UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE GEOCIÊNCIAS
CURSO DE GRADUAÇÃO EM OCEANOGRAFIA
ISANA SOUZA BARRETO
ESTUDO DA BIODEGRADAÇÃO DE PETRÓLEOS BRASILEIROS: ISOLAMENTO
E SELEÇÃO DE MICRORGANISMOS DEGRADADORES
Salvador
2016
1
ISANA SOUZA BARRETO
ESTUDO DA BIODEGRADAÇÃO DE PETRÓLEOS BRASILEIROS: ISOLAMENTO
E SELEÇÃO DE MICRORGANISMOS DEGRADADORES
Monografia apresentada ao Curso de Graduação em Oceanografia, da Universidade Federal da Bahia, Instituto de Geociências, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Bacharel em Oceanografia.
Orientadora: Prof.ª Dra. Olívia Maria Cordeiro de Oliveira Coorientadora: Prof.ª Dra. Danusia Ferreira Lima
Salvador
2016
2
TERMO DE APROVAÇÃO
ISANA SOUZA BARRETO
ESTUDO DA BIODEGRADAÇÃO DE PETRÓLEOS BRASILEIROS: ISOLAMENTO
E SELEÇÃO DE MICRORGANISMOS DEGRADADORES
Monografia aprovada como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Oceanografia, Instituto de Geociências, Universidade Federal da Bahia, pela seguinte banca examinadora:
Aprovado em: _____ de _____________ de ______.
BANCA EXAMINADORA
_______________________ Danusia Ferreira Lima – Coorientadora
Doutora em Geologia pela Universidade Federal da Bahia/ UFBA/ Brasil.
_______________________ Sarah Adriana Rocha Soares
Doutora em Química pela Universidade Federal da Bahia/ UFBA/ Brasil.
_______________________ Ilene Matanó Abreu
Doutora em Geoquímica pela Universidade Federal Fluminense/UFF/ Brasil.
3 Dedico este trabalho ao meu pai, Reinaldo Cardozo Barreto,
4
Agradecimentos
Primeiramente sou grata a minha coorientadora Danusia (mulher de ouro), obrigada pela oportunidade, confiança, paciência e orientação.
Gratidão ao meu pai (meu grande incentivador e investidor), a toda minha família, minhas irmães, minhas tias, avós e primas pelo apoio.
Agradeço de coração, aos meus grandes amigos, Tainara, Luanna, Lindoca, Lais, Barreto, Lucas Coppa, Mini, Jel, que tanto me incentivaram.
Aos meus companheiros de laboratório, Carlito, Marcão, Mila, Anderson, Clarinha, Milton, Keila, Mari e Cintia.
A grande e maravilhosa equipe do NEA, Ruy, Ilene, Sarinha, Monsieur Jam, Gi, Alex, Regina, Lismar, Drica, Naná, Cícero por serem sempre solicitos e gentis.
Aos meus professores, em especial ao prof Cícero, Angelo, Karina, Antônio Fernando, Augusto Minervino, Hebe, por serem exemplos de dedicação e profissionalismo.
A minha orientadora, professora Olívia e a Claudia Yolanda, pela oportunidade e contribuições dadas ao trabalho.
Aos meus coordenadores do PRH-52, professor Leonardo (sempre prestativo e gentil) e ao professor Ícaro.
A Agência Nacional de Petróleo e Gás (ANP), Programa de Recursos Humanos da ANP, ao DEMPETRO e ao NEA, pelo suporte financeiro e logístico fornecido para a construção deste trabalho.
E a todos que, mesmo aqui não citados, contribuíram para essa etapa da minha vida acadêmica.
5 “A ciência trabalha na fronteira entre conhecimento e ignorância. Não temos medo de admitir algo que não sabemos. Não ha vergonha nisso, a única vergonha é fingir que temos todas as respostas.” (Neil deGrasse Tyson)
“A verdadeira sobrevivência da espécie humana depende da manutenção de um oceano vivo e limpo, em toda a sua extensão.
“O oceano é o cinto de segurança do planeta.” (Jacques Cousteau)
“A generosidade é o melhor negócio para humanidade.”
6
RESUMO
Apesar dos recentes avanços tecnológicos, acidentes com derramamento de petróleo tem se tornado uma fonte expressiva de poluição marinha, gerando impactos econômicos e ambientais. Dentre as estratégias para o controle da contaminação, a biorremediação é um ramo da biotecnologia ambiental que pode ser utilizada para recuperação dos ecossistemas marinhos impactados, através das atividades metabólicas bacterianas e fúngicas, que degradam os hidrocarbonetos de petróleo, utilizando-o como fonte de carbono. Desta forma, este estudo tem como objetivo avaliar a biodegradação dos compostos de petróleo, isolar e selecionar microrganismos com potencial degrador, através de análises geoquímicas e microbiológicas. Para isto, foram utilizadas amostras de água do mar coletadas do experimento de simulação de derramamento ao longo de 180 dias, para os petróleos da Bacia do Recôncavo, Campos, Potiguar, Santos e Sergipe-Alagoas. A partir dos resultados obtidos, foi possível inferir que houve degradação dos petróleos, corroborado pela variação das quantidades das razões de P/n-C17, F/n-C18, P/F e HPT/UCM, devido principalmente a fotoxidação e a biodegradação. Foram isolados 19 bactérias e 17 fungos, testados quanto à eficiência degradadora e verificou-se que diferentes grupos microbianos apresentaram capacidade em degradar distintos tipos de petróleo em tempos variados.
7
ABSTRACT
Despite the recent technological advances, oil spill accidents have become an significant source of marine pollution, occasioning economic and environmental impacts. Among the strategies for the control contamination, bioremediation is an environmental biotechnology branch that is used for recovery of impacted marine ecosystems, by bacterial and fungal metabolic activity degradein oil hydrocarbons, utilizing them as a carbon source. Thus, this study aims to evaluate the biodegradation of oil compounds, isolate and select microorganisms with degrador potential through geochemical and microbiological analysis. For this, sea water samples were collected using oil pouring simulation experiment over 180 days, for the oil Recôncavo, Campos, Potiguar, Sergipe-Alagoas and Santos Basin. From the results obtained, it was possible to prove that there was degradation of the oils, corroborated by by the variation of the ratio of P/n-C17, F/n-C18, P/F and HPT/UCM, mainly due to photo-oxidation and biodegradation. There was 19 bacteria strain and 17 fungi isolated, which were tested for degrading efficiency and it was found that microbial groups presented different capacity to degrade distinct oil types at various times.
