MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ALDAIR DE SOUSA PAIVA
PERFIS IMUNOFENOTÍPICOS DAS DOENÇAS
LINFOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS
NO RIO GRANDE DO NORTE
NATAL/RN 2018
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Elaborado por Adriana Alves da Silva Alves Dias - CRB-15/474 CDU 616-006.44 RN/UF/BSCCS
1. Doenças Linfoproliferativas Crônicas Citometria de Fluxo - Tese. 2. Imunofenotipagem - Tese. 3. Citometria de Fluxo - Tese. I. Cavalcanti Júnior, Geraldo Barroso. II. Título.
Paiva, Aldair de Sousa.
Perfis imunofenotípicos das doenças linfoproliferativas crônicas no Rio Grande do Norte / Aldair de Sousa Paiva. - 2018.
150f.: il.
Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Natal, RN, 2018.
ALDAIR DE SOUSA PAIVA
PERFIS IMUNOFENOTÍPICOS DAS DOENÇAS LINFOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS NO RIO GRANDE DO NORTE
Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. Orientador: Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior
NATAL/RN 2018
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Prof.: Dra. Ana Katherine da Silveira Gonçalves de Oliveira
Vice-Cordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saude: Pro. Dr. Guilherme Maranhão Chaves
NATAL/RN 2018
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao amigo, Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior, meu orientador, que pela sua simplicidade, ética, senso apurado e investigativo, matém unidos todos os hematologistas deste Estado em benefício dos pacientes hematológicos.
AGRADECIMENTOS
A minha família Sanali, Hugo, Gustavo e Larissa pela compreensão e estímulo.
Aos colegas Dr. Rodrigo Villar e Dr. Marcelo Rocha, Diretor e Vice Diretor do Hemocentro Dalton Cunha, por sua prestimosa dedicação a esta Instituição.
A Coordenação e equipe de funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde pela oportunidade e desempenho nas suas tarefas.meu agradecimento especial a Kaliene, Alana (Secretarias).
A Fundação de Apoio à Pesquisa do estado do Rio Grande do Norte (FAPERN) pelo apoio financeiro.
Aos membros da banca de qualificação, Prof. Dr. Aldo Medeiros, Prof. Dr. Paulo Medeiros, Prof. Dr. Irami Araújo Filho, que com suas valiosas observações muito contribuíram para o aperfeiçoamento do trabalho final.
Aos colegas Dr. Marcos Leão, Dr. Henrique Fonseca, Dr. Claudio Macêdo, Dr. Afonso Lamas, Dr. Francisco Fernandes Júnior, Dr. Rodrigo Villar, Dr. Enildo Alves, Dra. Irian Farkat, Dra. Telma Cassandra, Dr. Rodolfo Soares, Dr. Andre Hipólito, Dr. Francisco Cury, Dr. Lavoisier Campos, Dr. Marcelo Rocha, Dr. James Farley, Dr. Kleber Cavalcanti, Dra. Edilene Melo, Dr. Wilson Cleto de Medeiros Filho, Dra Maria Zélia Fernandes e Dra. Edvis Serafin, Dr. Frank Bahia, Dra Carolina Vilarim, Dra. Daniela Albuquerque por permitirem compartilhar estas informações.
A Dra. Linete Rocha fundadora do Hemocentro Dalton Cunha e Núcleo de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pelo empenho e dedicação em prol da Hematolgia e Hemoterapia do Rio Grande do Norte,uma das pioneiras da hemoterapia no Brasil. Seu exemplo inspirou muitos , dentre estes me incluo.
A Dra. Gabriela Vasconcelos, Pos Doutoranda, pela sua presteza, extremo rigor científico na produção dos resultados e revisão do manuscrito.
Ao valioso time do Laboratório de Citometria de Fluxo do Hemocentro Dalton Cunha: Lorena, Gilena e Rozana (Farmaceuticas–Bioquimicas), Giliane , Alessandra, Victor Cezar, Eduarda, João (Estagiarios), pelo empenho na realização dos exames de imunofenotipagem.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ac Anticorpos
ALK Anaplastic lymphoma kinase ATL Adult T Cell Leukemia BCL-2 gene anti-apoptótico CCND1 Ciclina D1
CD Cluster differentiation
CF Citometria de Fluxo
CFU–GEMM Unidade Formadora de Colônia de Granulócitos, Eosinófilos, Monócitos e Macrófagos
CTL Célula Tronco Linfóide
DLBCL Diffuse Large B Cell Lymphoma DLC Doença Linfoproliferativa Crônica DLPC Doença Linfoproliferativa Crônica EBER-ISHVírus Epstein Barr na Hibridização in situ EBV Epstein Barr Vírus
EUA Estados Unidos da América
FCL Free Chain Light
FISH Hibridizaçãoin situ por fluorescência HCL Hairy Cell Leukemia
HHV8 Herpes Vírus Tipo 8
HIV Vírus da Imunodeficiência humana
HLA-DR Receptor de Superfície Celular MHC classe II HTLV Vírus T-linfotrópico Humano
Ig Imunoglobulina
IgHV3 Immunoglobulin Heavy-Chain Variable Region 3 INCA Instituto Nacional do Câncer
IRF4 Fator Regulatório de Interferon 4
LB Linfócito B
LB Linfócito B
LCP Leucemia de Células Plasmáticas LCV Leucemia de Células Vilosas
LCVv Leucemia de Células Vilosas Variante LECV Linfoma Esplênico de Células Vilosas
LF Linfoma Folicular
LGLG-T Leucemia de Grandes Linfócitos Granulares T LGLG-NK Leucemia de Grandes Linfócitos Granulares NK LLC Leucemia Linfocítica Crônica
LLP Linfoma Linfoplasmocítico LLTA Leucemia Linfoma T do Adulto
LNH Linfoma Não Hodgkin
LPL-B Leucemia Prolinfocítica B LPL-T Leucemia Prolinfocítica T
LT Linfócito T
LTc Linfócito T citotóxico LTh Linfócito T helper
MALT Tecido linfóide associado à mucosa
MF Micose Fungóide
MI Mononucleose Infecciosa
MM Mieloma Múltiplo
MO Medula Óssea
MUM1 Oncogene-1 do Mieloma Múltiplo MW Macroglobulinemia de Waldestron
NK Natural Killer
OMS Organização Mundial da Saúde
SC Stem cell
SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida SNC Sistema Nervoso Central
SP Sangue Pereiférico
SS Síndrome de Sézary
TCR Receptor de Célula T
TACTH Tranplante Autólogo de Células Tronco Hematopoiética TCD4+ Linfócito T CD4+
TdT Terminal Deoxynucleotidyl Transferase
RESUMO
Introdução: As Doenças Linfoproliferativas Crônicas (DLPC) constituem um grupo de neoplasias linfáticas que se caracterizam pela proliferação de linfócitos maduros neoplásicos. A Imunofenotipagem por Citometria de Fluxo (ICF) é uma prática de rotina no diagnóstico diferencial desses tumores, contribuindo para maior precisão. Objetivos: Demonstrar os perfis imunofenotípicos diagnóstico de pacientes portadores de DLPC no Rio Grande do Norte(RN); Demonstrar a aplicabilidade de painel específico para o diagnóstico de pacientes com Mieloma Multiplo; Determinar a monoclonalidade das DLPC-B; Implementar base de dados para pesquisas clínicas Métodos: Pacientes (n = 500) com DLPC foram investigados pela CF. Além disso, foram reunidas outras informações dos pacientes, como idade, sexo e dados hematológicos. Resultados: Os resultados mostraram que 86,6% dos casos eram DLPC-B e 13,4%, DLPC-T/NK. A distribuição das DLPC-B foi: 279 Leucemia Linfocítica Crônica ; 17 Leucemia Prolinfocítica B; 11 Leucemia de Células Vilosas; 3 Linfoma Folicular ; 3 Linfoma Esplênico com Linfócitos Vilosos; 12 Linfoma de Células do Manto; 01 Macroglobulinemia de Waldenstron; 47 Mieloma Múltiplo; 12 Leucemia de Células Plasmáticas; 09 Linfoma de Burkitt e 39 LNH- Leucemizado . A classificação DLPC de T/NK foi: 11 Leucemia de Grandes Linfócitos Granulares; 14 Leucemia Prolinfocítica T; 10 Leucemia de Células T do Adulto; 8 Síndrome de Sézary e 24 Linfoma Periférico T. Conclusão: Os dados demonstram que a imunofenotipagem é uma técnica confiável e segura no esclarecimento diagnóstico dos pacientes portadores de DLPC. Foi possível a detecção de monoclonalidade nas DLPC-B. O diagnóstico de mieloma múltiplo se beneficia da aplicação do painel específico. Este estudo se consolida como base de pesquisa clínica para as DLPC no Rio Grande do Norte. Aprovado pelo Comitê de Ética em pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes- UFRN
