UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DO TRAIRI
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
JOÃO OCTÁVIO SALES PASSOS
A BIOESPECTROSCOPIA COMO FERRAMENTA DE TRIAGEM PARA A FIBROMIALGIA: MELHORANDO O DIAGNÓSTICO PARA
POTENCIALIZAR A FUNCIONALIDADE
SANTA CRUZ 2020
JOÃO OCTÁVIO SALES PASSOS
A BIOESPECTROSCOPIA COMO FERRAMENTA DE TRIAGEM PARA A FIBROMIALGIA: MELHORANDO O DIAGNÓSTICO PARA
POTENCIALIZAR A FUNCIONALIDADE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação da Faculdade de Ciências da Saúde do Trairi da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Pegado de Abreu Freitas.
Área de concentração: Saúde Funcional nos Diferentes Ciclos da Vida.
SANTA CRUZ 2020
JOÃO OCTÁVIO SALES PASSOS
A BIOESPECTROSCOPIA COMO FERRAMENTA DE TRIAGEM PARA A FIBROMIALGIA: MELHORANDO O DIAGNÓSTICO PARA
POTENCIALIZAR A FUNCIONALIDADE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação da Faculdade de Ciências da Saúde do Trairi da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação.
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________ Prof. Dr. Rodrigo Pegado de Abreu Freitas
Orientador
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
_____________________________________________________ Dra. Aline Ranzolin
Examinador externo
Universidade Federal de Pernambuco
_____________________________________________________ Prof. Dra. Sandra Cristina de Andrade
Examinador externo ao programa Universidade Federal do Rio Grande do Norte
À minha família pelo incentivo e amor incondicional em todos momentos dessa trajetória acadêmica.
AGRADECIMENTOS
A Deus pelo dom da vida;
Aos meus familiares pelo amor, atenção, correções, esforço e investimento nos meus sonhos; Aos meus amigos e colegas de mestrado, pelas ajudas, risadas, cervejas e iluminações providenciais em todo o processo de elaboração desse projeto;
Aos amigos extra academia pelo empenho em me mostrar algo mais que números, e que me mostraram que viver não cabe no Currículo Lattes;
A todos os colaboradores que “em funções menos científicas” possibilitaram as condições necessárias para o desenvolvimento dessa pesquisa;
A todos os pacientes e voluntários que me ajudaram a chegar até aqui;
Ao Professor Rodrigo Pegado por todo conhecimento, orientação em nível acadêmico e por seu exemplo como pessoa.
Pés, para que os quero, se tenho asas para voar.
RESUMO
O Colégio Americano de Reumatologia (ACR) apresentou em 2010 um consenso para diagnóstico da fibromialgia (FM). Porém, observou-se que mesmo com um guia de avaliação e diagnóstico existe muitos casos de subdiagnóstico ou de falsos diagnósticos. Isso se deve à falta de marcadores químicos, imunológicos ou exames específicos para a detecção da FM. Este projeto tem como objetivo utilizar da bioespectroscopia (espectroscopia no infravermelho) e técnicas multivariadas de classificação como novas tecnologias para identificação da FM utilizando apenas o plasma sanguíneo como material de análise. Trata-se de um estudo analítico transversal com 126 sujeitos com FM e 126 sujeitos saudáveis no grupo controle. Para todos os sujeitos, foram aplicados questionário sociodemográfico, coletado dados clínicos de impacto da FM, intensidade da dor, níveis de ansiedade, qualidade de vida e uma coleta de 10 ml de sangue. Para a análise do plasma sanguíneo, foi utilizado espectroscopia de reflexão total atenuada de infravermelho por transformada de Fourier (ATR-FTIR) em conjunto com técnicas quimiométricas, fornecendo uma abordagem de diagnóstico de baixo custo, rápida e precisa. Diferentes algoritmos quimiométricos foram testados para classificar os dados espectrais. O algoritmo genético com análise discriminante linear (GA-LDA) obteve os melhores resultados de diagnóstico com sensibilidade de 89,5% em um conjunto de testes externo. O modelo GA-LDA identificou 24 números de onda espectrais responsáveis pela separação de classes; entre estes, a Amida II (1545 cm-1) e as proteínas (1425 cm-1) foram identificadas como características discriminantes.Os dados clínicos mostram que houve diferença estatística entre os grupos nas variáveis FIQ (p = 0,0001), ansiedade (p = 0,001), dor (p = 0,0001) e qualidade de vida (p = 0,0001). Esses resultados reforçam o potencial da espectroscopia ATR-FTIR com análise multivariada como uma nova ferramenta para rastrear e detectar pacientes com FM de maneira rápida, de baixo custo, não destrutiva e minimamente invasiva.
ABSTRACT
The American College of Rheumatology (ACR) presented in 2010 a consensus for the diagnosis of fibromyalgia (FM). However, they can use an assessment and diagnosis guide as there are many cases of underdiagnosis or false diagnosis. This causes a lack of chemical, immunological markers or tests for FM detection. This project aims to use biospectroscopy (spectroscopy without infrared) and multivariate classification techniques as new technologies for the identification of FM, using only blood plasma as the material of analysis. This is a cross-sectional analytical study with 126 members divided into the Fibromyalgia group and the control group. For all subjects, a sociodemographic questionnaire was applied, collected clinical data on the impact of FM, investigated with pain intensity, anxiety levels, quality of life; as well as a collection of 10 ml of blood from each participant. Analysis of their blood plasma using attenuated total reflection Fourier-transform infrared (ATR-FTIR) spectroscopy in conjunction with chemometric techniques, hence, providing a low-cost, fast and accurate diagnostic approach. Different chemometric algorithms were tested to classify the spectral data; genetic algorithm with linear discriminant analysis (GA-LDA) achieved the best diagnostic results with a sensitivity of 89.5% in an external test set. The GA-LDA model identified 24 spectral wavenumbers responsible for class separation; amongst these, the Amide II (1545 cm
-1) and proteins (1425 cm-1) were identified to be discriminant features. Clinical data showed
significant difference between groups in FIQ (p = 0.0001), anxiety (p = 0.001), pain (p = 0.0001) and quality of life (p = 0.0001). These results reinforce the potential of ATR-FTIR spectroscopy with multivariate analysis as a new tool to screen and detect patients with fibromyalgia in a fast, low-cost, non-destructive and minimally invasive fashion.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 11
1.1 HIPÓTESE... 14
1.2 OBJETIVO GERAL (PRIMÁRIO) ... 14
1.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS (SECUNDÁRIOS) ... 14
2 METODOLOGIA... 16
2.1 ALOCAÇÃO DOS SUJEITOS E PROCEDIMENTOS... 16
2.2 AVALIAÇÃO CLÍNICA... 17
2.3 MÉTODO DE COLETA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRA BIOLÓGICA. 18 2.4 RISCOS... 19
2.5 BENEFÍCIOS... 20
2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA - METODOLOGIA DE ANÁLISE DE DADOS... 20
2 RESULTADOS... 22 3 DISCUSSÃO... 26 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS... 29 REFERÊNCIAS... 30 APÊNDICE A... 34 APÊNDICE B... 35 ANEXOS... 51
1 INTRODUÇÃO
Dentre as diversas síndromes dolorosas crônicas, apresentamos a fibromialgia (FM) como destaque por ter uma etiopatogenia desconhecida e terapêutica contra a dor limitada durante o processo de reabilitação 1. A FM apresenta-se como uma síndrome multifatorial presente em 0,66 a 4,4% na população em geral, sendo mais comum em mulheres (cerca de 90%) que em homens, especialmente na faixa etária entre 35 e 60 anos 1. Sua sintomatologia destaca-se pelo rico espectro, permeando distúrbios cognitivo-comportamental e físico 2.