8
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Bacias sedimentares brasileiras, com destaque para as principais Bacias Petrolíferas Brasileiras. ...17 Figura 2- Local de amostragem da água do mar. ...26 Figura 3- Trabalho de Campo. (a) Coleta de sedimento em recipientes de alumínio e (b) Coleta de água do mar em garrafões de 20L. ...27 Figura 4- Montagem do experimento na bancada de laboratório do NEA. (a) Unidades de simulação de vidro e (b) Aquários com bomba de aeração para simulação de ondas. ...28 Figura 5- Montagem do experimento. (a) Amostras de petróleos das Bacias do Recôncavo, Campos, Potiguar, Sergipe e Santos; (b) Adição de amostra de petróleo cru nas unidades de simulação. ...29 Figura 6- (a) Câmara de Fluxo Laminar, (b) Aparato de Filtração à Vácuo e (c) Amostras de soluções salinas diluídas. ...33 Figura 7- Isolamento de fungos e bactérias das amostras. (a) Procedimento de isolamento de microrganismo e (b) Purificação por estrias múltiplas para bactérias. ...34 Figura 8- Preservação dos microrganismos pelo Método Castellane. (a) Procedimento de corte e transferência para frasco-ampola de vidro e (b) Colônias etiquetadas e embaladas. ...36 Figura 9- Teste de oxidação em placas multipoços. (a) Confecção de placa multipoços para o petróleo de Campos e (b) Ilustração da mudança de cor do indicador DCPIP após 24 h de incubação ...37 Figura 10- Teste de oxidação com agitação. (a) Procedimento em Fluxo Laminar e (b) Incubadora com mesa agitadora. ...38 Figura 11- Procedimento para leitura do Teste de oxidação com agitação. (a) Espectrofotômetro de absorção molecular e (b) Vails para leitura. ...39 Figura 12- Filtros elaborados para reter as partículas em suspensão das amostras. ...40 Figura 13- Procedimento de Coloração das lâminas utilizando um Kit Gram. (a) Reagente violeta de genenciana; (b) Mordente lugol; (c) Álcool absoluto e (d) Safranina fuscina genicada. ...41 Figura 14- Confecção de lâmina para visualização no microscópio. ...42 Figura 15- (a) Procedimento de Microcultivo; (b) Confecção das lâminas no 1° dia e (c) Lâminas após sete dias de cultivo. ...43 Figura 16- (a) Microscópio Óptico utilizado para visualizar os microrganismos nas lâminas. (b) Programa Cellsens Dimension. ...43 Figura 17- Monitoramento in situ, dos parâmetros físico-químicos. ...45 Figura 18- Gráfico das razões P/n-C17, F/n-C18, P/F e HPT/UCM para as unidades de simulação nos tempos 0, 20, 80, 120 e 180. (a) HPT/UCM, (b) P/F, (c) F/n-C18 e (d) P/n-C17. ...48 Figura 19- Gráfico para o número de células viáveis das unidades de simulação nos tempos 0, 20, 80, 120 e 180. (a) Número de células viáveis de bactérias e (b) Número de células viáveis de fungos. ...51 Figura 20- Gráfico de percentuais médios da utilização da fonte de carbono pelas cepas bacterianas para o teste 1. ...55 Figura 21- Gráfico de percentuais médios da utilização da fonte de carbono pelas cepas bacterianas para o teste 2. ...55 Figura 22- Mudança de coloração do DCPIP da forma oxidada para forma reduzida. ...56
9 Figura 23- Gráfico de percentuais médios da utilização da fonte de carbono pelas cepas bacterianas e isolados fúngicos para o teste1. ...56 Figura 24- Gráfico de percentuais médios da utilização da fonte de carbono pelas cepas bacterianas e isolados fúngicos para o teste 2. ...57 Figura 25- Mudança de coloração do DCPIP da forma oxidada para forma reduzida. ...58 Figura 26- Gráfico de percentuais médios da utilização da fonte de carbono pelas cepas bacterianas e isolados fúngicos para o teste1. ...58 Figura 27- Gráfico de percentuais médios da utilização da fonte de carbono pelas cepas bacterianas e isolados fúngicos para o teste 2. ...59 Figura 28- Mudança de coloração do DCPIP da forma oxidada para forma reduzida. ...60 Figura 29- Gráfico de percentuais médios da utilização da fonte de carbono pelas cepas bacterianas e isolados fúngicos para o teste1. ...60 Figura 30- Gráfico de percentuais médios da utilização da fonte de carbono pelas cepas bacterianas e isolados fúngicos para o teste 2. ...61 Figura 31- Mudança de coloração do DCPIP da forma oxidada para forma reduzida. ...62 Figura 32- Gráfico de percentuais médios da utilização da fonte de carbono pelas cepas bacterianas e isolados fúngicos para o teste1. ...62 Figura 33- Gráfico de percentuais médios da utilização da fonte de carbono pelas cepas bacterianas e isolados fúngicos para o teste 2. ...63 Figura 34- Mudança de coloração do DCPIP da forma oxidada para forma reduzida. ...64 Figura 35- Estruturas similares de gêneros dos fungos Aspergillus e Penicillium. ...65 Figura 36- Estruturas similares de gênero dos fungos (a) Aspergillus e (b) Penicillium encontrado nas cepas isoladas. ...65 Figura 37- Cepas fúngicas selecionadas pelo teste de oxidação. (a) Imagem real da cepa fúngicas crescidas em meio BDA e (b) Imagem fotográfica em lâmina da cepa fúngicas obtidas por microscopia ótica de x40. ...66 Figura 38- Cepas bacterianas selecionadas pelo teste de oxidação. (a) Imagem real da cepa bacteriana em meio ágar nutriente e (b) Imagem fotográfica em lâmina da cepa bacteriana obtida por microscopia ótica de x40. ...68
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Densidade e fluidez para as amostras de petróleos utilizadas no experimento. ...31
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Lista de alguns gêneros de microrganismos degradadores de compostos do petróleo descritos na literatura...22 Quadro 2- Descrição geológica e geoquímica das amostras de petróleo cru utilizadas no experimento...30
11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABNT – Associação Brasileira de Normas Técnicas
ANP – Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis API – Do Inglês, American Petroleum Institute
BDA – Batata-Dextrose-Agar BR – Abreviatura de Branco BTS – Baía de Todos os Santos CA – Abreviatura de Campos
CG/FID- Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização de Chama DCM - Diclorometano
EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária HPAs – Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos
HTP– Hidrocarbonetos Totais do Petróleo IGEO – Instituto de Geociências
LEPETRO – Laboratório de Estudos do Petróleo mL – Mililitro
NEA – Núcleo de Estudos Ambientais NSO – Nitrogênio, Enxofre e Oxigênio
PCA – Principal Component Analysis; Método estatístico, Análise de componentes principais PETROBRAS – Petróleo Brasileiro S.A.
pH – Potêncial Hidrogeniônico PO – Abreviatura Potiguar RE – Abreviatura de Recôncavo RPM – Rotação por Minuto SA – Abreviatura de Santos
SE – Abreviatura de Sergipe - Alagoas
Whole oil – Óleo total, análise cromatográfica para alcanos n-C8 a n-C40, isoprenóides
Pristano e Fitano e UCM
UCM- Unresolved Complex Misture; Mistura Complexa Não Resolvida μL – Microlitro, Unidade de Volume
12
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 14
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 16
2.1 PETRÓLEO ... 16
2.2 IMPACTO AMBIENTAL POR DERRAMAMENTO DE PETRÓLEO ... 18
2.3 BIORREMEDIAÇÃO ... 20 3. OBJETIVOS ... 25 3.1 OBJETIVO GERAL ... 25 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 25 4. ÁREA DE AMOSTRAGEM ... 26 5. MATERIAIS E MÉTODOS ... 27 5.1 TRABALHO DE ESCRITÓRIO ... 27 5.2 TRABALHO DE CAMPO ... 27 5.3 TRABALHO DE LABORATÓRIO ... 28 5.3.1 MONTAGEM DO EXPERIMENTO ... 28 5.3.2 ANÁLISES GEOQUÍMICAS ... 29 5.3.3 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS ... 32
5.3.3.1 QUANTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS ... 32
5.3.3.2 ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS ... 34
5.3.3.3 QUANTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS TOTAIS ... 35
5.3.3.4 PRESERVAÇÃO DOS MICRORGANISMOS ... 35
5.3.3.5 SELEÇÃO DOS MICRORGANISMOS... 36
5.3.3.5 CLASSIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS ... 40
6. RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 44
6.1 ANÁLISES GEOQUÍMICAS ... 44
6.1.1 MONITORAMENTO GEOQUÍMICO ... 44
6.1.2 BIODEGRADAÇÃO DO PETRÓLEO ATRAVÉS DA ANÁLISE DOS PERFIS GEOQUÍMICOS ... 48
6.2 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS ... 51
6.2.1 ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE MICRORGANISMOS DEGRADADORES DE HIDROCARBONETOS ... 54
6.2.2 CLASSIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS DEGRADADORAS DE HIDROCARBONETOS .. 65
7. CONCLUSÃO ... 71
8. APÊNDICE ... 72
13 APÊNDICE 2 – Média dos parâmetros geoquímicos das unidades de simulação do
experimento. ... 73 APÊNDICE 3- Média do número de células viáveis das unidades de simulação do
experimento. ... 74 APÊNDICE 4- Média dos resultados obtidos para os Testes 1 e 2 das cepas fúngicas e
bacterianas da unidade de simulação do petróleo da Bacia de Campos. ... 74 APÊNDICE 5- Média dos resultados obtidos para os Testes 1 e 2 das cepas fúngicas e
bacterianas da unidade de simulação do petróleo da Bacia de Potiguar. ... 75 APÊNDICE 6- Média dos resultados obtidos para os Testes 1 e 2 das cepas fúngicas e
bacterianas da unidade de simulação do petróleo da Bacia do Recôncavo. ... 76 APÊNDICE 7- Média dos resultados obtidos para os Testes 1 e 2 das cepas fúngicas e
bacterianas da unidade de simulação do petróleo da Bacia de Santos. ... 77 APÊNDICE 8- Média dos resultados obtidos para os Testes 1 e 2 das cepas fúngicas e
bacterianas da unidade de simulação do petróleo da Bacia de Sergipe. ... 78 9. REFERÊNCIAS ... 79
14
1. INTRODUÇÃO
O petróleo, desde sua descoberta em território nacional, transformou profundamente a economia, a sociedade e o espaço do Brasil, principalmente nas últimas quatro décadas, fornecendo energia e matérias-primas para o processo de industrialização, gerando além de crescimento econômico, muitos problemas ambientais (MONIÉ, 2003; SILVA et al. 2008).