Palavras-chave: Citometria de Fluxo. Imunofenotipagem. Transtornos linfoproliferativos
ABSTRACT
Introduction: Chronic Lymphoproliferative Diseases (DLPC) are a group of lymphatic neoplasms characterized by the proliferation of mature neoplastic lymphocytes. Immunophenotyping by Flow Cytometry (ICF) is a routine practice in the differential diagnosis of these tumors, contributing to greater precision. Objectives: To demonstrate the immunophenotypic profiles of patients with DLPC in Rio Grande do Norte (RN); Demonstrate the applicability of a specific panel for the diagnosis of patients with multiple myeloma; Determine the monoclonality of DLPC-B; Implement database for clinical research Methods: Patients (n = 500) with DLPC were investigated by CF. In addition, other patient information, such as age, sex and haematological data, was collected. Results: The results showed that 86.6% of the cases were DLPC-B and 13.4%, DLPC-T / NK. The distribution of DLPC-B was: 279 Chronic Lymphocytic Leukemia; Prolinfocytic Leukemia B; 11 Vilous Cell Leukemia; 3 Follicular lymphoma; 3 Splenic Lymphoma with Vilous Lymphocytes; 12 Mantle Cell Lymphoma; 01 Macroglobulinemia of Waldenstron; 47 Multiple Myeloma; 12 Plasma Cell Leukemia; 09 Burkitt's Lymphoma and 39 NHL-Leucemy. The DLPC classification of T / NK was: 11 Granular Lymphocyte Leukemia; 14 Prolinfocytic Leukemia T; 10 Adult T-Cell Leukemia; 8 Conclusions: The data demonstrate that immunophenotyping is a reliable and safe technique in the diagnostic clarification of patients with DLPC. It was possible to detect monoclonality in DLPC-B. The diagnosis of multiple myeloma benefits from the specific panel application. This study consolidates as a clinical research base for DLPC in Rio Grande do Norte. Approved by ethics committee in research Hospital Onofre Lopes- UFRN
SUMÁRIO
1. Introdução………. 18
2. Revisão de Literatura ………... 21
2.1. Células do Sistema Imune ………. 21
2.1.1. Linfócitos ……….. 23
2.1.1.1. Linfócitos B ……….. 24
2.1.1.2. Linfócitos T ……….. 25
2.1.1.3. Células Natural Killer ………. 26
2.2. Órgãos Linfoides e a Rede Linfática ………... 26
2.3. Linfocitose x Linfopenia ………... 30
2.4. Doenças Linfoproliferativas Crônicas ……….. 32
2.4.1. Considerações Gerais ………... 32
2.4.2. Classificação ………... 33
2.4.3. Importância da Imunofenotipagem por Citometria de Fluxo no Diagnóstico e Classificação das Doenças Linfoproliferativas Crônicas ………... 36
2.4.4. Doençãs Linfoproliferativas Crônicas de Células B ………... 42
2.4.4.1. Leucemia Linfocítica Crônicas (LLC) ……… 42
2.4.4.2. Leucemia Prolinfocítica B (LPL-B) ………... 53
2.4.4.3. Leucemia da Células Vilosas (LCV) ………... 55
2.4.4.4. Leucemia de Células Vilosas Variante (LCV-v) ………... 58
2.4.4.5. Linfoma Folicular ( LF) ……… 59
2.4.4.6. Linfoma de Células do Manto (LCM) ………... 60
2.4.4.7. Linfoma Esplênico de Células Vilosas (LECV) ………... 62
2.4.4.8. Linfoma Linfoplasmocítico (LLP) / Macroglobulinemia de Waldströn (MW) ………... 62
2.4.4.9. Linfoma de Burkitt (LB) ……… 64
2.4.4.10. Mieloma Múltiplo (MM) ……… 66
2.4.5. Doenças Linfoproliferativas Crônicas de Células T ………... 70
2.4.5.1. Leucemia Prolinfocítica T (LPL-T) ………... 70
2.4.5.3. Micose Fungoide/Síndrome de Sézary (SS) ………... 73
2.4.5.4. Leucemia/Linfoma de Célula T do Adulto (LLTA)………... 75
3. Justificativa ………... 77
4. Objetivos……….... 78
4.1. Geral ………... 78
4.2. Específicos ………... 78
5. Casuística e Metodologia……… 79
5.1. Seleção das Amostras de Pacientes ………... 79
5.2. Métodos ……… 80
5.2.1. Teste de Viabilidade Celular ……….. 80
5.2.2. Hemograma e Estudo Citomorfológico ………. 80
5.2.3. Imunofenotipagem ……….. 81
5.2.3.1. Marcação de Antígenos de Superfície ………... 81
5.2.3.2. Investigação de Cadeias Leves das Imunoglobulinas ………... 82
5.2.3.3. Marcação de Antígenos Intracitoplasmáticos e Nucleares ………... 82
5.2.3.4. Leitura e Análises ……… 83 5.3. Exames Adicionais ……….. 84 6. Resultados……….... 86 6.1. Classificação Imunológica ……….. 86 6.2. Dados Demográficos ……….. 87 6.3. Parâmetros hematológicos ……… 88 6.4. Citomorfologia ………... 91 7. Discussão……….. 141 8. Conclusões……… 159
9. Considerações Finais e Pespectivas Futuras…………... 160
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fluxo do paciente com linfocitose ... 32
Figura 2. Cintometria de fluxo ... 36
Figura 3. Algoritmo do diagnóstico das neoplasias da células B ... 39
Figura 4. Morfologia de células sanguíneas de DLPC-B ... 99
Figura 5. Morfologia de células sanguíneas de DLPC-T ... 100
Figura 6. Dot Plot representativo dos fenótipos de DLPC-B ... 101
Figura 7. Dot Plot representativo do fenótipo de DLPC-T ... 102
Figura 8. Doenças linfoproliferativas crônicas – Neoplasia B e Neoplasia T .. 131
Figura 9. Distribuições de neoplasias ... 131
Figura 10. Doenças linfoproliferativas crônicas B – LLC ... 132
Figura 11. Doenças linfoproliferativas crônicas B - LPL- B ... 132
Figura 12. Doenças linfoproliferativas crônicas B – LCM ... 133
Figura 13. Doenças linfoproliferativas crônicas B – LF ... 133
Figura 14. Doenças linfoproliferativas crônicas B – LNH – Fase leucêmica .... 134
Figura 15. Doenças linfoproliferativas crônicas B – LCV ... 134
Figura 16. Doenças linfoproliferativas crônicas B – LCVv ... 135
Figura 17. Doenças linfoproliferativas crônicas B – LELV... 135
Figura 18. Doenças linfoproliferativas crônicas B – MW ... 136
Figura 19. Doenças linfoproliferativas crônicas B – MM ... 136
Figura 21. Doenças linfoproliferativas crônicas B – LB ... 137
Figura 22. Doenças linfoproliferativas crônicas T – LPL-T ... 138
Figura 23. Doenças linfoproliferativas crônicas T – LGLG-T... 138
Figura 24. Doenças linfoproliferativas crônicas T – LGLG – NK... 139
Figura 25. Doenças linfoproliferativas crônicas T – LCTA... 139
Figura 26. Doenças linfoproliferativas crônicas T – SS ... 140
Figura 27. Doenças linfoproliferativas crônicas T – LCTP... 140
LISTA DE TABELAS Tabela 1. Classificação da OMS para as neoplasias do tecido linfóide... 35
Tabela 2. Classificação das Doenças Linfoproliferativas Crônicas ... 40
Tabela 3. Características Imununológicas das DLPC-B ... 41
Tabela 4. Painel de Anticorpos monoclonais ... 85
Tabela 5. Subgrupos das Doenças Linfoproliferativas Crônicas n ... 94
Tabela 6. DLPC-B e a incidência do fenótipo detectado ... 95
Tabela 7. Distribuição em subgrupos das DLPC-T ... 96
Tabela 8. Dados demográficos e laboratoriais das DLPC-B ... 97
ANEXOS
Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa... 177 Publicações ... 178
1. INTRODUÇÃO
As doenças linfoproliferativas crônicas (DLPC) representam um grupo de neoplasias do sistema linfo hematopoiético que apresentam características clínicas, morfológicas e imunológicas heterogêneas. Constituem proliferações clonais de natureza maligna de células maduras do sistema imune, com diferentes comportamentos clínicos, fatores prognósticos e características epidemiológicas, podendo envolver linfócitos B, T e células Natural Killer (NK)(1).
