999). Há também trabalhos demonstrando que drogas tais como o midazolam liberaram o comportamento punido em testes de conflito e no LCE, o que sugere a presença de receptores BZDs nesta estrutura (Pesold e Treit, 1996). Estes efeitos de diminuição do medo ocorrem em áreas do sistema límbico ricas em receptores BZDs e podem ser bloqueados pela co-administração do antagonista Ro 15-1788 (Pesold & Treit, 1994). A presença de receptores de serotonina (5-HT) pode ser demonstrada pela infusão de compostos não BZDs tais como a ritanserina, buspirona, ondansetron, granisetron, 8-OH-DPAT (8-hidroxi-2-di-n-propilaminotetralina), entre outros. As primeiras evidências experimentais implicando a 5-HT na ansiedade foram vistas em testes de conflito, mais precisamente no teste do “beber punido” (Geller-Seifter), em ratos (Graeff, 1999). A administração de um composto inibidor da síntese de 5-HT, o para-cloro-fenilalanina (PCPA), liberou o comportamento de pressão à barra suprimido por punição (Graeff, 1999). Assim foi sugerido que a 5-HT intermediava os efeitos supressores da punição, ou seja, a presença de 5-HT inibia o comportamento de pressão à barra (efeito ansiogênico).
A serotonina pode ter diferentes papéis na modulação da ansiedade, dependendo dos subtipos de receptores em que ela irá atuar. Existem sete famílias de receptores 5-HT, as quais podem ser subdivididas em: 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D, 5-HT1F, 5-HT2A, 5-HT2B,
5-HT2C, 5-HT5A, 5-HT5B (Zifa e Fillion, 1992). Os subtipos da família 5-HT2 podem ser
encontrados em estruturas tais como o córtex cerebral, gânglio basal, estruturas límbicas e plexo coróide, tendo importância clínica no tratamento da ansiedade generalizada e algumas fobias (Menard & Treit, 1999). A família 5-HT3 tem importância clínica registrada
para o tratamento da ansiedade generalizada, com distribuição em estruturas límbicas e na área “postrema”. O subtipo 5-HT1A tem propriedades ansiolíticas confirmadas pelos seus
agonistas tais como a buspirona e o 8-OH-DPAT, e está amplamente distribuído pelo sistema límbico, em estruturas como os núcleos da rafe, hipocampo, amígdala e septo (Menard & Treit, 1999). Este subtipo é o mais largamente estudado, pela técnica de infusão de ligantes (agonistas e antagonistas), de forma sistêmica ou central, diretamente nas estruturas límbicas.
Com o desenvolvimento de novos modelos animais e de drogas seletivas para os diferentes subtipos de receptores serotoninérgicos — 5-HT1A, 5-HT2, 5-HT3 entre outros —
diferentes padrões de resultado foram sendo encontrados no estudo da modulação serotonérgica da ansiedade, de modo que a primeira hipótese que dizia respeito a um papel ansiogênico da serotonina teve de ser alterada (Graeff et. al., 1997). Menard e Treit (1998), em um estudo com ratos utilizando infusões do agonista pleno de receptores serotoninérgicos do tipo 5-HT1A (8-OH-DPAT) no hipocampo e no septo, encontraram uma
diminuição nas respostas de medo, porém com respostas diferentes em dois modelos experimentais de ansiedade, o LCE e o “esconder defensivo” . Em um outro estudo, File e Gonzalez (1996) observaram a resposta de ratos ingênuos ou experienciados em um teste de ansiedade no LCE, após a administração de 8-OH-DPAT nas doses de 50, 100 ou 200ng, e de um antagonista de receptores tipo 5-HT1A, o tertatolol, no núcleo dorsal da rafe
ou no hipocampo ventral. Encontraram que nos ratos ingênuos, nenhum dos ligantes teve efeito significativo. Porém, em ratos experienciados no LCE, o 8-OH-DPAT teve efeitos ansiolíticos nas doses de 100 e 200ng quando administrados no núcleo dorsal da rafe, que foram antagonizados pelo tertatolol, sugerindo que os efeitos foram mediados pelos receptores 5-HT1A (File & Gonzalez, 1996).
