TÍTULO: AÇÃO DO HIPOCLORITO DE SÓDIO FRENTE AOS BIOFILMES FÚNGICOS DO GÊNERO ASPERGILLUS
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO
CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA
SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE FRANCA
INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): JÉSSICA ALINE DE SOUZA CASTELLANE
AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): REGINA HELENA PIRES
ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): POLIANA CAROLINY ROSA
AÇÃO DO HIPOCLORITO DE SÓDIO FRENTE AOS BIOFILMES FÚNGICOS DO GÊNERO ASPERGIILUS
1. RESUMO
A presença de micro-organismos em superfícies sólidas, pode favorecer a formação de biofilmes, os quais são estruturas complexas que aderem às superfícies e são muito resistentes aos agentes antimicrobianos. Vários compostos químicos são usados no meio hospitalar para proporcionar a desinfecção e/ou esterilização, sendo que para o controle de micro-organismos em Unidades de Hemodiálise é preconizado pela legislação o uso de hipoclorito de sódio (0,05%). Esse estudo teve o objetivo de avaliar a efetividade do hipoclorito de sódio contra biofilmes gerados por isolados fúngicos do gênero Aspergillus spp. (18 cepas), previamente coletados em um Serviço de Hemodiálise hospitalar. A formação de biofilme foi induzida em microplacas de 96 poços em aerofilia, utilizando a metodologia de redução do XTT (sódio 3´-[1-(fenilaminocarbonil)- 3,4-tetrazolio]- bis (4-metoxi- 6-nitro) ácido benzeno sulfônico hidratado) avaliando a viabilidade dos biofilmes. Infecções associadas aos biofilmes são causas determinantes de morbidade e mortalidade em Serviços de Hemodiálise e o monitoramento microbiano é um dos principais fatores envolvidos, buscando minimizar o tempo de internação e os gastos do sistema de saúde.
Palavras-chave: Hemodiálise; dialisato; biofilmes fúngicos; desinfecção; hipoclorito de sódio.
2. INTRODUÇÃO
A insuficiência renal crônica (IRC) é diagnosticada como uma patologia complexa, levando a falência do órgão e pode acometer pessoas de qualquer faixa etária, sendo que seu desenvolvimento é lento e sintomático (1-2). Uma das terapias utilizadas nestes casos, é a hemodiálise que é caracterizada como um processo artificial de filtração, realizado por uma máquina, onde a mesma exercerá mecanicamente as funções que o rim não é mais capaz de realizar (3).
A máquina de hemodiálise funciona com um dialisador composto por capilares (membranas semipermeáveis) que bombeia todo o sangue retirado do paciente para
ser filtrado (3). O sangue do paciente é manipulado três vezes por semana, numa média de 4 horas com um fluxo que gira em torno de 350 a 400mL/minutos (4). É comum a reutilização do capilar dialisador no mesmo paciente, sendo cabível tomar medidas de segurança, como enxágue para remoção total do sangue, seguido de limpeza química para desinfecção (5).
A água utilizada na terapia, em média 150 litros/turno, obrigatoriamente deve estar dentro das normas de qualidade recomendada pela legislação federal vigente, sendo seu monitoramento constante, respeitando os parâmetros físico-químicos e microbiológicos (4, 6-9).
A presença de micro-organismos, nutrientes orgânicos e pH, associados a fatores físicos (pontos cegos, baixo fluxo ou áreas de estagnação de água) favorecem a formação de biofilmes em todo o sistema de tratamento e distribuição de água (10). Biofilme é a forma de vida microbiana, onde os micro-organismos aderem aos suportes sólidos, produzindo substâncias poliméricas extracelulares, formando uma rede gelatinosa que imobiliza e oferece proteção as células (11). Após formados, os biofilmes podem tanto se manterem aderidos firmemente à superfície, como podem se desprender e contaminar outras superfícies (12).