A exploração de petróleo e gás “offshore” é considerada uma fonte pontencial de impactos ambientais, dentre as atividades antrópicas localizadas na plataforma continental. Além dos riscos de acidentes durante a operação de poços, prospecção e perfuração, estas atividades são fontes significativas de hidrocarbonetos, partículas em suspensão e metais pesados (POZEBON, 2005; LACERDA et al., 2006).
O litoral brasileiro é formado por um mosaico de ecossistemas de alta relevância ambiental, manguezais, restingas, dunas, praias, ilhas, costões rochosos, baías, brejos, falésias, estuários, recifes de corais e outros ambientes importantes do ponto de vista ecológico, todos apresentando diferentes espécies animais e vegetais (IBAMA, 2010).
Dentre as várias tecnologias disponíveis para o tratamento destes locais contaminados, a biorremediação, é considerada uma tecnologia ecologicamente correta e de baixo custo, particularmente quando aplicada a locais contaminados por petróleo. Essa técnica utiliza-se da habilidade de microrganismos, para restaurar e preservar a qualidade ambiental para todas as formas de vida de um ecossistema. A utilização de plantas, bactérias e fungos para os processos de biorremediação tem sido muito relatada ultimamente, principalmente quanto ao uso de fungos e bactérias, devido ao seu grande potencial genético (SRIVASTAVA; THAKUR, 2006; MARTINS, 2009; LIMA, 2014; SOUZA, 2003).
Para a aplicação da técnica de biorremediação em ambientes contaminados por derramamento de petróleo é importante avaliar as variáveis que influenciam no processo de biodegradação dos componentes do óleo no meio natural, como a composição química dos diferentes tipos de petróleo, provenientes de diversas regiões produtoras, o grande número de produtos refinados e ainda a ação de processos de intemperismo (SOUZA, 2003). As taxas de biodegradação dos componentes do petróleo também variam com o local e com fatores ambientais, como a temperatura, presença de oxigênio, nutrientes e pH, e são limitadas pela capacidade metabólica das populações de microrganismos autóctones degradadores de hidrocarbonetos (COELHO, 2005; LIMA, 2014).
É possível medir a eficiência da técnica de biorremediação através de testes de monitoramento, com ensaios microbiológicos, onde é possível identificar fatores limitantes e sua otimização. Estes são normalmente usados na determinação do potencial degradador
15 da microflora local, da taxa e da extensão com que a biodegradação acontece durante a biorremediação (BALBA et al., 1998; SOUZA, 2003; COELHO, 2005; LIMA, 2014).
Dessa maneira, este trabalho visa avaliar a capacidade de microrganismos, coletados em experimentos de mesocosmos simulando um derramamento, em biodegradar hidrocarbonetos de petróleo. O processo de biodegradação foi monitorado ao longo de 180 dias, sendo selecionados fungos e bactérias potenciais.
16
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 PETRÓLEO
O petróleo (do latim petra oleum – “óleo de pedra”) é considerado uma substância oleosa, inflamável e menos densa que a água. Na Antiguidade era utilizado nas formas de betume, asfalto, alcatrão, como impermeabilizante ou inflamável com finalidades bélicas, entre outros usos (CANUTO, 2008; FERDANDES, 2009).
A composição do petróleo é formada por uma mistura complexa de hidrocarbonetos que podem ser divididos em quatro frações: saturados, aromáticos, resinas e asfaltenos. A fração dos compostos saturados inclui os n-alcanos, alcanos ramificados (isoalcanos) e cicloalcanos. A fração aromática contém hidrocarbonetos monoaromáticos voláteis como benzeno, tolueno e xileno; os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA); os nafteno-aromáticos; e compostos de enxofre, tais como tiofenos e dibenzotiofenos. As resinas e a fração asfalteno consistem de moléculas polares contendo nitrogênio, enxofre e oxigênio. As resinas caracterizam-se por serem sólidos amorfos dissolvidos no óleo, enquanto os asfaltenos apresentam-se como grandes moléculas coloidais, dispersas no óleo. A proporção destas frações no petróleo depende de fatores tais como fonte, história geológica, idade, migração ou alteração do mesmo (BALBA et al., 1998; PIRÔLLO, 2006).
O Brasil é um país com uma das maiores extensões de margem continental do mundo, abrangendo diversos segmentos com bacias sedimentares com diferentes características geológicas e diferentes graus de conhecimento do potencial exploratório (ASMUS et al.; PONTES, 1973; PONTE et al. 1980; OJEDA, 1982; ASMUS, 1984; GUARDADO et al. 1989; MOHRIAK et al. 1990 a; MOHRIAK et al. 1990 b; CHANG et al. 1992; MATOS, 1992; BIZZI et al., 2003).
A maioria das bacias sedimentares brasileiras foi formada no paleozoico/mesozoico e são classificadas em Intracratônica, Strike-Slip, Antepaís e Riftes Abortados (Aulacógenos) (BIZZI, et al., 2003). Das vinte e cinco bacias sedimentares existente no território brasileiro, dezessete são offshore (no mar ou submersas) e ocupam uma área de 1.550.000,00 Km2 (até a lâmina d’água de 3.000 m); oito são onshore (no continente ou emersa), ocupando uma extensão de 4.500.000,00 Km2 (ANP, 2015; REYS, 2015).
No Brasil, o primeiro direito de extração foi concedido em 1858, para exploração de mineral betuminoso, na Bahia. Pesquisas e perfurações de poços foram efetuadas de forma esparsa na Bahia, Alagoas e São Paulo até que, em 1939, foi encontrado petróleo a 210 metros de profundidade em Lobato, Bahia. O primeiro campo comercialmente viável foi descoberto dois anos depois, em Candeias, também na Bahia (THOMAS, 2001).
17 De acordo com o Ministério de Minas e Energia (MME), as principais bacias petrolíferas brasileiras têm origem das Bacias de Campos, Santos, Potiguar, Recôncavo e Sergipe – Alagoas (Figura 1).
Figura 1- Bacias sedimentares brasileiras, com destaque para as principais Bacias Petrolíferas Brasileiras.
Fonte: Modificado da ANP pela autora.
A Geoquímica do Petróleo se baseia na aplicação de princípios químicos para o estudo da origem, migração, acumulação e alteração do petróleo. As ferramentas geoquímicas são medidas técnicas, modelos conceituais e numéricos, construídos diretamente da extrapolação de dados dos experimentos laboratoriais (HUNT, 1996; HUC, 2003; ARAUJO, 2007).
Os parâmetros químicos da composição do petróleo, perfis de distribuição dos compostos por análise cromatográfica e as razões moleculares de biomarcadores são ferramentas importantes na interpretação de dados para processos de remediação.
18
2.2 IMPACTO AMBIENTAL POR DERRAMAMENTO DE PETRÓLEO
A Zona Costeira brasileira é uma unidade territorial, definida em legislação para efeitos de gestão ambiental, que se estende por 17 estados e abriga mais de 400 municípios, distribuídos do norte equatorial ao sul temperado do País (CETESB, 2007).
As regiões costeiras constituem menos de 20% da superfície do planeta, mas acomodam mais de 45% da população humana, hospedando 75% das grandes cidades com mais de 10 milhões de habitantes. Esta é uma importante zona de produção de alimentos por meio de atividades como agropecuária, pesca e aquicultura. Além disso, é foco de desenvolvimento industrial, de transporte e fonte significativa de recursos minerais, incluindo petróleo e gás natural; principal destino turístico em todos os continentes; e abundante reservatório natural, do qual depende o funcionamento do planeta (ZAMBONI et al., 2008).
As zonas costeiras são consideradas regiões de transição ecológica que desempenham importante função de ligação e trocas genéticas entre os ecossistemas terrestres e marinhos, fato que as classificam como ambientes complexos, diversificados e de extrema importância para a sustentação da vida no mar (MMA, 2002).
Diversas espécies marinhas são fonte de consumo humano direto e indireto. Os recursos vivos marinhos podem ser componentes para fármacos, cosméticos ou outros usos médicos, fertilizantes, genes usados na biotecnologia, matéria-prima para indústrias ou usada na construção civil, além de todos os usos para a aquicultura (THORNE-MILLER, 1999). Além disso, mais da metade da produção mundial de petróleo é retirada dos oceanos (ZAMBONI et al., 2008).
