Êpen
AUTARQUIA ASSOCIADA À UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
AVALIAÇÃO FUNCIONAL DE CÉLULAS DE CARCINOMA MAMÁRIO HUMANO T47D APÓS TRANSDUÇÃO COM
ANTI-SENSE PARA A PROTEÍNA CARREADORA DE CÁLCIO S100P
BETTINA BEiSSEL
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Mestre em Ciências na Area de Tecnologia Nuclear - Aplicações.
Orientadora:
Ora. Maria Helena Bellini
São Paulo
2005
Autarquia a s s o c i a d a à U n i v e r s i d a d e de São P a u l o
Avaliação funcional de células de carcinoma mamário humano T47D após transdução com Anti-sense para a
proteína carreadora de cálcio S100P
Bettina Beíssel
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de IVIestre em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear - Aplicações.
O r i e n t a d o r a :
Dra. Maria Helena Beilini
S ã o P a u l o 2 0 0 5
Prece de São Francisco de Assis
Ó Senhor!
Faze de mim um instrumento da Tua Paz:
Onde há ódio, faze que eu leve o Amor;
Onde há ofensa, que eu leve o Perdão;
Onde há discórdia, que eu leve a União;
Onde há dúvidas, que leve a Fé;
Onde há erros, que eu leve a Verdade;
Onde há desespero, que eu leve a Esperança;
Onde há tristeza, que eu leve a alegria;
Onde há trevas, que eu leve a luz.
Ó mestre! Faze que eu procure menos Ser consolado, do que consolar;
Ser compreendido, do que compreender;
Ser amado, do que amar...
Pois:
É dando, que se recebe.
É perdoando, que se é perdoado.
É morrendo, que se vive para a vida eterna.
Tradução de Manuel Bandeira
Dedico este trabalho ao Luiz Paulo, por t o d a paciência, a m o r e c o m p r e e n s ã o e a o s n o s s o s mais preciosos t e s o u r o s : Sofia e Mathias...
Dedicatória iv
e à m i n h a IVIãe, que s e m p r e acreditou nos m e u s s o n h o s !
Agradecimentos
Gostaria d e a g r a d e c e r i m e n s a m e n t e a t o d o s a q u e l e s que participaram da elaboração deste t r a b a l h o , direta ou indiretamente, possibilitando a s s i m q u e ele p u d e s s e ser c o n c l u í d o . Foram muitas p e s s o a s especiais c o m as quais convivi e aprendi muito.
Á Dra. Maria Helena Beilini, d o u t o r a pela U N I F E S P e pesquisadora d o IPEN q u e me orientou neste trabalho, dividindo seu c o n h e c i m e n t o e d a n d o - m e a o p o r t u n i d a d e de c o n h e c e r o m u n d o da pesquisa.
Ao Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro d a Silva, d o c e n t e d o D e p a r t a m e n t o d e Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista d e Medicina ( U N I F E S P - E P M ) por ter aberto as portas de seu laboratório e m e acolhido s e m p r e pronto para ensinar e colaborar.
A o Prof. Dr. Néstor Schor, Professor Titular da disciplina de Nefrologia da U N I F E S P - E P M e P r ó - R e i t o r d e P ó s - G r a d u a ç ã o e Pesquisa da U N I F E S P - E P M , que possibilitou a realização de vários e x p e r i m e n t o s ao permitir que utilizasse s e u laboratório.
Ao Dr. J o ã o Bosco Pesqueiro, d o D e p a r t a m e n t o de Biofísica da U N I F E S P - E P M , por ter possibilitado a realização da parte de biologia celular, permitindo que utilizasse o seu laboratório.
Á Dra. Regina Affonso pelo apoio i m e n s u r á v e l , pelo incentivo e principalmente pela a m i z a d e sincera.
Ao IPEN e a o C N P q pela c o n c e s s ã o de recursos financeiros.
À Naiara, Cristina, AIdrey, Fabíola, T a t i a n a , Márcio, Paulo, A n a Maria, e t o d a s as p e s s o a s felizes e a m i g a s do laboratório, de Ginecologia Molecular da U N I F E S P - E P M .
Agradecimentos vi
A o Alberto, à Regiane, ao Marcelo, aos t é c n i c o s do laboratório e a t o d o s os d e m a i s que f a z e m o u f i z e r a m parte do grupo do Dr. J o ã o B o s c o pelo g r a n d e apoio e e n s i n a m e n t o s .
À Dra. Maria Mitzie Brentani D o c e n t e do D e p a r t a m e n t o d e Radiologia da F a c u l d a d e d e Medicina da Universidade de S ã o Paulo, por ter-nos cedido as células T 4 7 D e à toda sua e q u i p e que s e m p r e esteve disposta a nos auxiliar e m n o s s a s dúvidas e m relação à cultura celular.
À s a m i g a s Enia C o u t i n h o e Michelly França Piccoli pelo apoio e a m i z a d e .
A o Dr. V i c e n t e de Paulo Castro Teixeira, Doutor e m medicina, da disciplina d e Nefrologia da U N I F E S P - E P M pelo apoio c o n s t a n t e .
A o Dr. Esper G e o r g e s Kallás e grupo do Laboratório d e Imunologia da U N I F E S P - E P M pelo uso do citômetro de fluxo e à Dra. Maria A p a r e c i d a Daiboni do laboratório d e Nefrologia pelo e n s i n a m e n t o da técnica de citometria.
À Dra. S o r a y a S o u b h i Smaili d o c e n t e do D e p a r t a m e n t o de F a r m a c o l o g i a , setor d e M o d o d e A ç ã o de Drogas pelo uso do microscópio confocal a s s i m c o m o às técnicas do aparelho.
À Dra. Olga Z a z u k o d o IPEN pelo uso da sala de cultura e eterna simpatia.
À Dra. Mônica Mathor do IPEN e grupo por ter cedido material e pelo a p o i o c o n s t a n t e .
E a todo o grupo do laboratório de Nefrologia que m e a c o l h e u e m e a j u d o u muito, principalmente ao Marcos A n t o n i o C e n e d i z e pelo apoio e n o r m e no q u e se refere ao uso do P C R e m t e m p o real.
A v a l i a ç ã o f u n c i o n a l de células de c a r c i n o m a m a m á r i o h u m a n o T 4 7 D a p ó s t r a n s d u ç ã o c o m A n t i - s e n s e para a proteína c a r r e a d o r a d e c á l c i o S 1 0 0 P
Bettina Beissel
R E S U M O
A proteína 81 OOP é um membro da familia carreadora de cálcio 3100 e foi isolada, primeiramente, de placenta humana por Emoto e cois., em 1992. Vários estudos apresentaram fortes indícios sobre o seu envolvimento em processos neoplásicos, porém ainda não se conhece sua real função biológica. No tecido mamário, a 81 OOP foi detectada em carcinomas invasivos de células ductals. Sua presença em altas concentrações nestas células foi considerada um forte indicativo de progressão tumoral in vivo, e acredita-se que ela tenha um importante papel na imortalização de células epiteliais mamárias in vitro. Neste trabalho descrevemos a construção do vetor retroviral pLXSN com o gene da proteína 81 OOP em sentido anti-sense, a transdução deste gene para células de carcinoma mamário T47D e o estudo destas células após a transdução.
Para este estudo, utilizamos primeiramente a técnica de PCR em tempo real para a quantificação da expressão gênica. Os resultados demonstraram uma redução de 63%
da expressão dos clones T47D8100P-A/S em relação à expressão dos clones T47DLX8N controle. Realizamos então, ensaio de imunofiuorescência em Microscópio confocal para avaliar a técnica anti-sense em relação à expressão proteica. Nas imagens notamos uma marcação do anticorpo da proteína S I OOP bem menos pronunciada nas células T47DS100P-A/8 em relação às células controle. Encerramos o trabalho com ensaios de citometria de fluxo para avaliar uma eventual alteração no ciclo celular. Os resultados mostraram que o grupo controle apresentou uma média de 34,04% das células na fase 8 do ciclo celular enquanto que o grupo das células transduzidas apresentou uma média de 26,40% na mesma fase. Houve, portanto uma redução de 23%
de células na fase 8 entre o grupo de células controle e das que receberam o vetor retroviral com anti-sense. Estes resultados demonstraram que a técnica de anti-sense foi eficiente para diminuir a expressão gênica e proteica da proteína carreadora de cálcio 81 OOP em células T47D, confirmando ser esta uma interessante ferramenta nos estudos de expressão gênica, além de sugerir a continuidade dos estudos com estes clones em ensaios in vivo.
