UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚ
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS
ANA CAROLINA MACEDO DA SILVA DIAS
ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DE 8-HIDROXI-2’-DEOXIGUANOSINA EM LIQUEN PLANO ORAL
NATAL -RN 2020
ANA CAROLINA MACEDO DA SILVA DIAS
ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DE 8-HIDROXI-2’-DEOXIGUANOSINA EM LIQUEN PLANO ORAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Odontológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Ciências Odontológicas, na área de concentração de Patologia Oral e Estomatologia.
Orientadora: Prof. Dra. Roseana de Almeida Freitas
NATAL – RN 2020
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu filho amado Heitor Luiz, o presente que Deus me deu, por todo amor incondicional que sempre me transmitiu, desde que nasceu. Por toda força que me fez ter quando nem eu mesma achei que eu teria. Por ter sido meu anjinho da guarda, meu melhor amigo, e por estar sempre comigo sendo meu fiel companheiro.
AGRADECIMENTOS
Agradeço, em primeiro lugar, a Deus, por todas as bençãos que tem feito em minha vida. Sou extremamente grata, porque mesmo nos meus momentos mais difíceis, eu sei que Ele nunca soltou a minha mão.
À toda a minha família, por todo amor e apoio durante toda essa caminhada. Vocês são um grande exemplo de união e amor. Agradeço por todos os valores transmitidos a mim e que, consequentemente, tem me permitido transmitir ao meu filho. Tenho imensa gratidão à minha mãe Kátia, por ter sido o meu porto seguro, quem cuidou de meu filho com todo amor e carinho para que eu pudesse realizar este feito em minha vida profissional; à minha avó Albanita, por sempre ter sido a minha grande inspiração e minha maior torcedora; Ao meu avô Luiz por ser um pai e um exemplo de homem para mim; e aos meus irmãos Vanessa Macêdo e João Luiz. A Vanessa, que mesmo distante, me deu muita força para seguir em frente mesmo nos poucos e curtos momentos que pudemos conversar. Você é um grande exemplo para mim. Sei que a vida corrida nos impede de estarmos mais próximas, mas tenho certeza do amor entre nós e que uma sempre estará disposta a fazer o que for preciso para ver a outra feliz; A João Luiz, obrigada pela boa convivência em casa, por ser um tio e padrinho maravilhoso para Heitor e por todo apoio que me deu, inclusive em relação a Heitor. Eu amo vocês incondicionalmente!
Às minhas queridas orientadoras, Prof. Dra. Ana Miryam e Prof. Dra. Roseana Freitas por todos os ensinamentos. Meus sinceros agradecimentos por terem me recebido de braços abertos, por toda paciência e compreensão com relação a todas as dificuldades que enfrentei ao longo do segundo ano de mestrado. Agradeço de coração à Prof. Ana Miryam, que mesmo após se aposentar, continuou preocupada com o andamento da pesquisa e comigo e à Prof. Roseana, que esteve disposta a me aceitar como orientanda mesmo com minha pesquisa já iniciada e sabendo de todos os obstáculos que eu estava enfrentando naquele momento da minha vida. Sou muito grata pela confiança, pela tranquilidade que me transmitia e por nunca ter duvidado de que tudo daria certo.
Agradeço também à Prof. Dra. Ericka Janine, por todo apoio oferecido nesta pesquisa. Por toda orientação e ajuda que me deu especialmente durante a formulação do projeto de pesquisa. A sra. tem minha grande admiração pela profissional competente que és; e à Prof. Dra. Patrícia Teixeira, pela convivência desde a graduação e por ser sempre presente em minha vida acadêmica.
À todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas, especialmente aos professores da Estomatologia e Patologia Oral: Dra. Ana Miryam Costa de Medeiros, Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira, Dra. Hébel Cavalcanti Galvão, Dr. Leão Pereira Pinto, Dra. Lélia Batista de Souza, Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel, Dra. Patrícia Teixeira de Oliveira, Dr. Pedro Paulo de Andrade Santos, e Dra. Roseana de Almeida Freitas.
Agradeço por todos os ensinamentos e por realizarem a profissão de vocês com tanto amor e compromisso. Tenho enorme respeito por todos vocês!
Aos meus grandes amigos da vida, por estarem sempre presentes e serem compreensíveis em todas as minhas ausências ao longo do mestrado. Agradeço especialmente à minha prima, irmã de alma e futura colega de profissão Ana Beatriz Macedo, por ter sido meu suporte em todos os momentos de dificuldade! A convivência com você no DOD me fez em diversos momentos vencer grandes barreiras. Sou grata também por todas as conversas sobre a vida e por todas as emoções compartilhadas! Sem você, talvez eu não tivesse conseguido. À minha amiga de mais de 10 anos, Paula Piazza, por ter sido extremamente presente em minha vida e por todo apoio! Foi maravilhoso poder compartilhar com você de momentos de descontração e espero poder continuar compartilhando de muitos outros momentos ao seu lado. Ao meu amigo, Pablo Mortimer, por todas as conversas, por todo estímulo e por ter permanecido em minha vida, sendo sempre presente tanto em minha vida quanto na vida do meu filho. Agradeço por ter participado de um ano que, apesar de difícil, foi um ano de muito amadurecimento, crescimento pessoal e profissional para mim, você com certeza abriu meus olhos para muitas coisas! Eu amo vocês.
À toda a minha turma de mestrado, por serem sempre tão dispostos a ajudar o próximo. Eu nunca tinha estado em uma turma tão unida quanto a nossa. Agradeço à Carla Samily, Carolina Maria Campos, Cíntia Barreto, Clarice Brito, Fernanda Félix, Gustavo Trindade, Hélder Domiciano, Joaquim Felipe, Katianne Soares Rodrigues, Maurília Medeiros e Natália Rodrigues, por todos os momentos compartilhados dentro e fora do meio acadêmico. Sempre lembrarei de vocês com muito carinho, me inspirando na melhor parte de cada um de vocês. Carla e Katianne, duas meninas super esforçadas, inteligentes e dedicadas! Carol e Clarisse, a energia de vocês é contagiante! Vocês sabem levar a vida de forma leve e feliz. Isso é lindo. Cíntia com seu jeito doce, que encanta a todos. Fernanda e seu jeito único, autêntica, inteligentíssima e apaixonada pela ciência, filosofias e muitas outras coisas. Você tem minha admiração! Gustavo e Hélder, dois queridos que estão sempre dispostos a ajudar o próximo! Maurília super prestativa e divertida! Joaquim, o Tarzan, e seu jeito tranquilo. Natália, você tem minha admiração por sua garra para trabalhar, estudar e ter conseguido concluir o mestrado mesmo sem bolsa com muito esforço e dedicação! Vocês são demais!
Um agradecimento especial a Clarice, Fernanda, Gustavo e Hélder, pessoas que nutro um carinho especial. À Clarice, minha eterna duplinha da clínica, continue sempre sendo essa pessoa tão divertida; à Fernanda, minha amiga e confidente, que por diversas vezes foi uma “psicóloga” para mim e sempre estava aberta para me ouvir, ajudar e aconselhar. Saiba que você foi fundamental inclusive na reta final que, quando eu estive desmotivada para escrever a dissertação em um tempo limitado, você com todo seu otimismo me fez acreditar que não seria tão difícil assim e que poderia, inclusive, ser bastante prazeroso, como acabou sendo para mim. O seu amor pela pesquisa científica me fez enxergar tudo isso de forma mais leve; à Gustavo, por sempre ter me inspirado ser uma pessoa melhor pelo seu jeito de ser com todos a sua volta; a Hélder, por todos os momentos
de descontração e por todas as conversas que me estimularam a seguir em frente na profissão que escolhi. Eu nunca vou esquecer do karaokê em Maceió.
Aos doutorandos, Ana Cláudia Macêdo, Caio Barros, Cristianne Medeiros, Dáurea Sena, Dennis, Everton Freitas, Glória França, Janaina Lessa, Juliana Pinheiro, Larissa Rolim, Leorik Pereira, Mara Luana, Mariana, Nelmara Silva, Ondina Rocha, Rani Iane e Rodrigo Mafra, por toda a ajuda que me deram, especialmente no início, quando as lâminas eram verdadeiras incógnitas para mim. Um agradecimento especial a Rodrigo Mafra, por ter feito a análise estatística deste trabalho com grande eficiência e organização! Eu tenho certeza absoluta que você será um grande patologista e terá muito sucesso. É isso que eu desejo a você, de todo o meu coração!
