ipen AUTARQUIA ASSOCIADA À UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

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ipen

AUTARQUIA ASSOCIADA À UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

AVALIAÇÃO DA MICROBIOTA FÚNGICA E DA PRESENÇA DE

MICOTOXINAS EM AMOSTRAS DE PLANTAS MEDICINAIS

IRRADIADAS ADQUIRIDAS NO COMÉRCIO VAREJISTA E

ATACADISTA

SIMONE AQUINO

Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Doutor em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear - Aplicações.

Orientadora:

Dra. Anna Lucia C.H.VilIavicencio

Sao Paulo

2007

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INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES

Autarquia associada à Universidade de São Paulo

AVALIAÇÃO DA MICROBIOTA FÚNGICA E DA

PRESENÇA DE MICOTOXINAS EM AMOSTRAS DE

PLANTAS MEDICINAIS IRRADIADAS ADQUIRIDAS NO

COMÉRCIO VAREJISTA E ATACADISTA

S I M O N E A Q U I N O

Tese apresentada c o m o parte d o s requisitos para obtenção d o Grau de Doutor em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear Aplicações.

Orientadora:

Dra. A n n a Lucia C. H. Villavicencio

S ã o Paulo 2007

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valorização dos e s t u d o s d e s d e m i n h a infância.

À m i n h a f a m í l i a , W a g n e r , Elaine, Rafael e Walter, p o r e s t a r e m a o m e u lado e m m o m e n t o s c h e i o s d e o b s t á c u l o s .

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AGRADECIMENTOS

À Dra. A n n a Lucía C. H. Villavicencio por partilhar s e u s c o n h e c i m e n t o s , a m i z a d e e, s o b r e t u d o m e ensinar q u e determinação, p e r s i s t ê n c i a e força d e v o n t a d e s ã o as b a s e s d a b u s c a científica.

A o Prof. Dr. B e n e d i t o Corrêa por sua inestimável a m i z a d e , paciência e c o n s e l h o s e m e aceitar e m s e u g r u p o e m e orientar c o m o sua p r ó p r i a a l u n a .

A o Instituto de P e s q u i s a s Energéticas e N u c l e a r e s - I P E N - C N E N e C R T D , r e p r e s e n t a d o p e l o Dr. W i l s o n A p a r e c i d o Parejo C a l v o , p e l a o p o r t u n i d a d e , a p o i o e f i n a n c i a m e n t o e m t o d a s as e t a p a s d e s t e t r a b a l h o .

À M S c . E d i a y n e G o n ç a i e z , Dra. Maria Helena R o s s i , D r a . J o a n a D ' a r c Felício, Dr. M a r c o s R. P o t e n z a , Juliana H. C. N o g u e i r a , p e l o s c o n s e l h o s , o r i e n t a ç õ e s e d e s e n v o l v i m e n t o prático das análises r e a l i z a d a s n o Instituto Biológico d e S ã o P a u l o , f u n d a m e n t a i s neste projeto.

À Dra. Sueli Borrely, Dr. A f o n s o R. A q u i n o e a o s m e u s c o l e g a s M i c h e l , Ingrid, R e g i n a l d o , VIadimir, Thaise, G u s t a v o , Priscila e R o s a m a r í a , p e l o c a r i n h o e a m i z a d e nos m o m e n t o s d e convivência no I P E N .

A T a t i a n a A l v e s d o s Reis, T é c n i c a d o Laboratório d e M i c o t o x i n a s d o I C B II, p e l o c o m p a n h e i r i s m o e por ensinar as metodologias e e x e c u ç ã o d a s a n á l i s e s d e s e n v o l v i d a s n e s t e t r a b a l h o .

A o s e n g e n h e i r o s Elizabeth S o m e s s a r i e Carlos G a i a d a Silveira, p e l o c a r i n h o e por auxiliarem n o processo d e irradiação das a m o s t r a s .

À Patrícia, R a q u e l , M a u r o , A d r i a n a , Ivyna, F a b i a n e , D a n i e l e , Shirley, V i v i a n e , Liliana, A n i n h a e Mônica Louvison pela a m i z a d e e c o n v i v ê n c i a a f e t u o s a n o I C B II.

A o C N P q pelo auxílio financeiro, s e m o q u a l , n ã o s e r i a p o s s í v e l o d e s e n v o l v i m e n t o d e s t e projeto.

A t o d o s a q u e l e s q u e , direta ou indiretamente, c o l a b o r a r a m para o d e s e n v o l v i m e n t o e c o n c l u s ã o d e s t e trabalho, o s m e u s i n e s t i m á v e i s a g r a d e c i m e n t o s .

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Bernard Siiaw

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A V A L I A Ç Ã O D A M I C R O B I O T A F Ú N G I C A E D A P R E S E N Ç A D E M I C O T O X I N A S E M A M O S T R A S DE P L A N T A S M E D I C I N A I S I R R A D I A D A S A D Q U I R I D A S NO

C O M É R C I O V A R E J I S T A E A T A C A D I S T A

S I M O N E A Q U I N O

R E S U M O

O presente estudo analisou os efeitos da radiação g a m a na sobrevivência de fungos e m plantas medicinais e m b a l a d a s , adquiridas do comércio atacadista e varejista, em diferentes períodos (O e 30 dias) após o tratamento por irradiação. Cinco tipos de plantas medicinais [Peumus boldus, Cameilia sinensis, Maytenus ilicifolia, Pauilinia cupana and Cássia angustifolia), foram coletadas de diferentes municípios do Estado de São Paulo e s u b m e t i d a s ao tratamento por irradiação, utilizando-se uma fonte ^°Co (tipo G a m m a c e l l 220), c o m d o s e s de 5,0 kGy e 10 kGy e taxa de dose de 3,0 kGy/h. A m o s t r a s não irradiadas (grupo controle) foram usadas na contagem de fungos e diluições seriadas de 10"^ a 10"^ das amostras f o r a m s e m e a d a s em duplicata e plaqueadas u s a n d o o m é t o d o de cultura em superfície, e m ágar Dicloran Glicerol 1 8 % (DG18) e c o n t a d a s após cinco dias a 2 5 ° C . O grupo controle revelou a presença dos g ê n e r o s Aspergilius e Penicillium, os quais são conhecidos como fungos toxigênicos e p o u c a s amostras do g r u p o controle e s t a v a m dentro dos limites seguros, estabelecidos pela Organização Mundial de S a ú d e ( O M S , 1998) para plantas medicinais. E m resposta a resistência do tratamento por ionização, na dose de 5 kGy, foi o b s e n / a d o q u e os gêneros Aspergilius, Piioma e Syncephalastrum foram radiorresistentes, a p ó s o processo (dia O e 30° dia). O tratamento por radiação g a m a foi efetivo na d e s c o n t a m i n a ç ã o de t o d a s as amostras d e plantas medicinais, após 30 dias, c o m a d o s e d e 10 kGy e mantidas e m condições de v e d a ç ã o . Não foram detectadas aflatoxinas nas a m o s t r a s do grupo controle, ainda que estas amostras estivessem intensamente c o n t a m i n a d a s c o m Aspergilius flavus.

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S I M O N E A Q U I N O

A B S T R A C T

This present study evaluated the effect of gamma radiation on t h e fungal sun/ival in packed medicinal plants, purchased from wholesale and retail market, in different period (0 and 30 days) after the treatment. Five kind of medicinal plants {Peurnus boldus, Camellia sinensis, Maytenus ilicifolia, Pauilinia cupana and Cassia angustifolia), w e r e collected from different cities of São Paulo State, a n d submitted to irradiation treatment using a ^°Co source (type Gammacell 220) with d o s e s of 5,0 kGy and 10 kGy and at dose rate of 3.0 kGy/h. Non-irradiated s a m p l e s (control group) were used for fungal counts and serial dilutions from 10"^ to 10"^ of the samples were seeded in duplicates and plated using the surface culture method in Dichloran 1 8 % Glycerol Agar (DG 18) and w e r e counted after five d a y s at 2 5 ° C . T h e control group revealed the p r e s e n c e of genera Aspergillus and Penicillium, w h i c h are known as toxigenic fungi and a few samples of control group w e r e within the safety limits of World Health Organization ( W H O , 1998) to medicinal plants. In response to resistance of ionizing treatment, in the dose of 5 kGy, it w a s o b s e n / e d that the genera Aspergillus, Phoma and Syncephalastrum were radio-resistant after t h e process (day 0 and 30° day). T h e treatment by g a m m a radiation w a s effective in decontamination of all irradiated s a m p l e s of medicinal plants, after 30 days, with the d o s e of 10 kGy and kept of veiled conditions. It w a s not detected aflatoxins in s a m p l e s of control group, even though these s a m p l e s w e r e heavily contaminated w i t h Aspergillus flavus.