Resumo vii
A v a l i a ç ã o f u n c i o n a l de células de c a r c i n o m a m a m á r i o h u m a n o T 4 7 D a p ó s t r a n s d u ç ã o c o m A n t i - s e n s e para a proteína c a r r e a d o r a d e c á l c i o S 1 0 0 P
Bettina Beissel
R E S U M O
A proteína 81 OOP é um membro da familia carreadora de cálcio 8100 e foi isolada, primeiramente, de placenta humana por Emoto e cois., em 1992. Vários estudos apresentaram fortes indícios sobre o seu envolvimento em processos neoplásicos, porém ainda não se conhece sua real função biológica. No tecido mamário, a 81 OOP foi detectada em carcinomas invasivos de células ductals. 8ua presença em altas concentrações nestas células foi considerada um forte indicativo de progressão tumoral in vivo, e acredita-se que ela tenha um importante papel na imortalização de células epiteliais mamárias in vitro. Neste trabalho descrevemos a construção do vetor retroviral pLXSN com o gene da proteína 81 OOP em sentido anti-sense, a transdução deste gene para células de carcinoma mamário T47D e o estudo destas células após a transdução.
Para este estudo, utilizamos primeiramente a técnica de PCR em tempo real para a quantificação da expressão gênica. Os resultados demonstraram uma redução de 63%
da expressão dos clones T47D8100P-A/8 em relação à expressão dos clones T47DLX8N controle. Realizamos então, ensaio de imunofiuorescência em Microscópio confocal para avaliar a técnica anti-sense em relação à expressão proteica. Nas imagens notamos uma marcação do anticorpo da proteína 81 OOP bem menos pronunciada nas células T47DS100P-A/8 em relação às células controle. Encerramos o trabalho com ensaios de citometria de fluxo para avaliar uma eventual alteração no ciclo celular. Os resultados mostraram que o grupo controle apresentou uma média de 34,04% das células na fase 8 do ciclo celular enquanto que o grupo das células transduzidas apresentou uma média de 26,40% na mesma fase. Houve, portanto uma redução de 23%
de células na fase 8 entre o grupo de células controle e das que receberam o vetor retroviral com anti-sense. Estes resultados demonstraram que a técnica de anti-sense foi eficiente para diminuir a expressão gênica e proteica da proteína carreadora de cálcio 81 OOP em células T47D, confirmando ser esta uma interessante ferramenta nos estudos de expressão gênica, além de sugerir a continuidade dos estudos com estes clones em ensaios in vivo.
F u n c t i o n a l e v a l u a t i o n of h u m a n breast c a n c e r cell line T 4 7 D after a n t i - s e n s e t r a n s d u c t i o n w i t h S 1 0 0 P c a l c i u m - b i n d i n g protein.
Bettina Beissel
A B S T R A C T
S 1 0 0 P is a m e m b e r of the S 1 0 0 E F - h a n d calcium binding protein family and w a s first purified f r o m h u m a n placenta by E m o t o and colleagues (1992).
T h e r e is c o n s i d e r a b l e evidence that S I OOP is involved in neoplastic p r o c e s s e s , but t h e real f u n c t i o n and effect of this molecule are still u n k n o w n . In breast tissue, S I OOP has b e e n detected in ductal invasive c a r c i n o m a . Its p r e s e n c e in high c o n c e n t r a t i o n in t h e s e cells w a s c o n s i d e r e d a strong indication of t u m o r progression in vivo and it is believed that S I OOP might play an important role in the immortalisation of h u m a n breast epithelial cells in vitro. In this study w e describe t h e construction of the retroviral vector p L X S N with the S 1 0 0 P g e n e in antisense orientation, the introduction of this g e n e into T 4 7 D cells a n d the study of this cells after t r a n s d u c t i o n . First w e used t h e real t i m e P C R t e c h n i q u e to quantify the g e n e e x p r e s s i o n . T h e results s h o w a reduction of 6 3 % of e x p r e s s i o n within t h e T 4 7 D S 1 0 0 P - A / S infected population c o m p a r e d with control T 4 7 D L X S N clones. T o d e t e r m i n e t h e impact of the S I OOP antisense t e c h n i q u e o n protein e x p r e s s i o n in T 4 7 D cells, w e p e r f o r m e d i m m u n o f l u o r e s c e n c e staining and a n a l y s e d the resulting images using a c o n f o c a l m i c r o s c o p e . T h e i m a g e s s h o w e d m u c h less p r o n o u n c e d antibody m a r k i n g of the S I OOP protein in t h e T 4 7 D S 1 0 0 P - A / S cells c o m p a r e d with control cells. To evaluate w h e t h e r the a n t i s e n s e a p p r o a c h could c a u s e a n y alteration in t h e cell cycle, w e finished the study with flow c y t o m e t h c analysis of the cell distribution. This cell cycle analysis c o n f i r m e d a reduction of 2 3 % in t h e S - p h a s e fraction of t h e T 4 7 D S 1 0 0 P - A / S cell g r o u p c o m p a r e d w i t h control group.
T h e s e results s h o w that the antisense m e t h o d o l o g y w a s efficient in d e c r e a s i n g expression of the S I OOP g e n e a n d protein levels in T 4 7 D cells in vitro and suggest that t h e s e clones should be used for in vivo studies.
Sumário ix
S U M A R I O
P á g i n a
1. Í N T R O D U Ç À O 1 1.1 C a r r e a d o r e s d e Cálcio 1
1.2 Família S I 00 2
1.3 S 1 0 0 P 8 1.4 C â n c e r de m a m a 11
1.5 T é c n i c a anti-sense 13 2. O B J E T I V O S D O T R A B A L H O 16
3 M A T E R I A I S E M É T O D O S 17
3.1 M A T E R I A I S 17 3.1.1 E q u i p a m e n t o s e acessórios principais 17
3.1.2 Principais reagentes 19 3.1.3 Principais reagentes utilizados para biologia molecular 20
3.1.4 Principais reagentes para cultura celular 21
3.1.5 Oligonucleotídeos 21 3.1.6 V e t o r Retroviral 22 3.1.7 L i n h a g e n s celulares 24 3.1.7.1 Fibroblastos NIH-3T3 24 3.1.7.2 Fibroblastos G P + E 8 6 24 3.1.7.3 Fibroblastos G P + e n v + A m 1 2 24
3.1.7.4 Células T 4 7 D 2 4
3.2 M É T O D O S 25 3.2.1 Construção do vetor retroviral 25
3.2.1.1 O b t e n ç ã o do c D N A da S I OOP 25 3.2.1.2 S e q ü ê n c i a m e n t o da S 1 0 0 P 25 3.2.1.3 C o n s t r u ç ã o de Oligonucleotídeos 26 3.2.1.4 Amplificação do c D N A da S1 OOP pelo método de P C R 27
3.2.1.5 Extração do Produto de P C R 27 3.2.1.6 Preparação do vetor p L X S N 28
CCMSSÃO l#iTOML Dfc" mñ&A MÜCLhA.R/SP-iPEi^
3.2.1.7 Ligação da S I OOP ao vetor retroviral p L X S N 28 3.2.2 T r a n s f o r m a ç ã o e m bactérias c o m p e t e n t e s D H 5 a 2 8
3.2.3 A m p l i f i c a ç ã o dos p l a s m i d e o s 29 3.2.4 Extração e purificação d o s p l a s m i d e o s L S 1 0 0 P S N - Mini Prep 29
3.2.5 A n á l i s e de Restrição 30 3.2.6 Preparação das células de e m p a c o t a m e n t o 30
3.2.7 T r a n s f e c ç ã o transiente e m células G P + E 8 6 c o m cloreto de cálcio 30
3.2.8 Infecção p e r m a n e n t e 31
3.2.9 Titulação 3 2 3.2.10 Cultura de células d e carcinoma m a m á r i o T 4 7 D 34
3.2.111nfecção d a s células T 4 7 D 34 3.2.12 Extração d e R N A d a s células T 4 7 D 35