Há resultados inconsistentes em relação ao papel da serotonina na modulação da ansiedade, sendo encontrados efeitos ansiolíticos, ansiogênicos, ou então, ausência de efeitos. Por esta inconsistência, Deakin e Graeff formularam uma hipótese de que a 5-HT desempenha um papel dual na regulação da ansiedade, que é dependente do local da injeção, da substância e da dose utilizada (Deakin & Graeff, 1991). Em concordância com esta hipótese, podemos citar um estudo de Canto-de-Souza et. al. (2001), que encontrou efeitos ansiolíticos de microinfusões de WAY-100635, um antagonista de receptores 5-HT1A, no núcleo mediano da rafe (mas não no núcleo dorsal da rafe), no teste do LCE em
camundongos ingênuos e experienciados, aumentando a exploração dos braços abertos e diminuindo comportamentos de avaliação de risco. Este estudo esperava encontrar efeitos ansiogênicos pela estimulação pré-sináptica dos receptores somatodendríticos dos neurônios do núcleo mediano da rafe, porém, observou-se efeito contrário (Canto-de-Souza, et. al. 2001). Com base nestes dados, é possível perceber a complexidade da transmissão serotonérgica, o que dificulta a elucidação dos mecanismos neurais da ansiedade.
Objetivo
Devido à inconsistência de efeitos da 5-HT na modulação da ansiedade, e as descrições da literatura acima citadas, este estudo buscou verificar os efeitos da administração de 8-OH-DPAT, agonista de receptor de serotonina 5-HT1A, no septo dorso-lateral de camundongos
Material e Método
1. Sujeitos
Foram utilizados camundongos machos da cepa suíço-albino (n= 29), selecionados de acordo com o peso de 25-30g, fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar). Os animais foram alojados em gaiolas coletivas de polipropileno (45 x 28 x 13cm) forradas com palha em grupos de oito por gaiola e mantidos no biotério do Laboratório de Psicologia e Aprendizagem (LPA), onde permaneceram em condições controladas de temperatura (25 ± 1ºC), iluminação (ciclo claro-escuro de 12/12 horas) e livre acesso a alimento e água. As luzes eram acesas às 07:00 horas.
2. Droga
Utilizou-se o agonista de receptor 5-HT1A 8-OH-DPAT,
[(±)-8-hydroxi-2-(di-n-propilamino) tetralin] hidrobromide, RBI, PM: 328,3g, dissolvido em Veículo (Salina 0,9% NaCl e Tween 80) nas doses de 0, 5,6 e 10nmol/0,1µl.
3. Cirurgia e Microinjeção
Os sujeitos receberam anestesia intraperitoneal de tiopental sódico (90mg/kg) e de Lidocaína sob a pele da cabeça, para a implantação estereotáxica (Insight) de uma cânula-guia (25-gauge) de 7mm de comprimento no septo dorso-lateral (0,08mm anterior ao bregma, 0,20mm lateral e 1,4mm ventral, com ângulo de implantação 20º) de acordo com as coordenadas do Atlas de Franklin e Paxinos (1987). A cânula foi fixada ao crânio com cimento acrílico e selada com um mandril para proteção. Após quatro ou cinco dias de recuperação, os sujeitos eram submetidos à microinjeção unilateral no septo dorso-lateral, com a utilização de uma agulha de 9mm, acoplada a um tubo de polietileno, que foi conectado a uma seringa Hamilton 10µl. A infusão foi realizada por uma bomba (Insight BI 2000), programada para injetar 0,1µl num intervalo de 60s. Após a infusão, esperávamos 90s para a confirmação do fluxo da solução, verificado pela movimentação de uma pequena
bolha de ar no tubo de polietileno, e a agulha era retirada para a recolocação do mandril na cânula-guia. Os animais ficavam alojados em uma caixa de espera por mais 90s até que a droga fizesse efeito e o teste no LCE fosse iniciado.
4. Equipamento
Foi utilizado o labirinto em cruz elevado (LCE), um aparato feito de madeira e vidro que consiste de dois braços abertos (30 x 5 x 0,25cm) e dois braços fechados (30 x 5 x 15cm), unidos ortogonalmente a uma plataforma central (5 x 5cm) elevada a uma altura de 38,5cm do solo. Os braços abertos, a plataforma central e o piso dos braços fechados são feitos de madeira, enquanto que as paredes dos braços fechados são feitas de vidro transparente.
Figura 1: Labirinto em Cruz Elevado
5. Procedimento Geral
Após o período de recuperação, os animais foram pesados e aleatoriamente designados a um dos três tratamentos: microinjeção unilateral do veículo (controle), de 8-OH-DPAT nas doses de 5,6 ou 10nmol/0,1µl (experimental). Em seguida, foram expostos ao LCE, colocados ao centro do labirinto, com a face voltada para um dos braços abertos.