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SUMARIO

1 INTRODUÇÃO 01 2 OBJETIVOS 09 3 REVISÃO DA LITERATURA ....10

3.1 Plantas medicinais e legislação 10 3.2 Contaminação fúngica em produtos de origem vegetal 17

3.3 Fungos toxigênicos e micotoxinas 20

3.4 Aflatoxinas 23 3.5 Efeitos da radiação ionizante em fungos e em aflatoxinas 25

4 MATERIAIS E MÉTODOS 28 4.1 Amostras de plantas medicinais 28

4.2 Tratamento pelo processo de irradiação 30 4.3 Determinação de atividade de água (Aa) 32 4.4 Isolamento da microbiota fúngica das amostras 32 4.5 Potencial toxigênico das cepas de Aspergilius flavus isolados 34

4.6 Análise da presença de aflatoxinas nas amostras 35 4.6.1 r\/létodo: Soares e Rodriguez-Amaya, (1989) 35 4.6.2 Imunoextração (coluna de imunoafinidade) 36

4.7 Cromatografía em Carnada Delgada 38

4.8 Quantificação 39 4.9 Testes fitoquimicos qualitativos 39

5 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 4 2

6 RESULTADOS 43 6.1 Determinação da atividade de água (Aa) 43

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6.4 Pesquisa da microbiota fúngica (amostras irradiadas) 51

6.5 Extração de Aflatoxinas das amostras 65 6.5. Extração de aflatoxinas (Soares e Rodriguez-Amaya, 1989) 65

6.5.2 Imunoextração 66 6.6 Potencial toxigênico das cepas de A. flavus isolados 66

6.7 Testes fitoquimicos qualitativos 66

7. DISCUSSÃO 68 7.1 Determinação da atividade de água (Aa) 68

7. 2 Pesquisa da microbiota fúngica do grupo controle.... 70 7.3 Freqüência (%) de isolados fúngicos por locais de venda 71

7. 4 Pesquisa da microbiota fúngica (amostras irradiadas) 72

7.5 Extração de aflatoxinas 75 7.5.1 Método: Soares e Rodriguez-Amaya (1989) 75

7.5.2 Imunoextração 76 7.6 Potencial toxigênico das cepas de A. flavus isolados 78

7.7 Testes fitoquimicos qualitativos 80

8 CONCLUSÕES 82

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LISTA DE TABELAS

Página

TABELA 1 Designação, emprego e substâncias marcadoras das plantas medicinais

Boldo, Sene, Espinheira Santa, Guaraná e Chá verde 13

TABELA 2 Atividade de água das amostras controle (C), irradiadas com 5 kGy (5) e irradiadas com 10 kGy (10) de drogas vegetais, adquiridas do mercado atacadista e

varejista 43

TABELA 3 Contagens de fungos isolados (UFC/g) das amostras do grupo controle (não irradiadas) e irradiadas com a dose de 5 kGy analisadas no dia O e após 30

dias de Boldo 55

dias de Espinheira santa 56

dias de Sene 57

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dias de Ciiá verde 59

dias de Boldo 60

dias de Espinheira santa 61

dias de Sene 62

dias de Guaraná em pó 63

TABELA 12 Contagens de fungos isolados (UFC/g) das amostras do grupo controle (não irradiadas) e imadiadas com a dose de 10 kGy analisadas no dia O e após 30

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LISTA DEFIGURAS

Página

FIGURA 1 Estruturas químicas das principais aflatoxinas 23

FIGURA 2 Pontos de venda em feira livre e apresentação à granel em sacarias 28

FIGURA 3. Pontos de venda em feira livre e apresentação à granel em sacarias 28

FIGURA 4 Pontos de venda em feira livre e apresentação à grane! em sacarias 28

FIGURA 5 Produtos dispostos em lojas especializadas e embalados 29

FIGURA 8 Fracionamento e preparo das amostras coletadas do mercado

atacadista para análises em laboratório 29

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FIGURA 13 Guaraná 30

FIGURA 14 Espinheira santa 30

FIGURA 15 Chá verde 30

FIGURA 16 Boldo '. 30

FIGURA 17 Amostras embaladas para o tratamento pelo processo de

irradiação 31

FIGURA 18 Amostras embaladas para o tratamento pelo processo de

irradiação 31

FIGURA 19 Fonte Gammacell - ^°Co (IPEN - CNEN/SP) 31

FIGURA 20 Equipamento Aqualab do Laboratório de Micotoxinas (ICB ll-USP)

utilizado na determinação da Aa 3 2

FIGURA 21 Isolamento da microbiota 33

FIGURA 22 Incubação das placas a25°C 33

FIGURA 23 Imagem de microscopia óptica de Aspergillus spp 33

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FIGURA 25 Teste de potencial toxigênico em ágar coco de Aspergillus

spp 34

FIGURA 26 Teste de potencial toxigênico em ágar coco de Aspergillus

spp 34

FIGURA 27 Esquema de extração de aflatoxinas (Soares &

Rodriguez-Amaya-1989) 36

FIGURA 28 Coluna Aflatest®-VICAl/l 37

FIGURA 29 Uso da coluna laboratório de Micotoxinas ICB ll/USP) 3 7

FIGURA 30 Imunoextração de aflatoxinas por coluna de imunoafinidade (Bugno,

2006) 38

FIGURA 31 Cromatografia em camada delgada (CCD) 39

FIGURA 32 Rotaevaporador (Instituto Biológico) 40

FIGURA 33 Extratos obtidos após secagem 40

FIGURA 34 Representação esquemática das etapas do experimento 42

FIGURA 35 Isolados fúngicos em placas de Petri (diluições de lOr^ a 10'^) 44

FIGURA 36 Freqüência de gêneros de fungos isolados em amostras de Boldo (não

irradiadas) 45

FIGURA 37 Freqüência de espécies de Aspergillus isolados em amostras de Boldo

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FIGURA 39 Isolados fúngicos do grupo controle de Espinheira santa 46

FIGURA 40 Freqüência de especies de Aspergillus isolados em amostras de

Espinheira santa (não irradiadas) 47

FIGURA 41 Freqüência de gêneros de fungos isolados em amostras de Sene (não

irradiadas) 47

FIGURA 42 Freqüência de espécies de Aspergillus isolados em amostras de Sene

(não irradiadas) 48

FIGURA 43. Freqüência de gêneros de fungos isolados em Guaraná em pó (não

irradiado) 48

FIGURA 44 Freqüência de espécies de Aspergillus isolados em amostras de

Guaraná (não irradiadas) 49

FIGURA 45 Freqüência de gêneros de fungos isolados em Chá verde (não

irradiado) 49

FIGURA 46 Freqüência de espécies de Aspergillus isolados em amostras de Chá

verde (não irradiado) 50

FIGURA 47 Comparação da contaminação fúngica de plantas medicinais de acordo

com a forma de comercialização 51

FIGURA 48 Freqüência de fungos da amostras controles e irradiadas no dia O e

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FIGURA 49 Phoma spp. em Sene (5 kGy) 53

FIGURA 50 Aspergillus spp. em Sene (5 kGy) 53

FIGURA 51 Colônia de A. niger 53

FIGURA 52 Colonia de Syncephalastrum spp 53

FIGURA 53 Syncephalastrum spp 53

FIGURA 54 Gêneros fúngicos isolados em drogas vegetais, após o tratamento com

a dose de 5 kGy (dia 0) 53

FIGURA 55 Gêneros fúngicos isolados em drogas vegetais, após o tratamento com

a dose de 5 kGy (30 ° dia) 54

FIGURA 56 Isolados fúngicos em amostras de Sene após 30 dias do tratamento i pelo processo de irradiação (controle, 5 e 10 kGy) 65 '

FIGURA 57 Cromatografía (EE) de Chá verde (controle, 5e10 kGy) 67

FIGURA 58 Cromatografía (EH) de Chá verde (controle, 5e10 kGy) 67

FIGURA 59 Cromatografia (EE) de E. santa (controle, 5e10 kGy) 67

FIGURA 60 Cromatografia (EH) de E. santa (controle, 5e 10 kGy) 67

FIGURA 61 Cromatografía (EE) das amostras do grupo controle, 5e 10 kGy 67 i

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recurso terapêutico e m p r e g a d o na p r e v e n ç ã o , no tratamento, na cura de distúrbios, disfunções ou d o e n ç a s em h o m e n s e animais (Choi et al., 2002; Veiga et al., 2005).

O descobrimento das propriedades curativas das plantas ocorreu de forma meramente intuitiva, através da observação de animais, que buscavain nas ervas a cura para suas doenças (Hart, 2005). Estudos arqueológicos d e m o n s t r a r a m a existência de antigos papiros egípcios c o n t e n d o a descrição do uso de plantas, na terapia médica, que se divulgou para a M e s o p o t a m i a , disseminando-se mais tarde entre os gregos e romanos, que h e r d a r a m e aperfeiçoaram os conhecimentos egípcios (Mors, 1982). A maioria das plantas medicinais de interesse nos dias atuais, advém de civilizações antigas da África, Ásia, América do norte, Central e do Sul (Phillipson, 2001).

Recentemente, o foi e n c o n t r a d o j u n t o ao corpo do c h a m a d o Iceman ( H o m e m do gelo), descoberto nos Alpes Italianos e m 1 9 9 1 , c o m idade aproximada de 5.300 anos, fragmentos de "fungo de videira" {Birch fungus ou Piptoporus betulinus), presumidamente usado c o m o laxante e antibiótico (Capasse, 1998).