3.2.13 A n á l i s e da pureza do R N A por eletroforese 35 3 . 2 . 1 4 O b t e n ç ã o d e c D N A pelo método d e transcrição reversa 36
3.2.15 R e a ç ã o d e polimerização e m cadeia e m t e m p o real ( P C R e m t e m p o real)37
3.2.16 Ensaio de Imunofluorescência e m Microscopia C o n f o c a l 38
3 . 2 . 1 7 Ensaio d e Citometria d e Fluxo 3 9
4 R e s u l t a d o s 4 0 4.1 S e q ü ê n c i a m e n t o 40
4.2 O b t e n ç ã o do c D N A da S I OOP 41 4.2.1 A m p l i f i c a ç ã o pela técnica de P C R 41 4.2.2 Preparação do c D N A da S I OOP para o vetor p L X S N 41
4.3 P r e p a r a ç ã o d o vetor p L X S N 4 2 4.4 Ligação do c D N A da proteína S I OOP ao vetor retroviral p L X S N 4 3
4.5 A n á l i s e de restrição 4 4 4.6 Preparação d a s células de e m p a c o t a m e n t o Fibroblastos G P + E 8 6 4 5
4.6.1 T r a n s f e c ç ã o T r a n s i e n t e e Infecção p e r m a n e n t e 45 4.7 Título viral a p r e s e n t a d o pelas células anfotroficas para os c l o n e s
A m i 2 L S 1 OOPSN-anti-sense 4 6 4.8 Cultura de células d e carcinoma ductal m a m á r i o T 4 7 D 4 8
4.9 Infecção d a s células de carcinoma m a m á r i o T 4 7 D 48
4.10 O b t e n ç ã o d e RNA 50 4.10.1 Extração d e RNA d o s clones T 4 7 D L S 1 0 0 P S N - A / S e T 4 7 D L X S N 50
Abstract xi
4.10.2 Eletroforese para avaliar a q u a l i d a d e do R N A 51
4.11 A m p l i f i c a ç ã o e quantificação do c D N A 52 4.11.1 R e a ç ã o e m cadeia da Polimerase e m t e m p o real 52
4.11.2 Gel de a g a r o s e para c o n f i r m a ç ã o do produto de P C R e m t e m p o real 56
4.12 Microscopia confocal 57 4.13 Ensaio de citometria de fluxo 59
5 D I S C U S S Ã O 6 3 6 C O N C L U S Õ E S 71 7. R E F E R Ê N C I A S B I B L I O G R Á F I C A S 72
Lista de T a b e l a s
P á g i n a T a b e l a 4.1 Título viral a p r e s e n t a d o pelas células anfotroficas A m 1 2 L S 1 0 0 P S N -
Anti-sense 4 7 T a b e l a 4.2 Título viral a p r e s e n t a d o pelas células anfotroficas A m 1 2 L X S N 4 7
Tabela 4.3 R e n d i m e n t o da extração de R N A total de células T 4 7 D a p ó s o
processo d e extração c o m trizol 51 Tabela 4.4 Relação d e e x p r e s s ã o adquirida a partir das m é d i a s d o s C T ' s 55
T a b e l a 4.5 Distribuição d a s células no ciclo celular, valores estão e x p r e s s o s e m p o r c e n t a g e m e c o r r e s p o n d e m à média e erro padrão d o s resultados d e 4 e n s a i o s
e m duplicata 61
Lista de Figuras xiii
Lista de Figuras
P á g i n a
Figura 1.1 R e p r e s e n t a ç ã o e s q u e m á t i c a da estrutura s e c u n d á r i a da proteína S I 00,
que a p r e s e n t a os dois d o m í n i o s EF de ligação ao cálcio (DonatOo, 2001 ) 3
Figura 1.2 D e s e n h o da mão EF 3 Figura 1.3 R e p r e s e n t a ç ã o e s q u e m á t i c a do rearranjo d e um d í m e r o de proteína
S 1 0 0 a p ó s a ligação ao ion cálcio 5 Figura 1.4 R e p r e s e n t a ç ã o e s q u e m á t i c a d a s vias d e ação intra e extracelulares
das proteínas S I 0 0 (Marenholz I. e cois., 2004) 6 Figura 1.5 E s q u e m a da técnica de anti-sense 14 Figura 3.1 V e t o r retroviral p L X S N c o m s e u s e l e m e n t o s principais: 23
Figura 3.2 E s q u e m a da T r a n s f e c ç ã o transiente e m linhagem ecotrófica 32
Figura 3.3 E s q u e m a da titulação e m células N I H - 3 T 3 33
Figura 4.1 E s q u e m a da amplificação por P C R 41 Figura 4.2 Gel de a g a r o s e 1 % , c o m a representação do f r a g m e n t o do c D N A da
S I OOP, utilizado para a construção d o vetor L S 1 0 0 P S N 42 Figura 4.3 Gel de a g a r o s e 1 % , c o m a representação do f r a g m e n t o do vetor
p L X S N , utilizado para a construção d o vetor L S 1 0 0 P S N 42 Figura 4.4 E s q u e m a da construção d o vetor L S I OOPSN-anti-sense 43
Figura 4.5 D e s e n h o da análise de restrição c o m a e n z i m a S a c i 4 4
Figura 4.6 Gel de agarose 1 % 45 Figura 4.7 Clone A m 1 2 L S 1 0 0 P S N - a n t i - s e n s e - 6 corado c o m R o d a m i n a B 46
Figura 4.8 Célula T 4 7 D e m cultura 48 Figura 4.9 Célula T 4 7 D infectada c o m o Clone A m 1 2 L S 1 0 0 P S N anti-sense/4, 7
dias a p ó s o inicio da seleção c o m G 4 1 8 49 Figura 4.10 Células T 4 7 D s e m vetor L X S N , a p ó s 7 dias d e seleção c o m o
antibiótico G-418 50 Figura 4.11 Gel d e agarose c o m M O P S a p r e s e n t a n d o as s u b u n i d a d e s
ribossomais 2 8 S e 18S 51 e d e m o n s t r a n d o a integridade e a excelente qualidade do R N A extraído 51
cmss^f) HKiümL Dt" EmmA NUCLEAR/SP-ÍPEÑ
Figura 4.12 Gráfico obtido e m um d o s ensaios de P C R e m t e m p o real a p r e s e n t a n d o o padrão de e x p r e s s ã o da ciclofilina A e m t o d o s os clones 53 Figura 4.13 Gráfico obtido e m um d o s ensaios de P C R e m t e m p o real a p r e s e n t a n d o o padrão de e x p r e s s ã o da S l O O P . e m t o d a s as a m o s t r a s e m
triplicata 53 Figura 4 . 1 4 Gráfico obtido e m um dos ensaios de P C R e m t e m p o real
a p r e s e n t a n d o o padrão de e x p r e s s ã o das células T 4 7 D - L X S N para o g e n e
e n d ó g e n o e para o g e n e da S I OOP 54 Figura 4.15 Gráfico de P C R e m t e m p o real a p r e s e n t a n d o a e x p r e s s ã o do Clone
T 4 7 D L S 1 0 0 P S N - A / S 4 54 Figura 4.16 Gráfico d e m o n s t r a n d o a relação d e e x p r e s s ã o obtida e m P C R e m
t e m p o real 56 Figura 4.17 Ge! de a g a r o s e 1,5% c o m produto do P C R e m t e m p o real 57
Figura 4.19 Gráfico gerado pelo p r o g r a m a ModFit c o m a representação das f a s e s
do ciclo celular 60 Figura 4.20 Gráfico gerado pelo p r o g r a m a ModFit c o m a representação das f a s e s
do ciclo celular do clone T 4 7 D L S 1 0 0 P S N - A / S 4 de acordo c o m a quantidade de
DNA m a r c a d o 60 Figura 4.21 Histograma d e m o n s t r a n d o a distribuição d e f a s e s de ciclo celular d a s
células T 4 7 D - L X S N e do clone T 4 7 D - L X S N - A / S 4. R e s u l t a d o s expressos c o m o
média ± E P 62
Introdução 1
1 I N T R O D U Ç Ã O
1.1 C a r r e a d o r e s d e C á l c i o
U m a d a s m a i s difundidas vias d e sinalização intracelular está b a s e a d a no uso de s e g u n d o s m e n s a g e i r o s , assim c o m o o cálcio, q u e é um s e g u n d o mensageiro e x t r e m a m e n t e c o m u m e versátil e q u e controla u m a g r a n d e variedade de p r o c e s s o s celulares.
Desde o início da vida, este íon está envolvido e m processos vitais, c o m o m e d i a d o r d a fertilização e regulador de alguns d o s processos d o ciclo celular da f a s e e m b r i o n á r i a . Já c o m o s e g u n d o m e n s a g e i r o , age na t r a n s d u ç ã o de estímulos extracelulares e m respostas intracelulares (Kirby e cols., 1992;
Muller, A e cols., 1999). U m a propriedade que o torna um m e n s a g e i r o intracelular altamente a d e q u a d o é o fato de se ligar f i r m e m e n t e ás proteínas.