Trata-se de neoplasias que acometem geralmente pessoas com idade superior a 50 anos, podendo ocasionalmente ocorrer em pessoas mais jovens, afetando mais homens que mulheres na proporção de 2:1, respectivamente, proporção esta que tende a decrescer com o aumento da faixa etária(2)
Nessas doenças é importante a distinção entre DLPC primárias e a fase de leucemização dessas entidades, sendo usualmente designadas por leucemias ou linfomas leucemizados quando predomina a sua expressão no sangue periférico (SP) e/ou na medula óssea (MO) ou simplesmente linfomas quando predomina infiltração dessas células restritas nos órgãos linfoides secundários ou outros tecido(3).
A denominação “crônica”, consagrado pela caracterização de doença indolente ou assintomática, induz em erro, pois algumas DLPC incluídas nessa designação têm um comportamento clínico agressivo e evolução rapidamente fatal. Podendo também pensar o mesmo, para o termo “linfoproliferativas”, também empregado na classificação dessas neoplasias, pois na maioria dos mecanismos envolvidos na sua patogénese consiste fundamentalmente na inibição da apoptose e não numa proliferação celular descontrolada como observada nas leucemias agudas(4).
Todas elas apresentam, no entanto, uma característica comum: o fenótipo maduro de células linfóides, independentemente das características morfológicas sugestivas de “maturidade” ou de “imaturidade” e do curso clínico menos ou mais agressivo(4).
Não é possível a abordagem das DLPC sem um entendimento claro dos conceitos de “clonalidade”, “neoplasias” e “malignidade” já que existe um paralelismo entre eles ou seja os processos neoplásicos são de uma forma geral monoclonais e potencialmente malignos, enquanto os processos reacionais constituem expansão do tipo policlonal ou oligo-clonal e portanto clinicamente benignos. Desta forma, quando
que os linfócitos expandidos têm origem numa célula comum e, portanto, partilham o mesmo tipo de rearranjo genético que codificam para o receptor de células T ou “T- Cell Receptor” (TCR) no caso das DLPC de células T ou para as imunoglobulinas (Igs) no caso das DLPC de células B que pode ser demonstrada, por técnicas de biologia molecular ou imunofenotipagem por citometria de fluxo, ficando explicito que uma resposta imune fisiológica se organiza sempre de uma forma policlonal e a de que uma expansão monoclonal é sempre de natureza maligna(4).
Até recentemente, a caracterização dessas neoplasias eram realizadas basicamente pela análise descritiva da citomorfologia de distensão de SP, aspirado de MO ou imprintch de tecidos afetados tais como linfonodos ou massas tumorais. No entanto, em função da similaridade da morfologia muitas vezes observada nessas entidades, sua classificação e, consequentemente, a escolha do tratamento são bastante dificultados, exigindo a confirmação diagnóstica por meio de outros procedimentos tais como biopsia, imunofenotipagem e genotipagem dentre outros(4). Nos últimos anos a Organização Mundial de Saúde (OMS) dos tumores dos tecidos hematopoiético e linfoide preconiza uma abordagem diagnóstica com ênfase nos seguintes parâmetros: morfológico, fenotípico e genotípico. No entanto, não é necessário e tão pouco favorável do ponto de vista custo-benefício realizar múltiplos testes em todas as amostras(5).
Nos dias atuais, o diagnóstico hematopatológico dessas entidades é dependente de uma combinação de análise citomorfológica e histológica. No entanto, técnicas de imunofenotipagem como a citometria de fluxo (CF) e a imuno-histoquímica (IHQ) tem trazido informações relevantes ao diagnóstico, como o estágio de maturação das populações celulares analisadas, a presença de células com fenótipos significativamente anormais, além de avaliar a presença de marcadores associados ao prognóstico ou até mesmo marcadores que são alvos terapêuticos(5).
Nos últimos anos, a CF substituiu progressivamente a microscopia de imunofluorescência, constituindo hoje o método de referência para a identificação, caracterização e quantificação de células neoplásicas das DLPC.(6)
A popularização da CF deve-se a vantagens únicas desta tecnologia: simplicidade, rapidez e capacidade de análise de um grande número de células num curto espaço de tempo; a possibilidade de avaliar a expressão antigénica de uma forma qualitativa e quantitativa além da possibilidade de uma avaliação
multiparamétrica determinada pelo número crescente de anticorpos monoclonais (AcMo) e de fluorocromos disponíveis(7).
Do ponto de vista de diagnóstico, a imunofenotipagem por CF é empregada fundamentalmente para identificação e caracterização das células linfóides neoplásicas com interesse na classificação das DLPC. Mais recentemente, a utilidade da CF tem sido ampliada a outras áreas de interesse clínico que incluem a investigação de prognostico, monitoramento de doença residual mínima após tratamento e seleção de pacientes para tratamento alvo específico(8).
As DLPC mais comuns são as de células B. Entretanto, várias outras entidades originárias de células T e NK, embora mais raras podem atualmente ser bem caracterizadas utilizando por imunofenotipagem através da CF(8).
Na caracterização das DLPC de células B, o painel de AcMo deve distinguir essas doenças das alterações reativas (não clonais), através da demonstração de monoclonalidade pela demonstração de um clone com predomínio da expressão de um único tipo de cadeia leve das imunoglobulinas (kappa ou lambda), na superfície ou intracitoplasmático(8).
As DPLC e células T são neoplasias de origem pós-timicas caracterizando-se, portanto, pelo fenótipo “terminal deoxytidyl transferase” (TdT) e CD1a negativos, aliado a positividade para um ou mais marcadores de linfócitos T(9).
As DLPC de células NK são entidades raras, caracterizando-se pela presença de linfocitose de linfócitos grandes e granulares (LGL) associados com a expressão de antígenos relacionados a células NK tidas como o CD16, CD56 e CD57(9).
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Células do sistema imune
O sistema imune é o conjunto de células, tecidos, órgãos e moléculas que em humanos servem para a eliminação de agentes ou moléculas estranhas, inclusive o câncer, com a finalidade de manter a homeostasia do organismo(10).
Os mecanismos fisiológicos do sistema imune consistem numa resposta coordenada dessas células e moléculas diante de agentes infecciosos e outros ativadores, levando ao surgimento de respostas específicas e seletivas (memória imunológica), podendo também ser induzida através das vacinas. Na ausência de um sistema imune funcional, infecções leves podem sobrepujar o hospedeiro e levá-lo à morte. Porém, mesmo com um sistema imune funcional, o homem, por exemplo, pode adquirir uma doença infecciosa ou um câncer, pois a resposta imune específica, diante de um agente agressor, leva tempo para se desenvolver e, além disso, tanto organismos estranhos, como células neoplásicas, desenvolvem mecanismos de evasão para fugir da resposta imune (11).
As respostas imunes são mediadas por uma variedade de células e por moléculas que estas expressam. Os leucócitos são as células que desempenham as principais ações, mas outras células, que se encontram nos tecidos, também participam da resposta imunitária, enviando sinais e recebendo estímulos dos leucócitos(11).
As células que participam do sistema imunitário se originam na medula óssea (MO), onde evoluem para a fase adulta. Nos seus estágios mais precoces, as células tronco diferenciam-se em duas vias originando células progenitoras linfoides e células progenitoras mielóides. Posteriormente as células progenitoras perdem a capacidade de diferenciação, dando origem, cada uma delas, apenas a uma linhagem celular(11). A partir da medula, e por meio de vasos sanguíneos, elas migram junto com todos os elementos celulares do sangue. As células da linhagem linfóide darão origem os linfócitos B, T e células natural killer (NK). As células progenitoras mielóides darão origem aos, granulócitos, juntamente com as hemácias, que transportam o oxigênio e as plaquetas que participam da coagulação. As células que derivam do progenitor mieloide e do progenitor linfoide são as que mais interessam para o entendimento das
ações do sistema imunitário, de modo que, nesta revisão, não serão considerados os megacariócitos e os eritrócitos(12).