Durante o Renascimento, c o m a valorização da experimentação e c o m as grandes viagens para as índias e A m é r i c a , nasceu um novo período de progresso no conhecimento das plantas e s u a s aplicações, após um período de estagnação na Idade Média. A partir do século X V houve u m a preocupação e m catalogar um

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grande número de vegetais, identificando-os e classificando-os de acordo c o m a procedência e características dos principios ativos. A medicina popular e o conhecimento sobre o uso de plantas são os resultados de várias influências primitivas, culturais e históricas ( G a r d a , 2 0 0 3 ; Rates, 2001).

Heinrich et al. (1992) relatam que l e v a n t a m e n t o s realizados com uma comunidade indígena, d e m o n s t r a r a m que o sabor " a m a r g o e adstringente" eram os indicadores na seleção do uso da erva para propósitos de cura e tratamento. Estas observações s u g e r e m que os h o m e n s primitivos e animais buscavam as partes de plantas mais amargas, adstringentes ou r e p u g n a n t e s .

De 25 plantas medicinais estudadas, e n c o n t r a d a s na natureza, o sabor amargo ou adstringente foi citado e m 16 (73%) destas. O gosto amargo, adstringente ou repugnante, caracterizando a n ã o paiatabilidade de uma parte da planta, indica que esta é a região onde a s u b s t a n c i a química marcadora ou ativa encontra-se presente (Hart, 2005).

.A Revolução Industrial e o d e s e n v o l v i m e n t o da química orgánica provocaram a substituição dos m e d i c a m e n t o s vegetais por produtos contendo princípios ativos deles extraídos, ou seus derivados sintéticos, através de modificações estruturais e síntese de novas moléculas. Os produtos naturais passaram a apresentar u m significado místico e esta a b o r d a g e m era oposta ao novo modus vivendi d a s sociedades industrializadas, que consideravam a utilização de produtos naturais c o m o opção de p e s s o a s incultas e de baixa renda e não aferiam a estes produtos qualquer valor f a r m a c o l ó g i c o (Rates, 2001).

Entretanto, c o m o passar do t e m p o , a s plantas continuaram sendo importantes no d e s e n v o l v i m e n t o de novas d r o g a s e cerca de 3 0 % dos fármacos prescritos são derivados d e plantas e dos 2 5 2 f á r m a c o s considerados básicos ou

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O c r e s c i m e n t o da indústria farmacêutica e o desenvolvimento de novos e m a i s eficazes f á r m a c o s sintéticos, não diminuíram a importância das plantas medicinais e, nas últimas d é c a d a s , tem sido verificado progressivo a u m e n t o na d e m a n d a de plantas medicinais e m países c o m o França, Itália, Inglaterra, E s p a n h a e E s t a d o s Unidos (Abu-Irmaileh e Afifi, 2003; Bent e Ko, 2004).

Foi neste contexto, observada a tendência generalizada de retorno ao tratamento de d o e n ç a s c o m plantas, que a Organização Mundial da Saúde (OMS), e m A s s e m b l é i a G e r a l e m 1978, determinou o início de um programa mundial c o m o fim d e avaliar e utilizar os remédios da c h a m a d a medicina tradicional. A O M S estima que 80%¡ da população deste planeta, de algum modo, utiliza plantas medicinais c o m o m e d i c a m e n t o s e q u e 25.000 espécies de plantas sejam usadas nas p r e p a r a ç õ e s da medicina tradicional. É conveniente lembrar que m a i s de 3 6 5 . 0 0 0 e s p é c i e s de plantas j á f o r a m catalogadas e isto corresponde a cerca de 6 0 % d a s plantas existentes (Garcia, 2006).

Por definição, drogas vegetais são plantas medicinais ou suas partes, que após p r o c e s s o s d e coleta, estabilização e s e c a g e m estão e m condições d e s e r e m utilizadas c o m o m e d i c a m e n t o s . A s preparações derivadas de droga vegetal são produtos d a e x t r a ç ã o da matéria-prima vegetal, c o m o por exemplo, extratos, tinturas e e x s u d a t o s , e n q u a n t o que fitoterápicos correspondem a m e d i c a m e n t o s obtidos e x c l u s i v a m e n t e d e matérias-primas vegetais, sendo caracterizados pelo c o n h e c i m e n t o d e sua eficácia e dos riscos de seu uso, assim c o m o pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade (Brasil, 2004).

A t u a l m e n t e , a p r o x i m a d a m e n t e 8 2 % da população brasileira utiliza produtos à b a s e de e r v a s . Vários são os fatores econômicos, sociais e culturais que influenciam a utilização d e plantas medicinais e terapias alternativas:

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e Elevado custo dos medicamentos convencionais, que torna o acesso proibitivo à parte da população (Fennel et al., 2004; Veiga et al., 2005);

«5 Insatisfação c o m a medicina convencional (considerada ineficiente) e busca por terapias alternativas (Abu-Irmaileh e Afifi, 2003, Rates, 2001);

e P r e o c u p a ç ã o c o m efeitos adversos de medicamentos convencionais e a crença q u e m e d i c a m e n t o s naturais são mais seguros e saudáveis ( A b u -Irmaileh e Afifi, 2 0 0 3 , Rates, 2 0 0 1 ; Chan, 2003).

A m o v i m e n t a ç ã o no mercado de produtos de origem vegetal reflete o crescente interesse e a u m e n t o do comércio. Estima-se que, e m 1997, o mercado mundial m o v i m e n t o u cerca de US$ 10 bilhões, c o m crescimento de 6,5% ao ano (Calixto 2 0 0 0 ; Rates, 2001). Neste mesmo ano, o mercado europeu movimentou cerca de U S $ 7 bilhões, sendo US$ 3,5 bilhões na A l e m a n h a , US$ 1,8 bilhão na França, U S $ 800 milhões na Itália, US$ 500 milhões no Reino Unido, US$ 300 milhões na E s p a n h a e cerca de US$ 100 milhões nos países nórdicos. No Japão e alguns países da Á s i a alcançaram cerca de US$ 2,1 bilhões e US$ 2,3 bilhões, respectivamente (Calixto 2000; Rates, 2 0 0 1 ; Veiga et al., 2005).

No Brasil, até 1996, a estimativa do c o n s u m o de medicamentos sintéticos girava e m torno de 6 3 % , adquiridos por uma parcela da população de apenas 2 0 % . O restante encontrava nos produtos de origem natural, especialmente as plantas medicinais, a principal ou única fonte de recursos terapêuticos, justificando o crescimento do m e r c a d o de medicamentos fitoterápicos, na ordem de 15% ao ano (Di Stasi 1996).

O Brasil não se destaca na produção de fitoterápicos, quando c o m p a r a d o a países c o m o China, índia e A l e m a n h a . O mercado interno movimenta cerca de U S $ 500 milhões, apesar d e apresentar a maior biodiversidade do planeta, c o m 6 0 . 0 0 0 espécies vegetais que correspondem a 2 0 % de toda flora mundial. P r o b l e m a s e c o n ô m i c o s , culturais e sociais, falta de planejamento q u e garanta a

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dificuldades encontradas e que, freqüentemente, resultam e m produtos cuja qualidade não atende requisitos mínimos (Simões e S c h e n k e l , 2 0 0 3 ; Rates, 2001).

O uso individual de fitoterápicos não é considerado c o m o um problema de Saúde Pública. No entanto, o uso de m e d i c a m e n t o s naturais passou a ser um problema de Saúde Pública, nos dias atuais, c o m o advento da produção maciça e o c o n s u m o massificado d e lotes considerados c o m o "alterados, adulterados ou impróprios para o c o n s u m o " , onde qualquer p r o b l e m a relacionado á baixa qualidade atinge c e n t e n a s de pessoas, c o n f o r m e descrito no artigo 62, da Lei Federal 6.360 (Brasil, 1976).

A maioria das plantas medicinais, comercializadas in natura ou embaladas, apresenta-se fora do p a d r ã o , ou seja, o produto não t e m assegurado suas propriedades terapêuticas e aromáticas preconizadas e/ou estão contaminados por impurezas, tais c o m o terra, areia, dejetos animais, outras espécies vegetais, coliformes fecais, e t c , contradizendo a idéia de q u e os produtos de origem vegetal sejam freqüentem.ente c o n s i d e r a d o s seguros por s u a origem natural. Esta. situação foi gerada pela pouca exigência dos c o n s u m i d o r e s c o m relação à qualidade do produto, à ação incipiente d a fiscalização oficial e aos produtores que oferecem um produto de baixa q u a l i d a d e , ocasionando um círculo vicioso, e m prejuízo ao público interno fraco e d e s i n f o r m a d o (Brasil, 2006).

A necessidade d e c o m p r o v a ç ã o da qualidade, s e g u r a n ç a e eficácia envolvem análises c o m p l e x a s e a falta d e especificações farmacopêicas, contribui para a baixa qualidade d o s produtos d e origem v e g e t a l , a l é m d e possibilitar a ocorrência de adulterações. São vários os relatos d e produtos de origem vegetal adulterados, incorretamente identificados ou substituídos por espécies diferentes c o m m e s m a indicação d e uso (Bent e Ko, 2 0 0 4 , V e i g a et al., 2005).