Aos meus irmãos patológicos, Everton Freitas, Hanna Gil, Katianne Soares e Leonardo Carlan, pelos conhecimentos compartilhados e por sempre estarem prontos para me ajudar, além de serem grandes inspirações para mim! Desejo muito sucesso para vocês! Agradeço também à Amanda Gonzaga, minha “primeira irmã” patológica, por toda força e ajuda que me deu na realização desta pesquisa!
Aos funcionários, Gracinha, Sandrinha, Hévio, Beth, Ricardo, Idel, Lourdinha, Talita e Cláudia. Meus sinceros agradecimentos por todo apoio e por sempre terem sido pessoas tão amorosas comigo! Vocês são profissionais extremamente competentes e queridos por todos!
À UFRN, por ter sido minha segunda casa durante quase sete anos, considerando graduação e pós-graduação; e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro que possibilitou a realização desta pesquisa.
Muito obrigada a todos vocês! Sem vocês eu não teria conseguido chegar aqui! “Ninguém cresce sozinho”!
“Que você seja alegre mesmo quando vier a chorar. Que você seja sempre jovem, mesmo quando o tempo passar.
Que você tenha esperança, mesmo quando o sol não nascer.
Que você ame seus íntimos, mesmo quando sofrer frustrações.
Que você jamais deixe de sonhar, mesmo quando vier a fracassar.
Isso é ser feliz” Augusto Cury
RESUMO
O Líquen Plano Oral (LPO) é uma doença mucocutânea crônica imunomediadae relativamente comum na mucosa oral. Diversas pesquisas têm sido desenvolvidas com intuito de elucidar a patogênese dessa lesão, destacando-se aquelas que utilizam biomarcadores de estresse oxidativo. O objetivo deste estudo foi avaliar o dano oxidativo ao DNA no LPO por meio da expressão imuno-histoquímica da 8-OHdG, para verificar o possível envolvimento deste biomarcador na patogênese desta lesão. A imunoexpressão da proteína 8-OHdG foi avaliada semiquantitativamente no epitélio de 46 casos de LPO e 17 amostras de mucosa oral clinicamente normal e os dados submetidos à análise estatística por meio dos testes não-paramétricos de Kruskall-Wallis e Mann Whitney. O nível de significância foi estabelecido em 5% (p> 0,05). Ao analisar a imunoexpressão do 8-OHdG nas formas erosivas e reticulares do LPO e na mucosa oral normal, foi observada tendência à maior imunoexpressão nuclear da 8-OHdG nos LPOs erosivos, em comparação aos LPOs reticulares e à mucosa oral normal. Contudo, o teste não-paramétrico de Kruskall-Wallis não evidenciou diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (p=0,088). Também foi observada tendência à maior intensidade de marcação para a 8-OHdG em casos de LPO reticular e erosivo, se comparados à mucosa oral normal, embora também não tenha sido encontrada significância estatística (p=0,085). Em relação à sintomatologia, foi observada maior imunomarcação tanto citoplasmática quanto nuclear (p=0,004 e p=0,016, respectivamente) da 8-ÓHdG nos casos sintomáticos, em comparação com os casos assintomáticos. Os resultados deste estudo indicam uma elevada expressão imuno-histoquímica da 8-OHdG em LPO, sugerindo o papel do estresse oxidativo em sua patogênese, podendo constituir um alvo terapêutico adicional para essa doença.
ABSTRACT
The Oral Lichen Planus (OLP) is a chronic immune mediated mucocutaneous disease and relatively common in the oral mucosa. Several researches have been carried out with the intention of identifying pathogens of this lesion, standing out as research that uses oxidative stress biomarkers. Among these biomarkers, there is an 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG), which is generated after oxidative damage in DNA. The aim of this study was to evaluate the oxidative damage to DNA in the OLP through the immunohistochemical expression of 8-OHdG, to verify the possible involvement of this biomarker in the pathogenesis of this lesion. An immunoexpression of 8-OHdG protein was evaluated in a semi-quantitative way in the epithelium of 46 cases of OLP and 17 samples of clinically normal oral mucosa and with statistical analysis data using Kruskall-Wallis and Mann Whitney non-parametric tests. The level of significance was established at 5% (p> 0.05). When analyzing an immunoexpression of 8-OHdG in the erosive and reticular forms of OLP and normal oral mucosa, there was a trend of greater nuclear immunoexpression of 8-OHdG was observed in erosive OLP, compared to reticular OLP and normal oral mucosa. However, the Kruskall-Wallis non-parametric test did not show statistically significant differences between groups (p = 0.088). There was also a trend of greater intensity of marking for 8-OHdG in cases of reticular and erosive OLP, when compared to the normal oral mucosa, although no statistical significance was found (p = 0.085). In relation to symptomatology, greater immunomarking was observed, both cytoplasmic and nuclear (p = 0.004 and p = 0.016, respectively) of 8ÓHdG in symptomatic cases, in comparison with asymptomatic cases. The results of this study indicate a high immunohistochemical expression of 8-OHdG in OLP, suggesting an oxidative stress role in its pathogenesis, which may constitute an additional therapeutic target for this disease.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Mecanismos envolvidos na patogênese do LPO. (a) Os queratinócitos ativados por antígenos associados ao MHC classe I secretam quimiocinas que atraem linfócitos; (b) Linfócitos T CD4+ reconhecem o antígeno presente nos queratinócitos através do MHC classe II e secretam quimiocinas, ativando os linfócitos T CD8+; (c) Os linfócitos T CD8+ induzem a apoptose dos queratinócitos através da ligação do receptor Fas com seu ligante; (d) Interação entre mastócitos e linfócitos T. Os mastócitos liberam proteínas quinases, que estimula a liberação da metaloproteinase MMP-9 e esta atua modelando a matriz extracelular
edestruindo a
membranabasal...22
Quadro 1: Critérios clínicos e histopatológicos de diagnóstico para líquen plano oral...32 Figura 2: Imunoexpressão do 8-OHdG em LPO reticular e erosivo; A e B – LPO reticular, expressão imuno-histoquímica em nível citoplasmática e nuclear, evidenciando maior intensidade de marcação em camada basal (100x e 200x, respectivamente); C e D – LPO erosivo, expressão imuno-histoquímica em nível citoplasmática e nuclear, evidenciando maior intensidade de marcação em camada basal (100x e 200x, respectivamente)...38 Figura 3:Imunoexpressão do 8-OHdG em LPO reticular (A) e erosivo (B), evidenciando marcação nuclear mais intensa do que a citoplasmática (200x)...38 Figura 4:Imunoexpressão do 8-OHdG em mucosa oral normal proveniente de remoção de lábio duplo (A) e gengiva clinicamente saudábel (B), evidenciando marcação mais pronunciada no espécime de gengiva, em comparação com o espécime de lábio duplo (100x)...39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Distribuição absoluta e relativa dos casos de LP oral de acordo com características clínicas. Natal-RN, 2020...37
Tabela 2: Análise dos escores de imunopositividade e da intensidade de marcação citoplasmática para 8-OHdG, nos espécimes teciduais de LP reticular, LP erosivo e mucosaoralnormal.Natal-RN,
2020...40
Tabela 3: Análise dos escores de imunopositividade e da intensidade de marcação nuclear para 8-OHdG, nos espécimes teciduais de LP reticular, LP erosivo e mucosa oral normal. Natal-RN, 2020...40
Tabela 4: Análise dos escores de imunopositividade para 8-OHdG e suas diferenças entre LP reticular, LP erosivo e mucosa oral normal. Natal-RN, 2020...41
Tabela 5: Análise da intensidade de marcação para 8-OHdG e suas diferenças entre LP reticular, LP erosivo e mucosa oral normal. Natal-RN, 2020...41
Tabela 6: Análise dos escores de imunopositividade citoplasmática para 8-OHdG e suas diferenças de acordo com características clínicas dos casos de LP. Natal-RN, 2020...42