A resposta imune é exercida por dois eixos biológicos principais: a imunidade inata e imunidade adaptativa, esta última exercida por dois eixos biológicos principais: a imunidade humoral que compreende essencialmente a produção de anticorpos (Ac) e a imunidade celular desempenhada pelos linfócitos T. Ambos os sistemas dependem dos linfócitos, quer seja na produção de anticorpos, quer seja na resposta imune celular. Estas células derivam das células primitivas pluripotentes (células tronco multipotentes) presentes na medula óssea (MO) que têm a capacidade de auto- renovação, proliferação e diferenciação (13).
O progenitor mieloide é o precursor dos granulócitos, fagócitos mononucleares (macrófagos), células dendríticas e mastócitos do sistema imune. Os macrófagos são as células fagocitárias mais relevantes. Estas células são a forma diferenciada dos monócitos sanguíneos, que se encontram estrategicamente distribuídos em vários tecidos para dar origem ao sistema fagocitário mononuclear
Os microgliócitos são os macrófagos do cérebro, as células de Kupffer são os macrófagos do fígado, os macrófagos alveolares fazem parte do tecido pulmonar, entre outros macrófagos residentes em diferentes tecidos. As funções dos macrófagos se caracterizam pela neutralização, ingestão e destruição de partículas, incluindo os biopatógenos, além de processar e apresentar antígenos para os linfócitos T (14).
Neste contexto, são as células dendríticas as mais especializadas na captura e na apresentação de antígenos para os linfócitos T. As células dendríticas imaturas migram do sangue para residirem nos tecidos e realizam tanto a fagocitose quanto a micropinocitose. Após contato com um patógeno, maturam rapidamente e migram para os nódulos linfáticos, onde encontram o ambiente adequado para a apresentação de antígenos aos linfócitos T (15).
Os granulócitos recebem essa denominação por possuírem grânulos em seu citoplasma que se coram especificamente por corantes hematológicos tradicionais. São também chamados de leucócitos polimorfonucleares, devido às formas de seus núcleos. Existem três tipos de granulócitos, sendo eles os neutrófilos, os eosinófilos e os basófilos; todos com um tempo de vida relativamente curto(12).
Os neutrófilos, assim como os macrófagos e as células dendríticas, são representantes do grupo de células fagocitárias do sistema imunitário inato, mas, diferentemente destas células, não apresentam antígenos para os linfócitos T(16).
Os neutrófilos são os elementos celulares mais numerosos presentes no SP e importantes da resposta imune inata. Os eosinófilos são importantes na resposta contra infecções parasitárias ou processos alérgicos. Os basófilos tem função provavelmente similar e complementar à dos mastócitos, células cujo precursor parece ser comum aos basófilos sanguíneos que, devido a semelhanças funcionais, também se diferenciam ao chegar aos tecidos onde residem. Eles se localizam principalmente à margem dos vasos sanguíneos e liberam mediadores que agem nas paredes vasculares quando ativados (16).
2.1.1- Linfócitos
Os linfócitos maduros constituem 20-40% dos glóbulos brancos do sangue periférico. Circulam continuamente e são capazes de migrar para espaços tissulares e órgãos linfoides, servindo como ponte entre diferentes estruturas do sistema imunitário(17).
As populações de linfócitos B, T e células NK são diferentes quanto à sua função, mas de difícil identificação do ponto de vista morfológico, tornando a imunofenotipagem por citometria de fluxo um método fundamental para distinção destas células normais bem como de sua contraparte maligna com nas leucemias e linfomas. Adicionalmente, a expressão diferencial de determinados marcadores celulares de diferenciação tem sido utilizada para delinear estágios de diferenciação e de ativação celular, e identificar distintos subtipos funcionais de linfócitos(17).
Os linfócitos T são células capazes de reconhecer estruturas polipeptídicas através de um complexo macromolecular CD3/receptor clonal de célula T (CD3/TCR ), enquanto os linfócitos B exercem o reconhecimento através de imunoglobulinas de superfície celular. Embora as estruturas de reconhecimento das células NK não sejam totalmente conhecidas, sabe-se que elas expressam proteínas associadas à linhagem T (CD2 e CD8), e ainda moléculas específicas ou relacionadas como o CD16, o CD56 e o CD57, além de expressarem moléculas de adesão como o CD11b e CD11c(18).
2.1.1.1. Linfócitos B
Os linfócitos B (LB) se formam na medula óssea circulam, migrando depois para os órgãos linfóides secundários tornando-se células efetoras após ativação por antígeno. Durante esta fase do desenvolvimento os LB iniciam o rearranjo da sua cadeia pesada de Ig (células pró-B), produzem a cadeia pesada (células pré-B), expressam o receptor de células pré-B na superfície celular (células pré-B tardias), completam o rearranjo das cadeias leves e expressam IgM de superfície (células B imaturas) e IgM e IgD na superfície celular (células B maduras), reagem com o respectivo antígeno (tornando células B ativadas) gerando posteriormente linfócitos B de memória e células produtoras de anticorpos ou plasmócitos (17).
Os LBs expressam inicialmente o antígeno CD19 que é restrito à linhagem B, com expressão do HLA-DR e do antígeno CD34. Segue-se então o aparecimento do antígeno CD10. A expressão do CD10 distingue duas fases no desenvolvimento da célula B: uma inicial caracterizada por alta densidade de CD10 e uma tardia com baixa densidade do CD10, perda do CD34 e ganho do antígeno CD20. Nesta segunda fase, algumas células exibem cadeias “mü” citoplasmáticas (c) significando diferenciação para o estágio de célula pré-B. As células pré-B são bem caracterizadas por apresentarem c e ainda não apresentarem imunoglobulinas de superfície (sIg)(17).
O estágio final da diferenciação terminal dos LBs ocorre nos órgãos linfóides periféricos, sendo caracterizado pela mudança de classe da cadeia pesada das imunoglobulias, com perda da IgM de superfície e aquisição de outros isotipos, tais como a IgG, IgE ou IgA, através de um novo rearranjo do gene da imunoglobulina(17). Os LB maduros são caracterizados pela expressão de novos antígenos restritos à célula B, como o CD21 e o CD22 que estão presentes em linfócitos em repouso. A ativação dos linfócitos implica na perda desses antígenos e da IgD, com concomitante surgimento do antígeno CD23(17).
Durante todo este processo podemos caracterizar estes tipos celulares e estudar a progressão do desenvolvimento dos LB através da expressão de marcadores celulares ou antígenos de diferenciação celular (Cluster of diferentiation ou CD), presentes durante toda a diferenciação, como o CD19, ou específicos de cada
estágio de diferenciação, como o CD34, CD10, CD22, CD20, CD21, CD24 e o complexo CD79a/CD79b dentre outros(17).
Os LB circulantes correspondem entre 10 a 15% dos linfócitos totais circulantes e caracterizam-se pela expressão do CD19 e CD20, e de cadeias leves kappa () ou
lambda (λ) das imunoglobulinas, nunca as duas, em uma relação к/λ de 3:2 ou seja
60% e 40% para e respectivamente (17)
2.1.1.2. Linfócitos T
Os linfócitos T (LT) correspondem a cerca de 70 a 80% dos linfócitos circulantes no sangue periférico. No início de seu desenvolvimento as células pre-T saem da medula óssea numa forma imatura (CD4-/CD8-) e sem o receptor de células T (TCR), migrando para o timo onde se tornam células T maduras, migrando posteriormente para os órgãos linfóides secundários. Durante o processo de maturação elas sofrem proliferação, rearranjo dos genes do TCR para gerar uma grande diversidade de especificidades antigénicas, e adquirem marcadores de superfície específicos de células T(18).
Durante a sua maturação no timo essas células passam a expressar uma molécula de ligação a antígenos(TCR). Posteriormente adquirem outros marcadores como o CD3 (inicialmente intracitoplasmático), CD1a, CD2, CD5 e CD7. Os estágios do desenvolvimento das células T podem ser definidos pelo rearranjo e expressão do TCR e pela expressão de CD4 e CD8 que segue a sequência: CD4-/CD8- ou células duplamente negativas, CD4+/CD8+ ou células duplamente positivas e finalmente, células CD4/-CD8- ou CD4-CD8+. Na fase final de diferenciação celular, pode-se distinguir duas subpopulações funcionalmente distintas de linfócitos T, que se denominam T-helper (LTh ou TCD4+) e T citotóxicas (LTc ou TCD8+), graças a presença do antígeno CD4 e ausência de CD8 e vice-versa, respectivamente(18).
