CAMPUS DE CURITIBANOS CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS
CURSO DE AGRONOMIA
Edilberto Venção
Influência dos fitorreguladores ANA e BAP na multiplicação de Calibrachoa sellowiana (Sendtn.) Wijsman in vitro
Curitibanos, SC 2021
Edilberto Venção
Influência dos fitorreguladores ANA e BAP na multiplicação de Calibrachoa sellowiana (Sendtn.) Wijsman in vitro
Trabalho Conclusão do Curso de Graduação em Agronomia do Centro de Ciências Rurais da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito para a obtenção do título de Bacharel em Agronomia. Orientador: Prof. Lírio Luiz Dal Vesco, Dr.
Curitibanos, SC 2021
RESUMO
Calibrachoa sellowiana, pertence à família Solanaceae, é uma espécie endêmica do Brasil, de
ocorrências na região Sul.Com ocorrência no Bioma Mata Atlântica, em vegetações dos Campos de Cima da Serra (Campo de Altitude), Campo Limpo e Campo Rupestre, no qual desperta atenção pelas suas flores e valor ecológico. Conhecida popularmente como petúnia, com elevado potencial ornamental por apresentar flores de coloração purpúrea, violáceas e tubo de anteras amarelo. Técnicas de micropropagação são ferramentas de imensurável potencial para multiplicação de espécies vegetais, utilizando-se das técnicas de cultura de tecidos permite a propagação em grande escala genótipos elites com a fixação do ganho genético. Objetivou-se neste trabalho avaliar o efeito das diferentes concentrações e combinação de fitorreguladores para promover a multiplicação in vitro de C. sellowiana contribuindo com o desenvolvimento de um protocolo de propagação massal. O trabalho foi conduzido no Laboratório de Biotecnologia e Genética do Campus da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) em Curitibanos. Brotações mantidas em cultivo in vitro foram subcultivadas em meio de cultura MS e isento de fitorreguladores, para a obtenção da quantidade de amostras para instalação do experimento. Segmentos caulinares com duas a três gemas foram inoculados em meio de cultura MS, suplementados ou não dos reguladores BAP (0; 1,0 µM) combinado com ANA (0; 0,1; 0,25 e 0,5 µM). O delineamento experimental foi em blocos casualizados (DBC), em esquema bifatorial (concentrações de ANA x presença ou ausência de BAP), com quatro repetições, sendo cada parcela constituída de cinco tubos de ensaio com dois explantes. Dados de número de nós, contagem pelo número de folha, e estimativa de número de propágulos a partir de explantes de três nós, e altura de brotos (cm) foram coletados aos 15, 30, 45 e 60 dias em cultivo. O uso do meio de cultura MS, suplementados com diferentes concentrações de ANA mais BAP (1 µM) ou somente com BAP (1 µM), promoveram maiores e significativo número de nós e novos propágulos. Outro fator relevante foi a indução de um grande número de pequenos brotos e o desenvolvimento de calos com característica, do tipo cultura nodular, na base das culturas. Fator caracterizado nesta espécie como responsiva a presença de fitorreguladores ANA e BAP, revelando alta eficiência regenerativa o que permite a produção de mudas em escala. Na altura dos brotos observou-se que, o uso dos meios de cultura MS básico ou com a suplementação de ANA, isoladamente, promovem maior alongamento das brotações. Quanto tempo do subcultivo, considera-se, portanto, intervalos de 45 dias para evitar o esgotamento das condições nutricionais do meio, na fase de multiplicação e um crescimento excessivo dos brotos na fase de alongamento.
ABSTRACT
Calibrachoa sellowiana, belongs to the Solanaceae family, is an endemic species of Brazil,
occurring in the South region. Occurs in the Atlantic Forest Biome, in vegetation of the Campos de Cima da Serra (Campo de Altitude), Campo Limpo and Campo Rupestre, in which it attracts attention for its flowers and ecological value. Popularly known as petunia, with high ornamental potential for presenting purple, violet flowers and yellow anther tube. Micropropagation techniques are tools of immeasurable potential for multiplication of plant species, using the techniques of tissue culture allows the propagation on a large scale of elite genotypes with the fixation of genetic gain. The objective of this work was to evaluate the effect of different concentrations and combination of phytoregulators to promote the in vitro multiplication of C.