A FM é descrita como uma síndrome de origem desconhecida caracterizada por dor crônica generalizada, aumento da sensibilidade à palpação, presença de ansiedade e depressão, perturbações do sono, rigidez e fadiga 3. A melhor terapêutica física preconizada por consensos e diretrizes é o exercício físico aeróbico de média intensidade que deve ser praticado por tempo indeterminado 4. Coadjuvante ao exercício, apresenta-se como alternativas o uso de correntes
elétricas, fototerapia laser e terapias alternativas como o Tai Chi 5,6. É sabido, portanto, que a
FM apresenta uma sensibilização central da dor resultando em amplificação dos sinais álgicos
7. Seguere-se com isso que o exercício físico seja a principal terapêutica sugerida, por modular
fenômenos centrais que diminuem a hiperagesia7.
Na década de 1990, o Colégio Americano de Reumatologia (ACR) (1990) descreveu critérios para o diagnóstico da FM, sendo necessários 3 meses ou mais de dor generalizada e dor à palpação em pelo menos 11 dos 18 pontos estabelecidos. No ano de 2010, o ACR estabeleceu novos critérios, sendo uma abordagem alternativa para o diagnóstico clínico da FM, incluindo uma escala de gravidade dos sintomas, uma escala de dor global e eliminando a avaliação dos tender points 1. Os dois protocolos ressaltam a importância do sintoma álgico, mas o segundo defende que a dor não é primordial para o diagnóstico da FM e complementa que o quadro somático, cognitivo, a fadiga, as alterações do sono e humor são também importantes para o diagnóstico correto1.
Mesmo com critérios de diagnóstico apresentados em consensos internacionais, o clínico ainda enfrenta bastante dificuldade no diagnóstico8. Isso se deve à ausência de marcadores laboratoriais, de imagem ou genéticos que possam ser patognomônicos ou que caracterizem o achado aos sintomas da FM 8,9. Além disso muitos dos sintomas da FM são bastante semelhantes com o de outras síndromes dolorosas ou de transtornos comportamentais, fazendo com que o seu diagnóstico seja dado através da exclusão de outras doenças em sua maioria reumáticas ou de distúrbios de comportamento4 8. Através da investigação dos
sintomas, muitas das evidências surgiram depois que investigadores perceberam que esta condição não era originada a partir de danos periféricos ou inflamação muscular, começando então a explorar o componente neurológico central 3 7. A acurácia do diagnóstico correto na FM ainda é tema de diversos estudos, sendo o paciente comumente diagnosticado tardiamente43.
Sabendo que ainda não são conhecidas as formas eficazes de reduzir a incidência desta doença, uma das principais medidas disponíveis para diminuição dessa morbimortalidade, consiste em programas de detecção precoce1 9. A detecção precoce da FM está baseada no conceito teórico de que quanto mais cedo em sua história natural a doença é detectada, mais eficaz é o tratamento.4 43 O objetivo da detecção precoce é identificar a doença em seu início e com isso encaminhar o paciente para a melhor terapêutica possível, evitando referenciá-lo de forma errônea, prescrever medicamentos indevidos e identificar os fatores de risco que possam exacerbar o quadro clínico 43 44.
No Brasil, o método de referência para detecção da FM são os critérios do ACR/2010 e se baseiam em critérios puramente clínicos14. Existe uma necessidade urgente de melhorar os
métodos de detecção precoce atuais, particularmente em questões relacionadas com a rapidez e confiabilidade no resultado44. A rápida detecção da doença é fundamental para garantir uma
intervenção correta e eficaz ao tratamento do paciente4. Em termos mais objetivos, a detecção rápida economiza tempo, esforço e custo. Isto pode parecer uma meta idealista. No entanto, considerando os rápidos avanços na ciência e na tecnologia, métodos de detecção como a bioespectroscopia e técnicas de classificação multivariadas, podem tornarem-se os métodos convencionais em breve39 40 41 42.
De acordo com estudos feitos pelo (ACR) para diagnóstico e classificação da FM, grupos de pacientes com FM, apresentaram boa diferenciação em relação ao grupo controle de pacientes com sintomas e quadro de dores reumatológicas, semelhantes ao quadro sintomático da FM, obtendo acurácia de 84,9% e sensibilidade de 88,4% na determinação dos grupos, tendo em vista pacientes avaliados com combinações de dores generalizadas em 11 dos 18 pontos de dores3 8. Mesmo assim, o diagnóstico da FM tem uma média de 2,3 anos e 3,7 visitas ao médico43.
A espectroscopia tem sido cada vez mais reconhecida como uma poderosa tecnologia na área biomédica11 e na microbiologia12. Criado pelos físicos e químicos, tradicionalmente tem sido utilizada para a identificação de entidades moleculares presentes em substâncias desconhecidas. Atualmente, é usada por diferentes laboratórios de pesquisa na determinação de quantidades relativas de componentes bioquímicos presentes em células13 e tecidos14, elevando a uma nova área: bioespectroscopia.
A bioespectroscopia compreende a faixa do infravermelho médio (MIR, mid infrared, = 2500 – 25000 nm) do espectro eletromagnético17. Esta faixa é absorvida por biomoléculas15
16. Particularmente dentro da faixa IR, entre 1800-900 cm-1, é considerada como a região de
impressão digital e bioquímica das moléculas pois apresenta modos vibracionais fundamentais das estruturas presentes em amostras biológicas17.
Uma lista contendo as principais vantagens da bioespectroscopia na detecção de biomoléculas, segundo alguns autores15 18, são listadas: (1) fornece informação relacionada à propriedade molecular do material analisado; (2) relativamente rápido e fácil para uso: a maioria das amostras podem ter seus espectros registrados em menos de 5 minutos; (3) exige uma pequena quantidade de amostras: nano-micrograma; (4) uma elevada relação sinal/ruído pode ser obtida; (5) pode ser aplicado em programas de rastreamento devido; (7) técnica não-destrutiva: a amostra é preservada de forma intacta durante a análise; (8) instrumentação de baixo custo e portabilidade39 40.