(22)

Muitos produtos podem estar c o n t a m i n a d o s c o m resíduos de pesticidas, metais tóxicos, c o m o arsênico, c l i u m b o , mercúrio, c á d m i o e tálio, além de microrganismos e suas toxinas (De Smet, 2 0 0 4 ; T a s s a n e e y a k u l et al., 2004). Entre as fontes de contaminação, p o d e m ser citados o a m b i e n t e , as condições de cultivo e colheita, s e c a g e m , processamento, a r m a z e n a m e n t o e o transporte de plantas medicinais (Chourasia, 1995; C h a n , 2 0 0 3 ; S m o l i n s k e , 2 0 0 5 ) .

Fatores ambientais p o d e m interferir na q u a l i d a d e de drogas vegetais e preparações derivadas não apenas por permitirem a d e c o m p o s i ç ã o química de seus constituintes, mas t a m b é m por permitirem a contaminação por microrganismos e, portanto, é e s p e r a d o que drogas vegetais estejam contaminadas por um amplo espectro d e m i c r o r g a n i s m o s . Diversos trabalhos relatam a presença de fungos toxigênicos e m especiarias, substratos de plantas medicinais e frutas (Aziz et al., 1997; Abu-Irmaileh e Afifi, 2003; Efuntoye, 1996).

Esporos ou fragmentos de micelio (presentes no solo, e m restos de plantas, sementes ou transportados pela chuva e insetos) s ã o os responsáveis pelo início da contaminação e pelo desenvolvimento d o f u n g o na planta, particularmente no que se refere às se.mentes imaturas (Aziz et al., 2 0 0 2 ) .

Durante a colheita, as s e m e n t e s s ã o e x p o s t a s a d a n o s m e c â n i c o s e à contaminação fúngica. A p ó s a colheita, o d e s e n v o l v i m e n t o dos fungos toxigênicos e a produção de micotoxinas são d e p e n d e n t e s de u m a c o m p l e x a série de fatores (Ciegler, 1978):

(1) susceptibilidade do substrato á colonização do fungo toxigênico;

(2) fatores físicos: temperatura do a m b i e n t e , u m i d a d e do substrato, umidade relativa do ar durante o a r m a z e n a m e n t o , a e r a ç ã o , d a n o s mecânicos e tempo de a r m a z e n a m e n t o ;

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mesm.o substrato, interação de micotoxinas e presença de insetos.

A presença d e f u n g o s potencialmente toxigênicos encontrados e m drogas vegetais, deve ser c o n s i d e r a d o um indicativo e m potencial para a contaminação por micotoxinas, que p o d e m causar efeitos agudos e crônicos em várias espécies, nos diferentes órgãos e sistemas (Nunes, 2003).

Cerca de 300 toxinas são conhecidas, entretanto, somente algumas t ê m sido b e m estudadas. Para as micotoxicoses humanas, as aflatoxinas e ocratoxinas são apontadas c o m o carcinogênicas, e as fusariotoxinas (tricotecenos e fumoni.sinas) são de considerável importância, podendo causar riscos à saúde humana e animal ( Y o s h i s a w a , 1999; N u n e s , 2 0 0 3 ) .

Efuntoye (1999) avaliou a relação entre t e m p o de estocagem das plantas (por um período d e três meses) e níveis toxigênicos, demonstrando que, q u a n t o maior o t e m p o de a r m a z e n a m e n t o , maior era a produção de toxinas. Q m e s m o autor ainda observou q u e , após 90 dias de e s t o c a g e m , os níveis toxigênicos a p r e s e n t a r a m elevação m á x i m a nas plantas.

Nunes (2003) d e m o n s t r o u altos níveis de aflatoxinas em 50 amostras d e cinco tipos de fitoterápicos d e uso c o m u m na cidade de São Paulo. Neste estudo foi constatado que 8 0 % d a s amostras analisadas apresentaram elevados índices de contaminação, t o r n a n d o o produto impróprio para o consumo, s e n d o que 5 6 % dos isolados de Aspergilius flavus e os dois isolados de Aspergilius parasiticus produziram, aflatoxinas.

Roy et al. (1988) demonstraram a presença de aflatoxinas e m 14 de 15 amostras d e plantas medicinais, estudadas na índia, s e n d o encontradas as

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seguintes e s p é c i e s fúngicas: Aspergilius flavus, A. candidus, A. niger, A luchuensis, A. ochraceus, A. nidulans, Fusarium verticillioides, F. oxysporum, Cun/ularia lunata, Penicillium citrinum, Alternata alternaria e Rhizopus stolonifer

O e m p r e g o do tratamento pelo processo de irradiação pode ser um valioso m e i o de prevenir os riscos de contaminação fúngica, além de representar a alternativa mais a d e q u a d a para a descontaminação desta classe de produtos. Aziz et al. (1997), e s t u d a r a m os efeitos da radiação g a m a na viabilidade de fungos e actinomicetos c o n t a m i n a n t e s de plantas medicinais, revelando que 5 kGy foi a dose letal para a maioria dos fungos e actinomicetos contaminantes. Sweiha (1984) e M o u s s a (1988) relataram que actinomicetos são inteiramente eliminados após o tratamento c o m a dose de 10 kGy.

Os custos líquidos da irradiação oscilam entre 10 e 15 dólares americanos por tonelada, no caso da aplicação de uma dose baixa (por e x e m p l o , para inibir g e r m i n a ç õ e s nas batatas e nas cebolas) e, entre 100 e 250 dólares por tonelada, no caso d e aplicação de uma dose alta (por exemplo, para garantir a qualidade higiênica d a s especiarias). E m alguns casos, a irradiação pode ser muito m e n o s custosa o u , c o m o na maioria dos casos, o preço final do produto não aumenta s o m e n t e p e l o fato d e q u e u m produto tenha sido tratado pelo processo d e radiação ionizante ( I G G F I , 1999).

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O presente estudo propôs um l e v a n t a m e n t o da contaminação fúngica de plantas medicinais, e m cinco municipios, o n d e há predominância da classe mais baixa da população e o c o m é r c i o de plantas medicinais é intenso. C o m base nessas considerações, os principais objetivos f o r a m :

o Apresentar um p a n o r a m a local d o m e r c a d o de plantas medicinais e características dos produtos comercializados q u a n t o à c o n t a m i n a ç ã o fúngica;

» Isolar e identificar os principais gêneros fúngicos e m cinco amostras de drogas vegetais coletadas d o c o m é r c i o varejista e atacadista de quatro municípios pertencentes à Direção Regional de S a ú d e (DIR IV- Franco da Rocha) e do município de São Paulo;

e Identificar as principais espécies e analisar o potencial toxigênico do gênero Aspergilius, bem c o m o determinar a p r e s e n ç a d e aflatoxinas nas amostras de plantas medicinais coletadas;

o Verificar os efeitos da radiação ionizante (raios g a m a ) , nas doses de 5 e 10 kGy na d e s c o n t a m i n a ç ã o das d r o g a s vegetais logo a p ó s o tratamento (dia 0) e após 30 dias;

« Analisar o perfil fitoquímico das drogas vegetais, após o tratamento pelo processo d e radiação ionizante, c o m as d o s e s de 5 e 10 kGy.

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10

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 P l a n t a s m e d i c i n a i s e l e g i s l a ç ã o

Fitoquimicos são substâncias produzidas naturalmente pelas plantas, para protegê-las contra vírus, bactérias e fungos. Eles p a r e c e m ajudar na prevenção d e alguns tipos de d o e n ç a s e incluem centenas d e substâncias c o m o carotenóides, flavonóides, isoflavonas, compostos fenólicos, licopeno, saponinas, terpenos, sulfetos alílicos, indol e várias outras (Simões et al., 2 0 0 3 ) .

Os fitoquimicos p o d e m ser facilmente e n c o n t r a d o s nos alimentos que fazem parte da nossa alimentação habitual: frutas, v e g e t a i s , grãos, legumes e sementes. Por meio d e plantas medicinais secas o u f r e s c a s e seus extratos naturais, a fitoterapia trata das várias enfermidades. C h a m a m o s d e plantas medicinais as que têm aplicação c o n s a g r a d a pelo uso médico o u pelo povo, que constam da Farmacopeia Brasileira o u do The Merk Index ( P a n i z z a , 1997).

A importância do e m p r e g o da matéria-prima vegetal, na obtenção de um fitoterápico, representa u m fator importante na p r o d u ç ã o de um m e d i c a m e n t o c o m qualidade. A s matérias-primas ativas de origem v e g e t a l (planta fresca, seca, inteira ou e m partes), devido à sua c o m p l e x i d a d e de c o m p o s i ç ã o , requerem cuidados especiais, tanto no a r m a z e n a m e n t o quanto d u r a n t e a sua transformação. Na produção de produtos fitoterápicos, grande a t e n ç ã o d e v e ser dada ao planejamento da preservação da q u a l i d a d e físico-química e microbiológica, quer na matéria-prima ativa, quer dos p r o d u t o s intermediário e final (Sonaglio et al., 2003).