sellowiana, contributing to the development of a mass propagation protocol. The work was
conducted at the Biotechnology and Genetics Laboratory of the Campus of the Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) in Curitibanos. Shoots kept in vitro cultivation were subcultured in MS culture medium and free of phytoregulators, to obtain the quantity of samples for installation of the experiment. Stem segments with two to three buds were inoculated in MS culture medium, supplemented or not with BA regulators (0; 1.0 µM) combined with NAA (0; 0.1; 0.25 and 0.5 µM). The experimental design was in randomized blocks (DBC), in a bifactorial scheme (concentrations of NAA x presence or absence of BA), with four replications, each plot consisting of five test tubes with two explants. Data on number of nodes, count by leaf number, and estimate of the number of propagules from three-node explants, and height of shoots (cm) were collected at 15, 30, 45 and 60 days in cultivation. The use of the MS culture medium, supplemented with different concentrations of NAA plus BA (1 µM) or only with BA (1 µM), promoted a larger and significant number of nodes and new propagules. Another relevant factor was the induction of a large number of small shoots and the development of calluses with a nodular culture characteristic at the base of the cultures. Factor characterized in this species as responsive to the presence of NAA and BA phytoregulators, revealing high regenerative efficiency which allows the production of seedlings in scale. At the time of the shoots, it was observed that, using the basic MS culture media or with NAA supplementation, alone, promote greater elongation of shoots. Regarding the time of subculture, it is considered, therefore, 45-day intervals to avoid the depletion of the nutritional conditions of the medium, in the multiplication phase and an excessive growth of the shoots in the elongation phase.
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 9 1.1 OBJETIVOS ... 10 1.1.1 Objetivo Geral ... 10 1.1.2 Objetivos Específicos ... 10 2 JUSTIFICATIVA ... 11 3 REFERENCIAL TEÓRICO ... 12
3.1 A ESPÉCIE Calibrachoa sellowiana ... 12
3.2 POTENCIAL ORNAMENTAL ... 14
3.2.1 Mercado brasileiro de plantas ornamentais ... 16
4 METODOLOGIA ... 17
4.1 MATERIAL VEGETAL E AMBIENTE DE CULTIVO ... 17
4.2 PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES ESTOQUES E MEIOS DE CULTURA ... 17
4.3 PROCEDIMENTO DE SUBCULTIVOS PARA MULTIPLICAÇÃO DOS BROTOS 17 4.4 ENSAIO DE MULTIPLICAÇÃO DE BROTOS ... 18
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 18
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 19
5.1 ELABORAÇÃO DO MEIO DE CULTURA E SUBCULTIVOS DAS BROTAÇÕES. 19 5.2 EFEITO DO MEIO DE CULTURA NA MULTIPLICAÇÃO DE BROTOS ... 20
5.2.1 Estimativa do número de nós ... 20
5.2.2 Estimativa de novos propágulos ... 24
5.2.3 Estimativa de altura dos brotos ... 26
6 CONCLUSÃO ... 29
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS... 30
1 INTRODUÇÃO
Solanaceae é uma família que se compõem de 3000 espécies distribuídas em 150 gêneros e muitos destes estão presentes no ramo alimentícios, na medicina e no ramo ornamental (FELICIANO, 2008; GIACOMIN, 2010).
O gênero Calibrachoa que pertence à família Solanaceae é caracterizado por plantas arbustivas pequenas, perene, distribuídas no Brasil, Paraguai, Argentina e Uruguai. A maior parte das espécies do gênero ocorre no Brasil e várias são consideradas endêmicas (STEHMANN; GREPPI, 2011; FREGONEZI et. al., 2013; GREPPI et. al., 2013).
Calibrachoa sellowiana, pertence à família Solanaceae, é uma espécie endêmica do
Brasil, de ocorrências confirmadas, na região Sul, nos Domínios Fitogeográfico da Mata Atlântica, nos tipos de Vegetação, Campos de Cima da Serra (Campo de Altitude), Campo Limpo e Campo Rupestre (BASTOS; GRIMALDI, 2020; STHEMANN, 2020).
Neste clima característico dos Campos de Cima da Serra e a Floresta de Araucária, ao longo da Serra Geral, tem-se um alto grau de endemismo, e uma das espécies endêmicas encontradas nesta região é a C. sellowiana (STEHMANN,1999; BEHLING, 2002; IGANCI et.
al., 2011; GREPPI et. al., 2013).
É uma espécie de alto valor ecológico e conhecida popularmente como petúnia, com elevado potencial ornamental por apresentar flores que desperta atenção, por conter corola de coloração purpúrea, violáceas e tubo de anteras amarelo (STHEMANN, 1999; SOARES, 2011; BASTOS e GRIMALDI, 2020).
Posto isto, constata-se que são necessários estudos para melhor compreensão dos recursos genéticos de espécies vegetais nativas, tanto para conservação em seus habitats naturais, quanto para identificação dos potenciais de uso comercial. Para isto, uma das estratégias é o cultivo in vitro, que a partir deste, permitirá a multiplicação e produção em grande escala, em curto espaço de tempo e área utilizada.
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1.1 OBJETIVOS
1.1.1 Objetivo Geral
O objetivo do presente foi avaliar os efeitos dos fitorreguladores na regeneração in
vitro de Calibrashoa Sellowiana e contribuir para o desenvolvimento de um protocolo de
multiplicação massal.
1.1.2 Objetivos Específicos
Elaborar soluções estoques e preparar os meios de culturas;
Efetuar o subcultivo da cultura in vitro para utilizar como fonte de explantes;
Avaliar os efeitos das diferentes concentrações de ANA e BAP na regeneração de brotos.
