ASSOCIAÇÃO DE DUAS GONADOTROFINAS PARA A SUPEROVULAÇÃO DE VACAS DOADORAS DE EMBRIÕES
(Gonadotrophin association in super-ovulation of embryo donor cows)
Aníbal Ballarotti NASCIMENTO1,4*, Marcelo Marcondes SENEDA2, Ernesto
Cristovam da SILVEIRA3 & Harley PANSARD3
1 Curso de Especialização em Medicina de Animais de Produção/Universidade Estadual de Londrina; 2Departamento
de Clínicas Veterinárias/Universidade Estadual de Londrina, 3 Médico Veterinário Autônomo, 4 Embryomass/
Reprodução Animal
RESUMO
Este trabalho objetivou comparar Pluset isoladamente com Pluset mais Folltropin na superovulação de vacas para colheita de embriões. Dez vacas Bos taurus taurus da raça Simental foram submetidas a 2 tratamentos. Inicialmente, as vacas foram tratadas apenas com 400 - 600 UI de Pluset por 4 dias. Posteriormente, as mesmas vacas receberam 200 - 300 UI de Pluset nos dois primeiros dias e 80 - 120 mg de Folltropin nos dois dias finais. Foram colhidos 362 embriões em todas as colheitas. Dos 23 procedimentos realizados com Pluset, foram recuperados 174 embriões, enquanto das 18 colheitas realizadas com a associação Pluset-Folltropin, 188 embriões foram obtidos. Não houve variação na qualidade dos embriões entre tratamentos (p>0,05). Obteve-se uma média de 7,56 embriões com Pluset e 10,44 com Pluset-Folltropin, também sem diferença significativa (p>0,05). Os resultados sugerem a necessidade de mais estudos avaliando a associação de gonadotrofinas na superovulação de vacas doadoras de embriões.
PALAVRAS-CHAVE: superovulação, gonadotrofinas, embriões, bovinos.
ABSTRACT
The aim of this work was to compare Pluset alone and Pluset with Folltropin in super-stimulation for embryo collection in cattle. Ten cows (Bos taurus taurus) Simental were subjected to two treatments. Cows were initially treated only with Pluset (400-600 IU) for 4 days. After a resting period, they received Pluset (200-300 IU) for 2 days and Folltropin (80-120mg) for the two last days. A total of 362 embryos from all collections were obtained. One hundred seventy four embryos were in 23 procedures from cows receiving only Pluset, whereas 188 embryos from 18 collections were obtained from cows receiving Pluset and Folltropin. The embryo quality did not differ between treatments (p>0.05). The mean number of embryos obtained was 7.56 with Pluset and 10.44 with Pluset and Folltropin (p>0.05). This result suggests that it is necessary to perform further studies with the association of Pluset and Folltropin. KEY WORDS: Gonadotrophin, super-ovulation, embryos, cattle.
e-mail: aballarotti@yahoo.com.br *Autor para correspondência Ciência Animal, 14(2):89-94, 2004
INTRODUÇÃO
O tratamento para superovulação (SO) é um procedimento fundamental para a obtenção de múltiplos embriões em bovinos, sendo os resultados diretamente relacionados ao número e qualidade de estruturas obtidas (GEARHEART et al., 1989). Os resultados da SO variam em função do hormônio e quantidade utilizada e estado de nutrição das doadoras e variação individual (DE BEM et al., 1995).
A SO e a transferência de embriões (TE) são duas biotecnologias reprodutivas que têm sido amplamente usadas nos bovinos para a disseminação de animais selecionados e geneticamente superiores (ADAMS, 1994). Entretanto, a alta variabilidade na resposta dos ovários ao estímulo das gonadotrofinas continua sendo o principal desafio em programas de TE comerciais, apesar dos avanços técnico-científicos já existentes (HYTTEL et al., 1991; STOCK et al., 1996).
Vários tratamentos hormonais para induzir a SO em vacas têm sido intensivamente estudados nos últimos 50 anos (BARROS & NOGUEIRA, 2001). Entre os agentes superovulatórios mais testados está a gonadotrofina coriônica equina (eCG), que, na década de 1970, foi a principal gonadotrofina utilizada (ROWSON et al., 1972; BOLAND et al., 1978; ALFURAIJI et al., 1993). Possuindo efeito semelhante ao FSH, apresenta a conveniência de aplicação única, devido a sua meia-vida longa (GEARHEART et al., 1989), mas os resultados são muito heterogêneos, com elevada incidência de cistos e de embriões degenerados (ARMSTRONG et al., 1994). A gonbadotrofina coriônica humana (hMG) tem ação semelhante à do FSH e sua utilização foi relatada com sucesso em vacas refratárias a outras gonadotrofinas (RAJAMAHENDRAN & SIANANGAMA, 1992; BUNGARTZ et al. 1995). O hormônio folículo estimulante (FSH) extraído da pituitária de suínos, ovinos e equinos (DONALDSON, 1989) é atualmente o hormônio mais utilizado em programas de TE (FREITAS et al., 1998). Há relatos de variação na resposta superovulatória por diferenças individuais entre doadoras, raças ou pureza do produto comercial (GEARHEART et al.,
1989).