A relação normal de células TCD4/TCD8 é de 2:1, podendo ser alterado em condições patológicas tais como nas infecções por vírus como, por exemplo, nos indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e na mononucleose infecciosa, quando ocorre inversão da relação TCD4/TCD8 ou
presença de células duplamente positivas podendo estas condições também serem observadas nas imunodeficiências, doenças auto-imunes e outras patologias, nomeadamente leucemias e linfomas(18).
2.1.1.3 Células Natural Killer
As células natural killer (termo oriundo do inglês Natural Killer Cell), também conhecidas como células exterminadoras naturais ou células NK são definidas como células citotóxicas não específicas que são importantes na resposta precoce às células tumorais e infecções virais(18).
As células NK são oriundas da medula óssea, que correspondem a 5 a 15% das células mononucleares do sangue periférico. Possui tamanho ligeiramente maior que o do linfócito pequeno e presença do citoplasma granular abundante, permitindo diferenciá-las do linfócito T, sendo comumente denominadas como linfócitos granulares grandes. Seu citoplasma, bem como o dos linfócitos T citotóxico ou TCD8+, é caracterizado por conter grânulos contendo substancias citotóxicas (granzimas e perfurinas) mediadores de mecanismos da lise da célula-alvo(18).
As células NK e os linfócitos T expressam numerosas moléculas de superfície semelhantes entre si e que exterminam as células infectadas e células neoplásicas por meio de mecanismos similares. Dois marcadores encontradas na membrana, CD16 e CD56, são comumente utilizadas para identificação das células NK. Diferentemente dos linfócitos citotóxicos, as NK não são restritas por proteínas MHC (exibidas na superfície das células infectadas), são constitutivamente citolíticas e não desenvolvem memória. Por as células NK serem ativadas precocemente em uma resposta imune e não requererem sensibilização prévia para o desenvolvimento de células de memória após a sua ativação, elas são as células citotóxicas da imunidade inata, em contrapartida ao linfócito T citotóxico da resposta imune adaptativa (18).
2.2 Órgãos Linfoides e a Rede Linfática
Apenas 1% da população total dos linfócitos é encontrada circulando no SP. Na sua maioria, os linfócitos são encontrados nos chamados órgãos linfoides,
Os órgãos linfoides são tecidos organizados que contêm grandes quantidades de linfócitos em um ambiente de células não linfoides. Nesses órgãos, as interações que os linfócitos têm com as células não linfóides são importantes, tanto para o desenvolvimento dos linfócitos e o início da resposta imune adaptativa, como para a manutenção dos mesmos. Tais órgãos podem ser divididos em órgãos linfoides centrais ou primários, produtores de linfócitos, e órgãos linfoides periféricos ou secundários, que desempenham a função de maximizar o encontro entre os linfócitos e os produtos processados pelas células apresentadoras de antígenos, dando início à resposta imune(20).
Do ponto de vista funcional, o sistema linfoide pode ser dividido em três compartimentos: i) O primeiro compreende um reservatório de células não diferenciadas, denominadas de células tronco multipotentes ou stem cells (SC) que darão origem às células tronco linfoides (CTL), as quais são capazes de proliferação e maturação; ii) Um segundo compartimento consiste nos tecidos linfoides centrais ou primários (MO e Timo) que controlam o desenvolvimento das células linfoides, sendo focos de intensa linfopoese independente de estímulos antigênicos; iii) O terceiro compartimento inclui os órgãos linfoides periféricos ou secundários onde se observa uma população mista de linfócitos B e T(20).
Nos seres humanos, os órgãos linfoides centrais são a medula óssea e o timo, este último um grande órgão localizado na porção superior do tórax. Tanto os linfócitos B como as células T surgem na medula óssea, mas apenas os linfócitos B ali se diferenciam. Os linfócitos T migram para o timo para sofrer seu processo de diferenciação. Uma vez completada sua maturação celular, os dois tipos de linfócitos entram na corrente sanguínea, migrando posteriormente para os órgãos linfoides periféricos(21).
Os órgãos linfóides periféricos são especializados na captura do antígeno possibilitando o início das respostas imunes adaptativas. Os microrganismos patogênicos podem penetrar no hospedeiro por muitas portas de entrada, instalando o processo infeccioso em qualquer sítio, mas o encontro do antígeno com os linfócitos acontecerá nos órgãos linfóides periféricos: os nódulos linfáticos, o baço e tecidos linfóides associados às mucosas(21).
Os linfócitos estão em contínua recirculação entre esses tecidos, para os quais o antígeno também é carreado, vindo de locais procedentes de infecções,
primariamente dentro de células apresentadoras de antígenos (CAA) (macrófagos e células dendriticas dentre outras). Dentro dos órgãos linfoides, células especializadas, como as CAA, apresentam o antígeno para os LT até então células naives(22).
A rede linfática consiste em um extenso sistema de vasos que coletam o líquido intersticial, fazendo-o retornar para o sangue. Esse líquido intersticial é produzido continuamente pela passagem de água e solutos de baixo peso molecular através das paredes vasculares que penetram no espaço intersticial, pela secreção celular e outros fatores de excreção. Ao ser parcialmente drenado para os vasos linfáticos, passa a ser chamado de linfa. A linfa flui lentamente pelos vasos linfáticos primários, deságua em vasos linfáticos de calibre progressivamente maior, que convergem para o ducto torácico, e desemboca na veia cava superior que, por sua vez, devolve todo o volume para a corrente sanguínea, num fenômeno denominado recirculação(21).
Localizados em pontos de convergência da rede vascular, encontram-se os nódulos linfáticos (linfonodos) constituídos de uma série de órgãos encapsulados em forma de caroço de feijão, que se distribuem ao longo dos vasos linfáticos. Os vasos linfáticos aferentes drenam o fluido dos tecidos e carrega antígenos e células infectadas aos seios dos nódulos linfáticos, onde os antígenos são capturados. Os seios são revestidos por orifícios minúsculos, que permitem a linfa e seu conteúdo atravessarem o nódulo linfático e entrarem em contato com os linfócitos(23)
Nos nódulos linfáticos os linfócitos B e T estão situados em regiões distintas. As células B encontra-se principalmente nos folículos presentes na área cortical. Os linfócitos B localizam-se em folículos e nas áreas corticais, os linfócitos T encontram- se mais difusamente distribuídas em torno das áreas paracorticais, também conhecidas como zonas de células T ou áreas T-dependentes. Alguns folículos contêm áreas centrais chamadas de centros germinativos, os quais coram-se levemente com corantes histológicos. Os folículos sem centros germinativos, chamados de folículos primários, contêm principalmente linfócitos B maduros "naives". Os foliculos com centros germinativos (folículos secundários), isto é, que estão ativados, surgem após estimulação antigênica mediados pelas células T auxiliares, constituindo locais de proliferação e seleção de células B que produzem anticorpos de alta afinidade e geração de células B de memória. A formação do centro germinativo desloca as células originais do folículo primário para a periferia, que passam então a
Cada centro germinativo consiste de uma zona escura repleta de células B que proliferam, chamadas de centroblastos, e uma zona leve que contém células chamadas de centrócitos, os quais pararam de proliferar e estão sendo selecionados para sobreviver e diferenciar ainda mais (13). Por fim, a linfa sai por um vaso linfático eferente no lado oposto do nódulo linfático, numa região conhecida como hilo(24).
O baço encontra-se situado atrás do estômago e filtra o sangue da mesma forma como os nódulos linfáticos filtram a linfa e coletam antígenos. Também captura e se desfaz de células vermelhas senescentes. A massa principal deste órgão é composta pela polpa vermelha e os linfócitos circundam as arteríolas que o penetram, formando áreas da polpa branca, cuja região mais interna é dividida em uma camada linfoide periarteriolar, contendo principalmente células T e revestidas por uma coroa de células B(25).
A expressão tecido linfoide associado à mucosa (MALT) do termo em inglês “mucosal associated lymphoid tissue” é uma descrição geral para os tecidos linfoides não encapsulados, que existem nas regiões subjacentes às mucosas. Os MALTs se distribuem anatomicamente e seus componentes individuais incluem: i) O anel de Waldeyer - Anel de estruturas linfoides que circunda a faringe, sendo formado pelas tonsilas e adenoides, ii) Tecido linfoide associado aos brônquios (BALT) do termo em inglês bronchial-associated lymphoid tissue constituído por agregados linfocitários semelhantes, mas organizados difusamente, que protegem o epitélio respiratório, iii) Tecidos linfoides associados ao intestino (GALT) do termo em inglês “gut-associated
lymphoid tissues” os quais Incluem os folículos linfoides isolados e o apêndice cecal,
além de estruturas especializadas do intestino delgado, as placas de Peyer e tecido linfático urogenital(26).