A aplicação da bioespectroscopia gera espectros que apresentam centenas de variáveis ou comprimentos de onda por cada amostra analisada41 42. Para cada comprimento de onda
existe uma intensidade de absorbância. Assim, muitas amostras biológicas resultam na produção de uma grande quantidade de dados a serem analisados e interpretados. A análise multivariada é a ferramenta utilizada para o tratamento destes dados espectrais obtidos pela bioespectroscopia19. Em outras palavras, a análise multivariada na biologia médica emprega métodos matemáticos para realização de análises exploratórias20 e/ou classificação/identificação de amostras21.
Como uma etapa anterior a análise de interesse, a maioria dos dados espectrais passa por uma etapa de pré-processamento no qual permitem que os espectros possam ser comparados22. Em alguns casos, algoritmos podem ser utilizados para extrair seletivamente informações espectrais que ajudam na redução do número de variáveis e previnem efeitos como sobreajustes23. A escolha do método de cada uma destas etapas é, na maioria das vezes, altamente dependente da natureza das amostras biológicas, da instrumentação utilizada e na finalidade da análise. Ainda que a bioespectroscopia tenha sido largamente utilizada em diversos campos de atuação com finalidades analíticas, permanece como uma ferramenta recente em estudos em fluidos biológicos (plasma sanguíneo) na FM, pois seu desenvolvimento tem sido lento e dependente da dedicação de um número de cientistas relativamente baixo quando comparado com outras aplicações23 39.
Estudos com FM analisando fluidos biológicos é ainda uma área de pesquisa não explorada. Este mesmo reflexo é percebido no estado do Rio Grande do Norte, que apesar de
termos um avanço na espectroscopia analítica em diversos campos (petróleo, gás natural, materiais, águas, farmacêutica, alimentos, outros), existe uma escassez de pesquisas unindo a bioespectroscopia e técnicas de análise multivariada na área da saúde.
O presente estudo objetiva realizar a detecção da FM através de biomarcadores utilizando a bioespectroscopia juntamente com técnicas de classificação multivariada. Objetivamos também avaliar dor, ansiedade, impacto da FM e qualidade de vida.
1.1 HIPÓTESE
NULA:
Não haverá diferença significativa na utilização da bioespectroscopia para detecção da fibromialgia em mulheres no Rio Grande do Norte.
ALTERNATIVA:
Haverá diferença significativa na utilização da bioespectroscopia para detecção da fibromialgia em mulheres no Rio Grande do Norte.
1.2 OBJETIVO GERAL (PRIMÁRIO)
Verificar a possível detecção da FM através da utilização da bioespectroscopia juntamente com técnicas de classificação multivariada.
1.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS (SECUNDÁRIOS)
(1) registrar os espectros vibracionais de plasmas sanguíneos através da reflectância atenuada; (2) aplicar os algoritmos de classificação multivariada, tais como análise de discriminantes lineares (LDA, Linear Discriminant Analysis)24, análise por componentes principais (PCA, principal component analysis)25, PCA-LDA26, regressão por mínimos quadrados parciais acoplada a análise por discriminantes (PLS-DA, Partial Least Squares – Linear Discriminant Analysis)27, algoritmo das projeções sucessivas acoplada a análise por discriminante (SPA-LDA, Successive Projection Algorithm - Linear Discriminant Analysis)28 e algoritmo genético acoplado a análise por discriminante (GA-LDA, Genetic Algorithm - Linear Discriminant Analysis)
(3) cálcular os testes estatísticos a cada um dos modelos construídos agrupados por cepas, tais como, sensibilidade, especificidade, razão de probabilidade positiva e negativa, valor de predição positivo e negativo.
2 METODOLOGIA
Trata-se de um estudo analítico transversal realizado com 252 sujeitos do tipo caso controle no período de julho de 2018 a março de 2019 no Laboratório de Pesquisa Clínica e Epidemiológica (PESQCLIN-CCS-UFRN) localizado no Hospital Universitário Onofre Lopes. Foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Faculdade de Ciências da Saúde do Trairi (CEP/FACISA) sob o número do parecer 2.631.168 CAAE 79621217.2.3001.5292. Os sujeitos foram divididos em dois grupos: grupo FM e grupo controle.
Para todos os sujeitos, foi aplicado questionário sociodemográfico e realizado coleta de dados clínicos de impacto da FM, dor, qualidade de vida e ansiedade.
2.1 ALOCAÇÃO DOS SUJEITOS E PROCEDIMENTOS
Utilizando uma incidência de FM na população brasileira de 6,6%29 um nível de
significância de 0,5 e um poder do estudo de 0,8 foi calculado uma amostra de 252 pacientes, sendo 126 para o grupo FM e 126 para o grupo controle. Foram recrutadas mulheres na faixa etária entre 18 a 80 anos com diagnóstico clínico de FM de acordo com os critérios do ACR/2010, residentes na cidade de Natal, Rio Grande do Norte. A coleta de dados e o armazenamento das alíquotas foi realizada no Laboratório de Pesquisa Clínica e Epidemiológica (PESQCLIN-CCS-UFRN).
Os participantes da pesquisa foram recrutados mediante divulgação em mídia eletrônica (facebook, instagram) e no portal eletrônico (http://www.pntv.com.br) (https://m.facebook.com/story.php?story_fbid=241832116738355&id=1619887231665610)P ara a participação na pesquisa os participantes preencheram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) e o estudo foi aprovado pelo CEP UFRN-HUOL com número 2.631.168.
Os participantes do grupo FM (GFM) foram recrutados mediante convite formal realizado pelos pesquisadores ou que atenderam as chamadas das mídias eletrônicas. O grupo controle (GC) foi composto por voluntários saudáveis pareado pela idade com o (GFM), recrutados na UFRN e através das mídias eletrônicas e posterior convite formal realizado pelo responsável do estudo. A coleta do GC realizou-se fora do turno de estudo ou trabalho dos voluntários para evitar prejuízos em suas atividades.
Foram formados 2 grupos; GFM, formado por mulheres com FM; e GC, formado por mulheres sem a FM. Os critérios de inclusão no GFM foram: 1) pacientes que cumpriram os critérios para FM do ACR/2010; 2) idade entre 18 a 80 anos de idade; 3) não apresentarem
condições de saúde restritiva que impeçam a realização dos exames clinico e dos questionários; 4) pacientes que não foram submetidos a programas de fisioterapia ou reabilitação durante os três meses anteriores 5). Foram excluídos pacientes com distúrbios psiquiátricos e comportamentais graves o suficiente para limitar a participação nos exames, álcool/abuso de substâncias ilícitas, apresentarem doenças reumáticas e/ou autoimunes, incluindo síndrome de fadiga crônica, artrite reumatóide, gota e lúpus, gravidez, lactação, não conseguirem responder o questionário e recusarem a coleta de sangue. Todos os pacientes passaram por médico clínico prévio para diagnóstico da FM.
Os critérios de inclusão no GC serão: 1) pessoas saudáveis que não apresentam FM; 2) idade entre 18 a 80 anos de idade; 3) não apresentarem condições de saúde restritiva que impeçam a realização do exame físico e dos questionários; 4) pacientes que não foram submetidos a programas de fisioterapia ou reabilitação durante os três meses anteriores 5)Foram excluídos pacientes com distúrbios psiquiátricos e comportamentais graves o suficiente para limitar a participação nos exames, álcool/abuso de substâncias ilícitas, gravidez, lactação não conseguirem responder o questionário e recusarem a coleta de sangue.