Tabela 7: Análise dos escores de imunopositividade nuclear para 8-OHdG e suas diferenças de acordo com características clínicas dos casos de LP. Natal-RN, 2020...42
Tabela 8: Análise das correlações entre os escores de imunopositividade citoplasmática e nuclear para 8-OHdG, nos diferentes grupos estudados. Natal-RN, 2020...43
LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES
LPO Líquen Plano Oral LP Líquen Plano
OLP Do inglês Oral LichenPlanus 8-OHdG 8-hidroxi-2’-deoxiguanosina
TNF-α Do inglês Tumor Necrosis Factor-α IL-2 Interleucina 2
IFN-γ Interferon gama MMP-9 Metaloproteinase 9
MHC Do inglês MainHistocompatibilityComplex OMS Organização Mundial da Saúde
LLO Lesão Liquenóide Oral ERO Espécie Reativa de Oxigênio
MDA Malondialdeído
ERN Espécie Reativa de Nitrogênio
CCEO Carcinoma de Células Escamosas Oral
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte KW Kruskal-Wallis
U Mann-Whitney r Spearman
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO...16 2. REVISÃO DE LITERATURA...19 3. OBJETIVOS...28 3.1 OBJETIVO GERAL...28 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...28 4. MATERIAIS E MÉTODOS...30 4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS...30 4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO...30 4.3 POPULAÇÃO...30 4.4 AMOSTRA...30
4.5 CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DAAMOSTRA...30
4.5.1 Critérios de inclusão...30
4.5.2 Critérios de exclusão...31
4.6 ANÁLISE DOS DADOS CLÍNICOS...31
4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO...32 4.7.1 Técnica imuno-histoquímica...32 4.7.2 Análise imuno-histoquímica...33 4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA...34 5. RESULTADOS...36 5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA...36 5.2 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS...37 6 DISCUSSÃO...45 7 CONCLUSÕES...52 REFERÊNCIAS...53 APÊNDICES...57 ANEXO...74
1. INTRODUÇÃO
O Líquen Plano (LP) é uma doença crônica imunologicamente mediada e inflamatória, que afeta a pele e membranas mucosas, tendo sido recentemente descrita também como uma condição psicossomática, uma vez que seu desenvolvimento e exacerbação encontram-se bastante relacionados a períodos de tensão emocional (PAYERAS et al., 2013; PANTA et al., 2019). O Líquen Plano Oral (LPO) é a variante oral do LP. As lesões orais geralmente precedem as lesões em pele e podem até representar a única manifestação da doença. É muito comum a existência de períodos de remissão e recorrência e seu diagnóstico é baseado nos achados clínicos e histopatológicos (OLSON et al., 2016; MUTAFCHIEVA et al., 2018).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) classifica o LPO como uma desordem potencialmente maligna que necessita de acompanhamento de longo prazo (EL-NAGGAR et al., 2017). As taxas de transformação maligna relatadas na literatura variam bastante, mas a maioria dos estudos relata uma taxa de cerca de 1%, sendo o LPO erosivo o subtipo clínico com maior probabilidade de malignização, em comparação com os outros subtipos (GUPTA et al., 2015; AGHBARI et al., 2017; ENOMOTO et al., 2018).
A etiologia do LPO é incerta e a patogênese ainda é alvo de numerosas pesquisas. Entretanto, sabe-se que seu desenvolvimento envolve uma cascata de eventos com a participação de linfócitos T citotóxicos, que induzem a apoptose dos ceratinócitos da camada basal do epitélio (LANIOSZ et al., 2019).
Algumas pesquisas têm associado o estresse oxidativo à patogênese do LPO, sendo esse processo relacionado também à carcinogênese, já que as espécies reativas de oxigênio podem causar danos em macromoléculas, como o DNA (KAWANISHI et al., 2006; KUMAR et al., 2012; ABDOLSAMADI et al., 2014; DARCZUK et al., 2016).
O estresse oxidativo é definido como o desequilíbrio entre a produção de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) e a capacidade do organismo de excretar esses intermediários ou de reparar o dano causado por eles (REKHA et al., 2017). Sabe-se que as células normalmente produzem EROs na respiração celular normal, mas são expostas à estresse oxidativo quando há problema no seu sistema antioxidante ou devido a reações imunes (KUBO et al., 2014).
A 8-hidroxi-2’-deoxiguanosina (8-OHdG) é gerada após danos oxidativos na base nucleosídica 2’-desoxiguanosina, sendo uma forma oxidada desta. A 8-OHdG é um marcador adequado para avaliar o dano oxidativo do DNA e tem se mostrado útil para avaliar o risco de carcinogênese (KUMAR et al., 2012; HE et al., 2014). Acredita-se que determinar o status
oxidativo/antioxidante de uma doença inflamatória, como o LPO, pode ser útil para avaliar sua gravidade e monitorar a evolução e resposta ao tratamento (TVARIJONAVICIUTE et al., 2017).
Em virtude das incertezas a respeito da patogênese, evolução e da variada resposta ao tratamento nos casos sintomáticos de LPO, além do fato de não ter sido encontrado na literatura nenhum estudo imuno-histoquímico com esse marcador no LPO (CHAIYARIT et al., 2005; KAWANISHI et al., 2006; RAI et al., 2010; AGHA-HOSSEINI et al., 2012; TOTAN et al., 2015; KAUR et al., 2016), essa pesquisa objetivou avaliar o dano oxidativo do DNA no LPO através da expressão imuno-histoquímica da 8-OHdG, para verificar se esse mecanismo pode estar envolvido na patogênese dessa lesão.
REVISÃO DE
LITERATURA
2. REVISÃO DE LITERATURA
O LP é uma condição crônica imunomediada inflamatória que afeta, além da mucosa oral e genital, a pele, unhas e couro cabeludo. Em muitos casos, o envolvimento oral precede o aparecimento em outras regiões do corpo e quando ocorre como única manifestação é chamado de LPO (GUPTA et al., 2015; ALRASHDAN et al., 2016). É uma lesão relativamente comum, que acomete cerca de 1% a 4% da população mundial, principalmente mulheres de meia-idade e costuma ser uma lesão dinâmica, com períodos de remissões e recidivas (AGHBARI et al., 2017).
O LPO é classificado de acordo com seus aspectos clínicos como reticular, erosivo, atrófico, em placa, papular e bolhoso, sendo as formas reticular e erosiva as mais comuns. O LPO reticular é o mais facilmente reconhecido, caracterizando-se pela presença de estrias brancas e finas denominadas “estrias de Wickham” e por ser bilateral e assintomático. A forma erosiva, por outro lado, exibe eritema causado pela inflamação e ulceração também pode ser observada, havendo sintomatologia dolorosa. As outras formas clínicas são bem menos frequentes e podem aparecer em associação com outras (ALRASHDAN et al., 2016).
A localização mais comum do LPO é a mucosa jugal, porém também é observado em língua, gengiva e mucosa labial (ALRASHDAN et al., 2016). Entre as lesões que fazem diagnóstico diferencial com o LPO encontram-se a reação liquenóide, leucoplasia, lúpus eritematoso, pênfigo, penfigóide, doença do enxerto versus hospedeiro, estomatite ulcerativa crônica, entre outras (CHIANG et al., 2018).
Histologicamente, o LPO é caracterizado por exibir epitélio pavimentoso estratificado hiperortocetatinizado ou hiperparaceratinizado, apresentando degeneração hidrópica, exocitose e acantose. Normalmente observam-se ceratinócitos em degeneração na área de interface do epitélio e tecido conjuntivo, denominados de corpos de Civatte e a perda da nitidez da camada basal. Na lâmina própria, é característica a presença de um intenso infiltrado inflamatório em banda predominantemente mononuclear e composto principalmente por linfócitos (KRUPPA et al., 2015; CHIANG et al., 2018).
O diagnóstico do LPO é baseado nas características clínicas e histopatológicas, embora algumas técnicas, como a imunofluorescência direta, possam ser eficazes (CÓRDOVA et al., 2014). É importante salientar que Van der Meij e van der Waal sugeriram, em 2003, modificações nos critérios de diagnóstico para o LPO e Lesão Liquenóide Oral (LLO),
considerando as lesões bilaterais e múltiplas como LPO, enquanto classificaram lesões únicas como LLO.