A biodiversidade dos oceanos é enorme, apesar de ser pouco investigada. Contudo, é mundialmente reconhecida a ameaça de acidentes ambientais, principalmente com produtos químicos e petroquímicos embarcados. As pressões à integridade e ao equilíbrio ambiental das regiões costeiras, devido aos grandes conflitos de uso, fazem destas uma das mais ameaçadas do planeta, e a conservação desses recursos tende a ser cada vez mais problemática e custosa, tanto do ponto de vista político quanto ambiental (MMA, 2002).
O setor petrolífero, que tem muitas de suas instalações (de produção, transporte, tancagem e processamento) em localidades litorâneas, é a principal fonte de poluição por óleo, em suas formas crônicas e agudas, especialmente em áreas de ecossistemas sensíveis em áreas abrigadas. Estima-se que entre os anos de 1972 a 2014, cerca de 2.488.000 toneladas de óleo cru tenha sido derramado no mar devido aos acidentes ocorridos ao longo dos anos (ITOPF, 2014; SANTOS, 2016).
Derramamentos de petróleo no mar refletem-se diretamente sobre os ecossistemas costeiros próximos ao local do acidente, exigindo as ações necessárias para minimizar os efeitos causados pela contaminação e escolha das técnicas de limpeza que melhor se
19 aplicam a determinado ambiente devem ser definidas antes que o acidente ocorra (CETESB, 2007). As principais causas dos grandes derramamentos de petróleo, no período de 1970 a 2014, ocorreram durante a navegação em mar aberto (41%); e causados por colisões e encalhes (59%)(CANTAGALLO; MILANELLI; DIAS-BRITO, 2007; ITOPF, 2014; REYES, 2015).
Os pequenos vazamentos provenientes do transporte marítimo correspondem a 98% das perdas totais de petróleo e derivados. As perdas acidentais de 2% contribuem com o lançamento de aproximadamente 400 mil ton/ano de óleo no meio ambiente. O primeiro caso conhecido foi em 1967, envolvendo o encalhe do navio Torrey Canyon, derramando 123 mil toneladas de petróleo na zona costeira da Inglaterra e França, causando mortandade de aves e prejuízos à pesca e ao turismo (CETESB, 2005)
Apesar das estatísticas demonstrarem queda no número de acidentes que envolvem derramamentos de óleo no mar, eles continuam a ocorrer, e ameaçam, na maioria das vezes, a qualidade ambiental de ecossistemas costeiros. Em acidentes com grandes proporções, é necessário empregar procedimentos de limpeza especiais para cada tipo de situação, no entanto, várias estratégias de limpeza são mais prejudiciais que a própria ação do óleo. Por este motivo, a escolha dos procedimentos é fundamental para minimizar os impactos e acelerar os processos de recuperação dos ambientes contaminados (CETESB, 2007).
Perante a impossibilidade de eliminar riscos de acidentes, é essencial que tanto a indústria como os órgãos públicos estejam preparados para atender situações emergenciais com vazamento de óleo no mar. O plano de contingência é indispensável para determinar com antecedência os procedimentos para minimizar os impactos de qualquer natureza (IPIECA, 2000a; ITOPF, 1985a; CETESB, 2007).
Um procedimento de limpeza eficiente do ponto de vista do órgão ambiental é aquele que possibilita a remoção do contaminante, com mínimos impactos adicionais ao ecossistema atingido e favorece a recuperação do ambiente no menor tempo possível, entretanto, isso não significa a total remoção de qualquer resquício de óleo (KERAMBRUN; PARKER, 1998; DICKS, 1998; DICKS et al., 2000; CETESB, 2007).
Alguns dos procedimentos realizados para conter e limpar o ambiente contaminado por petróleo é: a contenções e a remoção mecânica em mar, que se bem feita, previne a contaminação costa da e necessidade de limpeza; uso de absorventes sintéticos e naturais; enterramento e revolvimento do sedimento; jateamento com água de alta e baixa pressão; biorremediação; dentre outros (CETESB, 2007).
20
2.3 BIORREMEDIAÇÃO
Baird (2002) definiu a biorremediação como “o uso de microrganismos vivos para degradar ou eliminar resíduos ambientais”. Em 1946, Zobell demonstrou a capacidade de certos microrganismos difundidos na natureza serem capazes de utilizar hidrocarbonetos como fonte de carbono e que a natureza do óleo e as condições ambientais eram altamente importantes no seu comportamento (BENTO, 2015). A biorremediação é baseada em três princípios básicos: a presença do microrganismo com capacidade metabólica, a disponibilidade do contaminante e as condições ambientais adequadas para o crescimento e atividade microbiana (PEREIRA et al., 2005, MENEGHETTI, 2007; CARNEIRO et al., 2010).
A biorremediação é considerada como uma tecnologia emergente para tratar locais contaminados mediante o uso de agentes biológicos capazes de modificar ou decompor poluentes alvos, que se tornou a principal aplicação da biotecnologia ambiental (MARIANO, 2006; SAN MARTÍN, 2011). O processo de biorremediação encontra-se em desenvolvimento tecnológico há, pelo menos, duas décadas. Foi aplicado em diversos cenários reais como os vazamentos dos navios Exxon Valdez, Amoco Cadiz, Apex Barge, Mega Borg, e Prestige (NOAA, 2004; SWANNELL; LEE; DONAGH, 1996, WHITFIELD, 2003; CETESB, 2007).
Dentre as estratégias de biorremediação existentes, destacam-se a bioaumentação, que é o uso de bactérias e outros microrganismos no meio ambiente capazes degradar contaminantes, como suplemento à comunidade microbiológica existente; e bioestimulação, que é a aplicação de nutrientes e co-substratos em áreas contaminadas para estimular o crescimento de populações autóctones de organismos capazes de degradar contaminantes; biorremediação intrínseca ou natural, que é a utilização de microrganismos autóctones, ou seja, do próprio local, sem qualquer interferência de tecnologias ativas de remediação. O benefício desses processos é a mineralização do poluente, isto é, a transformação em gás carbônico, água e biomassa (BENTO et al., 2003; MARIANO, 2007; LEE et al.,1999; CETESB, 2007).
No processo de biodegradação alguns microrganismos são munidos de arsenais enzimáticos capazes de utilizar o petróleo como fonte de carbono e energia através dos processos microbianos, resultando na quebra das moléculas em compostos de baixa massa molecular (VASCONCELOS, 2006; ZHANG et al., 2005; PIRÔLLO, 2006). No início do processo, os hidrocarbonetos são utilizados pelos microrganismos como fonte de energia (doadores de elétrons), enquanto os nutrientes (oxigênio molecular, nitratos, sulfatos ou íon férrico) são necessários como receptores de elétrons para a atividade microbiana. Ao final do processo de biodegradação os hidrocarbonetos são transformados em metabólitos, tais
21 como ácidos orgânicos e/ou CO2, levando a uma diminuição do teor de hidrocarbonetos saturados (CRUZ, 2012).
Além da produção de CO2 na degradação total, o destino dos hidrocarbonetos pode oferecer caminhos alternativos. Eles podem ser armazenados como glóbulos e alguns podem ser incorporados como biomassa (BERTRAND et al, 1983; DUMENIL et al, 1988). Contudo, os produtos parcialmente oxidados podem ser mais tóxicos e mutagênicos que o hidrocarboneto original. Dessa forma, existe a chance que ocorra um aumento temporário na toxidade e mutagenicidade durante o processo de biodegradação (WANG et al, 1990; BENTO, 2005).
Muitos microrganismos possuem a capacidade enzimática para degradar hidrocarbonetos do petróleo. Alguns microrganismos degradam alcanos (normal, ramificado, cíclico), outros aromáticos, e ainda outros degradam tanto hidrocarbonetos aromáticos quanto alcanos. Frequentemente, os n-alcanos com número de carbonos variando entre C
10 a C
26 são prontamente degradados, assim como os compostos tóxicos monoaromáticos benzeno, tolueno e xileno. A biodegradação de petróleo no ambiente marinho é realizada por uma grande diversidade de populações bacterianas, incluindo várias espécies de
Pseudomonas (ATLAS, 1995; PIRÔLLO, 2006).