2.2 AVALIAÇÃO CLÍNICA
A aplicação do questionário foi realizada de forma individual. O avaliador foi solicitado a ajudar o participante em caso de dúvidas. Inicialmente foi aplicado um questionário sociodemográfico (Apêndice A). Os questionários e a coleta de sangue foram realizados em um único dia.
Questionário de Impacto da FM
A capacidade funcional foi avaliada pela versão brasileira do Questionário de Impacto da FM (FIQ), validada por Marques et al. 30. Este é um questionário autoaplicável que compreende aspectos funcionais do indivíduo ao longo das últimas semanas, composto por três questões do tipo escala Likert (escala de respostas gradativas) e sete perguntas classificadas numa escala visual analógica (EVA). Todas as escalas variam de 0 a 10, onde uma pontuação alta indica elevado impacto negativo e uma maior severidade dos sintomas. O score total do FIQ é graduado de 0 a 100 pontos, sendo as maiores pontuações relacionadas ao alto impacto da doença na funcionalidade do indivíduo, consequentemente piorando sua qualidade de vida (Anexo 1).
Medical Outcomes Study 36 (SF 36)
O estado geral de saúde foi medido pelo Medical Outcomes Study 36 (SF 36), versão brasileira, composto por 36 itens que se dividem em oito tópicos: capacidade funcional (10 itens), aspectos físicos (4 itens), dor (2 itens), estado geral de saúde (5 itens), vitalidade (4 itens), aspectos sociais (2 itens), aspectos emocionais (3 itens), saúde mental (5 itens) e mais uma questão de avaliação comparativa entre as condições de saúde atual e a de um ano atrás. O resultado varia de 0 a 100, sendo 0 o pior estado geral de saúde e 100 o melhor36 (Anexo 3).
Escala Hamilton de Ansiedade
O quadro de ansiedade foi mensurado com a utilização da Escala de Ansiedade de Hamilton (HAS) 32. A escala possui 14 itens, que pode ser avaliado de 0 a 4, com uma pontuação
total de 56. Quanto maior a pontuação direcionada pelo indivíduo, maior será o grau de ansiedade (Anexo 5).
Avaliação da sensibilidade dolorosa e fadiga
Foi utilizada a Escala Visual Analógica (EVA) para a avaliação da dor e grau de fadiga. A EVA consiste em uma linha demarcadas em 100 milímetros onde a extremidade 0 representa “sem dor” e a 10 “pior dor possível”. Os indivíduos foram instruídos a marcar, na linha, o que melhor refletisse a intensidade da sua dor naquele momento.
2.3 MÉTODO DE COLETA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRA BIOLÓGICA
Foram coletados 10ml de sangue periférico do membro superior não dominante em tubo Vacutainer® BD com EDTA. O sangue foi em seguida processado e congelado a -15°C, para ser analisado no instrumento espectroscópico de infravermelho. A coleta e o armazenamento das amostras, até sua leitura, por questões analítico-operacionais, foi realizada no Laboratório de Pesquisa Clínica e Epidemiológica - PESQCLIN localizado no HUOL. Comprometendo-se os pesquisadores envolvidos, ao adequado armazenamento, manuseio e descarte das mesmas no final do estudo, não utilizando as amostras para nenhuma outra finalidade, salvo aquela explicitada no TCLE e na metodologia do projeto, fatos esses em consonância com a definições estabelecidas na Resolução CNS nº 441/2011. Durante o procedimento de coleta de sangue, as
participantes foram orientadas a realizar dieta livre, terem uma noite tranquila de sono e comparecer ao local de coleta no horário combinado.
Bioespectroscopia
Os espectros vibracionais foram adquiridos usando um instrumento ATR/FT-IR das amostras de plasmas sanguíneos foram registrados a partir do espectrômetro FTIR (Bruker Vertex 70 (Bruker Optics Ltd. Coventry, UK) equipado com acessório Helios ATR contendo um cristal de diamante, no ângulo de incidência de 45° de feixe de infravermelho. O instrumento foi configurado para realizar um total de 32 scans com resolução de 4 cm-1 para cada amostra e branco. Para cada amostra de plasma, três espectros foram coletados. Foi investigada a melhor resolução espectral, número de varreduras, posicionamento das amostras observando a maior relação sinal/ruído nos espectros de infravermelho.
Análise Multivariada
A importação dos dados espectrais e construção dos modelos de identificação/classificação multivariada foram realizados no ambiente MATLAB R2014b (The Math-Works, Natick, MA, USA) usando o PLS-Toolbox versão 7.8).
2.4 RISCOS
O risco para o participante foi o desconforto durante a coleta de sangue podendo causar hematomas, dor, infecção e constrangimento33. Caso algum destes eventos ocorra o técnico responsável pela coleta irá proceder ações para minimizar o impacto para o paciente, de acordo com o protocolo operacionais do Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL). Poderá ser colocado compressa de gelo no local de coleta de sangue para minimizar eventos a posterior como eczema e dor. Foi realizada a padronização de toda a conduta de coleta de sangue e os funcionários envolvidos foram todos profissionais de saúde com experiência e habilitados para tal procedimento. Esses fatos contribuem para que a meta de redução de riscos e complicações seja alcançada e, desse modo, o serviço seja reconhecido como seguro e confiável de acordo com as Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica e Medicina Laboratorial para Coleta de Sangue Venoso de 201033.
Se, em algum caso, a coleta não for possível após a segunda tentativa, a paciente foi excluída do estudo. Há também o risco de constrangimento durante a aplicação dos questionários, porém, foi minimizado pois foi aplicado de forma individual, em ambiente
controlado e por avaliador treinado. Todos os questionários que foram utilização são amplamente aplicados em pacientes com dor crônica e distúrbios de humor como depressão e ansiedade. A qualquer momento o participante pode pedir para interromper a avaliação em qualquer de suas etapas.
2.5 BENEFÍCIOS
O presente projeto não touxe benefícios diretos ao participante e isto encontra-se bem enfatizado no TCLE. Porém este projeto alcançou as seguintes contribuições científicas/tecnológicas:
(1) Desenvolvimento de uma nova metodologia de diagnóstico rápido, não destrutivo,
estatisticamente confiável e baixo custo. O mapeamento bioespectroscópico de plasmas sanguíneos bem como a sua interpretação multivariada será responsável para num pequeno intervalo de tempo (inferior a 5 minutos);
(2) Com a possibilidade de registro espectral utilizando instrumentos portáteis, as amostras
poderão ser analisadas no próprio local de coleta, eliminando a etapa de transporte do material para um laboratório de análises clínicas. Nesta perspectiva, erros e contaminações de amostras serão minimizados, assim como a maior frequência analítica do método proposto;
(3) O mapeamento bioespectroscópico dos plasmas juntamente com informações fornecidas
pelas técnicas convencionais, possibilitarão o desenvolvimento de um banco de dados, que podem ser controlados por um software, no qual em uma única plataforma, podemos encontrar as impressões digitais bem como outras características biológicas. O resultado desta perspectiva é a consolidação de uma nova tecnologia para detectar a FM.