A diferenciação dos linfócitos B e T seguem três diferentes estágios: o primeiro estágio ocorre na MO quando as SC, dependendo de estímulos, se diferenciam em célula tronco linfoide (CTL), que é um precursor comum dos linfócitos B, T e células NK, e em células progenitoras mielóides ou Unidade Formadora de Colônia de Granulócitos, Eritrocitos, Monócitos e Megacariocitos ou CFU-GEMM do termo em inglês “Colony-Forming Unit-Granulocyte, Erythrocyte, Monocyte/macrophage,
Megakaryocyte(23)”.
Na segunda fase, algumas das CTL migram para o timo onde, sob influência do microambiente , se diferenciam em LT. Os precursores linfoides que permanecem
na MO sofrem diferenciação que culminará com a formação dos LB. O terceiro e último estágio corresponde à aquisição de imunocompetência o que ocorre a nível dos órgãos linfóides secundários(23).
2.3 Linfocitose x Linfopenia
A linfocitose corresponde a um número aumentado de linfócitos circulantes, superior a 4.000/ µL.. na maioria dos laboratórios clínicos; enquanto a linfocitopenia refere-se à diminuição dos linfócitos no SP que, geralmente, corresponde a menos de 1.000 linfócitos/µL em adultos. Assim, para a contagem de glóbulos brancos em adultos, o intervalo normal (ou seja, dois desvios padrão acima e abaixo da média) é de 4.400 a 11.000 células/µL na maioria dos laboratórios clínicos. Os linfócitos, geralmente, constituem de 8% a 33% dos glóbulos vermelhos no SP(27).
Os mecanismos da indução de uma linfocitose pode ser causada pelo aumento da produção, redistribuição (da MO e/ou órgãos linfóides secundários) e/ou diminuição da morte celular. As várias causas de linfocitose diferem-se na contribuição de cada um desses mecanismos (27).
O aumento da produção de linfócitos pode ser devido a um processo maligno ou em resposta a um estímulo infeccioso ou inflamatório. A linfocitose maligna envolvendo a expansão de um clone de células relacionadas, ao passo em que os processos reativos, geralmente, refletem a expansão policlonal de vários clones de linfócitos (resposta policlonal). Os processos reativos podem levar à expansão de um ou mais subconjuntos de linfócitos (a exemplo de células T, células B e/ou células NK)(27).
Dentre as causas mais comuns de linfocitose reativas destacam-se: i) Linfocitose fisiológica da infância (do nascimento até aos 2 anos); ii) Infecções especialmente virais tais como rubéola, varicela, influenza, e todas as doenças exantemáticas da infância além do vírus Epstein-Barr, vírus Coxsackie, adenivírus, toxoplasmose, citomegalovírus, ou infecções como brucelose, tuberculose, sífilis secundária, vírus linfotropico de células T-humana (HTLV) e infecções por Rickettsias; iii). Situações diversas, como alergias medicamentosas, doença do soro, após esplenectomia, doença de Addison, hipopituitarismo, hipertiroidismo e em fumantes
As causas da linfocitose clonal existem em um espectro e variam de distúrbios pré-malignos os quais podem evoluir para doenças malignas abertas em uma variedade de linfomas e leucemias tais como as doenças linfoprolifertivas crônicas (DLPC) a LLCB e os linfomas não-Hodgkin leucemizados (LNHL) dentre outras(27).
A urgência da avaliação da natureza de uma linfocitose é orientada pela condição clínica do paciente, o grau e a taxa de aumento da linfocitose (se conhecida), bem como achados preocupantes (por exemplo, explosões leucêmicas) no esfregaço sanguíneo com presença de formas atipicas. Embora toda linfocitose maligna seja clonal, nem todas as expansões clonais são malignas. Algumas causas infecciosas ou inflamatórias da linfocitose podem estar associadas à expansão oligoclonal de linfócitos(27).
Distinguir os processos clonais dos policlonais, muitas vezes, é um passo importante na determinação da causa da linfocitose. A clonalidade não pode ser determinada pela avaliação inicial (história, exame físico ou hemograma completo). Nestes casos as técnicas de imunofenotipagem como a citometria de fluxo é a técnica inicial preferida para definir a clonalidade. Figura 1 (27).
No entanto, a citometria de fluxo não deve ser realizada em todos os pacientes com linfocitose. Assim, a decisão da realização da citometria de fluxo e a urgência do teste são determinadas pelo estado clínico do paciente, o nível de linfocitose e sua evolução (se conhecida), achados preocupantes em esfregaço sanguíneo (atipias linfocitárias, plaquetopenia e alterações citomorfologicas dos eritrócitos dente outras) e a preocupação do clínico e/ou do paciente(27).
Em geral, a citometria de fluxo do sangue periférico é o teste inicial preferido para a determinação da clonalidade no paciente com linfocitose. Comparada com outras técnicas especializadas (por exemplo: análise cromossômica e testes moleculares/genéticos), a citometria de fluxo fornece resultados mais rápidos e econômicos. Esta técnica pode definir clonalidade e determinar a linhagem e o imunofenótipo dos linfócitos(27).
Figura 1 – Fluxo do paciente com Linfocitose
2.4 Doenças Linfoproliferativas Crônicas
2.4.1. Considerações gerais
As Doenças Linfoproliferativas Crônicas (DLPC) constituem um grupo heterogêneo de doenças neoplásicas que, em comum, têm a sua origem a partir de células linfóides maduras (periféricas), as quais podem estar presentes na MO ou SP, podendo também se infiltrar em outros órgãos, como pele e órgãos linfóides secundários, linfonodos e baço, dentre outros (28).
Apesar de, na denominação “Doenças Linfoproliferativas”, enquadrarem-se todas as proliferações linfoides, na prática clínica, este termo encontra-se restrito a um grupo heterogêneo de neoplasias linfóides caracterizadas por um acúmulo de linfócitos B, T e NK de aparência madura e função anormal no SP. Essas entidades são classificadas conforme as características morfológicas, imunofenotípicas e citogenéticas, com alterações moleculares específicas (29).
As DLPC podem também cursar com adenopatias e hepato-esplenomegalia. Mas, em algumas destas patologias, a expressão da doença se dá através da linfocitose, consequência da fase de leucemização dessas neoplasias (29).
2.4.2. Classificação
Devido à complexidade considerável do sistema imune, não é surpreendente que os tumores originários desses tecidos sejam numerosos e complexos. Por conseguinte, a classificação dessas doenças tenta identificar as origens de células de tumores e sua maturidade aparente. Os primeiros sistemas de classificação basearam-se na arquitetura dos tecidos e nas aparências citológicas das células neoplásicas. Para algumas entidades, as características morfológicas são muitas vezes suficientes para estabelecer o diagnóstico. No entanto, com o desenvolvimento e aplicação da imunofenotipagem, testes genéticos e moleculares, reconheceu-se a existência de muitas entidades distintas, que não podiam ser distinguidas de forma confiável apenas pela morfologia (30).
A classificação dos cânceres linfóides proposta pela Organização Mundial de Saúde (OMS) foi concebida através de um consenso entre líderes internacionais em hematopatologia e oncologia clínica, levando em consideração as informações morfológicas, clínicas, imunológicas e genéticas para dividir os linfomas não-Hodgkin (LNH) e outros cânceres linfóides em entidades clínicas/patológicas que tenham relevância clínica e terapêutica(28).
A classificação da OMS foi publicada em 2008 e atualizada em 2016. Fundamenta-se também em critérios morfológicos e imunohistoquímicos bem definidos, comprovadamente associados à elevada concordância inter-observadores, havendo também forte fundamentação biológica, incluindo-se as mais atuais evidências da genética molecular. Esse sistema é apresentado na Tabela 1.
De forma geral e de acordo com a OMS, os diferentes tumores hematológicos foram agrupados em: Neoplasias mielóides, derivadas das células progenitoras da MO que, normalmente, desenvolvem-se em eritrócitos, granulócitos, monócitos e megacariócitos; Neoplasias histiocíticas/dendríticas, derivadas de células apresentadoras de antígeno; Neoplasias linfóides, derivadas de forma variável de progenitores de células B (derivadas da MO), progenitores de células T (derivados do timo), linfócitos T maduro (células T citotóxicas, células T auxiliares ou células T reguladoras) ou linfócitos B maduros (células B ou células plasmáticas)(28).