2 JUSTIFICATIVA
Devido ao seu potencial ornamental existe a possibilidade da C. sellowiana tornar-se fonte de renda para agricultores e floriculturas.
Ela é uma planta endêmica do Planalto Catarinense, e o desenvolvimento da pesquisa possibilitará desenvolver técnicas que possam vir a ser utilizadas para conservar a espécie in
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3 REFERENCIAL TEÓRICO
3.1 A ESPÉCIE Calibrachoa sellowiana
As plantas do gênero Calibrachoa (Solanaceae) arbustivas de porte pequeno, distribuídas no Brasil, Paraguai, Argentina e Uruguai, sendo que, apenas uma espécie ocorre na América do Norte e Europa (GREPPI et. al., 2013). A maior parte das espécies do gênero ocorrem no Brasil (STEHMANN; GREPPI, 2011), e vários são considerados endêmicos (FREGONEZI et. al., 2013), ocorrem naturalmente no sul do Paraná até o nordeste do Rio Grande do Sul, na região do campo de Palmas no Paraná e Curitibanos, em Santa Catarina (STEHMANN, 1999).
As regiões onde são encontradas possuem clima subtropical e tropical, seu habitat fica em áreas abertas, afloramentos rochosos e pastagens, em altitudes de 700 a 1.800m, podem ser encontradas em meio ao domínio florestal e em beiras de estrada também (FREGONEZI et. al., 2013; BASTOS; GRIMALDI, 2020). O modo de dispersão do gênero é barocoria e possuem autoincompatibilidade, exceto por uma espécie (STEHMANN, 1999; TSUKAMOTO et. al., 2002; FREGONEZI et. al., 2013).
A distribuição geográfica geral dos tipos morfológicos de flores em Calibrachoa spp., pode ser observada na Figura 1. A disposição das figuras no mapa reflete a área geral de ocorrência das espécies representativas de cada morfologia.
Figura 1 – Distribuição geográfica da espécie Calibrachoa spp. no Brasil, nos estados de
Santa Catarina e Rio Grande do Sul.
Nas figuras 2A e 2B observa-se a estrutura subarbustiva da Calibrachoa sellowiana (Sendtn.) Wijsman om seu caule lenhoso ramoso, nas figuras 2C e 2D observamos as peças florais com sua cor violácea, na figura 2C evidencia-se a parte interna amarelada até a altura das anteras, na figura 2E vemos a forma de suas folhas de filotaxia alterna e sésseis como descrito por Soares (2011), e Stehmann (1999; 2020).
Figura 2 – Calibrachoa sellowiana A-B) estrutura arbustiva ramosa; C-D) peças florais e E) característica das folhas.
Fonte: Flora Digital (c2021).
Em seu habitat a C. sellowiana tende a ficar dormente e desfolhada de julho a setembro. Em outubro a espécie inicia uma nova brotação de folhas entrando no estágio vegetativo. Em novembro inicia a formação dos botões florais e em dezembro começa a florir. Em janeiro e fevereiro as plantas já possuem frutos que terminam a maturação em março. De abril a julho a parte vegetativa fica visível (BASTOS; GRIMALDI, 2020).
Kanaya et. al. (2010) corrobora com Bastos e Grimaldi (2020) afirmando que a floração inicia no final da Primavera e estende-se até o início do Verão. Na Figura 3 observamos o percentual de indivíduos por fenofases.
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Figura 3. Percentual de indivíduos por fenofases.
Fonte: Bastos e Grimaldi (2020). 3.2 POTENCIAL ORNAMENTAL
Os Campos de Cima da Serra e a Floresta de Araucária situam-se entre 800 a 1.800 m de altitude. (IGANCI et. al., 2011). Essa formação ocorre ao longo da Serra Geral (BEHLING, 2002) no Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná, essa região possui um alto grau de endemismo e diversidade vegetal (IGANCI et. al., 2011).
Dentre as espécies endêmicas encontradas nos Campos de Cima da Serra e Floresta de Araucária encontra-se a C. sellowiana (Sendtn.) Wijsman como descreve Stehmann (1999) e Greppi et. al. (2013). Esta espécie do gênero Calibrachoa possui um potencial ornamental como descreve Bastos e Grimaldi (2020).
Esta espécie pode ser encontrada em Curitibanos, inclusive é de espontânea na área do
Campus da UFSC (Figura 4A), com destaque de excelente aspecto em formação de tapetes
verde e de exuberante beleza (Figura 4B). Portanto, tornando-se uma opção no emprego na ornamentação de áreas de jardinagem, a exemplo da utilização nos canteiros existentes na UFSC/Campus de Curitibanos (Figura 4C), com excelente desenvolvimento e potencial de propagação (Figura 4D).
A primeira Cultivar de Calibrachoa foi lançada nos anos 1990 (KANAYA et. al., 2010 apud RICE, 1997), desde então surgiram muitas cultivares com uma ampla gama de cores tais como rosa, roxo, branco, azul, vermelho, amarelo e alaranjado (MURAKAMI et. al., 2004; KANAYA et. al., 2010).