Os microrganismos capazes de realizar a função de biorremediação são conhecidos como biorremediadores (Agarwal, 1998). Vários microrganismos (Pseudomonas,
Burkholderia, Sphingomonas, Ralstonia, Comamonas, Achromobacter, Alcaligenes, Rhodococcus, Dehalococcoides) são conhecidos por degradar compostos xenobióticos, ou
acumular ou desintoxicar poluentes de metais traço, tais como Cd, Hg, Pb, Zn e L. (DALY, 2000; LLOYD et al., 2003). Alguns dos principais gêneros de agentes biorredutores que obtiveram sucesso na degradação de compostos do petróleo foram descritos na literatura (Quadro 1). Entretanto, o efeito esperado dos microrganismos depende da seleção específica para cada tipo de contaminante assim como as dadas condições adequadas para seu desenvolvimento.
22
Quadro 3- Lista de alguns gêneros de microrganismos degradadores de compostos do petróleo
descritos na literatura.
Microrganismo Gênero Referências
Bactérias
Achromobacter, Acidovorans, Acinetobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Aeromonas,
Arthrobacte, Beijemickia, Burkholderia, Bacterium, Bacillus, Comomonas, Corynebacterium,
Cycloclasticus, Flavobacterium, Gordonia, Kocuria, Klebsiella, Microbacterium, Moraxella,
Mycobacterium, Micrococcus, Neptunomonas, Nocardia, Ochrobactrum, Paracoccus, Pasteurella, Polaromonas, Proteus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodococcus, Staphylococcus, Sphingomonas, Stenotrophomona, Spirillum.Vibrio, Xanthomonas.
Wetler-Tonini, R. M. C. et al., 2010; Jacques et. al., 2007; Mariano, 2006. Fungos
Aspergillus, Bjerkandera, Candida, Chrysosporium, Cunnighamella, Curvularia, Drechslera, Fusarium, Lasiodiplodia, Mucor, Penicillium, Peniophora, Phanerochaete, Phlebia, Pleorotus, Prototheca, Rhizopus, Rhodosporidium, Rhodotorula, Sacharomyces, Sporobolomyces, Trichosporom, Trametes, Trichoderma. Behnood; Nasernejad; Nikazar, 2014; Balaji; Arulazhagan; Ebenezer, 2014; Lee et al., 2014; Mariano, 2006. Fonte: Modificado de DANTAS, 2016.
A utilização de plantas, bactérias e fungos para os processos de biorremediação tem sido muito relatada, principalmente quanto ao uso de fungos e bactérias, devido ao seu grande potencial genético (SRIVASTAVA; THAKUR, 2006; MARTINS, 2009; LIMA, 2014; SOUZA, 2003).
As bactérias são caracterizadas como seres unicelulares; sem carioteca; com paredes celulares, quase sempre, contendo o polissacarídeo complexo peptideoglicano; invisíveis a olho nu, só podendo ser visualizada com o auxílio do microscópio. Existe uma grande variedade de tipos de bactérias e suas formas variam, dependendo do gênero da bactéria e das condições em que elas se encontram. Geralmente apresentam uma das três formas básicas: cocos, bacilos ou espirilos (CARVALHO, 2010).
A parede celular é uma estrutura rígida que mantem a forma característica de cada célula bacteriana, são estruturas heterogêneas, apresentam camadas de diferentes substâncias que variam de acordo com o tipo de bactéria. Elas diferem em espessura e em composição, e servem como barreiras para algumas substâncias, previnem à evasão de certas enzimas, assim como a entrada de certas substâncias químicas e enzimas indesejáveis, que poderiam causar danos à célula. As bactérias podem ser encontradas, sobretudo no solo, na água doce e nos mares, mas também no corpo humano, nos animais, nas plantas, nos alimentos, entre outros. Dentre os principais grupos de bactérias existentes podemos citar: bactérias Gram-positivas, Gram-negativas, espiroquetas, riquétsias, clamídias, micoplasmas, micobactérias, actinomicetos, cianobactérias, entre outros (CARVALHO, 2010).
23 Algumas características das bactérias propiciam sua adaptação a várias condições ambientais, como seu crescimento rápido, versatilidade metabólica, plasticidade genética e rápida adaptação a variações do meio. Para sua sobrevivência e crescimento, bactérias necessitam basicamente de energia, carbono e nutrientes (MARTINS, 2004; TONINI, 2010).
Os fungos são caracterizados como organismos eucarióticos, heterotróficos e, geralmente, multicelulares. Em sua maioria, são constituídos por filamentos microscópicos e ramificados, as hifas, e o conjunto delas, constitui o micélio. Apresentam a parede celular com presença de substâncias quitinosa e células com organelas membranosas; reserva de energia na forma de glicogênio; normalmente crescem melhores em ambientes em que o pH é ácido, o qual são desfavoráveis para o crescimento da maioria das bactérias comuns; quase todos possuem forma aeróbica; e a maioria dos fungos é mais resistente a pressão osmótica que as bactérias (CARVALHO, 2010).
A capacidade de muitas espécies microbianas em utilizar hidrocarbonetos como substrato de crescimento, degradando os poluentes e utilizando-os como fonte de carbono e energia, pode ser explicada pela presença de petróleo em toda a biosfera (BOOPATHY, 2000; RAMSAY et al. 2000; WIDDEL et al., 200; DÍAZ, 2004; MANDRI et al., 2007; TONINI, 2010).
O petróleo nunca é completamente degrado e sempre deixa algum resíduo complexo, que frequentemente apresenta-se como um piche preto contendo uma alta proporção de compostos asfálticos. Entretanto, possui baixa toxicidade e biodisponibilidade, tornando-se contaminante inerte no meio ambiente (ATLAS, 1995).
Algumas das principais limitações existentes à biodegradação induzida é a falta ou limitação de oxigênio em ambientes redutores, como sedimentos de manguezais, onde mesmo com abundância de nutrientes a degradação anaeróbica é muito menos eficiente, visto que a biodegradação é essencialmente um processo aeróbico (EVANS; RICE, 1974; LEE; DE MORA, 1999; CETESB, 2007). Por outro lado, ambientes abertos como praias são menos sujeitos a limitações de oxigênio, mas torna-se difícil manter os nutrientes em sedimentos lavados pelas ondas e marés antes de serem incorporados pela microflora (CETESB, 2007). A baixa solubilidade em água é uma das características comuns a todas as frações de petróleo, o que dificulta a ação microbiana em degradá-los (KANALY et al. 2000, YU et al. 2005, CAMEOTRA & SINGH, 2009, SEO et al. 2009; TONINI, 2010).
O estudo dos processos de biodegradação é essencial para a aplicação da técnica de biorremediação em ambientes impactados por derramamento de óleo. As variáveis mais importantes a serem avaliadas neste processo de biodegradação no ambiente natural é a composição química dos diferentes tipos de petróleo, provenientes de diversas regiões produtoras; o grande número de produtos refinados e ainda a ação de processos de intemperismo. Além disso, é importante o conhecimento das interações bióticas entre os
24 diversos grupos de microrganismos capazes de degradar o petróleo, dos fatores abióticos ou ambientais propícios à condução do processo de biodegradação no ambiente contaminado e dos principais caminhos metabólicos usados pelos microrganismos (SOUZA, 2003).
25
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Este trabalho tem como objetivo o estudo da biodegradação de cinco tipos de petróleos brasileiros, através de simulações de derramamentos de petróleo em sistemas de mesocosmos, isolamento e seleção de microrganismos com potencial em degradar os hidrocarbonetos de petróleo.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
i. Analisar a influência dos parâmetros ambientais (pH, T° e oxigênio) em diferentes tipos de petróleo no sistema de mesocosmos;
ii. Analisar a taxa de biodegradação através dos perfis geoquímicos ao longo do tempo de amostragem de cinco tipos de petróleos e das razões de HTP/UCM, P/F, P/n-C17 e F/n-C18.
iii. Analisar o aumento das populações de microrganismos (UFCs) ao longo do tempo; iv. Isolar microrganismos em água do mar contaminada com hidrocarbonetos de
petróleo do experimento;
v. Selecionar microrganismos eficientes em degradar o petróleo para utilizar na construção de biofilmes;
26
4. ÁREA DE AMOSTRAGEM
A área de amostragem está localizada na praia de Ondina, Salvador, Bahia, Brasil (Figura 2). Nesta região, a Plataforma Continental é amplamente utilizada para a pesca, disposição de esgotos domésticos e recreação. Além disso, encontra-se próxima de terminais portuários de grande porte e atividades ligadas à indústria petrolífera (HATJE, et al., 2009; DOMINGUEZ, et al, 2011).
Figura 2- Local de amostragem da água do mar.
27
5. MATERIAIS E MÉTODOS
O trabalho foi desenvolvido por etapas, primeiro o trabalho de escritório, trabalho de campo, trabalho de laboratório, análises e por último o tratamento dos dados.