A OMS classifica o LPO como “desordem potencialmente maligna” (EL-NAGGAR et al., 2017) e estudos revelam que sua taxa de transformação pode ser de até 5,3% (GUPTA et al., 2015), apesar da maioria dos estudos relatar uma taxa de cerca de 1% (AGHBARI et al., 2017).
Na meta-análise realizada por Aghbari et al. (2017), composta por 57 estudos (19.676 pacientes), eles observaram uma taxa de transformação maligna de 1,1% e também observaram que o risco de transformação maligna é maior em LLO quando comparado com o LPO, com um risco ainda maior entre os pacientes tabagistas, etilistas e infectados com o vírus da hepatite C.Na revisão sistemática realizada por Giuliani et al. (2019), observou-se uma taxa de transformação maligna de 1,4%, com maior predominância para as formas erosivas, em pacientes do sexo feminino e para as lesões localizadas em língua.
Laniosz et al. (2019) identificaram em sua pesquisacom 303 pacientes portadores de LPO uma incidência de 3,1% de desenvolvimento de Carcinoma de Células Escamosas Oral(CCEO), com uma média de 14,7 anos após o diagnóstico inicial. Os autoresconcluíram que os pacientes com líquen plano erosivo tiveram aumento na incidência de CCEOs e que os mesmos devem ser acompanhados rigorosamente. Bandyopadhyay et al.(2017) também observaram a forma erosiva como a mais associada com a transformação maligna do LPO.
Embora existam evidências científicas a respeito da possibilidade do LPO sofrer malignização, o potencial de malignidade desta lesão ainda é controverso, uma vez que alguns pesquisadores acreditam que apenas lesões liquenóides, como as displasias liquenóides, muitas vezes erroneamente diagnosticadas como LPO, apresentam potencial de transformação maligna, e não o LPO sem qualquer displasia epitelial (AGHBARI et al., 2017; ROCK et al., 2018).
Na meta-análise realizada por Idrees et al. (2020), que utilizou rigorosos critérios de diagnóstico e critérios de inclusão, eles observaram que a taxa de transformação maligna para o LPO é bastante baixa, de 0,44%, sendo o risco maior entre os pacientes tabagistas, etilistas, soropositivos para o HCV e/ou os que apresentarem o subtipo erosivo do LPO. Os autores concluíram que as taxas de transformação malignas relatadas na literatura são superestimadas, devido a critérios de diagnóstico clínicos e histopatológicos não rigorosos.
O desenvolvimento do LPO envolve múltiplos fatores já conhecidos, porém ainda apresenta etiologia incerta. Alguns fatores de risco e “gatilhos” já foram descritos na literatura, incluindo fatores sistêmicos, como infecções virais, a exemplo do vírus da hepatite
C, hipertensão,distúrbios endócrinos, como o diabetes mellitus, distúrbios psicológicos, como ansiedade, estresse e depressão, desordens da tireóide, desnutrição, alergias e doenças imunológicas; e fatores locais, como acúmulo de biofilme, cálculo dentário e trauma local. Com relação aos distúrbios psicológicos, foi observado que o desenvolvimento e exacerbação do LPO estão bastante relacionados com períodos de tensão emocional, o que inclusive justifica o fato dessa lesão ter sido considerada uma condição psicossomática (PAYERAS et al., 2013; BARBOSA et al., 2015; MUTAFCHIEVA et al., 2018; NOSRATZEHI, 2018; PANTA et al., 2019).
Embora ainda alvo de inúmeras pesquisas, as principais teorias a respeito do desenvolvimento do LPO giram em torno de uma resposta desregulada mediada por células T frente a um antígeno presente nas células da camada basal do epitélio, que pode ser um antígeno próprio ou de origem exógena (KURAGO et al., 2016).Esse antígeno é responsável por tornar os ceratinócitos da camada basal susceptíveis a uma resposta imune, induzindo a ativação de linfócitos T CD4+ e CD8+ e à produção de citocinas, como IL-2, IFN-γ e TNF-α, que levam à apoptose dos ceratinócitos (PAYERAS et al., 2013).
Alguns mecanismos a respeito da patogênese do LPO já foram descritos e já é conhecido que os linfócitos TCD8+ migram em direção aos ceratinócitos da camada basal mediados por quimiocinas, levando à apoptose desses ceratinócitos de maneira direta, após serem ativados pela ligação ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I presente na superfície das células epiteliais supracitadas, ou de maneira indireta, com auxílio do linfócito T CD4+ e citocinas (GUPTA et al., 2015; ENOMOTO et al., 2018).
As citocinas têm um papel muito importante na patogênese do LPO. Entre estas, destaca-se a RANTES, que é uma citocina pró-inflamatória destaca-secretada pela ativação de linfócitos, ceratinócitos e outras células. Essa citocina resulta em degranulação dos mastócitos, que estimula a liberação de TNF-α, responsável por estimular a resposta dos linfócitos, e de proteína quinase, proteína responsável por estimular a liberação de metaloproteinases, demonstrando um papel indireto dos mastócitos na destruição da camada basal (Figura 1).
Acredita-se, ainda, que uma resposta imune não específica que resulta na destruição da membrana basal, ativação de uma matriz de metaloproteinase, secreção de quimiocinas e degranulação de mastócitos é responsável por suprimir a capacidade dos ceratinócitos da camada basal de secretarem colágeno tipo IV e laminina-5, que são fundamentais para manter a membrana basal íntegra e suprimir a apoptose nas células epiteliais.
Figura 1: Mecanismos envolvidos na patogênese do LPO. (a) Os ceratinócitos ativados por antígenos associados ao MHC classe I secretam quimiocinas que atraem linfócitos; (b) Linfócitos T CD4+ reconhecem o antígeno presente nos ceratinócitos através do MHC classe II e secretam quimiocinas, ativando os linfócitos T CD8+; (c) Os linfócitos T CD8+ induzem a apoptose dos ceratinócitos através da ligação do receptor Fas com seu ligante; (d) Interação entre mastócitos e linfócitos T. Os mastócitos liberam proteínas quinases, que estimula a liberação da metaloproteinase MMP-9 e esta atua modelando a matriz extracelular e destruindo a membrana basal.
FONTE: Adaptado de Payeras et al (2013).
Por fim, muitos pesquisadores estudam a possibilidade de o LPO ser uma doença autoimune e acreditam que proteínas do choque térmico possam ser potenciais autoantígenos, uma vez que foi observado maior expressão destas nos ceratinócitos do LPO. Ademais, outras particularidades clínicas reforçam essa hipótese, como o fato de o LPO ter início na fase adulta, devido à maior prevalência em pacientes do sexo feminino e sua comum associação com outras doenças autoimunes (ALRASHDAN et al., 2016; MUTAFCHIEVA et al., 2018).
Apesar desses mecanismos já terem sido largamente estudados, a patogênese exata do LPO ainda permanece desconhecida e diversas pesquisas vêm sendo realizadas a respeito da participação do estresse oxidativo nesta. O estresse oxidativo está envolvido não só na patogênese do LPO, mas também de muitas outras doenças inflamatórias, como doença de
Alzheimer, de Parkinson, além de algumas doenças que acometem a pele, como lúpus eritematoso sistêmico e pênfigo vulgar, e consiste no desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e sua eliminação pelo organismo ou capacidade das substâncias anti-oxidantes as neutralizarem. Como resultado da presença prolongada das EROs, os níveis de anti-oxidantes tendem a cair nos casos de inflamação crônica e/ou de carcinogênese (LOPEZ et al., 2014; DARCZUK et al., 2016; REKHA et al., 2017).
As EROs podem surgir de maneira endógena ou exógena. As formas endógenas são produzidas normalmente a partir de células inflamatórias e a partir da própria respiração celular normal, devido ao transporte de elétrons nas mitocôndrias. Por outro lado, entre as fontes exógenas de EROs, destacam-se os agentes químicos carcinogênicos, como o tabaco e seus metabólitos (KAWANISHI et al., 2006; DARCZUK et al., 2016).