O Cálcio intracelular está envolvido no m e c a n i s m o d e c o n d u ç ã o e t r a n s m i s s ã o d e impulsos nervosos, contração muscular, motilidade celular, secreção, transcrição, a p o p t o s e , diferenciação, e x p r e s s ã o gênica, e n e c r o s e entre outros (Berridge, 1997; D o n a t o , 2 0 0 1 ) . Este íon t e m portanto u m importante papel na regulação do c r e s c i m e n t o e diferenciação d a s células eucariotas, e um desequilíbrio e m sua h o m e o s t a s i a p o d e levar a u m a série de processos patológicos, c o m o c a r d i o m i o p a t i a s , hipertensão e inclusive contribuir na f o r m a ç ã o t u m o r a l ( H e i z m a n n e B r a u n , 1995).
O nível d e cálcio intracelular d e v e ser mantido baixo porque o s esteres fosfato são muito a b u n d a n t e s e os fosfatos de cálcio são bastante insolúveis, para isto, t o d a s as células t ê m s i s t e m a s de transporte para r e m o ç ã o de cálcio. O nível citossólico de cálcio e m células não excitadas é de a p r o x i m a d a m e n t e 0,1 p M , muitas v e z e s m e n o r do que a c o n c e n t r a ç ã o do meio extracelular.
Vários são os m e c a n i s m o s q u e a t u a m na h o m e o s t a s i a do cálcio intracelular, e entre eles d e s t a c a m - s e as proteínas c a r r e a d o r a s de cálcio.
Estas proteínas são as peças c h a v e na t r a n s d u ç ã o da sinalização e interação do cálcio c o m s e u s diferentes alvos ( M a n d i n o v a , A, e cols. 1998). Há um g r a n d e n ú m e r o de proteínas carreadoras de cálcio q u e a t u a m na sinalização intracelular e na m a n u t e n ç ã o da h o m e o s t a s i a do cálcio, p o r é m a maior representante é a família de proteínas S I 0 0 (Mueller, A. e cols., 1999), parte importante d e s t e estudo.
1.2 Família S 1 0 0
Os primeiros m e m b r o s descritos desta família f o r a m as proteínas S 1 0 0 B e S 1 0 0 A 1 , isoladas de cérebro de bovinos e d e n o m i n a d a s S 1 0 0 por s e r e m solúveis e m u m a solução 1 0 0 % saturada de sulfato d e a m ó n i a (Donato, 2 0 0 1 ) .
A s proteínas c a r r e a d o r a s de cálcio da família S I 0 0 estão envolvidas na regulação de u m a g r a n d e variedade d e p r o c e s s o s intracelulares e extracelulares.
Entre estes p r o c e s s o s estão o c r e s c i m e n t o celular, a mobilidade celular, a regulação do ciclo celular, a transcrição e diferenciação, a regulação de atividades enzimáticas e a regulação da h o m e o s t a s i a do cálcio ( E n g e l k a m p e cols.,1992;
Pedrocchi e cols., 1994; Donato, 2003). Essa regulação d e diferentes processos celulares é devida á interação c o m diferentes proteínas alvo (Mueller, A. e cols., 1999) m a s não a p r e s e n t a m a ç ã o enzimática c o n h e c i d a ( Z i m m e r e cols. 2 0 0 3 ) .
G e r a l m e n t e , e s s a s proteínas f o r m a m h o m o d i m e r o s ou h e t e r o d i m e r o s , p o r é m t a m b é m j á f o r a m descritas f o r m a n d o h e x â m e r o s ( M o r o z O.V. e cols., 2 0 0 2 ) . T o d o s os m e m b r o s p o s s u e m um arranjo estrutural e m c o m u m , c o m d u a s regiões q u e a p r e s e n t a m diferentes afinidades pelo cálcio c o n h e c i d a s por EF-hand ou m ã o s EF.
A t u a l m e n t e , a partir da homología d a s s e q ü ê n c i a s de a m i n o á c i d o s e outras p r o p r i e d a d e s m o l e c u l a r e s , mais d e 20 proteínas são c o n s i d e r a d a s m e m b r o s desta família, q u e está presente e x c l u s i v a m e n t e e m vertebrados ( D o n a t o , 2 0 0 1 ; G i r o l a m o , P., 2 0 0 3 ) .
Dos mais de 2 0 g e n e s h u m a n o s descritos até agora, 16 e n c o n t r a m - s e a g r u p a d o s no c r o m o s s o m o 1 q 2 1 . Sua estrutura gênica é a l t a m e n t e c o n s e r v a d a , g e r a l m e n t e c o m p r e e n d e n d o três exons e dois introns. Elas p o s s u e m entre 2 2 % e 5 7 % de homología na seqüência de a m i n o á c i d o s e v a r i a m entre 79 e 114 a m i n o á c i d o s ( M a r e h n o l z , I. e cols., 2 0 0 4 ; E n g e l k a m p , D . e cols. 1993). S ã o proteínas de baixa m a s s a molecular variando entre 9 e 13 kDa (Donato, 2 0 0 3 ) .
Introdução
O que caracteriza esta familia é sua estrutura altamente c o n s e r v a d a f o r m a d a por d u a s regiões que a p r e s e n t a m diferentes afinidades pelo cálcio c o n h e c i d a s por EF-hand ou m ã o s EF. C a d a região é f o r m a d a por u m a a hélice, u m a alça d e ligação ao cálcio e u m a outra a hélice. Portanto, a maioria d e s t a s proteínas possui dois centros de ligação ao cálcio c o n f o r m e pode ser visualizado na figura 1.1. C a d a um d o s centros é f o r m a d o pelas hélices E e F d e s s a proteína, que são posicionadas c o m o o d e d o indicador e o polegar da m ã o direita, f o r m a n d o um â n g u l o d e 9 0 g r a u s (Fig. 1.2), daí a d e n o m i n a ç ã o m ã o E F . O centro de ligação ao cálcio é f o r m a d o por u m a alça entre essas hélices.
LI H L2
H l H í l H III HIV
Figura 1.1 R e p r e s e n t a ç ã o e s q u e m á t i c a da estrutura secundária da proteína S I 00, q u e apresenta os dois d o m í n i o s EF de ligação ao cálcio ( D o n a t o , 2 0 0 1 ) .
L1 e L2:
H:
H I , H I I , H l l l e H I V : N:
C:
centros d e ligação ao cálcio
alça de ligação d o s dois d o m í n i o s EF a hélices
região N terminal região C terminal
Figura 1.2 D e s e n h o da m ã o EF
O modelo de interação entre as proteínas S 1 0 0 e as proteínas alvo ou receptores d e proteínas já foi e x a u s t i v a m e n t e proposto. Foi d e m o n s t r a d o para u m a série de proteínas S 1 0 0 q u e , ao se ligarem ao cálcio sua f o r m a apo-inativa, sofre u m a m u d a n ç a c o n f o r m a c i o n a l q u e e x p õ e importantes resíduos hidrofobicos ao solvente. De a c o r d o c o m o m o d e l o atual, e s s e a u m e n t o hidrofóbico leva a u m a m u d a n ç a estrutural da superfície da proteína permitindo a interação c o m a proteína alvo ( G h b e n k o , A . e cols. 1998; Girolamo,P., 2 0 0 3 ; Z h a n g e cols., 2 0 0 3 ) .
Portanto, a p ó s a ligação ao Cálcio ocorre u m a m u d a n ç a c o n f o r m a c i o n a l , t r a t a n d o - s e n o r m a l m e n t e de u m rearranjo da hélice III (Marenholz, I. e cols., 2 0 0 4 ) q u e e x p õ e m resíduos hidrofóbicos na região da d o b r a d i ç a , responsável pela ligação da proteína S 1 0 0 à proteína alvo (Fig. 1.3).
P o r é m , o m o d o de interação c o m os diferentes alvos entre o s distintos m e m b r o s da família é b e m variado ( M a r e n h o l z , I. e cols., 2 0 0 4 ) .
Várias análises bioquímicas e estruturais d e m o n s t r a r a m q u e as proteínas S 1 0 0 f o r m a m d í m e r o s e esta d i m e h z a ç ã o parece ser crucial para a interação da S I 0 0 ao cálcio (Koltzscher e G e r k e , 2 0 0 0 ) . A p e n a s um m e m b r o da família ocorre na f o r m a d e m o n ô m e r o , trata-se d e calbindin 3 (Marenholz, I. e cols., 2004).