Figura 4 – Calibrachoa sellowiana, espécies da flora nativa do Planalto Catarinense: A) Ocorrência natural na área do Campus da UFSC, Curitibanos, SC; B) Detalhes das flores de
aspecto ornamental. C) Planta cultivadas em canteiros no jardim da UFSC/Campus de Curitibanos e; D) Detalhes de ramos com exposição de gemas e segmentos nodais.
Fotos: A-C: Dal Vesco, L.L., ano de 2014.
Podemos verificar no trabalho de Kanaya et. al. (2010), que o melhoramento genético sobre as cultivares de Calibrachoa propiciou uma coloração floral variável do que nas espécies naturais, removeu o hábito de fechamento das flores ao anoitecer e uniformizou o tamanho floral, forma de crescimento, formato floral e formato das folhas das cultivares (Figura 5).
Figura 5 – Diagrama de dispersão bidimensional das pontuações do terceiro e quarto componentes principais das espécies naturais e cultivares.
Onde: Círculos brancos, espécies naturais do grupo 2; triângulos brancos, espécies naturais do grupo 1; círculos pretos, cultivares. Fonte: Kanaya et. al. (2010).
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Empresas como A Geoplant® comercializam por toda a Argentina, as espécies
Glandularia, Mecardonia e Calibrachoa. Esta empresa em parceria com o Instituto Nacional
de Tecnologia Agropecuária, situado na Argentina, desenvolvem o melhoramento genético das plantas com potencial ornamental e disponibilizam ao mercado (PAOLAZZI, 2017).
3.2.1 Mercado brasileiro de plantas ornamentais
No Brasil o mercado de plantas ornamentais vem sendo desafiador, como podemos verificar nos informativos dos dias 19/03/2021 e 26/03/2021 da Ibraflor (https://www.ibraflor.com.br/boletim-ibraflor) que informa que as restrições de comercialização impostas pelo governo, devido a pandemia de Covid-19, prejudicaram o setor.
No entanto, para empresas e produtores que conseguiram adaptar-se rapidamente às novas condições de mercado, visto as condições impostas pela Covid-19, conseguiram sair-se bem, como vemos nas notícias do: Dinheiro Rural (2021) que relata que “Em meio à pandemia, o setor de floricultura movimentou R$ 9,6 bilhões em 2020”; Acidade ON (2021) diz que “Queda do faturamento do setor é grande, mas poderia ser maior ainda não fossem as campanhas dos produtores, que convenceram consumidores de que plantas são essenciais” e Infomoney (2021) que informa que “Maior floricultura on-line da América Latina, a companhia viu sua demanda mais que dobrar por conta da pandemia e entregou mais de 680 mil pedidos em 2020, ante os 320 mil pedidos em 2019. Seu faturamento cresceu 140%”.
4 METODOLOGIA
4.1 MATERIAL VEGETAL E AMBIENTE DE CULTIVO
Brotações mantidas no ambiente do Laboratório de Biotecnologia e Genética (Figura 6A) do Campus da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) em Curitibanos, região do Planalto Catarinense, foram a fonte de explantes para a multiplicação in vitro. As culturas foram mantidas em ambiente de sala de crescimento com temperatura de 25 ºC ± 2 ºC e fotoperíodo de 16 horas de luz, no Laboratório de Biotecnologia e Genética do Campus Curitibanos, da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC).
4.2 PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES ESTOQUES E MEIOS DE CULTURA
Durante o período de abril a dezembro de 2020, em decorrência da pandemia do coronavírus, com a paralização das atividades presenciais e na ausência da equipe técnica do laboratório, foram necessários elaborar as soluções estoques. Seguindo o protocolo, mantido no laboratório, procedeu a preparação das soluções da formulação salina MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), referente a solução A, contendo as macronutrientes (NPK Ca Mg), a solução B, solução de ferro-EDTA e a solução de micronutrientes (Zn, Mn, B, Cu, Mo, Cl). Além disto foi necessário preparar as soluções estoques dos fitorreguladores ácido naftaleno acético-ANA e Benzil amino purina-BAP a 1000 µM. Após 24 horas do preparo as soluções foram armazenadas em ambiente de geladeira.
Na elaboração dos meios de cultura utilizou-se a formulação salina de MS, conforme descrita acima, denominado de MSB, foi o MS isento de fitorreguladores e adicionado de 30g/L de sacarose, 2 ml/L de vitamina de Morel (Morel & Wetmore, 1951). O pH do meio de cultura foi ajustado para 5,8 e em seguida foi adicionado 7,5 g/de ágar-ágar. Posteriormente, foi efetuada a autoclavagem a 121 ºC, a 1,3 atm por 15 minutos, conforme os procedimentos de Dill (2014) e Lima (2017).
4.3 PROCEDIMENTO DE SUBCULTIVOS PARA MULTIPLICAÇÃO DOS BROTOS
Brotações mantidas em cultivo in vitro, com a finalidade de realizar o experimento, foram efetuados subcultivos das brotações a cada 45 dias no período de abril a junho de 2020.