A utilização do FSH como agente indutor de superovulação tem sido intensamente observado. Experimentos envolvendo o uso de diferentes concentrações (SAUNDERS et al., 1990), a eficiência do produto comercial de um grande número de laboratórios e fontes animais (DEL CAMPO et al., 1990) e a variação da razão FSH:LH entre os produtos comerciais utilizados. Nestes estudos, a variação da potência do FSH e da razão FSH:LH foi evidente em diferentes produtos ou mesmo em partidas diferentes de um mesmo produto (BRAILEANU et al., 1998).
O desempenho de quatro gonadotrofinas foi estudado por HENDERSON et al. (1990). Folligon, FSH-, Folltropin e Ovagen. Utilizando-se ratas como modelo biológico, as gonadotrofinas foram administradas isoladamente para comparação da taxa de ovulação e número de oócitos produzidos. Não houve diferença significativa entre os tratamentos (p>0,05).
Resultados da comparação entre eCG e FSH em caprinos foram relatados por BATT et al. (1993), cujo experimento avaliou a produção de embriões utilizando apenas FSH ou uma associação com diferentes concentrações de FSH e eCG. Os resultados mostraram aspectos desfavoráveis da associação, pois o FSH utilizado isoladamente, mostrou maior número de embriões.
Em ovelhas, comparou-se o efeito do FSH-p e do Ovagen sobre as resFSH-postas dos ovários com referência ao crescimento folicular. À avaliação ultra-sonográfica, não se constatou diferença significativa entre os resultados alcançados (p>0,05) (GONZALEZ-BULNES et al., 2000).
Os produtos comerciais de FSH utilizam diferentes proporções FSH:LH. O Pluset apresenta uma relação FSH e LH próxima de 1:1, enquanto o Folltropin apresenta concentração de LH sempre baixa, com menor variação em sua relação FSH:LH (KELLY et al., 1997). Segundo estes autores, os efeitos de altas concentrações de LH incluem elevado número de folículos anovulatórios, ocorrência de embriões degenerados, aumento exacerbado do estroma ovariano, demora no retorno a ciclicidade fisiológica e baixa margem de segurança relacionada à dose total.
GONZALEZ et al.(1990) também mostraram os efeitos negativos de altas concentrações de LH na produção e qualidade de embriões bovinos. Os autores sugerem que a participação máxima de LH em uma preparação de FSH deve ser de, aproximadamente, 15 a 20%.
A relação FSH:LH nos extratos pituitários afeta a habilidade do ovário em responder ao tratamento com gonadotrofinas exógenas. Por este motivo, estabeleceu-se para tratamento superovulatório o protocolo de doses decrescentes, com o intuito de amenizar os efeitos indesejáveis da alta concentração de LH na fase final do crescimento folicular. No entanto, manter uma alta concentração de FSH até o momento da ovulação é essencial para o crescimento e desenvolvimento dos folículos, principalmente daqueles que se encontram em estágio mais atrasado (VISINTIN et al., 1996; GINTHER et al., 1998).
A comparação entre Pluset e Folltropin, administrados de forma isolada, foi relatada por KELLY et al. (1997), quando o objetivo foi testar os efeitos produzidos através de protocolos alternativos de horários, crescimento folicular e resposta ovulatória observada entre os dois produtos. Em novilhas os dois tratamentos produziram resultados similares, tanto na taxa de ovulação quanto de embriões produzidos, sem apresentar diferença estatística (p>0,05).
O objetivo do presente estudo foi comparar um protocolo convencional de SO com Pluset, a um protocolo experimental associando Pluset e Folltropin, quanto à quantidade e qualidade dos embriões obtidos em bovinos.
MATERIAL E MÉTODO
Foram utilizadas dez fêmeas Bos taurus taurus da raça Simental com idades entre 3 e 5 anos com semelhante condição corporal e
submetidos ao mesmo manejo, nutricional e sanitário. Os animais foram submetidos aos dois protocolos de superovulação, em um total de 41 colheitas nos 2 tratamentos. Inicialmente, todos os animais foram submetidos ao tratamento 1 (T1), no qual utilizou-se Pluset (Serono, Itália) como fonte comercial de gonadotrofina. Em uma segunda etapa, no tratamento 2 (T2), utilizou-se uma associação de Pluset e Folltropin (Vetrepharm Inc., Canadá).
Em ambos tratamentos as aplicações foram por via intramuscular (IM) durante 4 dias sucessivos em doses decrescentes, conforme e mostrado nas tabelas 1 e 2.
A quantidade das gonadotrofinas variou no T1, de 400 a 600 UI de Pluset. No T2, de 200 a 300 UI de Pluset e 80 a 120mg de Folltropin, obedecendo à unidade de medida empregada pelos laboratórios fabricantes.