N o r m a l m e n t e são isolados na f o r m a de h o m o d i m e r o s , p o r é m a diversidade de suas f u n ç õ e s biológicas p r o v a v e l m e n t e a u m e n t a pelas f o r m a ç õ e s d e h e t e r o d i m e r o s c o m s u b u n i d a d e s de outros m e m b r o s da família S I 0 0 ( W a n g , G. e cols., 2004).
Introdução
Sítio de ligação
adaptado de Marenholz e cols. 2004
Figura 1.3 R e p r e s e n t a ç ã o e s q u e m á t i c a do rearranjo de u m dímero de proteína S 1 0 0 a p ó s a ligação ao íon cálcio.
E m azul claro e azul escuro a p a r e c e u m m o n ô m e r o c o m a região de ligação á proteína alvo e m azul turquesa e o outro m o n ô m e r o a p a r e c e e m t o n s d e vermelho. O cálcio está r e p r e s e n t a d o e m a m a r e l o m o s t r a n d o que cada s u b u n i d a d e d e S 1 0 0 possui dois sítios d e ligação ao cálcio. A p ó s a ligação ao cálcio, as S 1 0 0 e x p õ e m resíduos hidrofóbicos, responsáveis pela ligação á proteína alvo.
A região carboxi-terminal t e m alta afinidade pelo cálcio, a p r o x i m a d a m e n t e 100 x superior ( D o n a t o , 2 0 0 3 ) e m relação à região a m i n o - terminal q u e a p r e s e n t a baixa afinidade ao cálcio ( H e i z m a n n e B r a u n , 1995;
Schäfer e H e i z m a n n , 1996).
A região C terminai c o n t é m a s e q ü ê n c i a clássica, c o m u m a t o d a s as proteínas c a r r e a d o r a s de cálcio EF. Consiste e m u m a seqüência d e 12 a m i n o á c i d o s . Já na região N terminal há u m a s e q ü ê n c i a diferente da s e q ü ê n c i a típica da EF, p o r é m específica para os m e m b r o s da subfamilia S I 0 0 , consistindo e m u m a s e q ü ê n c i a c o m p o s t a por 14 a m i n o á c i d o s (Schäfer e H e i z m a n n , 1996;
Marenholz, I. e cols., 2 0 0 4 ) .
A l é m de f o r m a r e m h o m o d i m e r o s e h e t e r o d i m e r o s alguns m e m b r o s da família t a m b é m f o r m a m estruturas m u l t i m é h c a s que p a r e c e m estar envolvidas c o m a ação extracelular d e s t a s proteínas. A l g u m a s d e s t a s f o r m a ç õ e s f o r a m descritas c o m S 1 0 0 A 1 2 (Moroz, O. V. e cols., 2002), S 1 0 0 A 4 (Novitskaya, V. e cols., 2000) e S 1 0 0 B (Barger, S. W . e cols., 1992; H u t t u n e n , H . E cols. 2000). Foi proposto que estas f o r m a ç õ e s d e s e n c a d e i a m a ligação ao receptor F ^ G E (receptor for a d v a n c e d glycation end product o u e m português: receptor para o produto final glicosilado) que por sua v e z ativa a cascata d e sinalização intracelular (Fig. 1.4) (Marenholz, I. e cols. 2 0 0 4 ) .
Figura 1.4 R e p r e s e n t a ç ã o e s q u e m á t i c a d a s vias de ação intra e extracelulares das proteínas S I 0 0 ( M a r e n h o l z I. e cols., 2 0 0 4 )
O m e c a n i s m o d e sinalização intracelular ativado pelo R A G E ainda não está c o m p l e t a m e n t e elucidado, m a s s a b e - s e que a ligação ao FíAGE leva a estimulação d e Erk, Jak/Stat e Rho e à ativação do fator d e transcrição NF-kp ( A r u m u g a m , T, e cols. 2 0 0 4 ) e parece induzir a ativação de C d c 4 2 / R a c e M A P Q u i n a s e (Hsieh, HL e cols. 2 0 0 4 ) . No caso de células cancerosas, a ativação d o F ^ G E foi relacionada c o m a estimulação da proliferação, sobrevivência e motilidade celular ( A r u m u g a m , ! . e cols, 2 0 0 4 ) .
ccMssÃo tmomi DE tm&h ¡M.n.KBj'Sp-í'Pín
Introdução
A primeira interação de um m e m b r o da família S 1 0 0 c o m este receptor foi relatada por H o f f m a n n e cols., em 1999, o n d e a ligação da S 1 0 0 A 1 2 c o m o R A G E sugere estar envolvida e m processos inflamatorios.
A maioria d o s m e m b r o s da família a p r e s e n t a alta especificidade por diferentes tecidos, por e x e m p l o , CalbindinS, por células intestinais; S 1 0 0 A 8 e S 1 0 0 A 9 , células g r a n u l o m a t o s a s e m o n ó c i t o s ; S 1 0 0 A 2 , tecido renal e pulmonar;
S 1 0 0 A 7 , células epiteliais (Girolamo, P., 2 0 0 3 ) e S I OOP, pelo tecido m a m á r i o . O s c o m p o n e n t e s da família S 1 0 0 a p r e s e n t a m diferentes p a d r õ e s d e e x p r e s s ã o nos diversos tecidos h u m a n o s , tanto e m c o n d i ç õ e s normais c o m o e m patológicas (Gribenko,A.V. e M a k h a t a d z e , G . I , 1998). O interesse por e s s a s proteínas v e m c r e s c e n d o nos últimos a n o s e m decorrência da sua e x p r e s s ã o diferenciada e m t e c i d o s neoplásicos, m e s m o e m estágios iniciais, e d o s e u e n v o l v i m e n t o e m p r o c e s s o s metastáticos (llg.E.C. e cols., 1996; G r i b e n k o , A . V , e M a k h a t a d z e , G.1,1998; H e i z m a n n , C . 2 0 0 2 ) .
A l t e r a ç õ e s nas e x p r e s s õ e s g ê n i c a s de m e m b r o s da família S I 0 0 f o r a m descritas e m d o e n ç a s c o m o s í n d r o m e s de D o w n e Alzheimer, inflamação crônica, fibröse cística, psoríase, epilepsia e c a r d i o m i o p a t i a s (van Eldik e Griffin, 1994;
N a c k e n W . e cols. 2 0 0 3 ; H e i z m a n n , 0 . 2 0 0 2 ) , b e m c o m o u m a série de neoplasias do páncreas, próstata ( C m o g o r a c - J u r c e v i c , T . e cols. 2 0 0 3 ; A m l e r , L . C . e cols.
2 0 0 0 ; l a c o b u z i o - D o n a h u e , C . A . e cols. 2 0 0 2 ; Sato, N. e cols. 2 0 0 4 ) e m a m a (Da Silva,I.D.C.G. e cols. 2 0 0 0 ; Mackay, A. e cols. 2 0 0 3 ; E m b e r l e y , E . D . e cols. 2 0 0 4 ) .
Já a S 1 0 0 A 2 , foi e n c o n t r a d a pouco e x p r e s s a e m células t u m o r a i s , sugerindo ser u m a candidata para s u p r e s s ã o gênica (Lee e cols., 1992). A S 1 0 0 A 6 foi e n c o n t r a d a sendo super e x p r e s s a e m u m a série de tecidos t u m o r a i s ( S c h ä f e r , B . W . e H e i z m a n n , C . W . 1996) e a S 1 0 0 A 4 está a s s o c i a d a a u m a baixa taxa de sobrevida e m pacientes c o m c â n c e r de m a m a a l é m d e induzir m e t á s t a s e s e m ratos ( R u d l a n d , P . e cols. 2 0 0 0 ) .
C o m o nos últimos a n o s t ê m - s e d e s c o b e r t o vários p r o c e s s o s patológicos relacionados a u m a alteração da c o n c e n t r a ç ã o de cálcio devido a alterações d e e x p r e s s ã o de seus c a r r e a d o r e s , e s s e s fatos t ê m a u m e n t a d o muito o interesse científico e m relação a e s s a classe de proteínas ( M a n d i n o v a , A. e cols, 1998; H e i z m a n n , C . W . e Braun,K. 95 ). A tabela 1.1 foi construída a partir d e um trabalho d e S c h ä f e r e H e i z m a n n (1996) que correlaciona diferentes m e m b r o s
da família S I 00 c o m diversas patologias.
T a b e l a 1.1 Correlação de alguns m e m b r o s da família S I 00 c o m patologias.