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Procedimento necessário para a obtenção da quantidade de amostras para instalação do experimento. Nesta etapa, para estimular a proliferação de brotos, foram utilizados frascos do tipo conserva (340 mL) e adicionando 25 mL de meio de cultura MSB, isento de fitorreguladores e geleificado, de acordo com a metodologia descrita por (DILL; DAL VESCO, 2015; LIMA, 2017).
4.4 ENSAIO DE MULTIPLICAÇÃO DE BROTOS
Segmentos nodais e ápices caulinares (1,0-1,5 cm), contendo 2 a 3 gemas, excitados de brotações jovens, de sucessivos subcultivos in vitro em meio de cultura MSB (ver item 5.3), foram a fonte de explantes utilizados para o ensaio de multiplicação in vitro. O processo de inoculação da cultura foi realizado em uma câmera de fluxo laminar.
O desenho experimental utilizado foi num esquema fatorial de 2x4 com oito tratamentos: duas concentrações de BAP (0; 1,0 µM) combinado com quatro de ANA (0; 0,1; 0,25 e 0,5 µM), ambos suplementados ao meio de cultura básico MSB. Cada unidade experimental foi constituída de cinco tubos de ensaio contendo dois explantes com 2-3 gemas por explante e repetidos quatro vezes em um delineamento em blocos casualizados (DBC). A cada tubo de ensaio foram adicionados 10 mL do meio de cultura, com 20 tubos por tratamento, totalizando 160 tubos.
Dados de número total de nós por tubo (referente aos dois explantes inoculados, média de 2-3 nós) e altura (cm) foram coletados após 15, 30, 45 e 60 dias em cultivo. Considerou-se para o número de nós a contagem do número total de folha existente nas brotações, uma vez que, cada axila foliar representa um segmento de nó com uma gema, como potencial propagativo. Para a estimativa de novos propágulos, efetuou-se a divisão do total de nós produzidos por 3 nós, considerando como um explante, utilizado a cada repicagem.
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados coletados de cada parâmetro foram submetidos à Análise de Variância (ANOVA) e ao teste Tukey (5%) de separação de médias, quando necessário os dados originais foram transformados em log (x+1), segundo as recomendações de Compton (1994).
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ELABORAÇÃO DO MEIO DE CULTURA E SUBCULTIVOS DAS BROTAÇÕES.
Os procedimentos realizados de repicagens para estimular a renovação das brotações, já existentes e mantidas em cultivo in vitro (Figura 6A), com sucessivas subcultivos, a cada 45 dias, permitiu a proliferação e com um excelente desenvolvimento dos brotos (Figura 6B). Resultando, portanto, na obtenção de necessidade amostral para instalação do ensaio, para os 160 tubos (Figura 6C) e contendo dois explantes (Figura 6C, detalhe), com 2-3 segmentos de nó ou gemas por explante.
Figura 6 – Procedimento de subcultivos da Calibrachoa sellowiana in vitro e preparação de meios de cultura: A) Brotações mantidas em ambiente de sala de crescimento, no Laboratório
de Biotecnologia e Genética/UFSC/Campus de Curitibanos; B) Após sucessivos subcultivos obtenção das brotações como fonte de explantes e C) Tubos de ensaio, referente ao experimento de multiplicação. No detalhe, inoculação de dois explantes no meio de cultura.
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5.2 EFEITO DO MEIO DE CULTURA NA MULTIPLICAÇÃO DE BROTOS
5.2.1 Estimativa do número de nós
A regeneração de brotos in vitro em C. sellowiana pode ser avaliada pela contagem direta dos novos brotos induzidos a partir do explante inicial, tal como se observa na Figura 7. No entanto, esta contagem torna-se dificultosa e imprecisa, a partir dos 30 dias de cultivo, em meio de cultura com a suplementação de fitorreguladores, a exemplo do ANA e BAP, por apresentar um grande número de pequenos brotos na base. Este evento pode ser observado com destaque, quando foi suplementado ANA (0,5 µM) mais BAP (1 µM) após 45 dias em cultivo (Figura 7A) ou após 60 dias (Figura 7B). Bem como, nos meios de cultura com menor concentração de ANA (0,25 µM) e na presença de BAP (1 µM), tanto em 45 dias (Figura 7C), quanto em 60 dias (Figura 7D) de cultivo.
Figura 7 – Proliferação múltipla de brotos de Calibrachoa sellowiana in vitro em meios de cultura: A) suplementado com os fitorreguladores ANA (0,5 µM) mais BAP (1 µM), após 45 dias em cultivo e; B) após 60 dias ou; C) meios com ANA (0,25 µM) mais BAP (1 µM), após
45 dias em cultivo e; D) após 60 dias. E) Desenvolvimentos e regeneração de pequenos brotos na base das culturas (ver setas e detalhes), em meio suplementado com ANA e BAP.