5.1 TRABALHO DE ESCRITÓRIO
O trabalho de escritório consistiu no levantamento bibliográfico, utilizando artigos ligados ao tema, como teses, monografias, dissertações, relatórios, livros e o Portal de Periódico da CAPES. Além disso, foram consultados professores e pesquisadores da área para o direcionamento das atividades e elaboração da monografia.
Para as análises dos dados, foram utilizados os seguintes programas estatísticos: Programa Excel 2010, para elaboração de gráficos e tabelas; Statística Versão 7.0, para as análises descritivas e multivariadas.
5.2 TRABALHO DE CAMPO
O trabalho de campo consistiu na coleta de água do mar para preencher as unidades de simulação montadas nas bancadas no laboratório do NEA.
O primeiro campo foi realizado para a coleta de água e sedimento. Foram coletados em garrafões de polietileno aproximadamente 20L de água do mar; e para o sedimento, foram coletadas alíquotas de areia da praia em recipientes de alumínio, na Praia da Ondina, Salvador, Bahia, Brasil (Figura 3). Todo o material de coleta foi previamente descontaminado seguindo o protocolo de amostragem do LEPETRO/NEA/IGEO/UFBA.
Figura 3- Trabalho de Campo. (a) Coleta de sedimento em recipientes de alumínio e (b) Coleta de
água do mar em garrafões de 20L.
Fonte: REYES, 2015.
28
5.3 TRABALHO DE LABORATÓRIO
O trabalho foi realizado no laboratório de Microbiologia, do Núcleo de Estudos Ambientais (NEA), localizado no Instituto de Geociências (IGEO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA). Teve início em outubro de 2014, com o Trabalho de Campo, Montagem do Experimento, Armazenamento, Preparo das Amostras e Análises Microbiológicas, e finalização em outubro de 2016.
5.3.1
MONTAGEM DO EXPERIMENTO
O experimento consistiu na simulação artificial do derramamento de petróleo no mar em sistema de mesocosmos. Foram utilizados 16 aquários de vidro com dimensões 0,35 x 0,35 x 0,55 m e capacidade de 30,5 litros (Figura 4a). Os aquários foram posicionados próximos de janelas para receberem luminosidade e ventilação natural, além disso, foram empregadas bombas de aeração para simular ondas no intuito de tornar as unidades de simulação mais próximo possível das condições naturais (REYES, 2015; SILVA, 2014) (Figura 4b).
Figura 4- Montagem do experimento na bancada de laboratório do NEA. (a) Unidades de simulação
de vidro e (b) Aquários com bomba de aeração para simulação de ondas.
Fonte: Autora, 2016.
Os petróleos utilizados tiveram origem das Bacias do Recôncavo, Campos, Potiguar, Sergipe e Santos, cedidos pela Petrobrás e pelo Projeto Campo-Escola, convênio entre a UFBA e a ANP e acondicionados em garrafas de vidro âmbar a -4°C (Figura 5a). Foram adicionadas às unidades de simulação, 28L de água do mar, 3% (m/m) da água do mar de areia e 5% de m/m de água do mar da amostra de óleo bruto, além do aquário branco, sem a presença de petróleo (Figura 5b).
29
Figura 5- Montagem do experimento. (a) Amostras de petróleos das Bacias do Recôncavo, Campos,
Potiguar, Sergipe e Santos; (b) Adição de amostra de petróleo cru nas unidades de simulação.
Fonte: Autora, 2015; Reyes, 2015.
As amostragens foram realizadas nos intervalos 0, 20, 80, 120, 180 dias entre os meses de outubro de 2014 e abril de 2015. Foram coletadas alíquotas de 1L de água dos aquários em frascos âmbar, todas em triplicata. As amostras foram refrigeradas em um freezer para posteriores análises. Após as coletas, houve a reposição de água do mar nos aquários na mesma proporção inicialmente retirada.
Para este trabalho, foram monitorados os seguintes parâmetros físico-químicos: Oxigênio Dissolvido (O.D), utilizando um medidor de O.D. microprocessado, portátil, com precisão de + /– 0.05 %; Potencial Hidrogeniônico (pH), utilizando um medidor de pH portátil, digital, com precisão de 0.01 unidades de pH ; Temperatura (T°), utilizando um termômetro acoplado ao oxímetro, com precisão de + /- 0.5 °C. Além disso, foram coletadas amostras de água e 200 mg de gotículas de óleo superficial intemperizado para posteriores análises geoquímicas da Doutoranda Claudia Yolanda Reyes, que servirão como base para a interpretação dos dados obtidos.
5.3.2 ANÁLISES GEOQUÍMICAS
Devido as suas distintas origens geológicas e geoquímicas, as amostras de petróleo utilizadas nessa pesquisa, são consideradas geneticamente diferentes. Segundo Szatmari e Porto (1982), são classificadas como do tipo III ou V (paleozóicas e aulacógenas), ou seja, rifte/rift (marginais passivas) e formadas no Mesozoico (BIZZI et al., 2003, apud GABAGLIA, 1991; REYS, 2015). Estas amostras tiveram descrição geológica e geoquímica, reunidas no Quadro 2.
30
Quadro 4- Descrição geológica e geoquímica das amostras de petróleo cru utilizadas no
experimento.
Bacia Poço Formação
(G-R) Tipo de Bacia Descrição Geoquímica Campos 7-RO- 105HP-RJS Coqueiros - Carapebus Offshore
- Petróleo biodegradado no reservatório (Campo Roncador);
- Petróleo originado por rocha geradora lacustre (Coqueiros) de água salgada do Eozóico do Andar Jiquiá.
- Petróleo do Reservatório da Formação Carapebus (arenito de idade Oligoceno).
Potiguar - Pendência /
CPT - Açu
Offshore- onshore
- Petróleo de origem lacustre de água doce e marinho evaporítico. Sergipe- Alagoas 3-SES-164 Cotinguiba / Riachuelo - Calumbi Offshore - onshore
- Petróleo não biodegradado da Bacia de Sergipe.
- Petróleo originado por rocha geradora marinha siliciclástica da Formação Cotinguiba/Riachuelo do Neozóico (Cenomaniano-Turoniano).
- Petróleo do Reservatório de Turbidito da Formação Calumbi (Neozóico).
Recôncavo
- Candeias -
Grupo Ilhas
Onshore
- Petróleo originado por rocha geradora de água doce do Eozóico (Formação Candeias) - Andar Rio da Serra;
- Petróleo do Reservatório de Arenitos fluviais do Grupo Ilhas de idade entre o Eozóico e Neozóico; Santos 9-LL-12D-RJS Piçarros - Itapema Offshore
- Petróleo não biodegradado do Pré-Sal da Bacia de Santos;
- Petróleo originado por rocha geradora lacustre de água salgada do Eozóico (Andar Piçarros).
- Petróleo do Reservatório da Formação Itapema (microbialito-estromatólito) Eozóico. Fonte: Modificado de REYS, 2015.
As amostras de petróleos foram analisadas pela Doutora Claudia Yolanda Reyes, com o propósito de identificar os perfis geoquímicos no tempo inicial do experimento (Tabela 1). As densidades foram calculadas sob a norma ASTM D-4052; e a fluidez, com base na norma ASTM D-97 (REYES, 2015).
31
Tabela 1- Densidade e fluidez para as amostras de petróleos utilizadas no experimento.
Bacia API [ºAPI] * Densidade [g.mL-1] Fluidez [ºC]
Campos 21,7 0,9225 -39
Potiguar 31,1 0,8695 Não analizada
Sergipe-Alagoas 39,2 0,8280 36
Recôncavo 31,5 0,8671 9
Santos 28,0 0,8865 15
*API – American Petroleum Institute Fonte: Modificado de REYS, 2015.
Os perfis cromatográficos apresentam informações onde é possível identificar hidrocarbonetos em amostras de óleo bruto e de óleo biodegradável, em amostras ambientais, com diferentes concentrações, composições e natureza. Entre os compostos que podem ser analisados, incluem alcanos normais (nC8-nC40), isoprenóides, HPAs (hidrocarbonetos policíclicos aromáticos) e os seus homólogos alquilados, e biomarcadores triterpanos e esteranos (WANG et al., 1995; LIMA, 2014). Dessa maneira, a identificação da presença dos compostos nas amostras é possível a partir dos tempos de retenção fornecidos pelo padrão e dos espectros de massa característicos dos hidrocarbonetos (LIMA, 2014).