Após a superovulação, inseminação artificial (IA) e colheita dos embriões, a procura e seleção das estruturas foi realizada conforme técnica descrita por DE BEM et al.(1995) e CRIVELENTI & ABREU (1997). O meio utilizado foi o PBS Dulbecco’s, na quantidade de 1000 mLpor animal. Os embriões, colhidos em filtro EmCom®, foram classificados conforme sua qualidade, sendo designados como grau 1 (G1) os de melhor qualidade, grau 2 (G2) embriões de qualidade intermediária, a grau 3 (G3) de qualidade inferior, obedecendo os parâmetros listados por DE BEM et al. (1995). Todos os procedimentos foram realizados pelo mesmo operador.
O número de colheitas variou de duas a quatro por doadora em cada tratamento.
Os dados foram analisados pelo programa SAS System for Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 2000). Utilizando o aplicativo Guided Data Analisys, os dados foram testados quanto à normalidade dos resíduos e homogeneidade das variâncias.
Tabela 1. Esquema do protocolo de superovulação com Pluset.
P: Pluset; F: Folltropin; D: dia; PG: Prostaglandina F2α; IA Inseminação Artificial
Período D0 D10 D11 D12 D13 D14
Manhã Cio 4mL (P) 3mL (P) 2mL(P)+PG 1mL (P) IA
Para a descrição dos resultados, foram empregados os erros padrão das médias e as médias (média ± desvio-padrão) dos dados originais. O nível de significância foi de 5%. A variável resposta analisada foi o número de embriões recuperados.
Foi empregada a análise de variância paramétrica ONE WAY ANOVA para verificar os efeitos dos tratamentos (Pluset versus Pluset+Folltropin) e o teste Duncan de médias (p<0,05) para verificar diferenças entre os tratamentos.
RESULTADOS
Em T1 foram recuperados 174 embriões em 23 colheitas, obtendo-se uma média de 7,56 embriões por colheita, e a classificação foi a seguinte: G1=58%, G2=32% e G3=10%. Em T2 foram recuperados 188 embriões em 18 colheitas, média de 10,44 embriões, classificados como G1=56%, G2=36% e G3=8%. A distribuição dos embriões de acordo com a qualidade está ilustrada na Fig. 2. No T2 foram colheitados três embriões a mais que no T1, porém não houve diferença significativa entre ambos tratamentos (p=0,10).
DISCUSSÃO
A maior média aparente de embriões em T2 pode ter ocorrido em função de haver uma menor concentração de LH no Folltropin, conforme mencionado na descrição das características do produto pelo fabricante. Em T2, de 8 aplicações, as 5 últimas foram feitas com Folltropin. Uma vez que a maturação do folículo dominante ocorre normalmente com níveis basais de LH (GINTHER, 2000), é possível que o Folltropin permita um crescimento mais homogêneo dos folículos, quando comparado ao Pluset. Isto permitiria oócitos mais padronizados quanto ao desenvolvimento, favorecendo a fecundação de mais estruturas e resultando em maior número de embriões viáveis.
A não variação estatística entre os tratamentos testados mostrou semelhança entre estes resultados e os descritos por HENDERSON et al. (1990); BATT et al. (1993) e KELLY et al. (1997). Estes autores também não registraram diferença (p>0,05) na comparação de gonadotrofinas para SO. A provável causa de não ter havido diferença estatística, pode ter sido conseqüência do elevado desvio padrão observado
Tabela 2. Esquema do protocolo de superovulação com associação de Pluset e Folltropin.
P: Pluset; F: Folltropin; D: dia; PG: Prostaglandina F2α; IA Inseminação Artificial
0 2 4 6 8 10 12 T 1 T 2
Figura 1. Número de embriões recuperados nos tratamentos T1 e T2 0 10 20 30 40 50 60 % G1 G2 G3 T1 T2
Figura 2. Valores percentuais da distribuição dos embriões de acordo com a qualidade nos tratamentos T1 e T2 (p>0,05)
Período D0 D10 D11 D12 D13 D14
Manhã Cio 4mL (P) 3mL (P) 2mL(F)+PG 1mL (F) I.A. Tarde Cio 4mL (P) 3mL (F) 2mL(F)+PG 1mL (F) I.A.
na variação do número de embriões obtidos inter e intratratamento. O número de embriões colhidos variou de 3 a 27 por doadora. Apesar do significativo número de colheitas, é possível que um número maior de repetições sinalizasse uma diferença significativa entre os tratamentos.
Um fator que interferiu negativamente nos resultados foi a variabilidade individual na resposta de cada doadora ao tratamento de superovulação. Tentou-se minimizar este fator, uma vez que todos os animais foram submetidos aos dois tratamentos e apresentavam condição corporal, sanitária e de manejo bastante semelhantes.
CONCLUSÃO
Apesar das dificuldades em se encontrar um protocolo adequado para superovulação, os resultados do presente trabalho parecem encorajadores para que mais estudos sejam realizados com a associação de gonadotrofinas na superovulação de vacas doadoras de embriões.
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Tabela 3. Número de colheitas, total, média e qualidade dos embriões recuperados por doadora nos tratamentos 1 (T1) e 2 (T2).
Qualidade dos Embriões Tratamento Número Colheitas Total Embriões Média Embriões G1 G2 G3 T1 23 174 7,56 101 55 18 T2 18 188 10,44 106 68 14 T1+T2 41 362 9 207 123 32
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Aceito em:11.11.2004 Recebido em:17.08.2004
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