(4) Uma vez observado características biológicas típicas da FM, poderemos compreender
melhor os mecanismos de sua etiologia bem como favorecer o diagnóstico correto, rápido e de grande acurácia.
A metodologia de análise de dados deste projeto foi realizada em 3 estágios: i) aplicação de algoritmos multivariados para extração da informação biológica existente nos espectros dos plasmas sanguíneos e construção de modelos de classificação multivariados. Estes algoritmos utilizam funções de análise discriminante linear juntamente com algoritmos de seleção de variáveis espectrais. ii) cálculo da sensibilidade e especificidade dos modelos de classificação multivariados; iii) validação analítica do modelo selecionado com introdução de novos espectros de plasmas.
Para as variáveis clínicas, as análises dos dados de cada variável foram realizadas com o software SPSS (V.19.0, Chicago, EUA) e Graph Pad Prism 5. As variáveis quantitativas foram expressas em média e desvio padrão (DP) e os dados sociodemográficos foram expressos em porcentagem. Foi realizado o teste de Kolmogorov Smirnov para avaliação da normalidade dos dados. Para comparação entre os grupos foi realizado testes t student não pareado.
A análise intergrupo das características demográficas obtidas no instrumento de coleta foram analisadas usando o teste de qui-quadrado para variáveis categóricas. Foi considerado significantemente estatísticas com valo de p < 0,05.
3 RESULTADOS
As características sociodemográficas e clínicas das amostras estão descritas na tabela 1. Os espectros brutos foram pré-processados trincando a região da biofingerprint (1800–900 cm-1), seguida pela suavização de Savitzky-Golay (SG), linha de base ponderada automática dos mínimos quadrados correção e normalização do vetor (Figura 1). Essas técnicas removem interferências físicas dos espectros que não estão associados às informações do analito, destacando o sinal de interesse. A suavização SG remove o ruído aleatório, a correção da linha de base minimiza os efeitos das distorções da linha de base comuns em materiais biológicos6 e a normalização do vetor remove variações sistemáticas associadas à espessura da amostra ou a diferentes pressões aplicadas no módulo ATR para medir as amostras10 20. Os espectros
pré-processados resultantes foram posteriormente analisados por várias técnicas quimiométricas para obter melhores resultados: análise de componentes principais com análise discriminante linear (PCA-LDA), análise discriminante quadrática (PCA-QDA) ou máquinas de vetores de suporte (PCA-SVM); algoritmo de projeções sucessivas com análise discriminante linear LDA), análise discriminante quadrática QDA) ou máquinas de vetores de suporte (SPA-SVM); e algoritmo genético com análise discriminante linear (GA-LDA), análise discriminante quadrática (GA-QDA) ou máquina de vetores de suporte (GA-SVM).
Antes da construção do modelo, 70% das amostras foram atribuídas ao conjunto de treinamento, 15% ao conjunto de validação e 15% ao conjunto de testes usando o algoritmo de amostragem uniforme Kennard-Stone21. O conjunto de treinamento foi utilizado para a construção do modelo, o conjunto de validação para otimização interna do modelo e o conjunto de testes para avaliação final do modelo, onde foram calculados valores de mérito (precisão, sensibilidade e especificidade) refletindo o desempenho do modelo em amostras externas. A precisão representa o número total de amostras classificadas corretamente, considerando negativos verdadeiros e falsos; a sensibilidade representa a proporção de positivos que são classificados corretamente; e a especificidade representa a proporção de negativos classificados corretamente22.
A tabela 2 ilustra o desempenho do modelo dos algoritmos testados. Os melhores resultados foram obtidos pelo GA-LDA, com acurácia de 84,2%, sensibilidade de 89,5% e especificidade de 79,0%. Essas métricas demonstram uma taxa de classificação satisfatória para
distinguir os dois grupos (caso vs. controle). O potencial do modelo para a separação de classes no conjunto de testes pode ser observado na Figura 2a, onde a dispersão dos dados em termos da pontuação da função discriminante é mostrada.
Os números de onda selecionados pelo GA-LDA são mostrados na Figura 2b. Esses números de onda responsáveis pela separação de classes foram: 943; 959; 974; 1078; 1113; 1121; 1134; 1140; 1142; 1148; 1153; 1159; 1182; 1192; 1319; 1385; 1398; 1423; 1477; 1545; 1622; 1636; 1668; e 1798 cm-1. Sua tentativa de atribuição de biomarcadores23 é mostrada na Tabela 3.
Figura 1: Espectros brutos e pré-processados na região da impressão digital. (a) Espectros
brutos; e (b) Espectros médios pré-processados para o caso (fibromialgia) e controles.
Figura 2: Resultados do GA-LDA para classificação de caso (fibromialgia) e controles. (a)
Gráfico da função discriminante para as amostras no teste; e (b) Números de onda selecionados de GA-LDA.
a. b.
Tabela 1: Características sociodemográficas e clínicas.
Outcomes Fibromyalgia Control p value
(mean ± SD) (mean ± SD) Age 48.02 ± 10.03 49.84 ± 11.42 0.471 FIQ 75.03 ± 13.97 27.2 ± 21.35 0.0001 Anxiety (HAS) 38.05 ± 9.26 18.18 ± 11.93 0.001 VAS 5.74 ± 2.41 1.77 ± 2.25 0.0001 SF-36 total 53.39 ± 20.51 113.6 ± 44.58 0.0001 SF-36 Physical 23.58 ± 9.17 58.69 ± 20.94 0.0001 SF-36 Mental 29.79 ± 12.39 59.57 ± 19.40 0.0001 Income* (%) 0.0003 1 Minimum Wage 6.7 29.4 2 to 3 Minimum Wage 53.3 41.2
4 Minimum Wage or more 33.3 11.8
Unreported 6.7 17.6 Marital status (%) 0.03 Married 60 41.2 Never Married 26.7 41.2 Widowed 6.7 5.9 Divorced 6.7 11.8 Not respond Education (%) 0.802 Elementary (incomplete) 0 5.9 Elementary 26.7 23.5 Secondary 26.7 41.2 University 46.7 29.4
DP = Desvio Padrão; FIQ = Questionário de Impacto da Fibromialgia; EVA = Escala Visual Analógica; EAH = Escala de Ansiedade de Hamilton. SF-36 = Formulário Curto de Pesquisa de Saúde 36. Os dados numéricos foram calculados usando o teste t não pareado. Os dados categóricos foram calculados com o teste Qui-quadrado. * Salário Mínimo Nacional Brasileiro, $ 252,14 por mês.
Tabela 2: Figuras de mérito para diferentes algoritmos aplicados para classificar caso
(fibromialgia) e controles no conjunto de teste.