Nos anos 80 e 90, e m função do a u m e n t o do c o n s u m o de plantas medicinais decorrente d o m o d i s m o naturalista existente à é p o c a , começaram a surgir regulamentações setoriais c o m p l e m e n t a r e s para e exploração e comercialização de plantas medicinais (Teixeira, 1 9 8 5 ) .

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A legislação, s o b r e medicamentos de origem vegetal, recebe diferentes a b o r d a g e n s e m sua regulação no mundo. Na Europa e Coréia os produtores são obrigados a a p r e s e n t a r e m provas científicas da segurança e eficácia de cada produto ( D e Smet, 2004). Nos Estados Unidos, são classificados como s u p l e m e n t o s alimentares e não é permitido afirmações quanto a propriedades f a r m a c ê u t i c a s , m a s são requeridas a certificação e o controle de qualidade destes produtos. A regulação e fiscalização são mais precárias nos países ern d e s e n v o l v i m e n t o , o n d e há grande número de produtos utilizados c o m base na tradição e no c o n h e c i m e n t o empírico sobre seu uso (Sardesai, 2 0 0 2 , Fennel et al., 2004).

No Brasil, os primeiros atos normativos de expressão referentes às plantas medicinais, e s t a v a m relacionados c o m as atividades ligadas á s a ú d e , baseados nos regimentos portugueses que citavam os cuidados c o m preparações de m e d i c a m e n t o s . Essas regulamentações perduraram até a chegada da Família Real p o r t u g u e s a no Brasil, m a s tal fato pouco contribuiu para a normatização dos produtos f i t o q u i m i c o s , m e s m o no período de independência (Marques e Petrovick, 2003).

Os m e s m o s autores relatam que a publicação da primeira Farmacopéia Brasileira elaborada (praticamente sozinho ao longo de 12 anos de pesquisa) por Rodolfo A l b i n o , c o n t e m p l o u mais de duzentas e oitenta espécies botânicas nacionais e estrangeiras, c o m p o n d o as monografias a serem usadas c o m o referência n o s aspectos d e controle da qualidade na produção de medicamentos, C o m a e x p a n s ã o das boticas e regulamentação da profissão farmacêutica a partir d e 1 9 3 1 , outros Decretos seriam posteriormente publicados para a r e g u l a m e n t a ç ã o e fiscalização das atividades relacionadas às drogas vegetais.

A t u a l m e n t e , a fiscalização dos medicamentos fitoterápicos, no Brasil, é realizada pela A n v i s a (Agência Nacional de Vigilância Sanitária). O Ministério da

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12

S a ú d e , em d e z e m b r o de 2000, realizou o Fórum Nacional para a Discussão da Proposta de Política Nacional de Plantas !\/iedicinais e Medicamentos Fitoterápicos. S e g u n d o dados da A n v i s a , alguns fitoterápicos podem auxiliar nas patologias mais diversas, c o m o no tratamento de problemas digestivos e biliares. Contudo, alerta para q u e os pacientes t e n h a m acompanhamento médico, para que não sejam prejudicados c o m as restrições de uso dos medicamentos (Conselho Regional de F a r m á c i a , 2006). A Resolução - RE n." 88, publicada e m 16 de março de 2004, relaciona alguns tipos d e fitoterápicos com suas propriedades benéficas para a s a ú d e e suas doses r e c o m e n d a d a s para uso como por e x e m p l o , a Espinheira santa, Guaraná, Boldo e Sene, onde constam orientações c o m o venda sem prescrição médica e s e m restrições de uso para tais drogas vegetais (TAB. 1) (Brasil, 2004).

Boldo-do-Chile {Peumus boldus), Espinheira santa {Maytenus ilicifolia). G u a r a n á {Pauilinia cupana), Sene {Cássia angustifolia) e C h á verde {Cameilia sinensis) são a l g u m a s d a s drogas vegetais de maior procura no comércio de p r o d u t o s naturais e considerando a forma caseira de c o n s u m o de drogas vegetais, ( c o m o infusões de folhas desidratadas), é importante ressaltar os limites de c o n t a m i n a ç ã o microbiológica de tais produtos. C o m p a r a n d o - s e com os limites p r e c o n i z a d o s pela Portaria n° 4 5 1 (revogada pela RDC n.° 12) que determinava os p a d r õ e s microbiológicos para alimentos e produtos de infusão c o m o chá, café, m a t e , e t c , os valores considerados aceitáveis para bolores e leveduras eram de a t é 5 x 1 0 ^ U F C / g (Brasil, 1997; Brasil, 2001).

A Portaria n° 123 de 19 d e outubro de 1994, da Secretaria d e Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde (Brasil, 1994), estabelecia o limite para bolores e leveduras de 1,0 x IO'* UFC/g e m drogas vegetais e determinava a ausência de f u n g o s d o gênero Aspergilius, dentre outros microrganismos e seus contaminantes. No entanto, tais especificações não se mantiveram na legislação, uma vez que a

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Portaria n° 123 foi revogada pela Resolução - RDC n°. 17, publicada em 24 de fevereiro de 2000 pela A N V I S A .

T A B E L A 1. Designação, emprego e substâncias m a r c a d o r a s das plantas medicinais Boldo, Sene, Espinheira Santa, Guaraná e Chá V e r d e .

N o m e da planta P r i n c í p i o s ativos o u P a r t e d a m a r c a d o r e s p l a n t a E m p r e g o Boldo-do-Chile (Peumus boldus) Espinheira santa {Maytenus ilicifolia) Guaraná {Pauilinia cupana) Sene {Cassia angustifolia) Chá verde {Camellia sinensis)

Óleo essencial (eucaliptol, ascaridol, cineol, eugenol e

alfa pineno); alcalóides (boldina); taninos; glicosídeos; flavonóides Carotenóides; taninos; óleo

essencial; terpenos (maitensina, maitomprina, maitombutina e maitolidina); flavonóides; pigmentos antocianina; mucilagens; açúcares. Cafeína; óleo fixo; pigmentos (matéria-prima

corante formada de 2 substâncias, uma vermelha

e outra parda); saponinas; amidos; pectinas; fibras;

sais minerais; taninos. Derivados hidroxiantracênicos

(calculados como senosídeo B) Catequinas, epicatequina (EC), epicatequina gaiato (ECG), epigalocatequina (EGC) e epigalocatequina gaiato (EGCG). Folhas Folhas Semente Folhas e frutos Folhas Colecistites; eliminador de cálculo biliar; afecções gástricas, hepáticas e renais; insuficiência hepática. Afecções gástricas, úiceras, feridas, escaras, afecções da pele, fermentações intestinais. Diarréias crônicas; disenterias; enxaquecas; hemicranias; máscara facial para pele oleosa; astenia; estimulante do

SNC.

Laxativo Suave; Indicada na constipação

por inércia intesfinal

Ação anfioxidante; diminuição dos níveis de

colesterol total, pressão arterial; propriedades

ligadas ao emagrecimento

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14

A RDC n°. 17, foi que definiu o regulamento dos m e d i c a m e n t o s de origem vegetal e fitoterápicos. Essa resolução e n q u a d r a v a os produtos e m três classes: novos, tradicionais e isentos de registro, e m virtude da n e c e s s i d a d e de uma politica q u e coordenasse os produtos de origem natural q u e , até então, estavam à venda no mercado em categorias indefinidas.

A p ó s a instauração da RDC n°. 17, f o r a m constatadas algumas falhas em relação à identificação dos produtos fitoterápicos d e origem nacional, principalmente e m relação ao registro na categoria dos tradicionais.

Posteriormente, a Resolução - R D C n°. 48 publicada e m 16 de março de 2004, revogou a R D C n°. 17 e definiu fitoterápico c o m o "medicamento obtido empregando-se e x c l u s i v a m e n t e matérias-primas ativas vegetais". É caracterizado pelo conhecimento d a eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e c o n s t â n c i a de sua qualidade. Sua eficácia e segurança são validadas através d e levantamentos etnofarmacológicos de utilização, documentações tecno-científicas e m publicações ou ensaios clínicos. Não se considera m e d i c a m e n t o fitoterápico a q u e l e q u e , na sua composição, inclua substâncias ativas isoladas, de qualquer o r i g e m , n e m as associações destas com extratos vegetais". A i n d a definiu matéria prima vegetal c o m o "planta medicinal fresca, droga vegetal o u derivada de droga vegetal".

Para registro d e u m fitoterápico, a R D C n.° 48 exige a documentação do controle de qualidade d o produto a c a b a d o , b e m c o m o os registros dos testes de pureza e integridade, incluindo: cinzas, cinzas insolúveis e m ácido clorídrico, umidade, pesquisa d e matérias e s t r a n h a s , pesquisa de contaminantes microbiológicos e d e m e t a i s tóxicos. Em caso d e utilização de métodos para eliminação de c o n t a m i n a n t e s , deve-se d e s c r e v e r o m é t o d o e a pesquisa de eventuais alterações d a matéria-prima.