Proteína Patologias a s s o c i a d a s S 1 0 0 A 1 C a r d i o m i o p a t i a s S 1 0 0 A 2 C â n c e r de m a m a
S I 0 0 A 3 C â n c e r
S 1 0 0 A 4 C â n c e r d e m a m a , Metástases
S 1 0 0 A 5 C â n c e r
S 1 0 0 A 6 M e l a n o m a s S 1 0 0 A 7 C â n c e r de M a m a S 1 0 0 A 7 L 1 / A 1 5 Psoríase
S 1 0 0 A 8 Fibrose cística e processo inflamatório S 1 0 0 A 9 P r o c e s s o s inflamatórios
S 1 0 0 A 1 0 C â n c e r
S 1 0 0 B Mal d e A l z h e i m e r e síndrome de D o w n S 1 0 0 P C â n c e r d e m a m a , próstata, p â n c r e a s
A n t i c o r p o s anti-SIOO v ê m s e n d o e m p r e g a d o s e m hospitais para classificação do tipo t u m o r a l pela técnica d e imunohistoquímica tanto e m adultos c o m o e m crianças, incluindo t u m o r e s n e u r o e n d ó c h n o s b e n i g n o s c o m o malignos, c a r c i n o m a de tireóide, m e l a n o m a e c a r c i n o m a renal sendo os principais alvos d e e s t u d o as S 1 0 0 A 1 e S 1 0 0 B ( P e d r o c c h i , M . e cols., 1994; llg,E.C. e cols., 1996).
S e g u n d o Mueller.A. e cols., as proteínas S 1 0 0 p r o v a v e l m e n t e t ê m u m p a p e l crucial na regulação da h o m e o s t a s i a do cálcio e m células t u m o r a i s .
1.3 S 1 0 0 P
A S I OOP é u m a proteína carreadora de cálcio, pertencente à família S 1 0 0 , o r i g i n a l m e n t e isolada a partir d e placenta h u m a n a ( E m o t o , Y . e cols., 1992).
P o s s u i 95 a m i n o á c i d o s , m a s s a m o l e c u l a r d e 10,4 kDa, e é o único m e m b r o da família S I 0 0 cujo g e n e está localizado no c r o m o s o m o 4 p 1 6 ( B e c k e r , T . e cols., 1992).
A t é p o u c o t e m p o , acreditava-se que se a p r e s e n t a v a a p e n a s na f o r m a h o m o d i m é r i c a , p o r é m , W a n g , G . e c o l a b o r a d o r e s , 2 0 0 4 , m o s t r a r a m q u e a S I OOP
Introdução
pode f o r m a r h e t e r o d i m e r o s c o m a S 1 0 0 A 1 . A S 1 0 0 A 1 é u m a proteína d e 9 3 a m i n o á c i d o s e apresenta 5 0 % d e similaridade c o m a S 1 0 0 P . A m b a s estão envolvidas e m diferentes patologias h u m a n a s .
A estrutura molecular da S 1 0 0 P já foi m i n u c i o s a m e n t e descrita e a proteína foi cristalizada por Z h a n g e cols., e m 2 0 0 2 , p o r é m ainda não se c o n h e c e a real f u n ç ã o d a S 1 0 0 P . Existem várias e s p e c u l a ç õ e s s o b r e seu m e c a n i s m o d e ação dentro d a s células normais, b e m c o m o nas células tumorais. Vários são o s estudos q u e l e v a m a c o n s i d e r a ç õ e s muito fori:es sobre a participação da S 1 0 0 P e m p r o c e s s o s neoplásicos. A e x p r e s s ã o da S 1 0 0 P foi descrita e m várias linhagens celulares de c â n c e r ( A r u m u g a m , T. e cols, 2 0 0 4 ) .
A c r e d i t a - s e que a S 1 0 0 P seja u m a d a s moléculas envolvidas no controle d o ciclo celular cujo desequilíbrio leva a célula a se tornar imortal. O u t r a e s p e c u l a ç ã o está relacionada c o m sua a t u a ç ã o e m relação ao a c ú m u l o de cálcio extracelular ou microcalcificações, o que por sua vez auxilia no diagnóstico clínico precoce d o c â n c e r d e m a m a (Da Silva, l.e cols., 2 0 0 0 ) .
A e x p r e s s ã o da S 1 0 0 P foi descrita e m células epiteliais do e s ó f a g o e m diferenciação, indicando q u e p r o v a v e l m e n t e participe n o r m a l m e n t e d e s s e processo ( S a t o , N . e Hitomi,J. 2002).
Foi o b s e r v a d o t a m b é m q u e a S 1 0 0 P p o d e interagir c o m a proteína do citoesqueleto ezrina de u m a maneira d e p e n d e n t e de cálcio, trata-se d e u m a ligação a l t a m e n t e específica, e c o m isso influenciar sua habilidade d e se ligar à actina e o s a u t o r e s postularam h a v e r u m a possível ligação c o m o p o d e r d e métastase e m células c a n c e r o s a s ( K o l t z s c h e r , M . e cols., 2 0 0 3 ) .
No tecido m a m á r i o , a S 1 0 0 P foi d e t e c t a d a e m células d e c a r c i n o m a ductal invasivo. A presença dessa proteína e m altas c o n c e n t r a ç õ e s , nas células neoplásicas m a m a r i a s , é um forte indicativo de progressão tumoral in vivo. A l é m disso, acredita-se q u e a S 1 0 0 P t e n h a u m importante papel na imortalização d e células epiteliais m a m a r i a s in vitro (Da Silva,I e cols., 2000). A s proteínas carreadoras de cálcio S 1 0 0 v ê m d e s p e r t a n d o interesse por sua e x p r e s s ã o diferenciada e m tecidos neoplásicos, m e s m o e m estágios iniciais e por s e u envolvimento e m p r o c e s s o s metastáticos (llg,E.C. e cols., 1996; G r i b e n k o , A . V . e M a k h a t a d z e , G.I.,1998; H e i z m a n n , C , 2 0 0 2 ) .
Há indícios d e q u e a S 1 0 0 P participe t a m b é m d o p r o c e s s o carcinogênico da próstata h u m a n a o n d e t e m sido a s s o c i a d a ao c a r c i n o m a não
d e p e n d e n t e d e hormônio e ao processo metastático ( G r i b e n k o , A.V. e cols., 1 9 9 8 ; A v e r b o u k h , L . e cols., 1996, M o u s s e s , S . e cols., 2 0 0 2 ; A m l e r , L . C . e cols., 2 0 0 0 ; Diederichs.S., e cols. 2 0 0 4 ) . S u a e x p r e s s ã o t a m b é m foi d e t e c t a d a no epitelio pancreático no qual havia se f o r m a d o um a d e n o c a r c i n o m a ( L o g s d o n , C . D . e cols., 2003). A l é m disso, a e x p r e s s ã o da S I OOP t a m b é m foi relacionada c o m a d i m i n u i ç ã o da sobrevida d e p a c i e n t e s c o m c â n c e r de p u l m ã o ( B e e r , D . G . e cols., 2 0 0 2 ) .
A r u m u g a m e cols., e m 2 0 0 4 , o b s e r v a r a m que a adição de S I OOP e x ó g e n o e m células da l i n h a g e m de c a m u n d o n g o s N I H - 3 T 3 a u m e n t a a proliferação celular e a sobrevivência das células após estímulos apoptóticos.
C o m p a r a n d o - s e células t u m o r a i s c o m células normais a d j a c e n t e s in vivo, Da Silva e cols., 2 0 0 0 , d e t e c t a r a m q u e o g e n e da S I OOP e n c o n t r a v a - s e de 2 a 20 vezes m a i s expresso no tecido t u m o r a l . O m e s m o resultado foi obtido a partir de células de linfonodos de pacientes c o m diagnóstico positivo para c a r c i n o m a m a m á r i o intraductal invasivo, o n d e a S I OOP t a m b é m aparecia 20 v e z e s mais a u m e n t a d a (Da Silva, I.D.C.G e cols, 2 0 0 0 ) .
E m t e s e a p r e s e n t a d a à F a c u l d a d e de Medicina da Universidade de S ã o Paulo e m 2 0 0 4 , A n a P. T. Shor, d e m o n s t r o u haver forte a s s o c i a ç ã o entre a S I OOP e o receptor de e s t r o g ê n i o na distinção do potencial d e hsco d a s lesões histológicas, c o n f i r m a n d o o papel importante da S I OOP no processo de t r a n s f o r m a ç ã o maligna. O b s e r v a n d o ainda que a ausência da proteína torna praticamente nula a possibilidade de progressão t u m o r a l , e m a i s ainda que sua a ç ã o d e p e n d e t a m b é m d o receptor de estrogênio.