Algoritmos Acurácia (%) Sensibilidade (%) Especificidade (%)
PCA-LDA 60.5 68.4 52.6
PCA-QDA 65.8 73.7 57.9
PCA-SVM 68.4 78.9 57.9
SPA-LDA 63.1 57.9 68.4
SPA-SVM 70.1 73.7 68.4
GA-LDA 84.2 89.5 79.0
GA-QDA 60.5 47.4 73.7
GA-SVM 57.9 57.9 57.9
O melhor algoritmo (GA-LDA) está destacado em negrito.
Tabela 3: Atribuição provisória dos marcadores espectrais selecionados por GA-LDA.
Wavenumber (cm-1) Tentative assignment
943 Phosphodiester region
959 Symmetric stretching vibration of ν1(PO43-)
974 OCH3 stretching in polysaccharides
1078 Phosphate I in RNA
1113 P-O-C symmetric stretching
1121 Symmetric phosphodiester stretching band RNA
1134 C-OH stretching band in oligosaccharide
1140 C-O stretching in phosphate and oligosaccharides
1142 C-O stretching in phosphate and oligosaccharides
1148 C-O stretching in carbohydrates
1153 Stretching vibrations of hydrogen-bonding
C-OH groups
1159 ν(C-O) of proteins and carbohydrates
1182 Amide III
1192 Collagen
1319 Amide III
1385 δ(CH3)
1398 CH3 symmetric deformation
1423 νs(COO2) in polysaccharides or pectin
1545 Amide II in proteins
1622 Peak of nucleic acids due to the base carbonyl
stretching and ring breathing mode
1636 β-sheet structure of Amide I
1668 Amide I (anti-parallel β-sheet)
1798 ν(C=C) in lipids
Abreviaturas, ν: vibração de alongamento; δ: vibração de flexão.
4. DISCUSSÃO
De acordo com estudos realizados pelo American College of Rheumatology para diagnóstico e classificação da fibromialgia2, grupos de pacientes com fibromialgia apresentam uma boa diferenciação de uma coorte controle contendo pacientes com dores reumatológicas (mas não fibromialgia) com precisão de 84,9% e sensibilidade de 88,4 % usando o diagnóstico tradicional através da combinação de análise de dores generalizadas em 11 a 18 locais de dor. Essas métricas de referência são muito semelhantes à nossa abordagem, usando análises espectroquímicas acopladas a técnicas quimiométricas, onde alcançamos uma precisão de 84,2% e uma sensibilidade de 89,5%. Vinte e quatro números de onda espectrais foram selecionados pelo GA-LDA como responsáveis pela separação caso-controle (Tabela 3). Entre eles estão as absorções de carboidratos, ácidos nucléicos, proteínas e lipídios9, que são frequentemente regiões de alterações para o diagnóstico da doença.
Como as amostras foram medidas no estado líquido, a água é uma interferência no sinal espectral, comprimindo e mascarando a absorvância de algumas bandas e alterando o perfil espectral da região da impressão digital em comparação com as amostras secas24 25. A água
afeta principalmente o espectro de infravermelho fora da região das impressões digitais, com bandas fortes de 3300 a 3400 cm-1 (alongamento de OH ligado a hidrogênio) e 3600 a 3650 cm-1 (alongamento de OH livre) 10, que foram regiões removidas dos espectros antes análise; no entanto, a água possui uma absorvância na região da impressão digital em 1646 cm-1, que aumenta o sinal de proteínas Amide I24, ampliando a banda e transformando a banda Amide II em um pequeno braço no lado direito da Amide I banda de absorção. Além disso, absorvâncias abaixo de 1000 cm-1 tendem a aumentar bastante no ambiente líquido24, comprimindo as faixas entre ~ 1200–1500 cm-1.
A realização de experimentos com amostras líquidas traz alguns benefícios, uma vez que a medição espectral é mais rápida e a configuração experimental é mais simples que a análise de amostras secas25, o que proporciona uma maior capacidade de produção. No entanto, as amostras líquidas são afetadas pela interferência da água, o que compromete a sensibilidade e o limite de detecção da técnica. Além disso, o cristal ATR deve ser limpo com mais rigor entre as medições, a fim de remover biomoléculas, particularmente proteínas absorvidas, na superfície do cristal25. No geral, a medição de amostras líquidas aumenta a frequência analítica da técnica, mas também traz riscos elevados, especialmente associados à interferência na água, portanto, é preciso ter cuidado ao usar biópsias líquidas para medições espectroscópicas. Aqui, a interferência na água parece não ser um problema que afeta a discriminação das amostras, uma vez que foi obtido um desempenho discriminante relativamente alto para distinguir as amostras com base nos perfis espectrais; mas o tipo de amostra, entre outros fatores, como tipo de substrato, volume da amostra ou a forma como a amostra é depositada26, deve ser investigado
durante a fase pré-analítica para outras aplicações, uma vez que a água entre outras interferências pode afetar gravemente regiões espectrais importantes. Portanto, o método de amostragem (amostras líquidas ou secas) depende da aplicação de interesse, da frequência analítica desejada e do grau de discriminação da amostra em questão. Obter resultados satisfatórios é um equilíbrio empírico desses fatores.
Hackshaw et al.16 usaram a espectroscopia de FT-IR para diferenciar 14 pacientes com fibromialgia daqueles com osteoartrite (n = 12) e artrite reumatóide (n = 15) com base em um teste de mancha de sangue. As amostras foram pré-tratadas com a remoção de proteínas com peso molecular acima de 10 k por ultrafiltração, portanto, a análise foi focada em metabólitos de baixo peso. Os dados espectrais foram analisados de forma multivariada usando o algoritmo SIMCA (Soft Independent Modeling analogia), onde foi obtida uma separação perfeita com zero erros de classificação (precisão de 100%); por outro lado, usando uma abordagem metabolômica baseada em cromatografia líquida de alta performance / espectrometria de massa em tandem (UHPLC / MS / MS) e cromatografia em fase gasosa / espectrometria de massa (GC / MS), a precisão foi substancialmente inferior a 75%. Hackshaw et al.17 também fibromialgia com perfil metabólico (n = 50) e outras doenças reumatológicas (artrite reumatoide (n = 29), osteoartrite (n = 19) e lúpus eritematoso sistêmico (n = 23) usando espectroscopia FT-IR e Raman com base em amostras de sangue, onde os diferentes distúrbios foram classificados com 100% de precisão usando o algoritmo SIMCA. Além das alterações metabolômicas16 17, Raffaeli et al.27 identificaram um receptor opióide Mu, expresso na superfície dos linfócitos B,
como marcador biológico (denominado Mu-Lympho-Maker) para um diagnóstico objetivo de dor crônica da fibromialgia.