Os testes tinham a duração de 5 minutos e foram registrados em vídeo-câmera para posterior análise dos comportamentos convencionais (freqüência de entradas nos braços abertos e fechados, tempo de permanência em ambos os braços e no centro, além de suas respectivas porcentagens) e etológicos. Os comportamentos etológicos incluem: levantamentos, esticamentos, mergulhos, autolimpeza e imobilidade, que podem ser protegidos, se ocorrem nos braços fechados ou no centro, oferecendo segurança, ou desprotegidos, quando ocorrem nos braços abertos do LCE (Rodgers, et. al. 1995). O comportamento de levantamento se define pela elevação do corpo sobre as patas traseiras, o de esticamento, por uma postura exploratória na qual o corpo vai para frente e volta para trás sem que ocorra movimentação das patas, e o mergulho, por um movimento exploratório da cabeça e ombros para baixo do nível do piso do LCE. Os comportamentos de autolimpeza e imobilidade se referem à duração de tempo em que o animal se lambe e se esfrega e em que permanece imóvel, respectivamente (Rodgers, et. al. 1995). A cada exposição dos sujeitos, o LCE foi limpo com algodão umedecido em uma solução de álcool a 20%, de forma a evitar vieses devido a algum odor deixado por outro animal.
6. Histologia
Após a fase de exposição ao LCE, os animais foram submetidos a microinjeção de azul de metileno (0,1µl), para demarcação da região atingida, seguindo o mesmo procedimento descrito para a microinjeção das drogas. Logo em seguida, foram sacrificados, decapitados e tiveram os encéfalos retirados, sendo estes armazenados em solução de formalina a 10%.
A histologia foi realizada com a ajuda de um micrótomo criostato (90 micrômetros). Os cortes foram colocados em lâminas para observação em microscópio e confirmação das regiões atingidas pela comparação com o Atlas de Franklin e Paxinos (1987). Os sujeitos que não tiveram a região do septo dorso-lateral atingida foram descartados da análise dos resultados.
Fig 2. Representação esquemática da localização do septo dorsal lateral, em vermelho.
7. Análise Estatística
Os resultados foram analisados pela análise de variância (ANOVA). Os valores de P inferiores ou iguais a 0,05 foram considerados significativos.
Resultados
As Figuras 3A e 3B mostram a ausência de efeitos das microinjeções do 8-OH-DPAT no septo dorso-lateral dos camundongos expostos ao labirinto em cruz elevado. A análise de variância (ANOVA) revelou ausência de efeitos para as porcentagens de entrada (F(2,26)=0,51, NS) e tempo de permanência nos braços abertos (F(2,26)= 1,56, NS). A
ANOVA também revelou ausência de efeitos para o número de entradas nos braços fechados (F (2,26) = 0,95, NS). 0 10 20 30 40
veículo 5,6 nmols/0,1ul 10 nmols/0,1ul 8-OH-DPAT 8-OH-DPAT % E n tr a d a s e T e m p o n o s b ra ç o s a b e rt o s
% Entradas nos braços abertos % Tempo nos braços abertos
0 5 10 15
veículo 5,6 nmols/0,1ul 10nmols/0,1ul 8-OH-DPAT 8-OH-DPAT N ú m e ro d e e n tr a d a s n o s b ra ç o s f e c h a d o s
Figura 3. Ausência de efeitos da administração do 8-OH-DPAT (veículo, 5,6, e 10 nmol/0,1µl) microinjetado no SLD de camundongos expostos ao LCE. As barras representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) das porcentagens de entradas e tempo gasto nos braços abertos (A) e o número de entradas nos braços fechados (B).
A
A Tabela 1 mostra a ausência de efeitos das microinjeções de 8-OH-DPAT no septo dorso-lateral dos camundongos expostos ao labirinto em cruz elevado. Não houve diferença significativa do 8-OH-DPAT nas duas doses testadas para os comportamentos, total de esticamentos (F(2,26)= 1,3, NS), mergulhos (F(2,26)= 0,009, NS) e levantamentos (F(2,26)=
0,514, NS), bem como para a % de esticamentos (F(2,26)= 1,838, NS), mergulhos (F(2,26)=
0,740, NS) e levantamentos (F(2,26)= 1,56, NS) protegidos, tempo de autolimpeza (F(2,26)=
0,07, NS) e imobilidade(F(2,26)= 0,75, NS) .
Tabela 1. Efeitos da microinjeção de 8 OH-DPAT (0, 5,6 e 10nmols/0,1µl) no septo dorso-lateral dos camundongos avaliados nos comportamentos etológicos no LCE.