Sabe-se que a saliva é um fluido bastante rico em antioxidantes, como o ácido úrico, glutationa e o ácido ascórbico, exibindo um papel protetor fundamental frente às EROs. Entretanto, mesmo diante de anti-oxidantes, existem situações em que a produção de EROs é tão acentuada que o organismo não consegue eliminá-las nem as neutralizar, o que causa o estresse oxidativo. Isso foi observado em diversas lesões, incluindo o LPO, que tem um componente inflamatório bastante evidente (KAWANISHI et al., 2006; DARCZUK et al., 2016; REKHA et al., 2017). Foi constatado que o sistema antioxidante salivar é um sistema fundamental do ponto de vista protetor frente ao estresse oxidativo, de forma que problemas nesse sistema podem aumentar o risco a inflamações (AZIZI, FARSHCHI, 2012) e acredita-se que a avaliação do estresacredita-se oxidativo em uma doença inflamatória pode acredita-ser útil para verificar sua gravidade e monitorar a evolução e a resposta ao tratamento da doença (TVARIJONAVICIUTE et al., 2017).
No estudo caso-controle realizado por Hashemy et al (2016), no qual avaliaram os níveis séricos de malonaldeído (MDA), que é um fator de estresse oxidativo, e a capacidade antioxidante total da saliva em pacientes com LPO e em um grupo controle, foi observado que há diferença na capacidade antioxidante total da saliva entre diferentes formas clínicas de LPO. Foi observada uma maior capacidade antioxidante da saliva nos pacientes com as formas ceratóticas em comparação com as formas erosivas e atróficas, sugerindo haver um maior nível de estresse oxidativo nestas últimas. Entretanto, os autores não observaram nenhuma diferença estatisticamente significativa sobre os níveis séricos de MDA antes e após 14 dias de tratamento com corticosteroides tópicos, o que demonstrou que o tratamento com corticosteróide pode não ter influência no estresse oxidativo.
O estresse oxidativo pode participar de mecanismos que levam à disfunção dos ceratinócitos e à apoptose destes. A produção excessiva de EROs, que gera o estresse oxidativo, além da produção excessiva de espécies reativas de nitrogênio (ERNs), normalmente produzidas durante processos inflamatórios, podem causar danos oxidativos ou nitrativos nas moléculas de DNA e quando esses danos não são reparados, podem levar à apoptose celular ou até mesmo à carcinogênese (KAWANISHI et al., 2006).
No que diz respeito ao dano oxidativo, a 8-OHdG é produzida no DNA nuclear e mitocondrial (WU et al., 2017), uma vez que ela é a forma oxidada da base nucleosídica 2’-desoxiguanosina e tem, portanto, se mostrado um marcador útil de dano de DNA e para avaliação do risco de carcinogênese, pois ele é capaz de mensurar o efeito dos danos oxidativos endógenos ao DNA e podes er considerado como fator de iniciação e de promoção da carcinogênese. A produção de 8-OHdG é considerada uma das principais modificações mutagênicas do DNAe ela pode ocorrer não só frente às EROs, mas também devido à exposição à luz ultravioleta e radiação (AGHA-HOSSEINI et al., 2012; KUMAR et al., 2012; HE et al., 2014; KAUR et al., 2016).
No estudo realizado por Kawanishi et al. (2006), que avaliou o papel do dano oxidativo e nitrativo do DNA na carcinogênese relacionada a processos inflamatórios crônicos a partir da técnica da imunofluorescência, foi demonstrada a presença de 8-OHdG e de 8-nitroguanina no epitélio oral de biópsias de pacientes com LPO, leucoplasia e carcinoma de células escamosas oral (CCEO), enquanto não observaram imunorreatividade em mucosa normal. Os autores concluíram, dessa forma, que esses marcadores podem ser úteis para avaliar o risco de carcinogênese relacionada a processos inflamatórios.
Agha-Hosseini et al (2012) e Totan et al (2015), ao avaliarem os níveis de 8-OHdG na saliva de pacientes com LPO, observaram uma concentração bem maior nestes pacientes em comparação com o grupo controle composto por pacientes saudáveis. No que diz respeito ao risco de transformação maligna, Totanet al (2015) sugeriram que a avaliação do 8-OHdG salivar, além da avaliação dos biomarcadores anti-oxidantes presentes na saliva, pode ser útil para o monitoramento de pacientes com LPO no futuro, embora ainda não haja um critério estabelecido de quais pacientes possuem maior risco de transformação maligna.
Kaur et al (2016) também avaliaram o 8-OHdG salivar em LPO, em outras lesões consideradas potencialmente malignas (leucoplasia e fibrose submucosa oral), e em CCEOs. Foi observado que tanto os pacientes com carcinoma quanto os com lesões potencialmente malignas, incluindo o LPO, apresentaram níveis salivares de 8-OHdG significativamente
maiores quando comparados ao grupo controle. Os autores concluíram, portanto, que esse mecanismo de dano de DNA pode ter uma ligação significativa com a carcinogênese.
Embora existam numerosos reparos enzimáticos de DNA e defesas anti-oxidantes não enzimáticas, a 8-OHdG não reparada no DNA pode resultar mutações transversais e induzir a carcinogênese. Inclusive, o aumento na 8-OHdGpode ocorrer não apenas devido a um aumento na taxa de dano oxidativo de DNA, mas também devido a um declínio na taxa de reparo (WU et al., 2017).
Ainda não há tratamento definitivo indicado para o LPO, o qual é reconhecido por suas altas taxas de recorrência e cronicidade, havendo remissão total em apenas 40% dos casos. Atualmente, é comum a realização de tratamento sintomático, especialmente para o líquen plano erosivo e bolhoso, sendo o uso de corticosteroides tópicos o tratamento considerado padrão-ouro. Em casos mais agressivos e/ou persistentes, a corticoterapia sistêmica pode ser utilizada como de escolha. Entretanto, esses fármacos estão associados a numerosos efeitos adversos e não são indicados para uso por longos períodos de tempo, além do fato de algumas vezes o uso prolongado resultar em queda da efetividade biológica desses medicamentos. A laserterapia também pode ser utilizada como um tratamento seguro e eficaz para o LPO (CÓRDOVA et al., 2014; KRUPPA et al., 2015; HASHEMY et al., 2016; LIU et al., 2017; GHAHREMANLO et al., 2018).
Alguns pesquisadores têm sugerido a possibilidade da neutralização do estresse oxidativo ser um importante alvo terapêutico, uma vez que o uso de antioxidantes orais pode inibir o aumento do estresse oxidativo e, consequentemente, ajudar a proteger os ceratinócitos do dano, contribuindo para alguma melhora clínica (DARCZUK et al., 2016; MANSOURIAN et al., 2017), além do fato dos antioxidantes orais apresentarem bem menos efeitos adversos do que os corticosteroides e de apresentarem menos contraindicações (GUTIERREZ et al., 2014).
No estudo realizado por Gutierrez et al. (2014), que comparou o tratamento local para LPO erosivo e não erosivo à base de antocianinas (antioxidantes naturais extraídos da casca da uva) com o tratamento com creme à base de propionato de clobetasol, neomicina e nistatina, foi observado um resposta igual ou melhor dos pacientes que utilizaram o tratamento com antioxidante em comparação com o grupo controle.
Alguns estudos mais recentes têm demonstrado que a combinação da terapia com corticosteroides e antioxidantes pode reduzir os efeitos adversos, além de potencializarem os efeitos do corticosteroide (GHAHREMANLO et al., 2018). A exemplo disso, o estudo realizado por Mostafa e Zakaria (2018), evidenciou uma melhora significativa dos sinais e
sintomas do LPO no grupo que utilizou a terapia combinada de ozônio, que tem forte atividade antimicrobiana e funciona como um poderoso agente antioxidante, com corticosteroide tópico, em comparação com os grupos que utilizaram essas terapias de maneira isolada.
Em uma revisão publicada por Nosratzihi (2018), foi relatado que produtos de peroxidação lipídica, cortisol e imunoglobulinas são biomarcadores para predizer a ocorrência do LPO e que os corticosteróides são drogas comuns para tratar o LPO, porém sua combinação com outros agentes, como anti-oxidantes (ácido fólico, vitamina B) são potenciais tratamentos para essa condição.