Os critérios atualizados para melhorar a detecção da fibromialgia3 propõem melhorias clínicas para a triagem de pacientes sem a necessidade de testes físicos extensos, como o teste dos locais da dor, e focando em critérios diagnósticos alternativos com base na gravidade dos sintomas; no entanto, não substitui nem supera as métricas estatísticas encontradas no estudo discutido anteriormente3. Em estudos envolvendo diferentes critérios diagnósticos2 3, é possível observar melhorias nos critérios a partir de 2010, agregando diferentes condições aos pacientes, como disfunção cognitiva, depressão e ansiedade24. A inclusão de critérios sintomáticos mais amplos pode melhorar a precisão, a sensibilidade e a especificidade do diagnóstico da fibromialgia, mas ainda é um teste demorado e um tanto subjetivo. O ATR-FTIR acoplado à quimiometria tem o potencial de substituir ou auxiliar na triagem da fibromialgia com base em uma pequena alíquota de plasma sanguíneo, acelerando e adicionando um grau extra de objetividade ao diagnóstico da fibromialgia.
A fibromialgia continua sendo um diagnóstico muito complexo e ilusório, com comprometimento negativo da carga econômica e financeira, que inclui exames laboratoriais e de imagem, visitas frequentes a especialistas e diferentes tratamentos1. Gendelman et al.1 sugerem que características específicas de pacientes, incluindo idade e comorbidades, podem inferir o tempo para o diagnóstico. Além disso, os fatores relacionados às habilidades dos médicos (má comunicação, idade e conhecimento dos critérios de diagnóstico do ACR) contribuem para a imprecisão do diagnóstico1 3. A falta de um diagnóstico definitivo da fibromialgia afeta potencialmente a funcionalidade, as atividades diárias e a produtividade do trabalho5,6. Embora o padrão do diagnóstico clínico da fibromialgia continue melhorando em termos de precisão e sensibilidade, há um reconhecimento crescente de erros de diagnóstico e sobdiagnóstico1. A análise espectroquímica com técnicas de classificação multivariada pode fornecer uma opção adicional para o diagnóstico clínico da fibromialgia.
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O presente estudo fornece um teste sanguíneo para a FM, onde a combinação de métodos quimiométricos e espectroquímicos contribui para o diagnóstico complementar da FM, ainda não descartando os estudos clínicos e os critérios da ACR.
Esforços para melhorar o diagnóstico precoce da FM são cruciais para reduzir déficits funcionais, tratamentos dispendiosos e fornecer melhores protocolos de reabilitação. Esses resultados reforçam o potencial da espectroscopia ATR-FTIR com análise multivariada como uma nova ferramenta para rastrear e detectar pacientes com FM de maneira rápida, de baixo custo, não destrutiva e minimamente invasiva.
Estudos adicionais para implementação da espectroscopia ATR-FTIR e comparando a FM com outras doenças reumáticas crônicas, como osteoartrite, artrite reumatóide e síndrome da fadiga crônica, são necessários para um diagnóstico potencial.
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APÊNDICE – A
INSTRUMENTO DE COLETA DE DADOS UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SÁUDE DO TRAIRI Projeto: Fibromialgia e Bioespectroscopia
DADOS PESSOAIS
NOME: Sexo: M ( ) F ( ) Nº Prontuário
Profissão:
Data de nascimento: Peso:
Idade: Altura:
Telefone: Tabagista: Sim ( ) Não ( )
Endereço: Data da Avaliação:
DADOS SOCIODEMOGRÁFICOS
Estado Civil: ( )Solteira ( )Casada ( )Viúva ( )Divorciada ( ) Não quis responder
Você se considera: ( )Branca ( )Amarela ( )Parda (mulata, mestiça, cabocla, etc.) ( )Indígena
( )Negra ( )Não sabe ( )Recusa a responder
Renda Familiar: ( )Até 1 salários mínimos (SM) ( )2 a 3 SM ( )≥ 4 SM ( )Não sabe ( )Não respondeu
Anos de estudo completos: ( ) Analfabeta ( ) 1 grau ( ) 2 grau ( ) 3 grau
DADOS CLÍNICOS
Faz uso de algum medicamento atualmente? ( ) Não ( ) Sim.
Qual? ______________________________________________________________________ Número de gestações: ( ) nulípara ( ) 1 gestação ( ) 2 gestações ( ) 3 gestações ( ) mais de 4 gestações
Histórico familiar de fibromialgia ( ) Sim ( ) Não Idade do diagnóstico de Fibromialgia: _________
Bioespectroscopia
APÊNDICE – B
Spectrochemical analysis in blood plasma combined with subsequent chemometrics for fibromyalgia detection
João Octávio Sales Passos1, Marcelo Victor dos Santos Alves2, Camilo L. M. Morais3, Francis L. Martin4, Antônio Felipe Cavalcante1, Telma Maria Araújo Moura Lemos5, Shayanne Moura5, Daniel L. D. Freitas2, João Vitor Medeiros Mariz2, Jean Lucas Carvalho2, Kássio M.
G. Lima2, Rodrigo Pegado*1.
Affiliations:
1Postgraduation Program in Rehabilitation Sciences, Federal University of Rio Grande do
Norte, Santa Cruz 59200-000, Brazil
2Institute of Chemistry, Biological Chemistry and Chemometrics, Federal University of Rio
Grande do Norte, Natal 59072-970, Brazil
3School of Pharmacy and Biomedical Sciences, University of Central Lancashire, Preston
PR1 2HE, UK
4Biocel Ltd, Hull HU10 7TS, UK
5Department of Clinical and Toxicological Analyses, Federal University of Rio Grande do
Norte, Natal, Brazil
*Corresponding author: Rodrigo Pegado, PhD. Faculty of Health Science of Trairí, Federal University of Rio Grande do Norte, Trairí St. 59200-000, Santa Cruz-RN, Brazil, Tel.: +55 (84) 99915-004. E-mail address: rodrigopegado@gmail.com
Abstract
Fibromyalgia is a rheumatologic condition characterized by multiple and chronic body pain, and other typical symptoms such as intense fatigue, anxiety and depression. It is a very complex disease where treatment is often made by non-medicated alternatives in order to alleviate symptoms and improve the patient’s quality of life. Herein, we propose a method to detect patients with fibromyalgia (n=252, 126 controls and 126 patients with fibromyalgia) through the analysis of their blood plasma using attenuated total reflection Fourier-transform infrared (ATR-FTIR) spectroscopy in conjunction with chemometric techniques, hence, providing a low-cost, fast and accurate diagnostic approach. Different chemometric algorithms were tested to classify the spectral data; genetic algorithm with linear discriminant analysis (GA-LDA) achieved the best diagnostic results with a sensitivity of 89.5% in an external test set. The GA-LDA model identified 24 spectral wavenumbers responsible for class separation; amongst these, the Amide II (1545 cm-1) and proteins (1425 cm-1) were identified to be
discriminant features. These results reinforce the potential of ATR-FTIR spectroscopy with multivariate analysis as a new tool to screen and detect patients with fibromyalgia in a fast, low-cost, non-destructive and minimally invasive fashion.
Keywords: Infrared spectroscopy, chemometrics, algorithm, chronic pain, diagnosis.