Além de infecções bacterianas, infecções fúngicas em pacientes hemodialisados, tem sido cada vez mais observado (13). Isolados fúngicos pertencentes aos gêneros Aspergillus spp., já foram identificados e citados em estudos anteriores, apontando suas patogenicidades e resistência contra diversos meios de desinfecções (14-16).
Aspergillus é um gênero de fungo anemófilo, também, encontrado no solo e
ambientes aquáticos. Em sua morfologia há presença de filamentos, hifas ramificadas formadoras de micélio e coloração negra, classificando-o como um Deuteromiceto e microscopicamente é observado a presença de conídios globosos (17).
Os micro-organismos formadores de biofilmes, possuem maior resistência a agentes antimicrobianos, podendo sobreviver após os procedimentos de sanitização (18), principalmente quando há o uso incorreto desses sanitizantes, como doses erroneamente utilizadas, pode gerar um tipo de resistência (19).
Atualmente, a RDC n° 11, de 13 de março de 2014, dispõe sobre os Requisitos de Boas Práticas de Funcionamento para os Serviços de Diálise e dá outras providências (20).
Dentre os antimicrobianos, os mais utilizados ao nível hospitalar é o hipoclorito de sódio o qual é um composto halogenado e teve o seu primeiro uso registrado no ano de 1792 denominando-se “água de Javele”; esta solução era utilizada em feridas (21). Sua ação antimicrobiana está relacionada com a formação de compostos contendo cloro ativo, como o ácido hipocloroso e o íon hipoclorito. O cloro ativo liberado, causa a oxidação irreversível do grupamento sulfidrila (grupamentos laterais de enzimas bacterianas) causando a inativação das enzimas essenciais e consequentemente a morte celular (22).
3. OBJETIVOS
Diante do exposto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a eficácia do hipoclorito de sódio, frente aos biofilmes gerados pelo gênero Aspergillus spp.,
4. METODOLOGIA
4.1 DESINFETANTE
O desinfetante utilizado nesse estudo foi o hipoclorito de sódio a 12% (Franquímica, Franca, SP, Brasil), diluído em meio (Roswell Park Memorial Institute, RPMI 1640, Sigma, St. Louis, Mo., USA) à concentração final de 0,05% ou 500 ppm.
4.2 MICRO-ORGANISMOS
Todos os isolados utilizados no estudo foram previamente recuperados a partir de cinco pontos do circuito hídrico de um Serviço de hemodiálise hospitalar os quais incluíam: (I) sistema de abastecimento municipal, (II) após o sistema de osmose reversa (III), (IV) e (V) linhas de distribuição hídrica nas salas onde se realizavam as sessões de diálise, designadas por sala A, B e C (5, 7). A identificação dos isolados obedeceu a numeração original estabelecida nos estudos anteriores (numeração sequencial na ordem de isolamento dos organismos). Foram utilizados 18 isolados de fungos filamentosos do gênero Aspergillus spp., provenientes dos estudos de Pires-Gonçalves et al. (23) e Varo et al. (16). Os fungos estão estocados em água e fazem parte do acervo de coleções de culturas da Universidade de Franca.