Neste contexto, a contagem do número de nós, que representa o total em cada tubo de ensaio, representa melhor a estimativa de novos propágulos regenerados e pode ser observado na Tabela 1. A partir disto, observou-se que, os maiores valores de números de nós regenerado, e significativos (p<0,01), foram observados, respectivamente, aos 45 e 60 dias de cultivo, no meio de cultura MS suplementado com ANA (0,5 µM) mais BAP (1 µM) com 116,8 e 129,1 nós. Valores que não diferem entre si, pelo teste Tukey (p<0,01) com o uso de ANA (0,25 µM) mais BAP (1 µM) com 108,0 e 122,5 nós. Assim como, quando se usou BAP (1 µM) com 105,6 e 120,7 nós respectivamente e, também, elevado número de brotos (Figura 8A). Seguido do uso da combinação de ANA (0,1 µM) + BAP (1 µM) com 99,6 e 120,9 nós (Figura 8B). No entanto, quando se utilizou o meio de cultura MS isento de fitorreguladores, a significância em relação aos anterior, foi somente aos 60 dias de cultivo com 124,9 nós (Tabela 1). A combinação de ANA e BAP suplementado ao meio de cultura MS, também promoveu maior proliferação, nesta mesma espécie, conforme relatados de Dill (2014), Dill e Dal Vesco (2015) e Lima (2017).
Tabela 1 – Número médio de nós das brotações de Calibrachoa sellowiana em resposta ao meio de cultura básico MS suplementado ou não com os fitorreguladores ANA (0, 0,1, 0,25,
0,5 µM) combinado com BAP (0; 1,0 µM), em cada tempo (dias) em cultivo.
Onde: Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si de acordo com o teste de Tukey (p ≤ 0, 01). Fonte: Elaborado pelo autor (2021).
Quando analisada a evolução do desenvolvimento de novos nós, observou-se uma tendência de redução do número, a partir de 45 dias em cultivo (Figura 9). Este evento é mais evidente, em todos os tratamentos, quando da presença de fitorreguladores ANA e BAP, ou somente BAP. Porém, o meio de cultura MS isento de fitorreguladores, apresentou um comportamento linear de ascensão no número de nós, a partir de 45 (88,3 nós) para 60 (124,9
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nós) dias de cultivo (Figura 9). Além de elevado número de nós, verificou-se que estes meios de cultura promovem um maior crescimento dos brotos (Figura 8 C-E). Fator que, também, resulta em maior número de nós, porém, pode ocorrer o curvamento dos brotos ao atingir a tampa. Considera-se a partir disto que, o tempo médio a cada subcultivo deve ser em torno de 45 dias da inoculação, após este período, é provável que ocorre o esgotamento das condições nutricionais do meio, saturação da atmosfera interna ao frasco.
Figura 8 – Proliferação múltipla de brotos, alongamento e indução de raiz em Calibrachoa
sellowiana in vitro em meios de cultura, após 60 dias em cultivo: A) MS suplementado com
BAP (1 µM); B) com ANA (0,1 µM) + BAP (1 µM) e; C-E) brotos alongados, em detalhe a formação de raízes: C) MS isento de fitorreguladores; D) ANA (0,1 µM); E) ANA (0,5 µM).
Fonte: Elaborado pelo autor (2021).
Outro fator importante observado no presente trabalho, foi o desenvolvimento e regeneração de pequenos brotos na base das culturas (Figura 7E, ver setas e detalhes). Destaca-se a partir disto que, meios com a preDestaca-sença dos fitorreguladores ANA e BAP, independente da concentração utilizada, revelou ser, portanto, fator fundamental para multiplicação in vitro de
Figura 9 – Evolução no desenvolvimento do número médio de nós de C. sellowiana em resposta ao meio de cultura básico MS suplementado ou não com os fitorreguladores ANA (0,
0,1, 0,25, 0,5 µM) combinado com BAP (0; 1,0 µM) após 15, 30, 45 e 60 dias de cultivo.
Fonte: Elaborado pelo autor (2021).
Este tipo de cultura, inicialmente promove a formação de um tipo de calo, com característica, do tipo cultura nodular, frequentemente observado em bromeliáceas (GUERRA; DAL VESCO, 2010). Este evento, também foi observado por Dill (2014), Dill e Dal Vesco (2015),nesta mesma espécie com o uso de ANA (0,1 µM) mais BAP (1 µM), quando avaliado em torno de 30 dias de cultivo. Já Lima (2017) obteve maior porcentagem de indução de culturas nodulares com uso de ANA (1 µM) mais BAP (1 µM), em 70 dias em cultivo. No entanto, nenhum destes trabalhos, bem como, no presente estudo, não foram realizados cortes histológicos para confirmação da regeneração destas estruturas.