Ainda nesta perspectiva, há as neoplasias que mostram as evidências de diferenciação mielóide e linfóide, presumivelmente, porque são derivadas de células progenitoras multipotentes (28).
As neoplasias linfóides T maduras e NK compreendem: Linfomas de Células T Periférico; Linfoma Anaplásico de Grande Células (LAGC); Linfoma de Células T Periféricas Cutâneas Primárias; Linfoma de Células T do Adulto; Leucemia de Grandes Linfócitos Granulares (LGLG); Leucemia Prolinfocítica T e Leucemia de Células NK (28).
Embora essa classificação seja apoiada por uma abordagem multiparamétrica ao diagnóstico, com identificação citomorfológica, imunofenotipagem e características genotípicas de cada entidade, não é necessária nem rentável a execução de múltiplos estudos em cada caso diagnosticado (31).
Diversos autores têm sugerido a utilização da imunofenotipagem por citometria de fluxo, aliada à citologia convencional, como método rápido e não invasivo de diagnóstico alternativo dessas neoplasias (31).
Trata-se de um método mais preciso, baseado na expressão de antígenos de diferenciação celular (marcadores de células) identificados através de um painel de anticorpos monoclonais (AcMo), os quais determinarão a fase em que está o processo de maturação dos linfócitos B e T/NK (31).
Alguns desses marcadores são considerados críticos e, portanto, suficientes para determinar a linhagem. No entanto, um painel mais extenso de AcMo pode proporcionar informações mais detalhadas sobre o processo leucêmico, podendo também avaliar a expressão de antígenos de valor prognóstico e determinação da clonalidade, além de também poder ser usado na avaliação da doença residual mínima (DRM) durante a terapia(32).
Tabela 1 - Classificação da OMS para as neoplasias do tecido linfóide.(5)
Neoplasias de Células B Neoplasias de Células T e Natural Killer (NK)
Neoplasias de Células B Precursoras Neoplasias de Células T Precursoras
Linfoma e Leucemia Linfoblástica de Células B Precursoras
Linfoma e Leucemia Linfoblástica de Células T Precursoras
Neoplasias de Células B Maduras (periféricas) Neoplasias de Células T Maduras (periféricas) e de Células NK
Leucemia Linfocítica Crônica e Linfoma Linfocítico de Pequenas Células B
Leucemia Prolinfocítica de Células T
Leucemia Prolinfocítica de Células B Leucemia Linfocítica granular de Células T
Linfoma Linfoplasmocítico Leucemia de Células NK agressivo
Linfoma de Células B de Zona Marginal Esplênico (± linfócitos vilosos)
Leucemia ou Linfoma de Células T Adultas (HTLV I)
Leucemia de Células Cabeludas Linfoma Extranodal de Células T e NK, tipo nasal
Mieloma de Células Plasmáticas ou Plasmocitoma
Linfoma de Células T, tipo enteropatia
Linfoma de Células B de Zona Marginal Extranodal associado à Mucosas (MALT)
Linfoma de Células T hepatoesplênico
Linfoma de Células B de Zona Marginal Nodal Linfoma Subcutâneo de Células T, do tipo peniculite
Linfoma Folicular Micose Fungóide e Síndrome Sézary
Linfoma de Células do Manto Linfoma Cutâneo Primário de Grandes Células
Anaplásicas
Linfoma Difuso de Grandes Células B Linfoma de Células T periféricas, não especificado
Linfoma Mediastinal de Grandes Células B Linfoma de Células T angioimunoblástico
Linfoma Primário de Efusão Linfoma Sistêmico primário de Grandes Células
Anaplásicas
Linfoma Intravascular de Grandes Células B Neoplasias de Células de linhagem T e Estágio de Diferenciação Incertos
Linfoma de Burkitt ou Leucemia de Células de Burkitt
Linfoma de Células NK blásticas
Neoplasias de Células B de Potencial Maligno Incerto
Neoplasias de Células T de Potencial Maligno Incerto
Granulomatose Linfomatóide Desordem Proliferativa Cutânea CD30+ (papulose
linfomatóide) Doença Linfoproliferativa Pós-Transplante
2.4.3 Importância da Imunofenotipagem por citometria de fluxo no diagnóstico e classificação das Doenças Linfoproliferativas Crônicas
A imunofenotipagem por citometria de fluxo (ICF) é um processo de análise multiparamétrica por meio do qual as características físicas e/ou químicas das células são medidas enquanto circulam numa corrente líquida, alinhadas uma a uma, em frente a um laser. O impacto do laser em cada célula produz sinais que representam diferentes parâmetros da célula e, depois, são recolhidos por detectores responsáveis por converterem os sinais recebidos em sinais eletrônicos a serem digitalizados e armazenados em suporte informático Figura 2 (33).
Para isso, os citômetros dispõem de um sistema hidráulico para a circulação do fluxo contínuo monocelular, de um sistema de luz laser que incide sobre as células, de um sistema óptico e eletrônico que recolhe a luz dispersada e de um sistema informático para processar os dados(33).
Apesar de a ICF ser uma técnica utilizada em vários autoanalizadores hematológicos, o termo restringe-se aos aparelhos que lêem e interpretam reações nas quais intervêm substâncias fluorescentes(33).
Os parâmetros medidos podem ser relacionados às características intrínsecas da célula, como tamanho e complexidade do núcleo e citoplasma, os quais são baseados em sinais de dispersão, ou parâmetros relacionados às propriedades antigênicas da célula, baseadas em sinais de fluorescência (31)
Os sinais de dispersão resultam da interação física da luz monocromática com uma partícula, como uma célula que produz uma mudança na direção da luz, em todas as direções. As características morfológicas fornecidas são o tamanho celular, características da membrana, do núcleo e do material granular no interior da célula (31).
Os sinais de fluorescência devem-se aos fluorocromos. O complexo antígeno-anticorpo é marcado por um fluorocromo que emite luz a determinado comprimento de onda quando excitado pela luz do laser (31).
Entre as várias aplicações da Citometria de Fluxo (CF), encontra-se a imunofenotipagem leucocitária, ou seja, a identificação de populações e subpopulações de leucócitos, particularmente de linfócitos, tendo como base a expressão de antígenos de membrana (34).
A ICF é uma técnica importante no diagnóstico e caracterização de neoplasias hematológicas. Ela permite a identificação de células com imunofenótipo aberrante, tornando-se uma ferramenta diagnóstica precisa mesmo na ausência de sintomatologia clínica (34).
A análise multiparamétrica, através da citometria de fluxo, é um método rápido, objetivo e quantitativo para determinação da linhagem celular (B, T e NK), caracterização do estádio maturativo das células no diagnóstico diferencial entre linfocitose reacional e proliferação monoclonal de células B, além de caracterização da heterogeneidade e dos aspectos aberrantes de células malignas, permitindo o monitoramento da terapia e detecção de doença residual mínima. Também, através da CF, podem ser identificados marcadores prognósticos, como a análise de ZAP-70, CD38, CD49d, dentre outros (33).
Cerca de 80% a 85% das DLPC são de linhagem B, ou seja, ocorrem a transformação maligna e expansão de um único clone de linfócitos B, originando as DLPC de células B, nas quais se destacam a Leucemia Linfocítica Crônica de Células B (LLC-B); a Leucemia Prolinfocítica de Linfócitos B (LPL-B); a
Tricoleucemia ou "Hairy Cell Leukemia" (HCL) e os linfomas linfocíticos de baixo grau em fase leucêmica, como o Linfoma de Células do Manto (LCM), o Linfoma Folicular (LF), o Linfoma Esplênico de Linfócitos Vilosos (LELV) e o Linfoma Linfoplasmocitóide ou Macroglobulinemia de Waldestrom (MW); podendo também ser incluídas neste grupo as discrasias de células plasmáticas, como o Mieloma Múltiplo (MM) e a sua forma leucêmica ou Leucemia de Células Plasmáticas (LCP)(35).
Na caracterização das neoplasias da linhagem B, por maior frequência, melhor conhecimento dos fenótipos anormais e maior disponibilidade de marcadores, a CF é amplamente utilizada. Nas neoplasias de células T, em contraste com as B, ainda é difícil identificar fenótipos aberrantes sendo, portanto, muitas neoplasias categorizadas como linfomas T não especificado(35).