5. DESENVOLVIMENTO
5.1 ENSAIOS DE SENSIBILIDADE DOS BIOFILMES AOS DESINFETANTES
Para estes ensaios, os fungos foram crescidos em meio ágar batata dextrose (PDA) por 3-5 dias à 30ºC para produção dos conídios. Decorrido esse tempo, ao tubo contendo o crescimento micelial foram adicionados 5 mL de salina tamponada (PBS - 10 mM fosfato de potássio; 0,15 M NaCl, pH 7,0) estéril contendo 0,025% (v/v) de Tween 20 (24) e agitado manualmente. A seguir, o líquido foi transferido para tubo cônico de plástico e deixado em repouso por 5 minutos. A operação foi repetida por 3 vezes. A suspensão conidial resultante passou por filtração em papel de filtro para remoção dos debris e estocada em freezer à - 20ºC. No momento dos ensaios, todas as suspensões conidiais foram ajustadas à concentração celular de 106 células/mL, por comparação ao padrão 0,5 da escala de turbidez de McFarland (24), em meio de cultura padronizado (RPMI 1640). A seguir, 200 µL de cada suspensão foram dispensados em placas de microtitulação de 96 poços (TPP, BIOGEN, Europe) e incubadas a 30°C por 72 h em aerofilia. Poços com apenas meio de cultura também foram incluídos no ensaio como controle de esterilidade da reação. A seguir, o sobrenadante dos poços que continham os biofilmes, foi aspirado cuidadosamente e lavados por três vezes com PBS para remoção das células não aderentes. Uma alíquota de 100 µL do desinfetante testado foi adicionado aos biofilmes pré-formados, incubando-se novamente por 30 minutos a 30ºC. Poços com biofilmes adicionados de RPMI (livres de desinfetantes) também foram incluídos no ensaio como controles de crescimento (100% de viabilidade). Após aspiração do sobrenadante e lavagem dos biofilmes, os mesmos foram submetidos à quantificação da viabilidade celular pela metodologia do sódio 3´-[1-(fenilaminocarbonil)- 3,4-tetrazolium]-bis (4-metoxi-6-nitro) ácido benzeno sulfônico hidratado (XTT). Os ensaios foram realizados em triplicata em três ocasiões diferentes.
5.2 ENSAIO DE REDUÇÃO DO XTT
A viabilidade dos biofilmes foi verificada usando-se o teste de redução do sal de tetrazólio, XTT (25). Resumidamente, XTT (Sigma, St.Louis, Mo., USA) foi preparado a concentração de 0,5 g/L em solução de Ringer-lactato, filtrado em filtro
com poros de 0,22 micrometros de tamanho, aliquotado e estocado a -80°C (26). Anteriormente a cada ensaio, uma alíquota de XTT foi descongelada e, menadiona (Sigma) foi adicionada à concentração final de 1 µM. Uma alíquota de 100 µL de XTT-menadiona foi então adicionada aos biofilmes pré-lavados bem como aos controles. As placas foram incubadas no escuro por 3 h a 37°C e, a mudança colorimétrica, medida em leitor de placas a 492 nm. Poços contendo meio de cultura/biofilmes/XTT/menadiona (controle positivo) e poços contendo meio de cultura/XTT/menadiona (controle negativo) também foram incluídos. Os poços que apresentaram D.O. mais baixa ou igual a 0,120 (três desvios padrão (0,023) acima da D.O. média (0,050) de um poço da microplaca limpa) não foram considerados como resultados obtidos a partir da metabolização do sal de tetrazólio pelo fungo e sim cor residual do reagente (fundo). Os experimentos foram realizados em triplicata em três ocasiões diferentes.
6. RESULTADOS
Após formação dos biofilmes em microplacas por 72h a 30 ºC, os mesmos foram expostos ao hipoclorito de sódio à 0,05%, por 30 minutos, sendo os resultados para Aspergillus spp. mostrado na Fig. 1.
Aspergillus spp. Aerofilia 1 2 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Isolado 05 Isolado 10 Isolado 46 Isolado 70 Isolado 105 Isolado 106 Isolado 109 Isolado 110 Isolado 171 Isolado 174 Isolado 181 Isolado 189 Isolado 194 Isolado 223 Isolado 224 Isolado 226 Isolado 245 Isolado 249 Pós hipoclorito Não tratado
D e n s id a d e ó p ti c a ( 4 9 2 n m )
Figura 1. Resultados da viabilidade celular dos biofilmes de Aspergillus spp. cultivados em aerofilia,
pós tratamento com hipoclorito de sódio a 0,05% por 30 minutos, expressos em média e desvio padrão. Os ensaios foram realizados em triplicata.
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Frente aos testes de ação antimicrobiana do hipoclorito de sódio, embora seja o desinfetante recomendado pela legislação, o mesmo se revelou insuficiente para matar as células presentes nos isolados testados.
Assim, torna-se necessário o estudo de novos sanitizantes para a desinfecção segura das águas de hemodiálise.
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