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral:
O presente estudo se propôs a avaliar e comparar a expressão imuno-histoquímica da8-OHdG em uma série de casos de líquen plano oral reticular e erosivo com, visando contribuir para o entendimento do possível papel do estresse oxidativo na patogênese dessa lesão.
3.2 Objetivos específicos:
• Analisar a porcentagem da imunoexpressão citoplasmática e nuclear da 8-OHdG em uma série de casos de LPO, comparando os tipos reticulares e erosivos com a mucosa oral normal;
• Analisar a intensidade da imunoexpressão da 8ÓHdG em uma série de casos de LPO, comparando os tipos reticular e erosivo com a mucosa oral normal;
• Analisar a associação da porcentagem da imunoexpressão citoplasmática e nuclear da 8-OHdG com a idade, sintomatologia, presença de lesões múltiplas e resposta terapêutica ao uso de propionato de clobetasol a 0,05%.
MATERIAL E
MÉTODOS
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
Este projeto foi cadastrado no Comitê Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) para análise de seu conteúdo através da Plataforma Brasil e aprovado sob o número de parecer 3.382.706 (ANEXO 1).
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
Este trabalho foi um estudo observacional transversal, no qual foi realizada uma análise imuno-histoquímica da expressão da 8-OHdG em uma série de casos de LPO.
4.3 POPULAÇÃO
A população desta pesquisa foi constituída por casos de LPO diagnosticados e acompanhados pelo Serviço de Estomatologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), que foram submetidos à biópsia e cujos espécimes estavam arquivados no Laboratório de Anatomia Patológica e Citopatologia do Departamento de Odontologia da mesma Universidade.
4.4 AMOSTRA
Para o estudo histológico e imuno-histoquímico, a amostra foi selecionada de forma intencional e não-probabilística, por conveniência, sendo constituída de 29 casos de LPO reticular e 17 casos de LPO erosivo, totalizando em46 casos de LPO. Para uma análise comparativa, foram utilizados 17 casos de mucosa oral normal obtidos de espécimes teciduais oriundos de cirurgia de remoção de lábio duplo (7 casos) e espécimes de gengiva clinicamente saudável (10 casos) provenientes de cirurgia de aumento de coroa clínica.
4.5 CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DA AMOSTRA
4.5.1 Critérios de inclusão
• Pacientes diagnosticados com LPO sem histórico de tratamento prévio à realização da biópsia;
• Blocos com espécimebiológico suficiente para confecção das lâminas necessárias para o estudoimuno-histoquímico.
4.5.2 Critérios de exclusão
• Pacientes tabagistas, ex-tabagistas que pararam de fumar há menos de 10 anos e etilistas;
• Pacientes sob tratamento que não compareceram às consultas de acompanhamento; • Pacientes que não se enquadraram nos critérios clínicos e histopatológicospropostospela Academia Americana de Patologia Oral e Maxilofacial(AAPOM/2016) (Quadro 1).
4.6 ANÁLISE DOS DADOS CLÍNICOS
Os dados clínico-demográficos dos pacientes, tais como sexo, idade, raça, hábitos, características clínicas da lesão e tratamento realizado foram coletados das fichas de biópsias e/ou prontuários clínicos dos pacientes que foram acompanhados na Clínica de Estomatologia da UFRN e colocados em uma ficha clínica previamente elaborada para esse fim (APÊNDICE A).
As lesões de LPO foram diagnosticadas tanto clinicamente quanto histopatologicamente cumprindo os critérios de diagnósticos propostos pela AAPOM/2016. As lesões de LPO foram consideradas como reticulares quando se apresentaram como estriações brancas, enquanto foram consideradas como erosivas quando se apresentaram como lesões eritematosas, ulceradas e com sintomatologia, conforme Neville et al (2016).
Quadro 1. Critérios clínicos e histopatológicos de diagnóstico para líquen plano oral.
Critérios clínicos
Distribuição multifocal simétrica
Lesões brancas e vermelhas exibindo uma ou mais das seguintes formas: reticular/papular, atrófica, erosiva, placa, bolhosa
Lesões não localizadas exclusivamente em locais onde são colocados tabacos sem fumaça
Lesões não localizadas exclusivamente adjacentes ou em contato com restaurações dentárias
O aparecimento das lesões não deve estar correlacionado com o início de uma medicação nem com o uso de produtos contendo canela
Critérios histopatológicos
Presença de um infiltrado inflamatório predominantemente linfocítico em forma de faixa ou irregular, na lâmina própria confinado à interface epitélio-lâmina própria
Células basais com degeneração hidrópica Exocitose linfocítica
Ausência de displasia epitelial
Ausência de alteração epitelial com arquitetura verrucosa FONTE: Adaptado de Cheng et al., 2016.
A resposta à terapia para os casos dos pacientes diagnosticados com LPOerosivo, foi observada a partir do acompanhamento dos pacientes, na Clínica de Estomatologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte que haviam sido tratados com protocolo terapêutico à base de solução de propionato de clobetasol a 0,05%, quatro vezes ao dia, durante 15 dias ou, nos casos de persistência da lesão, por mais 15 dias.
4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
4.7.1 Técnica imuno-histoquímica
Os espécimes de LPO e mucosa oral normal, fixados em formol a 10% e incluídos em parafina, foram submetidos a cortes de 3µm de espessura e posteriormente estendidos em lâminas de vidro, previamente limpas e preparadas com adesivo à base de 3-aminopropyltrietoxy-silano (Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA). Após isso, o material foi preparado para análise imuno-histoquímica, sendo submetido ao anticorpo anti-8-OHdG
na concentração de 1:400 (Santa Cruz BiotechnologiesInc®, MO, USA) com tempo de incubação de 60 minutos à temperatura ambiente. Para a realização do controle negativo, alguns cortes passaram pelo processamento imuno-histoquímico sem exposição ao anticorpo primário, para confirmar a especificidade da coloração
Os cortes foram desparafinados em xilol, reidratados em álcool (99,5 %) e recuperados com a solução Trilogy (Cell Marque®, Califórnia, USA), na concentração de 1:100 em panela Pascal por 3 minutos. Em seguida, os cortes foram incubados com o anti-8-OHdGpor 60 minutos em temperatura ambiente. Os espécimes foram, então, submetidos a duas lavagens com tampão fosfato de sódio (PBS) e foi utilizado o kit HiDef (Cell Marque®, Califórfia, USA), no qual foi utilizado o amplificador por 10 minutos e, após lavar com tampão TRIS (pH 7,4), utilizado o HRP por mais 10 minutos.Em seguida, os cortes foramcorados com DAB (3,3-diaminobenzidina, 0,05 %) (DAKO North America Inc®, Califórnia, EUA) e contra-corados com a hematoxilina de Harris (Sigma, Missouri, USA).
4.7.2 Análise da marcação imuno-histoquímica
A análise da expressão da 8-OHdG nos casos de LPO e mucosa oral normalfoi realizada observando-se a marcação nuclear e citoplasmática, de formas independentes, sendo consideradas positivas as células que apresentaram coloração acastanhada no núcleoe/ou citoplasma, independentemente da intensidade. Os casos da amostra foram avaliados através de microscópio ótico (Olympus CX31, Olympus Japan Co., Tokyo, JPN) efoi observada toda a extensão epitelial da área representativa da lesão, nos aumentos de 100x e 400x.
Para avaliar a marcação da 8-OHdG, foi realizada uma análise semi-quantitativa, por meio de uma adaptação da metodologia utilizada por Ma et al (2006), sendo feita uma avaliação baseada na porcentagem de células epiteliais marcadas ao longo de todo epitélio da área mais representativa da lesão. A porcentagem de marcação foi classificada com os escores 0 para marcação ausente; 1 para marcação inferior a 25%; 2para marcação entre 25% e 50%; 3 para marcação entre 50% e 75%; e 4 para marcação maior do que 75%. Foi realizada, ainda, uma análise qualitativa, independentemente do score, da intensidade de marcação, as quais foram classificadas como ausente, leve, moderada e forte.