Conforme observado, também, no presente trabalho, esta espécie é responsiva a presença de fitorreguladores, por apresentar facilidades na formação de calos (ver Figura 7 e 8A, 8B). No entanto, em todos os tratamentos ocorreu o desenvolvimento da parte aérea e quando da presença de calo, não desenvolveu raízes. Taiz e Zeiger (2013), descrevem que o balanço entre auxinas e citocininas, no meio cultura, determinam a formação de calos ou a ausência deles. Uma vez que para o tecido desenvolver-se como células indiferenciadas, um nível intermediário é requerido. Bem como para desenvolver a parte aérea, há necessidade de uma proporção maior de citocininas, porém, para a formação de raízes a proporção maior deve ser de auxinas. 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 15 30 45 60 N º de no s Dias em cultivo
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Neste contexto, o cultivo de calos poderia vir a ser um meio de obter uma propagação massa C. sellowiana. Visto que, poder-se-ia obter embriões somáticos a partir de culturas em suspenção para obtenção de sementes sintéticas (LANDA, 2000). Este método de propagação já é utilizado em uma gama de culturas tais como Solanum tuberosum (NYENDE et. al., 2005),
Arnebia euchroma (MANJKHOLA, 2005), Piper hispidinervum (GUEDES et. al., 2007) e Spartina alterniflora (UTOMO et. al., 2008).
Em ensaios realizados por Devi (2008) observou-se o número médio máximo de 8,0 brotos por explante inoculado de quatro genótipos de Lycopersicon esculentum Mill. a partir das folhas com 2,5 mg/L de AIA e 3,0 mg/L de BAP, que também correspondeu a máxima percentagem de regeneração de plantas e indução de calos. Foi constatado por Rodrigues et. al. (2013) que para Physalis peruviana L 1,3 mg/L de BAP no meio MS com 50% dos sais tem-se a melhor multiplicação in vitro. Isto sugere que novos ensaios poderiam ser realizados para
Calibrachoa sellowiana com diferentes concentrações de sais e fitorreguladores.
Foi observado para 60 dias de cultivo, que todos os tratamentos que tinham em sua composição BAP tiveram a formação de calos, todavia nos tratamentos com ANA observou-se também a formação de pequenos calos na base dos explantes. De modo geral esta divisão celular desordenada, denominada calo, é consequência da alta concentração de auxinas no meio de cultura (MANTELL et. al., 1994).
Em Solanum calvescens observou-se que quanto maior a dose de auxina maior a formação de calos e em Solanum tuberosum foi observado a formação de calos em meio de cultura contendo BAP (0,01 mg L-1) (PEREIRA, 2004; SARTO, 2018). Meyer (2009) observou a formação de calos em doze genótipos Calibrachoa com a concentração de BAP (0,01 mg L
-1). Tombion (2020) relata ter obtido a maior regeneração de plantas com MS + BAP (0,01 mg
L-1), porem 25% teve a formação de calos par Calibrachoa var. Pampa Salmón INTA.
5.2.2 Estimativa de novos propágulos
Quando foram calculados a formação de novos propágulos a partir do número total de nós produzidos, a evolução no número médio de novos propágulos regenerados, tendo como base explantes de 3 nós (Figura 10), como era de se esperar, reveladas as tendências observadas no número de nós da Figura 9. Porém, este parâmetro quantifica o número de novos explantes produzidos e com potencial de ser repicados para novos meios de cultura. Além disto, pode se observar na Figura 11, em relação aos 45 dias em cultivo, por representar o tempo ideal de
cultivo para efetuar novas repicagens. Observa-se, também, os mesmos tratamentos e valores, referente a Tabela 1, quanta a significância. Destacando, na mesma forma, valores e significâncias em relação aos mesmos tratamentos da Tabela 1. No entanto, é importante destacar que, a partir do maior valor (38,9 novos propágulos), proporcionado pelo meio com ANA (0,5 µM) mais BAP (1 µM), por exemplo, corresponde o número de novos propágulos que pode ser obtido a cada 45 dias de cultivos.
Estes valores, portanto, revelam a progressão na multiplicação in vitro desta espécie, quando são utilizados em média três segmentos de nós como explantes. Este fator é relevante, por caracterizar-se em um sistema de cultivo de alta eficiência regenerativa. Além disto, apresenta potencial para a multiplicação em grande escala. Sistema típico utilizados em processos de produção de mudas em Biofábricas.
Figura 10 – Evolução no número médio de novos propágulos (3 nós) regenerados de C.
sellowiana em resposta ao meio de cultura básico MS suplementado ou não com os
fitorreguladores ANA (0, 0,1, 0,25, 0,5 µM) e BAP (0; 1,0 µM) em relação ao tempo de cultivo.
Fonte: Elaborado pelo autor (2021).
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 15 30 45 60 N º de no v os prop ág ulos Dias em cultivo
26
Figura 11 – Número médio de novos propágulos (3 nós) regenerados de C. sellowiana em resposta ao meio de cultura básico MS suplementado ou não com os fitorreguladores ANA (0,
0,1, 0,25, 0,5 µM) e BAP (0; 1,0 µM) após 45 dias de cultivo. Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si de acordo com o teste de Tukey (p ≤ 0,01). CV (%) = 1,19.
Fonte: Elaborado pelo autor (2021).