As análises geoquímicas e os cálculos utilizados para avaliar a depleção do petróleo na água do mar contida nos aquários foram realizados pela doutora Claudia Yolanda Reys, em seu projeto de Doutorado. Os resultados dos cromatogramas foram obtidos após extração liquido-liquido e analisados por cromatografia gasosa acoplada a ionização de chama (CG/FID).
Para a extração líquido-líquido, foi utilizada a norma LEPETRO/NEA/REVILL et al. (2007), o aparelho Rota-evaporador BÜCHI®. Foi utilizada uma alíquota de 750 mL e adicionando quatro extrações sucessivas com 100 mL, 40 mL, 40 mL e 40 mL de diclorometano. Para reter as prováveis gotículas de água ainda presentes no solvente de extração, a amostra foi passada por funil de filtração contendo sulfato de sódio ativado. A amostra foi concentrada em rota-evaporador até 1 mL e logo transferida a vial de 2 mL. Posteriormente, a amostra do vial, foi pesada e logo aferida com diclorometano a uma concentração de 0,005 mg/μL para a posterior análise cromatográfica de HTP e UCM (REYES, 2014).
A análise de HTP e UCM em água foi realizada utilizando o Cromatógrafo com detector de ionização de chama, da marca AGILENT®, modelo GC/FID - 7890B. Foi
32 utilizadada uma concentração de 50 ppm (50000 ppb) e as amostras foram dissolvidas em diclorometano a uma concentração de 0,05 mgEOAD /μLDCM.
Foram monitorados os alcanos normais do C8 até o C40, os isoprenóides pristano e fitano, a soma total dos hidrocarbonetos (HTP) em µg/L, e as misturas complexas não resolvidas (UCM) pela cromatografia, que podem indicar degradação. Além disso, foram analisadas as relações Pristano/n-C17, Fitano/n-C18, Pristano/Fitano, que são razões usadas para avaliação do intemperismo do petróleo (FINGAS, 1995; DOUGLAS et al., 2002; MOLDOWAN; 2005; SNAPE et al., 2005; REVILL et al., 2007; FERNÁNDEZ-VARELA et al., 2008; DAWSON et al., 2013; TURNER et al., 2014; LUO, 2015-1,2; HO; YANG, 2015; 2015; PETERS; REYES, 2015).
Os isoprenóides pristano e o fitano são considerados recalcitrantes à biodegradação visto que alcanos de cadeia ramificada tendem a apresentar degradabilidade inferior, quando comparados aos n-alcanos (PEREIRA; GOMES; SORIANO, 2009), resultando em um aumento significativo das proporções de Pristano/n-C17 e Fitano/n-C18 nas amostras (WANG et al., 2013). Assim, as relações P/n-C17 e F/n-C18 podem ser utilizadas como índices de biodegradação (OVERTON et al, 1981; KENNICUTT, 1988; DIDYK; SIMONEIT, 1989; BARAKAT et al., 2001; DANTAS, 2016).
5.3.3 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS
5.3.3.1 QUANTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS
A contagem dos microrganismos pode ser realizada em amostras do local a ser remediado, com o objetivo de fornecer informações sobre a atividade biológica, e sobre o nível de aclimatação da população indígena, isto é, sua capacidade de conduzir o processo de biodegradação. O monitoramento do crescimento de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos também é usado ao longo da biorremediação, visando à medida de sua eficiência (BALBA et al., 1998; RAMSAY et al., 2000; SOUZA, 2005).
A quantificação dos microrganismos foi realizada com o objetivo de avaliar o crescimento das bactérias e fungos nas unidades de simulação durante o monitoramento do experimento. A metodologia utilizada foi a do Número Mais Provável de células (NMP), realizado através da contagem das Unidades Formadora de Colônias (UFCs). Essa técnica leva em consideração que cada colônia tenha sido gerada a partir de uma célula individual ou conjuntos de células (BISOGNIN, 2012; LIMA, 2014).
Para a avaliação do número de microrganismos foi feito o plaqueamento em meio orgânico sólido. Para as bactérias foi utilizado o meio de cultura Nutriente Ágar e para os fungos foi utilizado o meio de cultura Batata-Dextrose-Ágar (BDA). As análises foram
33 realizadas em amostras de água coletadas no primeiro dia e ao longo de 180 dias nas unidades de simulação.
As amostras de água foram submetidas ao processo de filtração a vácuo para retenção dos microrganismos presentes, posteriormente as UFCs retidas no filtro de nitrato celulose foram isoladas, preservadas e selecionadas através de testes que verifiquem a eficiência em degradar o petróleo.
A técnica da membrana filtrante consiste na filtração das amostras utilizando o aparato de filtração, membranas filtrantes e amostras de soluções salinas diluídas. Este método possibilita a contagem de UFCs em água salina contaminada por petróleo e é capaz de determinar o número total de bactérias e fungos presentes na água. Esta técnica de quantificação dos microrganismos é muito reprodutível e pode ser utilizada para grandes volumes de água (CETESB, 2007).
Foi coletado 1L de água do mar dos aquários em triplicata, dos cinco tipos de petróleo (Campos, Santos, Potiguar, Sergipe, Recôncavo), além do branco. As amostras foram homogeneizadas, retirada uma alíquota de 100 mL e adicionadas em 90 mL de solução salina e 270 µL de twin. Dentro da câmara de fluxo laminar foram realizadas diluições seriadas e posteriormente as amostras foram filtradas. O líquido contido nos erlenmeyers foi filtrado utilizando membranas de nitrato celulose com poros de 0.45 µm. O mesmo procedimento foi realizado para retenção de bactérias e fungos utilizando meios de cultura vertidos em placas petri e incubadas a 30° C em câmaras de germinação em posição invertida.
Todo material utilizado foi previamente autoclavado à temperatura de 120°C por 20 minutos e exposto a radiação U.V. por 15 minutos dentro do fluxo-laminar para descontaminação.
Figura 6- (a) Câmara de Fluxo Laminar, (b) Aparato de Filtração à Vácuo e (c) Amostras de soluções
salinas diluídas.
Fonte: Autora, 2016.
a
b
34 O crescimento microbiano foi realizado mediante a contagem das UFCs expresso em UFC/mL. A contagem foi efetuada após 24 horas para as bactérias e após sete dias para os fungos, com a ajuda de um contador de colônia manual.
A contagem foi realizada nas diluições onde se observou um número de colônias bem visíveis e individuais. Realizaram-se os cálculos para que a unidade de expressão fosse UFC/mL.
5.3.3.2 ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS
Para realizar o isolamento das UFCs retidas nas membranas de nitrato celulose, as cepas foram transferidas para um meio de cultura contido em uma nova placa de Petri estéril com o auxílio de uma alça de platina, para as bactérias; e para os fungos, foram cortados cubos contendo a cepa, com o auxílio de um bisturi (Figura 7).
Entre uma amostra e outra, a alça de platina e o bisturi, foram flambados em uma lamparina a álcool para a esterilização do instrumento, evitando assim a contaminação indesejada. As cepas foram purificadas por meio da técnica de esgotamento por estrias múltiplas, com o objetivo de obter culturas puras. Os microrganismos foram acondicionados na câmara de germinação a 30°C, em condições ideais para seu crescimento e posteriormente armazenados em um freezer para serem conservados.
Figura 7- Isolamento de fungos e bactérias das amostras. (a) Procedimento de isolamento de
microrganismo e (b) Purificação por estrias múltiplas para bactérias.
Fonte: Autora, 2016.
Um total de 17 cepas bacterianas e 19 isolados fungos foi isolado das amostras coletadas nas unidades de simulação. Todos os microrganismos foram armazenados na biblioteca do LEPETRO e sujeitos a testes para comprovação da eficiência em biodegradar o petróleo.
35
5.3.3.3 QUANTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS TOTAIS
A técnica de análise microbiológica mais usada no monitoramento da biorremediação é a de contagem em placas do número de microrganismos degradadores de hidrocarbonetos, através do método do Número Mais Provável (NMP) (ELIANE, 2005).
As análises de contagem de bactérias e fungos (UFCs) são importantes para processos de biorremediação, a fim de investigar a influência dos hidrocarbonetos sobre os microrganismos. Ensaios microbiológicos normalmente são usados na determinação do potencial degradador da microflora local, da taxa e da extensão com que a biodegradação acontece durante a biorremediação (BALBA et al., 1998).
A quantificação da população microbiana total presente nos aquários foi realizada para observar o número de células viáveis bacterianas e fúngicas (UFC) ao longo dos experimentos em mesocosmos.