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D e acordo c o m a legislação referente a esta classe d e produtos, todas as e m p r e s a s q u e solicitam o registro de um fitoterápico, devem apresentar literatura

científica sobre aspectos relacionados à segurança e eficácia de sua utilização e, a p e n a s são aceitos estudos publicados e m revistas e compêndios internacionais r e c o n h e c i d o s pela A g e n c i a Nacional de Vigilância Sanitária (Brasil, 2004). A q u a l i d a d e implica controle e nele estão envolvidos experimentos nos quais se

insere o controle de microrganismos, entre os quais se encontram os fungos filamentosos (Brandão, 1998; Bugno, 2002; Santos, 1995).

Na R D C n°48 os limites para contaminação fúngica de drogas vegetais não f o r a m mantidos e, a p e n a s estabelece q u e o controle da qualidade de drogas

vegetais e fitoterápicos d e v e m estar de acordo c o m a referência bibliográfica da F a r m a c o p é i a consultada e reconhecida pela ANVISA.

Embora a prática da fitoterapia encontre uma série d e dificuldades, o Ministério da S a ú d e publicou a Portaria n° 9 7 1 , de 3 d e maio de 2006, q u e

e s t a b e l e c e a Política Nacional de Práticas Integrativas e C o m p l e m e n t a r e s , visando oferecer ao Sistema Único d e Saúde - S U S , a possibilidade d e tratamento c o m plantas medicinais e fitoterápicos (Brasil, 2006).

E m 1998 a World Health Organization (WHO) publicou o d o c u m e n t o Quality

control methods for medicinal plant materiais, onde são descritos protocolos d e metodologias para o controle d a qualidade de plantas medicinais. Neste d o c u m e n t o

consta a d e t e r m i n a ç ã o de limites de microrganismos patogênicos, incluindo-se

fungos toxigênicos, b e m c o m o para as aflatoxinas. Os limites para fungos e m diferentes substratos d e plantas são W H O (1998):

condições aceitáveis d e higiene e onde se pretende aplicar tratamentos adicionais (incluindo descontaminação adicional por processos q u í m i c o s ou

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físicos): Fungos filamentosos, m á x i m o de 10^ unidades formadoras de colônias por g r a m a (UFC/g);

e Para matérias-primas de plantas pré-tratadas, antes do c o n s u m o , (com água fervente e m chás o u infusões) ou q u e são usadas e m formas tópicas: Leveduras e bolores m á x i m o 10'' U F C / g ;

o Para outras matérias-primas de uso interno: Leveduras e bolores máximo 10^ UFC/g.

A Farmacopéia Britânica (2004) e a Farmacopéia Européia (2000), no ansxo intitulado Microbial Quality of Pharmaceutical Preparations, apresenta as seguintes recomendações m í n i m a s (sem status mandatório) para produtos contendo uma ou mais drogas vegetais:

o Produtos a que s e r ã o adicionados á g u a fervente antes de seu consumo: máximo de 10^ U F C / g de bolores e leveduras;

o Para os d e m a i s produtos: m á x i m o de 10'* UFC/g de bolores e leveduras.

A Farmacopéia Brasileira (1998) e s e u s fascículos publicados de 1996 a 2005, apresentam u m total de 4 2 m o n o g r a f i a s de drogas vegetais e não determina especificações microbiológicas para drogas vegetais, m a s indica o limite para produtos de uso oral de 10^ U F C / g de bolores e leveduras. A 28^ edição da farmacopéia A m e r i c a n a ( U S P , 2005) r e c o m e n d a o limite de 10^ UFC/g como especificações m í n i m a s d e bolores e leveduras para drogas vegetais (Bugno, 2006).

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Não existe, até o presente momento, uma regulamentação específica para limites d e aflatoxinas e m fitoterápicos no Brasil. Para aflatoxinas, a W H O determina testes para a possível presença de aflatoxinas B i , B2, G i e G2, cuja presença de cada u m a delas, e m qualquer matéria-prima originária de plantas medicinais, é considerada c o m o altamente perigosa. A interpretação dos resultados c o n s i d e r a d o s satisfatórios para pesquisas de aflatoxinas ocorre q u a n d o n e n h u m a m a n c h a é obtida das amostras, correspondente á posição da m a n c h a padrão de aflatoxina, a p ó s a cromatografia. Caso apareça uma m a n c h a correspondente á posição da marca d o padrão, a amostra deverá ser considerada positiva para a p r e s e n ç a da micotoxina e ser posteriormente quantificada.

3 . 2 C o n t a m i n a ç ã o f ú n g i c a e m p r o d u t o s d e o r i g e m v e g e t a !

A obtenção de produtos fitoterápicos, quer seja e m escala oficinal, hospitalar ou industrial, requer a produção de acordo com os conceitos atuais de q u a l i d a d e e as matérias-primas ativas de origem vegetal, r e q u e r e m cuidados especiais, tanto no a r m a z e n a m e n t o quanto na sua transformação.

Nas últimas décadas, poucos estudos foram publicados sobre a c o n t a m i n a ç ã o fúngica e m plantas medicinais. Lutomsky e Kedzia (1980) analisaram 2 4 6 amostras d e drogas vegetais e verificaram contagens superiores a

10^ U F C / g d e bolores e leveduras em 9 0 % das amostras e 50 amostras a p r e s e n t a r a m os gêneros Aspergilius e Penicillium.

Roy et al. (1988) verificaram a presença d e 13 espécies fúngicas, c o m o A. flavus, A. candidus, A. niger, A. niger, A. luchuensis, A. ochraceus, A. nidulans, Fusarium verticillioides (moniliforme) e Penicillium citrinum, as quais e r a m as mais freqüentes. E m 124 amostras de condimentos e ervas advindos de m e r c a d o s e s p a n h ó i s . Garrido e colaboradores constataram que 8 7 , 5 % a p r e s e n t a r a m

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c o n t a g e n s acima de 10^ UFC/g, c o m a presença dominante dos gêneros Aspergillus e Penicillium.

Fischer et al. (1993), relataram que 84 amostras d e especialidades fitoterápicas, obtidas no comércio de São Paulo, apresentaram contagens superiores a 10^ U F C (de bolores e leveduras) por grama de a m o s t r a . Chourasia (1995) verificou a presença, principalmente de Aspergillus spp. {A. flavus, A. parasiticus e A. ochraceus) e Fusarium spp., em 5 4 % de a m o s t r a s de drogas v e g e t a i s de Bhagapur, índia.

Santos et ai. (1995) analisaram 5 i amostras de produtos füoterápicos e verificaram que 2 1 , 6 % das amostras estavam contaminadas c o m bolores e leveduras c o m contagens superiores a 10^ UFC/g, c o m a presença de Aspergillus spp. e Penicillium spp., e m 2 3 , 5 % e 2,0%, respectivamente, nas amostras. Efuntoye (1996) isolou 28 espécies de fungos em 2 5 % das a m o s t r a s de plantas medicinais adquiridas e m Ibadan (Nigéria), cujas espécies d o m i n a n t e s foram A. niger, A. flavus, F. verticillioides (moniliforme) e P. expansum.

A l e x a n d e r et al. (1997) constataram que, em 25 especialidades fitoterápicas constituídas de 250 a m o s t r a s de comprimidos, 46 amostras e m pós e granulos, 58 a m o s t r a s de líquido oral e 71 amostras d e produtos para uso tópico, 6 , 4 % a p r e s e n t a r a m contagens superiores a 2 x 10^ UFC/g e em 2 0 % d a s amostras de pós ou granulos, a c o n t a m i n a ç ã o era superior a 10'* UFC/g. A z i z et al. (1998) verificaram a presença de 10 gêneros fúngicos em 84 a m o s t r a s de plantas medicinais, coletadas no Cairo (Egito) sendo detectados com maior freqüência A. flavus, A. parasiticus, A. niger, Fusarium oxysporum e Penicillium viridicatum.

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Hait (1998) analisou 62 amostras de drogas v e g e t a i s e 11 amostras de chás c o m contagens fúngicas variando entre 10^ e 10^ e entre 10^ e 10"* UFC/g, respeciivamente. O autor isolou os g ê n e r o s p r e d o m i n a n t e s c o m o Aspergilius e Penicillium. A b o u - A r a b et al. (1999) analisaram a m o s t r a s de drogas vegetais e verificaram q u e os g ê n e r o s Aspergilius e Penicillium f o r a m os m a i s isolados, t a m b é m observados por EIshafie et al. (1999) e m 4 8 amostras de chá preto {Cameilia sinensis L.) onde a freqüência d o m i n a n t e o b s e r v a d a foi de A. niger, A. flavus e Penicillium s p p .

Nos últimos a n o s , o interesse pelo e s t u d o da c o n t a m i n a ç ã o fúngica em plantas medicinais cresceu e m relação ás d é c a d a s anteriores. Estudos mais recentes d e m o n s t r a r a m que a contaminação de bolores ainda p e r m a n e c e elevada. E m 138 amostras de drogas vegetais, adquiridas no comércio da Áustria e Alemanha, C z e c h et al. (2001) verificaram q u e 8 0 % a p r e s e n t a r a m contaminação fúngica acima de 10^ UFC/g (com c o n t a g e n s v a n a n d o entre 10^ e 10^ UFC/g). Martins et al. (2001) avaliaram 62 a m o s t r a s de 7 tipos de plantas medicinais, adquiridas e m Lisboa (Portugal) e verificaram p o p u l a ç õ e s médias d e fungos da ordem de 10^ U F C / g .