5.2.3 Estimativa de altura dos brotos
As maiores, significativas (p<0,01), altura média foram obtidas com o tratamento MS e isento de fitorreguladores (10,7 cm), não diferindo entre si, segundo teste Tukey (p<0,05), com o uso de ANA (0,1 µM) com 10,5 cm, seguido de ANA (0,5 µM) com 9,4 cm de altura, em 60 dias de cultivo (Tabela 2). Observou-se também que, estes meios de cultura, além de promover maior alongamento dos brotos, observa-se a indução a formação de raízes. Evento que se observa, em detalhe nas imagens representadas na Figura 8, no MS isento de fitorreguladores (Figura 8C), bem como, a presença, de somente, ANA a 0,1 µM (Figura 8D) ou com ANA a 0,5 µM (Figura 8E).
Observou-se também no presente trabalho que, a evolução do alongamento em relação ao tempo de cultivo, apresenta um comportamento linear de ascensão no alongamento dos brotos, para os melhores tratamentos de alongamento e descritos anteriormente (Figura 12).
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 38 ,9 a 36 ,0 ab 35 ,2 ab 33 ,2 ab 29,4 bc 24 ,9 cd 24 ,2 cd 21 ,1 d N º de no v os prop ág ulos Meio de cultivo
Tabela 2 – Altura média das brotações de C. sellowiana em resposta ao meio de cultura básico MS suplementado ou não com os fitorreguladores ANA (0, 0,1, 0,25, 0,5 µM) combinado
com BAP (0; 1,0 µM), em cada tempo (dias) em cultivo.
Onde: Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si de acordo com o teste de Tukey (p ≤ 0, 01). Dados, de todos os tempos de cultivos, foram transformados em log (x+1).
Fonte: Elaborado pelo autor (2021).
Figura 12 – Evolução no desenvolvimento da altura média de brotos de C. sellowiana em resposta ao meio de cultura básico MS suplementado ou não com os fitorreguladores ANA (0,
0,1, 0,25, 0,5 µM) combinado com BAP (0; 1,0 µM), após 15, 30, 45 e 60 dias de cultivo.
Fonte: Elaborado pelo autor (2021).
2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 15 30 45 60 A lt ura (cm) Dias em cultivo
28
No presente trabalho as doses de BAP não foram aplicadas em gradiente, porém é possível observar menor desenvolvimento em altura entre os tratamentos com adição de BAP e os sem adição de BAP. Quanto maior a adição de BAP no meio de cultura menos os explantes desenvolvem se em altura (COSTA et. al., 2017).
Outro fator, também a ser observado, da necessidade de efetuar o subcultivos no período, em torno de 45 dias. Este evento pode ser melhor visualizado, também na Figura 8 C-E que, em detalhes observa-se as brotações atingindo a parte superior da tampa. C-Este indicativo, quando da permanência em cultivo, como se observou de 45 a 60 dias, é um fator que promove o curvamento e limitando o alongamento das brotações.
6 CONCLUSÃO
A partir dos protocolos contidos no Laboratório de Biotecnologia e Genética do Campus da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) em Curitibanos foi possível elaborar o meio de cultivo MS e as soluções estoque de macronutrientes, micronutrientes, ANA e BAP.
O subcultivo da cultura para obtenção de explantes foi realizado com sucesso e obteve-se a quantidade suficiente de explantes para realização do experimento.
Foi possível avaliar o efeito das diferentes doses de ANA e BAP combinados ou não e suplementados ao meio de cultura básico MS.
30
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A multiplicação in vitro e em escala de C. sellowiana pode ser obtida quando utiliza-se com explante 2-3 utiliza-segmentos de nós, e cultivado em meio de cultura MS suplementado com ANA mais BAP ou somente BAP, resultando em elevado número de nós e, consequentemente, número de novos propágulos.
A presença de fitorreguladores, independente da concentração utilizada no meio de cultura, promoveu o desenvolvimento e regeneração de pequenos brotos na base das culturas.
A partir disto, sugere-se que, em subcultivos subsequente, estas estruturas, promoverão a formação de elevando número de novos brotos. Estes fatores, portanto, caracterizam-se em um método de alta eficiência regenerativa permitindo, a partir disto, a produção de mudas em escala.
A altura média dos brotos, também pode ser um parâmetro relevante a ser obtido, porque pode ser obtido um maior número de nós, bem como, de novos propágulos, como foi observado em cultivos com a meio MS isento de fitorreguladores ou da presença, de somente, do fitorregulador ANA.
E finalmente, o tempo médio entre cada subcultivo também é um fator importante a ser consideração na propagação massal de brotos. Considera-se, portanto intervalos de 45 dias entre subcultivos, porque períodos superiores pode ocorre o esgotamento das condições nutricionais do meio, saturação da atmosfera interna ao frasco e alongamento excessivo dos brotos.
Este trabalho pretendeu elucidar uma parte do conhecimento voltado ao desenvolvimento de um protocolo de multiplicação massal da C. sellowiana, deixando a partir disto, novas contribuições e sugestões para futuras estudos com esta espécie.
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