No entanto, quando utilizada em conjunto com outras informações clínicas, análises citomorfológicas, colorações citoquímicas, imuno- histoquímicas, análises moleculares e citogenéticas, a ICF pode auxiliar na conclusão do diagnóstico (36).
As DLPC de linhagem B podem ser confirmadas por duas evidências que caracterizam a presença de células neoplásicas desta linhagem: i) Presença de monoclonalidade para as cadeias leves da imunoglobulina de superfície (Igs). As DLP de linhagem B, habitualmente, apresentam um único clone derivado de uma célula com expressão de um único tipo de imunoglobulina, evidenciando pela superexpressão de um único tipo de cadeia leve, ou κ ou λ, em contraste com o padrão policlonal dos casos de linfocitose reacional que apresentam uma relação к/λ normal. ii) Expressão de fenótipos aberrantes relacionados a doenças específicas, tais como expressão aberrante do antígeno T CD5 na LLC-B. Figura 3 (34,37).
As DLPC de células T são menos frequentes que as DLPC-B e, frequentemente, podem ser identificadas por ICF. As neoplasias pós-tímicas caracterizam-se pelo fenótipo “terminal deoxytidyl transferase” (TdT) e CD1a negativos, aliadas à positividade para um ou mais marcadores de células T
.Adicionalmente, a presença de fenótipo aberrante nas células T neoplásicas deve ser distinguida da variação imunofenotípica normal, observada em linfocitoses de células T não neoplásicas, tal como nas infecções virais (38).
Figura 3 – Algoritmo do diagnóstico das neoplasias de células B
As DPLC de células NK são raras e apresentam características clínicas e biológicas mal definidas, caracterizando-se pela expressão de antígenos relacionados a células NK, tais como CD16, CD56, CD57 e CD8, além de antigenos compartilhados com os linfócitos T: CD2, CD8, granzimas e perfurinas, dentre outros (34,39).
As tabelas 2 e 3 mostram resumidamente a classificação das DLPC de linfócitos B, T e células NK, de acordo com o padrão de imunofenotipagem obtido pela CF.
Tabela 2 - Classificação das Doenças Linfoproliferativas Crônicas DOENÇAS LINFOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS DE CÉLULAS B
1) Leucemias Primárias
Leucemia Linfóide Crônica (LLC) Leucemia Prolinfocítica (LPL)
Leucemia de Células Vilosas (LCV) ou “Hairy Cell Leukemia” (HCL) Leucemia de Células Vilosas, forma variante (LCPv)
2) Linfomas Não Hodgkin em Fase Leucêmica (LNHL) Linfoma Folicular (LF)
Linfoma de Células do Manto (LCM)
Linfoma Esplênico com Linfócitos Vilosos (LELV)
Linfoma Linfoplasmocitóide ou Macroglobulinemia de Waldenström (MW) Linfoma de Burkitt (LB)
3) Mieloma Múltiplo (MM)
Leucemia de Células Plasmáticas (LCP)
DOENÇAS LINFOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS DE CÉLULAS T e NK 1) Leucemias Primárias
Leucemia de Linfócitos Grandes e Granulares (LLGG): Células T e NK Leucemia Prolinfocítica (LPL)
2) Linfomas Não Hodgkin em Fase Leucêmica (LNHL)
Leucemia de Células T do Adulto (LCTA) ou “Adult T Cell Leukemia” (ATLL) Micose Fungoide /Síndrome de Sézary (MF/SS)
Linfoma de Células T Periférico (LCTP)
Tabela 3 - Características imunológicas das Doenças Linfoproliferativas Crônicas. Antígenos Células – B Células T – NK LLC LPL LCV LLC LPL LECV LLC LPL LGC LPL LCTA SS LCTP Antígenos de Células B sIg + + + + + + + + (cyt) - - - - - CD10 - - - + - - - - CD19 + + + - + + + - - - - CD20 + + + + + + + - - - - CD21 + + + - + + + - - - - CD22 + + + + + + + - - - - CD23 + + + + - ? + - - - - CD79b -/+ + + + + + + - - - - CD52 + + + - + + + - - - - CD103 - - +/- - - - CD138 - - - + - - - - - CD200 + + + + + + + - - - - FMC7 -/+ + + + + + + - - - - Antígenos de células T e NK CD2 - - - + + + + + CD3 - - - +(T) + + + + CD4 - - - -/+ + + + +/- CD5 + -/+ - - + - - - +(T) + + + + CD7 - - - +(T) + -/+ - -/+ CD8 - - - +/- +/- - - - CD16-56 - - - +/- +(NK) - - - - TCR - - - -/+ + + + + TCR - - - +/- + + + + TCL-1 (cyt) - - - +/- +/- +/- +/- +/- Granzime - - - + +/- - - - Perfurine - - - + +/- - - - Outros Ciclina-D1 - - - - + - - - - HLA-Dr + + + + + + + - - - + - - CD11c - - + -/+ - -/+ - - - - CD25 -/+ - + - - - + - -/+ - + - - CD38 -/+ - + - - - +/- + +/- - + - - CD45 + + + + + + + - + + + + +
Nota: (sIg) Imunogl. de superfície; (TCR ϒ/δ) Receptor de cél. T gama/delta; (TCR α/β) Receptor de cél. T alfa/beta; (TCL1) Proteína 1A das
células T de leucemia/Linfoma; (HLA-Dr) Receptor de Superfície MHC classe II; (-) ausência de antigêno; (+) presença de antigeno; (-/+) antígeno presente em menos de 50% dos pacientes; (+/-) antígeno presente em mais de 50% dos pacientes; () expressão antigênica forte;
() expressão antigênica fraca; (cyt) presente no citoplasma; (T) Positivo em neoplasias T; (?) desconhecido; (LLC) Leuc. Linfoc. Crônica; (LPL) Leuc. Prolinfocítica; (LCV) Leuc. de Células Vilosas; (LF) Linfoma Folicular; (LCM) Linfoma do Manto; (LECV) Linfoma Esplênico de
Células Vilosas; (MW) ; (LCP) Leuc. de Cél. Plasmáticas; (LGLG) Leuc. de Grandes Linfóc. ; (LTA) Leuc.de Cél. T do Adl.; (SS) Síndrome Sézary; (LTP) Linfoma de Células T Periférico. Adaptado de Ruiz-Argüelles, GJ. & San-Miguel, JF (29).
2.4.4. Doenças Linfoproliferativas Crônicas de Células B
2.4.4.1. Leucemia Linfocítica Crônica (LLC)
A Leucemia Linfocítica Crônica (LLC) é a mais prevalente malignidade hematológica no ocidente, caracterizada pelo acúmulo anormal de linfócitos imuno-incompetentes(40)
É uma doença de adultos, ocorrendo em populações maiores que 35 anos. Estima-se que ocorram aproximadamente 15.100 novos casos por ano nos EUA, com uma prevalência de 140.000 casos(41)
Representa de 22% a 30% de todos os casos de leucemia, com uma incidência global projetada para algo entre <1 e 5,5 por 100.000 pessoas ao ano. Países como a Austrália, Estados Unidos da América (EUA), Irlanda e Itália têm as maiores taxas de incidência mundial, e a idade média do diagnóstico é em torno de 72 anos, com predomínio do sexo masculino na proporção de 2:1. Cerca de 5% a 10% dos casos, ocorrem entre familiares (42)
Houve uma crença geral de ser uma doença indolente, associada a um curso clínico prolongado, ou seja, de 10 a 20 anos, cuja eventual causa de morte pode não estar relacionada à LLC. No entanto, esta observação é verdadeira para menos de 30% dos pacientes(42).
Alguns pacientes, rapidamente, morrem de complicações ou causas ligadas diretamente à LLC, dentro de 2 a 3 anos, após o diagnóstico. Outros pacientes vivem de 5 a 10 anos com um curso inicial relativamente benigno, seguido de uma fase terminal de 1 a 2 anos. Durante esta fase, há uma morbidade considerável tanto da própria doença quanto de complicações da terapia(42) .
Durante a fase assintomática, os pacientes são capazes de manter o estilo de vida habitual. Mas, durante a fase terminal, o status de desempenho é fraco, com necessidades recorrentes de hospitalização. As causas mais frequentes de mortes são infecções sistêmicas graves, sangramentos ou caquexia (43)
Várias propostas têm sido sugeridas para a origem celular da LLC e, embora não haja consenso de qual seja seu correspondente celular anormal,