No tecido m a m á h o , a S I OOP foi d e t e c t a d a e m situações q u e vão d e s d e hiperplasia ductal atípica, até c a r c i n o m a in situ e c a r c i n o m a intraductal invasivo, p o r é m não e m tecido d e m a m a n o r m a l , o que levou a crer que a S I OOP t e m um papel importante no processo t u m o r a l (Da Silva, I., e cols. 2 0 0 0 ) .
O papel funcional d a S I OOP na imortalização e t r a n s f o r m a ç ã o de células epiteliais m a m á r i a s não está elucidado. T u d o indica q u e ela está envolvida e m múltiplos processos biológicos, c o m o , por e x e m p l o , na ativação de e n z i m a s envolvidas na progressão do ciclo celular. Por t o d o s e s t e s motivos e acreditando na importância desta proteína nos processos neoplásicos, principalmente relacionados ao câncer d e m a m a , r e s o l v e m o s estudar u m pouco m a i s sobre esta proteína.
Introdução 11
1.4 C â n c e r de m a m a
S e g u n d o o Instituto Nacional de C â n c e r ( I N C A ) , d o Ministério da S a ú d e , o c â n c e r d e m a m a é o s e g u n d o tipo de c â n c e r mais f r e q ü e n t e no m u n d o e o primeiro entre as muliíeres d e p o i s do c â n c e r de pele não m e l a n o m a . A incidência por c â n c e r de m a m a f e m i n i n a a p r e s e n t o u u m c r e s c i m e n t o contínuo na última d é c a d a , o q u e pode ser resultado de m u d a n ç a s s ó c i o - d e m o g r á f i c a s . S e u prognóstico é relativamente b o m , se diagnosticado nos estádios iniciais. E s t i m a - se que a sobrevida média geral cumulativa a p ó s cinco a n o s seja de 6 5 % nos países d e s e n v o l v i d o s , e de 5 6 % para os países e m d e s e n v o l v i m e n t o .
A p e s a r de ser considerado um c â n c e r relativamente d e b o m prognóstico, se diagnosticado e tratado nas f a s e s iniciais, as t a x a s de mortalidade por c â n c e r de m a m a c o n t i n u a m elevadas no Brasil, muito p r o v a v e l m e n t e porque a d o e n ç a ainda é n o r m a l m e n t e diagnosticada e m estádios a v a n ç a d o s . C o m base nas informações disponíveis d o s Registros Hospitalares do INCA, no período 2 0 0 0 / 2 0 0 1 , 5 0 % d o s t u m o r e s de m a m a f o r a m d i a g n o s t i c a d o s nos estádios III e IV o que diminui a sobrevida da paciente.
O n ú m e r o d e casos novos de c â n c e r d e m a m a e s p e r a d o s para o Brasil e m 2005 é de 4 9 . 4 7 0 , c o m u m risco e s t i m a d o de 53 c a s o s a cada 100 mil mulheres (INCA, 2 0 0 5 ) .
Na região S u d e s t e , o c â n c e r de m a m a é o mais incidente entre as mulheres c o m um risco e s t i m a d o d e 73 casos n o v o s por 100 mil.
S e c o n s i d e r a r m o s que as estimativas de c a s o s novos de c â n c e r de m a m a e m 2 0 0 3 e r a m de 4 1 . 6 1 0 , já p o d e m o s notar um a u m e n t o d e q u a s e 1 6 % e m relação as estimativas de 2 0 0 5 , o que significa u m d a d o muito p r e o c u p a n t e .
Não existem m e d i d a s práticas específicas d e p r e v e n ç ã o phmária do c â n c e r d e m a m a aplicável à p o p u l a ç ã o , e m b o r a e s t u d o s observacionais t e n h a m sugerido q u e a prevenção do t a b a g i s m o , a l c o o l i s m o , o b e s i d a d e e s e d e n t a r i s m o r e d u z a m o risco de c â n c e r de m a m a .
O que se sabe é q u e d u r a n t e as diferentes f a s e s da vida da mulher c o m o crescimento, p u b e r d a d e , g e s t a ç ã o , lactação e regressão p ó s - m e n o p a u s a l a m a m a sofre várias m u d a n ç a s e m relação ao t a m a n h o , f o r m a e f u n ç ã o ( R u s s o , J . e cols. 2001) e essas m u d a n ç a s p o d e h a m levar a a l g u m a f o r m a de m u t a ç ã o o u ao d e s e n v o l v i m e n t o do c â n c e r por diferentes motivos.
Foi postulado t a m b é m q u e u m a primeira g e s t a ç ã o a t e r m o e m m u l h e r e s j o v e n s exerce u m efeito protetor e m relação ao c â n c e r d e m a m a . P o r é m não está t o t a l m e n t e elucidada a relação do m e c a n i s m o reprodutivo e m relação ao d e s e n c a d e a m e n t o do c â n c e r d e m a m a o u c o m sua p r o g r e s s ã o ( R u s s o , J, e cols.
2 0 0 1 ) .
O c â n c e r de m a m a é u m a d o e n ç a e x t r e m a m e n t e h e t e r o g ê n e a , c o m u m a g r a n d e variabilidade clinica e histopatológica. Essa variabilidade reflete a sua etiologia c o m p l e x a , que sofre a influência de vários fatores e x ó g e n o s , assim c o m o e n d ó g e n o s . Dentre os fatores q u e a u m e n t a m o risco e n c o n t r a m o s a dieta, uso d e contraceptivos orais, a g e n t e s virais, nuliparidade, idade da phmeira g e s t a ç ã o , d u r a ç ã o do período reprodutivo, taxas h o r m o n a i s e a predisposição genética.
(Silva, R.L.A., 2 0 0 1 ) .
A l é m destes, d e s t a c a m o s a l g u n s outros fatores d e risco c o n s i d e r a d o s importantes pela A s s o c i a ç ã o Médica Brasileira e C o n s e l h o Federal d e Medicina e m 2 0 0 1 :
• Risco pouco elevado
• Menarca precoce (<12 anos)
• M e n o p a u s a tardia (> 55 anos)
• Phmeira g e s t a ç ã o a termo depois dos 34 a n o s
• O b e s i d a d e , dieta g o r d u r o s a e s e d e n t a r i s m o
• Terapia d e reposição h o r m o n a l por mais de 5 a n o s
• Ingestão alcoólica excessiva
• Risco m e d i a m e n t e elevado
• M ã e ou irmã c o m c â n c e r d e m a m a na p ó s - m e n o p a u s a
• A n t e c e d e n t e s de hiperplasia s e m atipla o u m a c r o c i s t o s apócrinos
• Risco muito e l e v a d o
• M ã e ou irmã c o m c â n c e r de m a m a na p r é - m e n o p a u s a
• A n t e c e d e n t e s de hiperplasia epitelial atípica ou neoplasia lobular in situ
Introdução 13
• Suscetibilidade genética c o m p r o v a d a (mutação d e B R C A 1 - 2 )
C o m relação a o s padrões histológicos dos c á n c e r e s d e m a m a , cerca d e 8 0 % são c a r c i n o m a s ductais e 1 0 % s ã o c a r c i n o m a s lobulares; o s 1 0 % restantes a p r e s e n t a m características variadas, c o m o o tipo medular e o s t u m o r e s raros c o m o o s c i s t o s - s a r c o m a filóide e o s a n g i o s a r c o m a s . O c a r c i n o m a ductal in Situ e o c a r c i n o m a lobular in situ estão a s s o c i a d o s a u m maior hsco d e desenvolver c â n c e r d e m a m a invasivo ( N a s c i m e n t o , P. A., 2000).
1.5 T é c n i c a a n t i - s e n s e
A metodologia anti-sense é u m a poderosa f e r r a m e n t a , não só para o estudo da regulação e f u n ç ã o gênica, m a s , t a m b é m , para o d e s e n v o l v i m e n t o d e novos a g e n t e s terapêuticos (Hélène.C. e T o u l m ê , J . J . 1990).