Introduction
Fibromyalgia is a rheumatologic disorder characterized by non-articular diffuse muscle aches associated to allodynia and hyperalgesia1. In addition to the chronic pain, other conditions such as depression, anxiety and alterations of sleep and memory are also symptoms often found in patients with fibromyalgia2. These numerous symptoms of functional and emotional origin generally cause a decline in the functional, labour and social ability of patients making the treatment harder and challenging2. Fibromyalgia is a common disorder found in the daily clinical routine of rheumatologists and rehabilitation clinics, having an estimated incidence in 1.1 to 6.4% of the general population1,3. The complexity of fibromyalgia starts on its diagnosis, where the medical doctor needs to have a correct clinical interpretation of the symptoms excluding other rheumatics and neurologic diseases2. Gendelman et al.2 evaluated fibromyalgia
diagnosis time in the primary care and observed that the disease continues having an elusive and complex diagnosis, taking even years to be properly elucidated. Patients take an average of 2.3 years and 3.7 visits to a clinical doctor in order to have a definitive diagnostic of fibromyalgia, which causes extra suffering to the patients and their families, additional medial costs and even resulting in incorrect treatments during this period3.
The diagnosis of fibromyalgia can be established by the classification criterion of the American College of Rheumatology (ACR) of 1990 (with the evaluation of tender points) or without the test of tender points by using a modified diagnostic criterion from ACR of 2010 or 20114. In 2010, the ACR published a revised criterion set that does not count the tender points5. These criteria include 19 pain sites and 41 somatic symptoms6. In 2011, these criteria were modified by removing the 41 somatic symptoms observed by the clinical doctor and replacing them by 6 self-reported symptoms (impaired sleep, fatigue, poor cognition, headaches, depression, and abdominal pain)6. In Japan, these criteria presented a sensitivity and specificity to diagnostic fibromyalgia of 64% and 96%, respectively6; while in Germany, these criteria presented a sensitivity and specificity of 76% and 82%, respectively7. By comparing the different definitions of 1990 and 2010/2011, fibromyalgia is diagnosed with 86% sensitivity and 90% specificity8.
These studies report a wide variation of sensitivity, specificity, diagnostic patterns and pain disturbs, where the only validated method to diagnose fibromyalgia is clinical examination without any additional apparatus to aid correct diagnostic6. Therefore, new techniques to aid
fibromyalgia screening in a fast, accurate and less-invasive fashion are needed. Novel spectrochemical analytical approaches play an important role as a new innovative technique towards clinical diagnostic9,10. These methods feature the use of vibrational spectroscopy techniques to analyse biological materials. Most molecules formed by covalent bonds absorb infrared (IR) radiation; amongst these, there are organic compounds containing important features of biological interest. Attenuated total reflection Fourier-transform IR (ATR-FTIR) spectroscopy enables quick and non-destructive analysis of tissue, cells or biofluids9,11; where, for example, a very small volume (i.e., microliters) of the latter can be used for measurement9. FTIR spectroscopy has been used to diagnose several types of cancer12, viruses13, neurodegenerative diseases14, among other conditions15. Fibromyalgia has been successfully differentiated from osteoarthritis and rheumatoid arthritis using FT-IR spectroscopy based on bloodspot tests16. Hackshaw et al.16 have detected a metabolomic fingerprint profile for fibromyalgia and other rheumatologic disorders using IR and Raman spectroscopy, where the spectrochemical signature included: CH bending in collagen, phospholipids and tryptophan; Amide III; CH in-plane bending in aromatic compounds; CH deformation, β-linkage and skeletal O-C linkage stretching for glycosaminoglycans; C stretching in tyrosine; and C-C twisting in phenylalanine. Moreover, studies using near-infrared spectroscopy have demonstrated great potential for fibromyalgia diagnosis using spectroscopy methods18,19.
The complexity of spectrochemical data requires the use of chemometric techniques in order to derive meaningful information from the sample being analysed10. Screening and diagnostic applications make use of multivariate classification techniques in order to distinguish and predict sample types based on their spectrochemical profile even in presence of unknown sources of variation or subtle spectral differences. Feature selection coupled with discriminant analysis techniques can provide early detection of fibromyalgia based on the sample spectrochemical profile in a quick, simple and low-cost fashion, hence, improving the disease diagnosis and patient treatment.
Results
Socio-demographic and clinical characteristics of samples are described in table 1. The raw spectra were pre-processed by truncating the biofingerprint region (1800–900 cm-1), followed by Savitzky-Golay (SG) smoothing, automatic weighted least squares baseline correction and vector normalisation (Figure 1). These techniques remove physical interferences from the spectra that are not associated with the analyte information, hence, highlighting the signal of interest. SG smoothing removes random noise, baseline correction minimises effects
of baseline distortions common in biological materials6, and vector normalisation removes systematic variations associated with sample thickness or different pressures applied in the ATR module to measure the samples10,20. The resultant pre-processed spectra were further analysed by several chemometric techniques in order to obtain optimal results: principal component analysis with linear discriminant analysis LDA), quadratic discriminant analysis (PCA-QDA) or support vector machines (PCA-SVM); successive projections algorithm with linear discriminant analysis (SPA-LDA), quadratic discriminant analysis (SPA-QDA) or support vector machines (SPA-SVM); and, genetic algorithm with linear discriminant analysis (GA-LDA), quadratic discriminant analysis (GA-QDA) or support vector machine (GA-SVM).
Before model construction, 70% of samples were assigned to the training set, 15% to the validation set, and 15% to the test set using the Kennard-Stone uniform sampling algorithm21. The training set was used for model construction, the validation set for internal model optimisation, and the test set for final model evaluation, where figures of merit (accuracy, sensitivity and specificity) reflecting the model performance towards external samples were calculated. The accuracy represents the total number of samples correctly classified considering true and false negatives; the sensitivity represents the proportion of positives that are correctly classified; and the specificity represents the proportion of negatives that are correctly classified22.
Table 2 illustrates the model performance of the algorithms tested. The best results were obtained by GA-LDA, with 84.2% accuracy, 89.5% sensitivity and 79.0% specificity. These metrics demonstrate a satisfactory classification rate for distinguishing the two groups (case vs. control). The model potential for class separation in the test set can be observed in Figure 2a, where the data dispersion in terms of the discriminant function score is shown.
The selected wavenumbers by GA-LDA are shown in Figure 2b. These wavenumbers responsible for class separation were: 943; 959; 974; 1078; 1113; 1121; 1134; 1140; 1142; 1148; 1153; 1159; 1182; 1192; 1319; 1385; 1398; 1423; 1477; 1545; 1622; 1636; 1668; and, 1798 cm-1. Their tentative biomarkers assignment23 are shown in Table 3.
Discussion
According to studies made by the American College of Rheumatology for diagnosis and classification of fibromyalgia2, groups of patients with fibromyalgia present a good differentiation from a control cohort containing patients with rheumatologic pains (but not fibromyalgia) with an accuracy of 84.9% and sensitivity of 88.4% using the traditional diagnostic through the combination of generalised pains analysis in 11 to 18 pain sites. These