Esta análise foi realizada duas vezes por um mesmo avaliador, previamente treinado com um pesquisador mais experiente, em momentos distintos, sem conhecimento dos dados clínicos do caso. Com o objetivo de verificar o nível de concordância intraexaminador, foi calculado o coeficiente Kappa ponderado (κ) e obtido valor de κ igual a 0,916, o que
evidencia nível de reprodutibilidade “muito bom”, conforme a classificação de Altman (1993).
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados obtidos foram organizados em um banco de dados informatizado com o auxílio do programa estatístico SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) na versão 22.0, a fim de facilitar a análise dos dados. Os dados obtidos com a avaliação imuno-histoquímica foram submetidos ao teste de Shapiro-Wilk, que indicou ausência de distribuição normal. Portanto, visando detectar possíveis diferenças na imunoexpressão da 8-OHdG de acordo com variáveis clínicas, foram aplicados os testes não-paramétricos de Kruskall-Wallis (KW) e Mann-Whitney (U) e, para avaliar a existência de correlação entre a imunomarcação nuclear e citoplasmática do 8-OHdG, foi realizado o teste de Correlação de Spearman (r). O nível de significância foi estabelecido em 5% (p<0,05).
5. RESULTADOS
5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
A amostra deste estudo foi constituída por 29 casos de LPO reticular e 17 casos de LPO erosivo. A maioria dos casos era de pacientes do sexo feminino (76,1%) e a idade variou de 21 a 83 anos, com média de 50,3 anos (Desvio padrão de ± 13,9), sendo a maioria da amostra composta por pacientes com mais de 40 anos de idade (69,5%). A maioria era de pardos ou negros (50,0% e 23,9%, respectivamente). Com relação à localização anatômica, a mucosa jugal foi a mais acometida (69,5% dos casos), seguido pela língua (19,6%) e gengiva (6,5%).
A maioria dos pacientes da amostra apresentava sintomatologia dolorosa (60,8%) e lesões múltiplas em diferentes localizações foram observadas em 37% dos casos. O tamanho das lesões variou de 0,5cm até 5cm e o tempo de evolução relatado pelos pacientes variou de 1 mês a 10 anos, embora a maioria dos casos tenha tido tempo de evolução menor do que 2 anos.
No tocante à história médica dos pacientes da amostra estudada, dos 46 casos de LPO, 4 pacientes (8,7%) apresentavam diabetes mellitus e hipertensão, 4 (8,7%) relataram ansiedade e depressão, e 1 (2,2%) relatou apresentar hipertireoidismo. Dos 11 casos de LPO erosivo que tiveram acompanhamento clínico, 5 casos obtiveram resposta total à terapia com propionato de clobetasol a 0,05%, 5 casos mostraram resposta parcial e 1 apresentou resistência à terapia. Destes 11 casos, 8 foram tratados durante 15 dias e apenas 3 precisaram estender o tratamento por mais 15 dias. Desses 3 que foram tratados por 1 mês, um obteve melhora total, outro obteve melhora parcial e o outro foi completamente resistente à terapia. O perfil clínico e epidemiológico da amostra encontra-se detalhado na Tabela 1.
Tabela 1. Distribuição absoluta e relativa dos casos de LP oral de acordo com características clínicas. Natal-RN, 2020. Variáveis N % Sexo Masculino 11 23,9 Feminino 35 76,1 Idade ≤ 40 anos 12 26,1 > 40 anos 32 69,5 Sem informações 2 4,4 Raça Branca 8 17,4 Parda 23 50,0 Negra 11 23,9 Sem informações 4 8,7 Localização anatômica Mucosa jugal 32 69,5 Língua 9 19,6 Lábio inferior 1 2,2 Gengiva 3 6,5 Palato duro 1 2,2 Aspecto clínico Reticular 29 63,0 Erosivo 17 37,0 Sintomatologia Presente 28 60,8 Ausente 17 37,0 Sem informações 1 2,2 Lesões múltiplas Sim 17 37,0 Não 22 47,8 Resposta terapêutica Sem remissão 1 9,0 Remissão parcial 5 45,5 Remissão total 5 45,5
Fonte: Disciplina de Patologia Oral – Departamento de Odontologia, UFRN. Legenda: LP, líquen plano.
5.2 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS
A marcação imuno-histoquímica da 8-OHdG foi evidenciada em todos os casos de LPO e evidenciada em todas as camadas do epitélio, sendo, entretanto, mais evidente e intensa nas camadas basal e parabasal (Figura 2). Embora a marcação citoplasmática tenha sido observada em maior número de camadas epiteliais do que a marcação nuclear, na maioria dos casos, evidenciou-se marcação nuclear com uma intensidade superior à marcação citoplasmática (Figura 3). Além disso, também foi observado imunoexpressão de 8-OHdG no infiltrado inflamatório, células endoteliais e células musculares. O epitélio de mucosa oral
normal apresentou marcação variável, sendo os espécimes provenientes de cirurgia de lábio duplo apresentando menor imunomorcação, enquanto os espécimes de gengiva clinicamente saudável obtiveram marcação em toda a extensão epitelial (Figura 4).
Figura 2.Imunoexpressão do 8-OHdG em LPO reticular e erosivo; A e B – LPO reticular, expressão imuno-histoquímica em nível citoplasmático e nuclear, evidenciando maior intensidade de marcação em camada basal (100x e 200x, respectivamente); C e D – LPO erosivo, expressão imuno-histoquímica em nível citoplasmática e nuclear, evidenciando maior intensidade de marcação em camada basal (100x e 200x, respectivamente).
Figura 3.Imunoexpressão do 8-OHdG em LPO reticular (A) e erosivo (B), evidenciando marcação nuclear mais intensa do que a citoplasmática (200x).
Figura 4.Imunoexpressão do 8-OHdG em mucosa oral normal proveniente de remoção de lábio duplo (A) e gengiva clinicamente saudável (B), evidenciando marcação mais pronunciada no espécime de gengiva, em comparação com o espécime de lábio duplo (200x).
Com relação à expressão da 8-OHdG no LPO reticular, foi observada predominância do escore 4 tanto para a expressão citoplasmática (65,6%) quanto para a nuclear (48,3%), seguido do escore 3 (17,2%), escore 2 (13,8%) e escore 1 (3,4%) para a marcação citoplasmática. Por outro lado, a marcação nuclear obteve o escore 2 como o segundo mais predominante para o LPO reticular (27,6%), seguido do escore 3 (17,2%) e escore 1 (6,9%). De maneira semelhante, o LPO erosivo apresentou predominância do escore 4 tanto para a expressão citoplasmática (82,3%) quanto para a nuclear (70,5%), seguido do escore 3 (11,8%), e 1 caso apresentando o escore 1, não tendo sido observado o escore 2 para marcação citoplasmática do LPO erosivo. No que diz respeito à marcação nuclear do LPO erosivo, os escores 2 e 3 obtiveram a mesma prevalência (11,8%) na amostra, e assim como para a marcação citoplasmática, apenas 1 caso obteve escore 1.
Para a mucosa oral normal, também foi evidenciada maior prevalência do escore 4 (64,7% para a citoplasmática e 35,3% para a nuclear), seguido pelo escore 1 (23,5%) para a marcação citoplasmática e escores 1 e 2 para marcação nuclear (23,5% da amostra com ambos escores). Apesar do escore 4 ter sido o mais observado na mucosa oral normal, da mesma forma que foi observado para os casos de LPO, foi evidenciado prevalência das intensidades fortes e moderadas para os dois subtipos estudados do LPO, enquanto na mucosa oral normal observou-se predominância das intensidades fraca e moderada. Esses resultados encontram-se detalhados nas tabelas 2 e 3.