Os cálculos foram realizados utilizando a contagem de colônias nas placas a partir das cinco diluições em solução salina estéril, realizadas de acordo com a CETESB (2007). Para os cálculos da contagem de colônias foi utilizada a seguinte fórmula:
𝑅 = 𝑎 ∙ 10𝑏 UFC/ mL Onde,
R= Resultado
a = os dois primeiros algarismos significativos (0 a 9) b = expoente (0 a 10)
Foram tomadas médias dos valores das diluições e o resultado final foi expresso considerando os dois primeiros algarismos representativos, transformados em potência de 10. Os resultados da contagem foram expressos em UFC/mL.
5.3.3.4 PRESERVAÇÃO DOS MICRORGANISMOS
Para a preservação dos microrganismos isolados, foi utilizado o Método de
Castellane. O objetivo é preservar os microrganismos através da redução do metabolismo
celular dos mesmos, manter as características básicas da cultura original e permitir que, por longo período de tempo, possam ser utilizadas em pesquisas ou para fins didáticos (SETTE et al., 2006).
O procedimento consistiu em cortar com o auxílio de um bisturi, cubos de 1cm2 contendo o microrganismo desejado e transferir para um frasco-ampola de vidro e
eppendorfs de plástico, contendo água destilada devidamente descontaminada (Figura 8a).
36 As colônias foram etiquetadas, embaladas, registradas e armazenadas na biblioteca do LEPETRO (Figura 8b).
Figura 8- Preservação dos microrganismos pelo Método Castellane. (a) Procedimento de corte e
transferência para frasco-ampola de vidro e (b) Colônias etiquetadas e embaladas.
Fonte: Autora, 2016.
5.3.3.5 SELEÇÃO DOS MICRORGANISMOS
Para avaliar a potencialidade dos microrganismos isolados em degradar os compostos do petróleo, foram realizados dois Testes Quantitativos: Teste de Oxidação em Placas Multipoços (Teste 1) e Teste de Oxidação com Agitação (Teste 2).
Segundo Hanson (1993), esse é um método proposto para avaliar o potencial que os microrganismos apresentam para degradar hidrocarbonetos usando-os como substrato, ou seja, ele permite observar a biodegradação pela mudança de cor de um indicador. Esta é uma reação de oxirredução que pode ser sinalizada pela mudança de cor do indicador DCPIP (2,6-diclorofenol-indofenol), de azul (forma oxidada) para incolor (forma reduzida). De acordo com Gomes (2004), esta técnica segue o princípio de que esse indicador consiste na verificação de ocorrência de oxidação biológica dos hidrocarbonetos, no meio de cultura onde o DCPIP atua como o aceptor de elétrons no processo de oxidação (LIMA, 2014).
Os testes baseiam-se na avaliação da descoloração do meio de cultivo utilizando um indicador DCPIP, visto que a degradação dos hidrocarbonetos para CO2 envolve uma reação de oxidação, utilizando organismos, em sua maioria, aeróbios. O destino dos hidrocarbonetos, além da produção de CO2 na degradação total, pode também oferecer caminhos alternativos, como armazenamento de glóbulos e alguns podem ser incorporados como biomassa (BERTRAND et al, 1983; DUMENIL et al, 1988; BENTO, 2005).
37 i. Teste de Oxidação em Placas Multipoços
A avaliação da capacidade das bactérias e dos fungos em degradar hidrocarbonetos foi realizada em ensaio preliminar. O método utilizado foi o do Protocolo para seleção de microrganismos degradadores descrito por LIMA (2014).
O procedimento consistiu em etiquetar as placas multipoços com a numeração do microrganismo (triplicata) e do poço controle. Inicialmente foi adicionado com o auxílio de uma seringa de vidro, em cada poço, 10 µL da fonte de carbono (0,1 g de petróleo: CA, PO, SE, RE, SA), diluídos em 2 mL de solvente diclorometano (DCM). Em seguida, após a evaporação do solvente, foi adicionado com a ajuda de um pipetador automático, 250 µL do meio nutriente Bushnell Haas Broth, recomendado para testes de biodegradação utilizando microrganismos. Seguidamente, foi adicionado em cada poço, com o auxílio de um pipetador automático, 25 µL de suspensão microbiana contido em tubos de ensaio, previamente homogeneizados em um agitador vortex, com exceção dos poços controle. Por último, foi adicionado 5 µL do indicador redox DCPIP.
Ao final do procedimento, as placas multipoços foram lacradas com papel filme nas bordas, para evitar contaminação, e incubadas a 30°C na câmara de germinação.
A descoloração para as bactérias e fungos, foi analisada nas primeiras 24 e 48 horas. A classificação da mudança da cor foi realizada visualmente comparando com o poço controle, em porcentagens de 25%, 50%, 75% e 100% (Figura 9).
Figura 9- Teste de oxidação em placas multipoços. (a) Confecção de placa multipoços para o
petróleo de Campos e (b) Ilustração da mudança de cor do indicador DCPIP após 24 h de incubação
Fonte: Autora, 2016.
Para o preparo do indicador DCPIP utilizado no procedimento, foram dissolvidos em 20 mL de água destilada, previamente autoclavada, 0,0034 g de DCPIP e 0,0040 g de
38 bicarbonato de sódio. A solução foi filtrada com um filtro de seringa em PTFE e transferida para um frasco âmbar etiquetado e protegido da luminosidade.
Para o preparo da suspensão microbiana em tubos de ensaio, foram transferidos fragmentos do meio de cultura de 0,6 cm2 com a pipeta de Pasteur, para os tubos de ensaio, contendo 5 mL de solução salina esterilizada para os fungos e 10 mL para as bactérias.
O teste foi realizado dentro da capela de fluxo laminar, para evitar contaminação externa. Todo o material utilizado foi devidamente embalado e descontaminado em autoclave, à temperatura de 120°C, durante 20 minutos.
ii. Teste de Oxidação com Agitação
O teste de oxidação com agitação foi realizado com o intuito de fornecer valores mais seguros e precisos, em relação aos resultados. Para isto, foi realizada uma adaptação da metodologia de Hanson et al. (1993) e Lima (2014), para avaliar o potencial biodegradante de petróleo por microrganismos, considerando o tempo necessário para a descoloração como indicador de biodegradação do petróleo e mudanças na absorbância ao longo da biodegradação.
O procedimento consistiu em etiquetar vials de 20 mL com a numeração do microrganismo (duplicata) e do controle. Inicialmente, foi adicionado com o auxílio de um pipetador automático, 125 µL da fonte de carbono (0,1 g de petróleo: CA, PO, SE, RE, SA), diluídos em 2 mL de solvente Diclorometano (DCM). Em seguida, após a evaporação do solvente, foram adicionados, com a ajuda de um pipetador automático, 9250 µL do meio nutriente Bushnell Haas Broth. Seguidamente, foi adicionado em cada vial, 3750 µL de suspensão microbiana contidos em tubos de ensaio, previamente homogeneizados em um agitador vortex, com exceção do vial controle. Posteriormente, os vials foram lacrados e colocados na mesa agitadora, a 200 rpm, incubado a 30° C, durante 12 horas (Figura 10).
Figura 10- Teste de oxidação com agitação. (a) Procedimento em Fluxo Laminar e (b) Incubadora
com mesa agitadora.
Fonte: Autora, 2016.
39 Após 12 horas de agitação, foi adicionado com a ajuda de um pipetador automático, 100 µL do indicador redox DCPIP e incubado a 30°C na câmara de germinação por mais 12 horas.
A descoloração para as bactérias e fungos, foi analisada nas primeiras 12 e 24 horas após a adição do indicador DCPIP. A leitura dos resultados foi obtida através do espectrofotômetro de absorção molecular Cary WinUV (Simple Reads Application, Version 5.0.0999) (Figura 11a).
O teste foi realizado dentro da capela de fluxo laminar, para evitar contaminação externa. Todo o material utilizado foi devidamente embalado e descontaminado em autoclave, à temperatura de 120°C, durante 20 minutos.
Figura 11- Procedimento para leitura do Teste de oxidação com agitação. (a) Espectrofotômetro de
absorção molecular e (b) Vails para leitura.
Fonte: Autora, 2016.
Para evitar interferência no resultado da leitura do espectrofotômetroro, devido à presença de gotículas de petróleo e do meio BH nas paredes da cubeta, foi feita a filtração do líquido dos vails utilizando papel filtro com poros de 8 µm (Figura 12).
a