Tratamento (nmoles/0,1µl) F(2,26) P Comportamentos no LCE 0 5,6 10 Total Esticamentos 66,1 ± 9,6 49,0 ± 7,5 66,9 ± 10,1 1,302 0,289 NS % Esticamentos BF 88,7 ± 6,7 90,8 ± 2,4 75,7 ± 8,9 1,838 0,179 NS Total Mergulhos 23,1 ± 4,3 22,9 ± 3,6 22,4 ± 2,3 0,009 0,991 NS % Mergulhos BF 85,5 ± 7,7 72,6 ± 7,7 76,5 ± 8,6 0,740 0,487 NS Total Lev. 16,1 ± 4,4 11,6 ± 2,8 15,7 ± 3,7 0,514 0,604 NS % Lev. BF 100,00 72,9 ±12,8 88,9 ± 11,1 1,560 0,229 NS Tempo autolimpeza 22,0 ± 6,0 18,5 ± 6,5 21,1 ± 6,9 0,079 0,924 NS Tempo imobilidade 6,2 ± 3,5 21,8 ±14,2 6,2 ± 5,2 0,758 0,479 NS
Tabela 1. Ausência de efeitos da administração do 8-OH-DPAT (veículo, 5,6, e 10 nmol/0,1µl) microinjetado no SLD de camundongos expostos ao LCE. Os valores representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) dos comportamentos: total de esticamentos, mergulhos, levantamentos e as porcentagens de esticamentos, mergulhos e levantamentos protegidos e tempo de autolimpeza e imobilidade.
Discussão
Nosso estudo demonstrou que as microinjeções de 8-OH-DPAT (doses de 5,6 e 10nmols/0,1ul) no septo dorso-lateral de camundongos submetidos ao labirinto em cruz elevado não produziram efeitos sobre os comportamentos convencionais de ansiedade nem para os índices etológicos. Estes resultados são compatíveis com aqueles encontrados por Menard e Treit (1998), pela infusão de R-(+)-8-OH-DPAT no septo de ratos, no teste do LCE. Porém, neste mesmo estudo, o agonista produziu reduções significativas no comportamento de “esconder” no teste do “esconder punido”, sugerindo um efeito ansiolítico, já que não houve alteração na atividade locomotora (Menard e Treit, 1998). Já em outra estrutura, o hipocampo dorsal, um padrão contrário de resultados foi encontrado, com um aumento significativo na exploração dos braços abertos no LCE e ausência de efeitos no “esconder punido”. A ausência de efeitos do 8-OH-DPAT no septo dorso-lateral de camundongos no teste do LCE pode ser devida a uma condição inerente ao próprio modelo, que utiliza comportamentos inatos ao organismo. Em testes que utilizam comportamentos condicionados, como o “esconder punido”, um efeito ansiolítico foi observado (Menard e Treit, 1998). Este dado pode indicar que a estimulação dos receptores do tipo 5-HT1A no septo dorso-lateral de camundongos ative substratos neurais que não são
avaliados pelo teste do LCE, já que a mesma estimulação destes receptores pós-sinápticos provocou efeitos ansiolíticos em outro modelo já citado (Menard e Treit, 1998).
Podemos observar na Figura 3A uma tendência ao aumento na porcentagem de entradas e também na porcentagem de tempo de permanência nos braços abertos do labirinto, para a dose mais alta deste agonista serotonérgico. Segundo trabalhos anteriores que avaliaram os índices de ansiedade no LCE, o aumento da exploração dos braços abertos deste aparato significa que o animal está com um nível de ansiedade mais baixo (Pellow et. al., 1985; Lister, 1987). Porém, devido aos elevados escores do erro padrão da média (EPM), o efeito ansiolítico não se confirmou dada a variabilidade desta amostra. Na dose de 10,0 nmol, as porcentagens de entrada e tempo nos braços abertos foram mais altas, sugerindo um efeito dose-dependente, não confirmado pela análise estatística. Outros estudos com doses mais elevadas poderiam ser realizados, para a verificação desse efeito,
ou também com um número maior de sujeitos, o que poderia diminuir a variabilidade da amostra, com a conseqüente diminuição do EPM.
Não houve diferenças quanto ao número de entradas nos braços fechados, o que significa que nenhuma das duas doses do 8-OH-DPAT interferiu na atividade locomotora dos animais testados. Quanto aos comportamentos etológicos, as microinfusões de 8-OH-DPAT também não produziram efeito, sem que ocorresse variação no número total de esticamentos, mergulhos e levantamentos, como também nas respectivas porcentagens.
Nossos resultados corroboram a hipótese de um papel dual da serotonina na modulação da ansiedade e que, dependendo da substância utilizada, da dose, da estrutura estimulada e do subtipo de receptor envolvido, podem ser encontrados efeitos ansiogênicos, como nos primeiros estudos sobre o tema, que lançaram a hipótese ansiogênica da 5-HT, efeitos ansiolíticos, bem como ausência de efeitos (Graeff et. al., 1996; Menard e Treit, 1999). Estudos posteriores são necessários para que o papel dos receptores 5-HT1A do septo
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