Martins et al. (2001) avaliaram 62 a m o s t r a s de plantas medicinais, adquiridas e m Lisboa (Portugal) e verificaram a p r e s e n ç a de Fusarium spp. (59,7%), Aspergilius flavus (22,6%), A. glaucus (32,2%) e A. niger {46,8%), além de Penicillium s p p . (61,3%). Rizzo et al. (2004) isolaram A. flavus e A. parasiticus e m 5 2 % de 152 amostras de plantas medicinais na A r g e n t i n a , enquanto 1 6 % apresentaram contaminação c o m F. verticilioides e F. proliferatum.

Rocha et al. (2004) analisaram 4 0 amostras d e S e n e e Boldo, coletados e m farmácias de manipulação e e m mercados d a cidade de C a m p i n a s e constataram que 4 5 % a c i m a dos limites permitidos pela O M S . Z a r o n i et al. (2004) verificaram

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que 7 9 % das 72 amostras de plantas medicinais, produzidas no Estado do Paraná, não a t e n d e r a m aos parâmetros estabelecidos pela W H O , com contagens que variaram entre 1,0 x 10^ e 8,4 x 10^ UFC/g de bolores e leveduras. Soriani et al. (2005) encontraram valores elevados de fungos e m amostras não irradiadas de Ginkgo biloba e guaraná e a c o n t a g e m total de fungos foi de 10^ and 10^ CFU/g, respectivamente. Entretanto, neste estudo não é discriminado os gêneros de fungos presentes nas drogas vegetais.

O s diversos autores citados relatam ainda a presença de outros gêneros de fungos e m plantas medicinais, tais como: Mucor, Rhizopus, Thamnidium, Alternaria, Cun/ularía, Cladosporium, Paecilomyces, Puliularia, Sporendonema, Syncephalastrum: Tricothecium, Erotium, Absidia, Tríchoderma e Rhizoctonia.

3.3 F u n g o s toxigênicos e m i c o t o x i n a s

A palavra micotoxina é derivada dos t e r m o s gregos "mykes", que significa fungo, e "toxikon", que significa toxina ou v e n e n o . O t e r m o micotoxina descreve um grupo bastante diversificado de c o m p o n e n t e s q u í m i c o s , c o m diferentes fórmulas estruturais, propriedades químicas, físicas e toxicológicas, tendo em c o m u m somente o fato de serem produtos de biossíntese fúngica. Micotoxinas são, desta forma, metabólitos fúngicos capazes de produzir efeitos agudos ou crônicos nos homens e nos animais (Council for Agricultural Science and Technology, 2003).

Micotoxinas são metabólitos secundários orgânicos, de baixo peso molecular, não proteináceos, c o m p l e x o s , c o m elevada toxicidade, q u a n d o em pequenas quantidades, a microrganismos, plantas e animais. P o d e m ser voláteis, parcialmente voláteis ou não voláteis. A s micotoxinas auxiliam os fungos a serem mais competitivos dentro de seu nicho ecológico, m a s não são necessárias para o crescimento e desenvolvimento de todas as e s p é c i e s fúngicas (Bugno, 2006).

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Fungos toxigênicos são aqueles capazes de produzir micotoxinas e são relativamente u b í q u o s e adaptados para colonizar, crescer e produzir toxinas em uma variedade de substratos, q u a n d o em condições favoráveis, de acordo com as exigências das diferentes espécies (Stoloff, 1979). Os principais gêneros fúngicos associados c o m a produção de micotoxinas são Aspergilius, Penicillium e Fusarium e são a m p l a m e n t e distribuídos no ecossistema brasileiro (Corrêa, 2000).

O risco potencial da presença de fungos toxigênicos e m plantas medicinais é a f o r m a ç ã o d e micotoxinas, principalmente e m países tropicais e subtropicais, que oferecem condições ambientais favoráveis ao crescimento fúngico e á produção de micotoxinas, cuja presença significa um perigo à saúde humana (Bugno et al., 2006).

E m condições específicas, e m geral independentes daquelas necessárias ao crescimento fúngico, a contaminação se inicia no c a m p o e continua durante a coleta, s e c a g e m e a r m a z e n a m e n t o (Bennet e Klich, 2003; Stoloff, 1979). O gênero Aspergilius é a m p l a m e n t e distribuído, embora ocorra c o m maior freqüência e m .«•egiões subtropicais e tropicais; sua capacidade de crescer em condiçcec de alta temperatura e baixa atividade d e água permite a colonização em extensa variedade de substratos, s e n d o encontrado c o m u m e n t e no período de armazenamento (Chourasia e Roy, 1 9 9 1 ; Pitt et al., 2000).

O s f u n g o s d o gênero Penicillium crescem e produzem micotoxinas preferencialmente e m climas temperados, c o m o citrinina, ocratoxinas, ácido ciclopiazônico e sterigmatocistina e t a m b é m estão associados aos períodos d e e s t o c a g e m de matéria-prima. O gênero Fusarium possui espécies adaptadas a vários habitats e s ã o amplam.eníe distribuídos, produtores de várias micotoxinas c o m o tricotecenos, fumonisinas e zearalenona (Pitt et ai., 2000).

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N e m todos os fungos são produtores de micotoxinas e a presença de e s p é c i e s fúngicas contaminantes não implica na presença de micotoxinas, qua d e p e n d e m d e condições favoráveis à produção e de fatores intrínsecos, como c e p a s de uma m e s m a espécie toxigênica, que não possuem capacidade de síntese de micotoxinas, necessitando da avaliação de seu potencial toxigênico quando isoladas (Chourasia, 1995; Corrêa et a/., 1997; Norred, 2000).

A principal via de exposição é a ingestão de produtos contaminados, embora a e x p o s i ç ã o dérmica e inalatória sejam importantes vias a serem consideradas, principalmente e m exposições ocupacionais. Os gêneros fúngicos Penicillium e Aspergilius, considerados os principais contaminantes de alimentos, são e n c o n t r a d o s e m áreas úmidas de edificações e a exposição crônica às suas micotoxinas t e m sido estudada em ambientes internos. Estudos e m animais indicaram que a exposição inalatória pode ser mais tóxica do q u e a ingestão. A a u s ê n c i a de fungos toxigênicos no ambiente não é um indicativo de que não e x i s t a m micotoxinas, u m a vez q u e estas p o d e m persistir no ambiente, m e s m o que o f u n g o produtor j á não esteja presente no local (Jarvis e Miller, 2005).

A severidade da micotoxicose é dependente do tipo de micotoxina envolvida, s i n e r g i s m o c o m outras substâncias químicas ou micotoxinas, d u r a ç ã o e via de e x p o s i ç ã o , dose, idade, sexo, predisposição genética, estado nutricional e de s a ú d e d o indivíduo. Os efeitos podem ser agudos ou crônicos, carcinogênicos, m u t a g ê n i c o s , teratogênicos e/ou imunossupressores (Bugno, 2006; Bennet e Klich, 2 0 0 3 ) .

A incidência ocorre, e m geral, em partes do mundo onde a manipulação e a r m a z e n a m e n t o de produtos são realizados sob condições p r e c á n s s , nas quais e x i s t e m problemas de m á nutrição e pouca regulação para proteger as populações e x p o s t a s . P o u c o s são os estudos referentes à incidência de micotoxinas e m drogas v e g e t a i s e fitoterápicos (Bugno, 2006).

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o o Anatoxina Bj O O Âílatoxina G i C O Aflatoxina B2

FIGURA 1. Estruturas químicas das principais aflatoxinas (Fonte: CAST, 2003).

Os fungos c o m u m e n í e encontrados e m d r o g a s vegetais são responsáveis pela deterioração de plantas medicinais e, a l g u m a s delas que contêm óleos essenciais, p o d e m sofrer rancidez biológica, ou seja, um tipo de deterioração causada por e n z i m a s hidroliticas e c o n t a m i n a n t e s microbiológicos, no caso mais conhecido, as aflatoxinas, q u e p o s s u e m propriedades carcinogênicas e são produzidas pelos f u n g o s toxigênicos Aspergillus flavus, A. parasiticus e A. nomius (Simões et a/., 2003; l A R C , 1993; Pitt & Hocking, 1999).

A s aflatoxinas são metabólitos s e c u n d á r i o s altamente tóxicos produzidos por espécies do g ê n e r o Aspergillus, principalmente A. flavus Link, A. parasiticus Speare e A. nomius. Químicamente, as aflatoxinas são cumarinas substituídas ligadas a deidrofurano. S ã o conhecidas 17 s u b s t â n c i a s d o grupo, entretanto, as mais importantes e m alimentos são as aflatoxinas B i , 82, G i e G2 (FIG. 1). A aflatoxina B i é a mais tóxica seguida da G i , B2 e G2 (Wyilie & M o r e h o u s e , 1977).