Tabela 2. Análise dos escores de imunopositividade e da intensidade de marcação citoplasmática para 8-OHdG, nos espécimes teciduais de LP reticular, LP erosivo e mucosa oral normal. Natal-RN, 2020. Expressão citoplasmática Grupo LP reticular n (%) LP erosivo n (%)
Mucosa oral normal n (%) Escore de imunopositividade 0 (0%) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (1-25%) 1 (3,4) 1 (5,9) 4 (23,5) 2 (26-50%) 4 (13,8) 0 (0,0) 1 (5,9) 3 (51-75%) 5 (17,2) 2 (11,8) 1 (5,9) 4 (>75%) 19 (65,6) 14 (82,3) 11 (64,7) Intensidade de marcação Ausente 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) Fraca 8 (27,6) 4 (23,5) 9 (52,9) Moderada 19 (65,5) 11 (64,7) 8 (47,0) Forte 2 (6,9) 2 (11,8) 0 (0,0) Total 29 (100,0) 17 (100,0) 17 (100,0)
Fonte: Disciplina de Patologia Oral – Departamento de Odontologia, UFRN. Legenda: LP, líquen plano.
Tabela 3. Análise dos escores de imunopositividade e da intensidade de marcação nuclear para 8-OHdG, nos espécimes teciduais de LP reticular, LP erosivo e mucosa oral normal. Natal-RN, 2020. Expressão nuclear Grupo LP reticular n (%) LP erosivo n (%)
Mucosa oral normal n (%) Escore de imunopositividade 0 (0%) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (1-25%) 2 (6,9) 1 (5,9) 4 (23,5) 2 (26-50%) 8 (27,6) 2 (11,8) 4 (23,5) 3 (51-75%) 5 (17,2) 2 (11,8) 3 (17,7) 4 (>75%) 14 (48,3) 12 (70,5) 6 (35,3) Intensidade de marcação Ausente 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) Fraca 11 (37,9) 6 (35,3) 10 (58,8) Moderada 13 (44,9) 6 (35,3) 6 (35,3) Forte 5 (17,2) 5 (29,4) 1 (5,9) Total 29 (100,0) 17 (100,0) 17 (100,0)
Fonte: Disciplina de Patologia Oral – Departamento de Odontologia, UFRN. Legenda: LP, líquen plano.
No que diz respeito à marcação citoplasmática, o teste de Kruskall-Wallis não evidenciou diferenças estatisticamente significativas entre os grupos estudados. Para a marcação nuclear, foi observada tendência à maior imunoexpressão da 8-OHdG nos LPOs erosivos, em comparação aos LPOs reticulares e à mucosa oral normal. Contudo, não foram observadas diferenças estatisticamente significativasentre os grupos (Tabela 4).
Tabela 4. Análise dos escores de imunopositividade para 8-OHdG e suas diferenças entre LP reticular, LP erosivo e mucosa oral normal. Natal-RN, 2020.
Localização/Grupo N Mediana Q25–Q75 Média dos
postos KW p*
Citoplasma
LP reticular 29 4,00 3,00–4,00 31,22 2,084 0,353
LP erosivo 17 4,00 4,00–4,00 36,21
Mucosa oral normal 17 4,00 1,50–4,00 29,12 Núcleo
LP reticular 29 3,00 2,00–4,00 31,78 4,865 0,088
LP erosivo 17 4,00 3,00–4,00 38,59
Mucosa oral normal 17 3,00 1,50–4,00 25,79 Fonte: Disciplina de Patologia Oral – Departamento de Odontologia, UFRN. Legenda: *Teste de Kruskall-Wallis. LP, líquen plano.
Ao compararmos a intensidade da marcação imuno-histoquímica do 8-OHdG entre o LPO erosivo, reticular e a mucosa oral normal, embora não tenha havido diferenças estatisticamente significativas, com base nas medianas e no valor de p, houve tendência à maior intensidade de marcação citoplasmática para a 8-OHdG em casos de LP reticular e erosivo, se comparados à mucosa oral normal. Além disso, no que diz respeito à intensidade da marcação nuclear, foi encontrada maior mediana para a intensidade de marcação da 8-OHdG nos casos de LP reticular e LP erosivo (1,00), em comparação à mucosa oral normal (mediana = 0,00). Contudo, os grupos também não demonstraram diferenças estatisticamente significativas (Tabela 5).
Tabela 5. Análise da intensidade de marcação para 8-OHdG e suas diferenças entre LP reticular, LP erosivo e mucosa oral normal. Natal-RN, 2020.
Localização/Grupo N Mediana Q25–Q75 Média dos
postos KW p*
Citoplasma
LP reticular 29 1,00 0,00–1,00 33,81 4,933 0,085
LP erosivo 17 1,00 0,50–1,00 36,03
Mucosa oral normal 17 0,00 0,00–1,00 24,88 Núcleo
LP reticular 29 1,00 0,00–1,00 33,24 3,465 0,177
LP erosivo 17 1,00 0,00–2,00 36,12
Mucosa oral normal 17 0,00 0,00–1,00 25,76 Fonte: Disciplina de Patologia Oral – Departamento de Odontologia, UFRN. Legenda: *Teste de Kruskall-Wallis. LP, líquen plano.
No que diz respeito à relação entre a imunopositividade para o 8-OHdG e as características clínicas do LPO, foi evidenciada uma maior imunoexpressão tanto citoplasmática quanto nuclear (p=0,004 e p=0,016, respectivamente) nos casos sintomáticos
em comparação com os casos assintomáticos. Entretanto, com relação às outras variáveis clínicas não foram observadas diferenças significativas entre a idade, a presença ou não de lesões múltiplas e a resposta ao tratamento com a imunoexpressão do 8-OHdG (Tabelas 6 e 7).
Tabela 6. Análise dos escores de imunopositividade citoplasmática para 8-OHdG e suas diferenças de acordo com características clínicas dos casos de LP. Natal-RN, 2020.
Variáveis N Mediana Q25–Q75 Média dos
postos U p* Idadea ≤ 40 anos 12 4,00 4,00–4,00 24,83 164,00 0,345 > 40 anos 32 4,00 3,00–4,00 21,63 Sintomatologiab Presente 28 4,00 4,00–4,00 17,21 139,50 0,004 Ausente 17 3,00 2,00–4,00 26,52 Lesões múltiplasc Sim 17 4,00 3,00–4,00 18,38 159,50 0,309 Resposta terapêutica Sem remissão/ remissão parcial 6 4,00 3,75–4,00 6,17 14,00 0,787 Remissão total 5 4,00 3,00–4,00 5,80 Fonte: Dados da pesquisa.
Legenda: *Teste de Mann-Whitney. LP, líquen plano.
a2 casos sem informações; b1 caso sem informação; c7 casos sem informações.
Tabela 7.Análise dos escores de imunopositividade nuclear para 8-OHdG e suas diferenças de acordo com características clínicas dos casos de LP. Natal-RN, 2020.
Variáveis N Mediana Q25–Q75 Média dos
postos U p* Idadea ≤ 40 anos 12 4,00 3,00–4,00 23,92 175,00 0,617 > 40 anos 32 4,00 2,00–4,00 21,97 Sintomatologiab Presente 28 4,00 3,00–4,00 17,62 146,50 0,016 Ausente 17 3,00 2,00–4,00 26,27 Lesões múltiplasc Sim 17 4,00 2,00–4,00 18,76 166,00 0,500 Resposta terapêutica Sem remissão/ remissão parcial 6 4,00 2,75–4,00 6,25 13,50 0,750 Remissão total 5 4,00 2,00–4,00 5,70 Fonte: Dados da pesquisa.
Legenda: *Teste de Mann-Whitney. LP, líquen plano.
Por fim, o teste de Correlação de Spearman (r) revelou uma moderada correlação positiva e estatisticamente significativa entre os escores de imunopositividade citoplasmática e nuclear da 8-OHdG, em casos de LP reticular (r = 0,664; p< 0,001) e de LP erosivo (r = 0,687; p = 0,002). Na análise dos espécimes de mucosa oral normal, foi encontrada fraca correlação positiva e estatisticamente significativa entre os referidos escores (r = 0,497; p = 0,042) (Tabela 8).
Tabela 8. Análise das correlações entre os escores de imunopositividade citoplasmática e nuclear para 8-OHdG, nos diferentes grupos estudados. Natal-RN, 2020.
Grupo n R p*
LP reticular 29 0,664 < 0,001
LP erosivo 17 0,687 0,002
Mucosa oral normal 17 0,497 0,042
Fonte: Dados da pesquisa.