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A s quatro substâncias são distinguidas c o m base nas s u a s fluorescencias, ou seja, a aflatoxina B i ( A F B i ) e a aflatoxina B2 (AFB2) emitem fluorescencia azul (blue), A aflatoxina G i ( A F G i ) e a aflatoxina G2 (AFG2) emitem fluorescência verde (green). A. flavus produz somente a s aflatoxinas B i e B2, e n q u a n t o A. parasiticus e A. nomius produzem as quatro toxinas. A s aflatoxinas são estáveis ao calor sendo decompostas à temperatura de cerca de 2 2 0 °C ( V a n Der Zijden et al., 1962).

Foi demonstrado, e m uma variedade d e e s p é c i e s animais, que a aflatoxina B i é o mais potente carcinogênico d e fígado q u e s e conhece. A carcinogenicidade em animais é tão elevada que qualquer esforço d e v e ser feito para monitorar e reduzir os níveis e m alimentos h u m a n o s (Pitt & H o c k i n g , 1999).

U m a d a s causas d a extrema toxicidade d a A F B i é devida a s u a rápida absorção pelo sistema gastrointestinal, q u e facilita a sua entrada na circulação sangüínea, através da via portal, e o seu transporte para o fígado , q u e é o maior sítio d e biotransformaçao da A F B i , o n d e ocorre inicialmente a ativação metabólica dos c o m p o n e n t e s tóxicos e carcinogênicos, e s u b s e q ü e n t e s reações com macromoléculas e organelas celulares. A biotransformaçao ocorre pela ação de enzimas microssomais pertencentes à superfamília de enzimias do citocromo P-450, resultado e m um c o m p o s t o reativo 8,9-epóxido, capaz d e reagir, através de ligações covalentes, c o m sítios nucleofílicos d e m a c r o m o l é c u l a s c o m o o ácido desoxirribonucléico (DNA), ácido ribonucleico ( R N A ) e proteínas (Bennet e Klich, 2003).

A ligação do derivado e p ó x i d o c o m g u a n i n a s da molécula do DNA, na posição N7, forma adutos, os quais representam a lesão bioquímica primária produzida por aflatoxinas, modificando a estrutura d o DNA e, conseqüentemente, sua atividade biológica, resultando e m efeitos m u t a g ê n i c o s e carcinogênicos (Dalezios et al., 1973; Pitt et al., 2 0 0 0 ) . A l é m da e p o x i d a ç ã o , a biotransformaçao das aflatoxinas inclui a f o r m a ç ã o d e metabólitos hidroxilados, m e n o s ativos, c o m o

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as aflatoxinas M, Q e P, hidrossolúveis e que p o d e m ser rapidamente excretadas (Oliveira e G e r m a n o , 1997).

Chourasia (1995) verificou a presença de aflatoxina B i em 4 3 % de drogas vegetais (0,05 a 0,91 |.ig/g) e Reif e Metzger (1995) verificaram a presença de aflatoxinas B i , B2, G i e G2 em amostras de drogas vegetais e preparações derivadas. Roy et al. (1988), constataram que 9 3 % das 15 a m o s t r a s de plantas medicinais coletadas d o comércio na índia, continham aflatoxinas c o m o um contaminante natural ( c o m concentrações entre 0,09 e 1,20 ¡ig/g) e q u e tais plantas e r a m destinadas para preparações tradicionais a fim de tratar uma moléstia. No entanto, o t r a t a m e n t o d e u m a doença com esse material pode levaria causar d a n o s mais severos para s a ú d e .

U m estudo realizado por Tassaneeyakul (2004) e colaboradores d e m o n s t r o u que d o total de 28 p r o d u t o s derivados de plantas medicinais (tabletes e cápsulas), 18 % apresentaram níveis detectáveis de aflatoxinas, variando d e 1,7 a 14,3 ng/g. Y a n g et al. (2005) relataram a presença de aflatoxinas em 14 a m o s t r a s de drogas vegetais chinesas, t e n d o sido detectadas aflatoxina B i em 3 amostras (1,58; 4,18 c 27,80 fig/g), aflatoxina B2 e m 3 amostras (1,32; 5,16 e 4,38 ^g/g) e aflatoxina G i e m u m a amostra (1,31 )ag/g).

3.5 Efeitos da r a d i a ç ã o ionizante em fungos e e m aflatoxinas

Quando a r a d i a ç ã o ionizante é absorvida por um material biológico, esta age diretamente e m alvos críticos na célula. A s moléculas de ácido nucleico p o d e m ser ionizadas ou excitadas, e por meio disso, iniciar a cadeia de e v e n t o s que c o n d u z e m às m u d a n ç a s biológicas e á morte celular. Este é o efeito direto da radiação, o qual é o p r o c e s s o dominante q u a n d o esporos secos d e m i c r o r g a n i s m o s são irradiados (Diehl, 1995).

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Alíernativamente, a radiação pode interagir com outros átomos ou moléculas na célula, particularmente água, para produzirem radicais livres, os quais podem difundir-se, alcançar e danificar o DNA. Este efeito indireto da radiação é importante e m células vegetativas, cujo citoplasma contém cerca de 8 0 % de água (Diehl, 1995).

O tipo de irradiação utilizado no tratamento de alimentos se limita ás radiações provenientes dos raios gama de alta energia, os raios X e os elétrons acelerados ( W H O , 1994). A p ó s a determinação das d o s e s e tratamento pelo processo de irradiação, as amostras são analisadas pela presença ou ausência de e s p o r o s sobreviventes, após a incubação e, o crescimento fúngico pode ser visualizado e m placas de Petri, contendo meio de cultivo es.oecífico pare fungos (Aquino, 2003).

A capacidade de crescimento é perdida em baixas d o s e s , entretanto, a idade d a s culturas pode influenciar consideravelmente a radiosensibilidade e por isso, experimentos conduzidos por diferentes autores, para determinar a sensibilidade à radiação de leveduras e bolores, não apresentem resultados idênticos, contudo, leveduras são g e r a l m e n t e m a i s resistentes do que bolores (Diehl, 1995).

A s espécies do grupo Aspergilius, especificamente A. niger e A. flavus, f o r a m mais freqüentes e m 84 amostras de plantas medicinais estudadas por Aziz et al. (1997). A i n d a neste estudo, foram isolados 9 gêneros fúngicos c o m o Absidia, Aspergilius, Cladosporium, Penicillium, Paecilomyces, Fusarium, Rhizopus, í/lucor e Scopulariopsis, s e n d o os gêneros Penicillium, Fusarium e Aspergilius considerados fungos toxigênicos e determinados os valores Dio para as seguintes e s p é c i e s : A. ochraceus (0,36 kGy); A. parasiticus (0,48 kGy); A. flavus (0,52 kGy); A. fumigatus ( 0,63 kGy); F. oxysporum (0,76 kGy) e F. solani (0,87 kGy). A sensibilidade d e fungos à radiação ionizante já foi discutida por diversos autores, q u e citaram valores de d o s e s compreendidas entre 4 a 10 kGy para a completa

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inibição da c o n t a m i n a ç ã o fúngica natural e m alimentos e especiarias (Sharnia eí a/., 1984; El-Far et a/., 1992; A z i z e E l - A a l , 1990). Rowley et a/. (1978) relatarem que os gêneros d e f u n g o s filamentosos apresentam u m a resistência intermediária à radiação ionizante, principalmente os gêneros Aspergillus e Penicillium. Somrner e Fortiage (1966) d e m o n s t r a r a m q u e a elevada resistência à radiação dos gêneros Alternaria e Fusarium se deve à multi-celularidade dos e s p o r o s .

Maity et al. (2004) d e m o n s t r a r a m q u e doses d e 1,0 kGy inibiram completamente os g ê n e r o s Rhizopus., Fusarium, Cladosporium e Tríchoderma em arroz {Oryza sativa) e Drechslera spp. foi observada após o tratamento com a dose de 2,0 kGy, e n q u a n t o Helminthosporium spp. e Cun/ularia s p p . apresentaram 100% de mortalidade q u a n d o e x p o s t a s à dose de 3,0 kGy. Os autores relataram que fungos do gênero Aspergillus s p p . não sobreviveram após o tratamento com 4,0 kGy, entretanto, colônias d e Alternaria spp. foram observadas no substrato irradiado.

A presença d e á g u a é u m fator importante na d e g r a d a ç ã o de aflatoxinas por radiação g a m a , u m a v e z que a radiólise da água produz radicais livres altamente reativos, que p o d e m atacar diretamente o anel terminal furano da aflatoxina, gerando produtos d e baixa atividade biológica (Rustom, 1997). Van Dick et al. (1982) d e m o n s t r a r a m q u e a atividade mutagênica da A F B i e m soluções aguosas (5 ^ig/mL) foi reduzida e m 34, 4 4 , 74 e 100 % nas doses de radiação gama de 2,5; 5; 10 e 20 kGy r e s p e c t i v a m e n t e .

Aquino e c o l a b o r a d o r e s (2005) d e m o n s t r a r a m que a dose de 2 kGy de radiação g a m a a s s o c i a d a à elevada atividade de água {Aa = 0,91) de grãos de milho, inoculados artificialmente c o m Aspergillus flavus toxigênico, degradou e m 6 8 , 9 % e 9 7 , 6 % as aflatoxinas B i e B2, presentes no substrato.