O princípio d a técnica d e anti-sense é a regulação da e x p r e s s ã o gênica d e u m a proteína alvo. Há a l g u m a s a b o r d a g e n s diferentes nesta t é c n i c a : u m a delas t e m o D N A c o m o alvo, e o bloqueio d a transcrição c o m o objetivo, isso é conseguido pela f o r m a ç ã o d e u m a tripla hélice de D N A f o r m a d a pela ligação d e oligonucleotídeos sintéticos, a triple-hélice é f o r m a d a pela ligação d e u m a a d e n i 9 n a a d u a s timinas pela f o r m a ç ã o d a s pontes d e hidrogênio, s e g u i n d o o m o d e l o d e p a r e a m e n t o d e W a t s o n e Crick. Outra a b o r d a g e m t e m o R N A mensageiro c o m o alvo e o bloqueio da t r a d u ç ã o c o m o objetivo pela f o r m a ç ã o d e u m a dupla hélice d e R N A ( H é l è n e , C . e T o u l m é , J . J . 1990).
C o n s i d e r a n d o - s e o R N A m e n s a g e i r o c o m o alvo, há n o v a m e n t e d u a s a b o r d a g e n s distintas q u e p o d e m ser utilizadas, u m a delas utiliza u m par d e oligonucleotídeos sintéticos, f o r m a d o s por u m a seqüência d e t e r m i n a d a d o R N A m e n s a g e i r o , estes oligonucleotídeos n o r m a l m e n t e não p a s s a m d e 2 0 pb. Outra é introduzindo-se a s e q ü ê n c i a codificadora inteira e m sentido invertido na célula alvo. Essa a b o r d a g e m é conhecida c o m o estratégia de antisense gene ( H é l è n e , C . e T o u l m é , J . J . 1990).
No nosso caso o p t a m o s pela s e g u n d a a b o r d a g e m , o n d e realizamos a introdução da fita m o l d e d o D N A c o m p l e m e n t a r do g e n e alvo no sentido invertido e e s p e l h a d o na célula alvo, c o m a intenção d e q u e esta se ligasse ao R N A
m e n s a g e i r o f o r m a n d o u m a dupla fita d e R N A e resultando na inibição parcial d a t r a d u ç ã o pelos ribossomos.(Fig. 1.5).
G E N E
Fita c o d i f i c a d o r a
5 ' G C T A C C A G G C 3 '
3 ' C G G A C C A T C G 5 Fita IVIolde
A N T I - S E N S E
' G C C T G G T A G C 3 '
3 ' C G A T G G T C C G 5 '
R N A s e n s e
5 ' G C U A C C A G G C 3 '
R N A a n t i - s e n s e 5 ' G C C U G G U A G C 3 '
5 G C U A C C A G G C 3 3 ' C G A U G G U C C G 5 '
Figura 1.5 E s q u e m a d a técnica d e a n t i - s e n s e
A alta especificidade d e s s a ligação f a z c o m q u e a técnica d e anti-sense seja u m a estratégia atrativa para m o d u l a r seletivamente a e x p r e s s ã o d e g e n e s envolvidos na p a t o g ê n e s e d e diversas d o e n ç a s ( T a m m , l . e cols., 2 0 0 1 ) .
E s s a m o d u l a ç ã o pode-se d a r por dois m e c a n i s m o s distintos:
c o m p e t i ç ã o c o m o m e c a n i s m o d e t r a d u ç ã o o u clivagem d o R N A m e n s a g e i r o ( H é l è n e , C . e T o u l m é , J . J . 1990). A d e g r a d a ç ã o d a dupla fita d e R N A ocorre principalmente pela ativação da R n a s e H . Este é p r o v a v e l m e n t e o m e c a n i s m o mais importante d a técnica d e anti-sense, a R n a s e H corta a fita heteroduplex D N A - R N A , p o r é m este m e c a n i s m o ainda não está t o t a l m e n t e e l u c i d a d o (Olie,R.A.
e Z a n g e m e i s t e r - W i t t k e , 2 0 0 1 ) .
ícmsk) miiomi oe WOCLEAR/SP-IPEN
Introdução 15
Para introduzir o g e n e no sentido anti-sense nas células alvo, utilizamos um vetor retroviral. O vetor p L X S N foi escolhido para a transferência g ê n i c a , pois e s s e s vetores são altamente eficientes e integrativos (Miller,A.D. e cols., 1993). São vetores relativamente seguros, c o m hsco m í n i m o d e m u t a g ê n e s e e o n c o g ê n e s e . O s retrovírus r e c o m b i n a n t e s são produzidos pela introdução do vetor e m linhagens d e células especializadas, c o n h e c i d a s c o m o células d e e m p a c o t a m e n t o virai (Markowitz,D. e cols.,1988a). A s partículas r e c o m b i n a n t e s são anfotroficas, p o d e n d o infectar u m a g r a n d e variedade de células d e m a m í f e r o s . A proliferação celular é necessária para a infecção (transdução) e a eficiência d e t r a n s d u ç ã o d a s células alvo p o d e c h e g a r a 1 0 0 % e m a l g u n s s i s t e m a s (Mulligan,R.C. 1993).
Neste trabalho d e s c r e v e m o s a construção de u m vetor retroviral c o m o g e n e da proteína carreadora d e cálcio S I OOP e m sentido anti-sense, a t r a n s f e c ç ã o deste g e n e para células endoteliais h u m a n a s e a diminuição da e x p r e s s ã o d e s s a s células.
O B J E T I V O S DO T R A B A L H O
O objetivo principal deste trabalho foi avaliar u m a eventual alteração na f u n ç ã o d e células d e c a r c i n o m a ductal m a m á r i o h u m a n o T 4 7 D a p ó s t r a n s d u ç ã o da proteína carreadora d e cálcio S 1 0 0 P e m sentido anti-sense, v a l e n d o - s e da transferência gênica c o m vetor retroviral.
Materiais e Métodos 17
3 MATERIAIS E M E T O D O S
3.1 M A T E R I A I S
3.1.1 E q u i p a m e n t o s e a c e s s ó r i o s principais
• A g i t a d o r - a q u e c e d o r , m o d e l o 2 5 8 , F A N E M Ltda., São Paulo, S P , Brasil;
• A g i t a d o r d e t u b o s (tipo vórtex), Q U I M I S A p . Científicos Ltda., São Paulo, S P , Brasil;
• A p a r e l h o d e eletroforese Electrophoresis Power Supply - modelo 2 5 0 , Life T e c h n o l o g i e s , Gibco B R L , EUA;
• A p a r e l h o Milli-Q-pIus, purificador de á g u a - M I L L I P O R E , B e d f o r d , MA, EUA;
• A u t o c l a v e vertical, modelo 4 1 5 , F A N E M Ltda., S ã o Paulo, S P , Brasil;
• Balança O h a u s , modelo N C T 2 0 0 , O h a u s C o . Florham Park, N J , EUA;
• B a n h o - m a r i a , modelo 100 - F A N E M Ltda., São Paulo, S P , Brasil;
• B a n h o - m a r i a , modelo T y p e 16500 D h - B a t h , B a r n s t e a d / T h e r m o l y n e ; D u b u g n e , Iowa, EUA;
• B a n h o - m a h a , Q U I M I S A p . Científicos Ltda., S ã o Paulo, S P , Brasil;
• Centrífuga M a r a t h o n 8k, Fischer Scientific, EUA;
• Centrífuga refrigerada a u t o m á t i c a Oppendorf Centrifuge 581 OR, E p p e n d o r f A G , H a m b u r g , A l e m a n h a ;
• Centrífuga refrigerada a u t o m á t i c a , M S E Micro C e n t a u r - S a n y o , São Paulo, S P Brasil;
• Centrífuga refrigerada a u t o m á t i c a , S u p e r s p e e d R C 2 - B , S O R V A L L , N e w t o n , Connecticut, EUA;
• Citômetro de Fluxo m o d e l o FACSCalibur, B D Biosciences, N J , EUA;
• Espectrofotômetro, J E W A , 6.500 U.V.V, Inglaterra;
• Espectrofotômetro, m o d e l o L K B Ultrospec III, P h a r m a c i a Biotech, EUA;
• Estufa retilinea, F A N E M Ltda., São Paulo, S P , Brasil;
• Estufa de cultura de células. Reveo habitat, G S Laboratory E q u i p m e n t , Asheville, NC, E U A ;
• Fluxo laminar h o r i z o n t a l , classe II, modelo B B F - 4 S S , Biological Safety Cabinet - G e r m f r e e L a b . Inc, Miami, EUA;
• L â m i n a s para microscopía c o n f o c a l . Lab T e k II C h a m b e r slide w/cover RS Glass slides, Nalge N U N C int., Naperville, E U A ;
• Material plástico estéril para cultura celular - C O R N I N G C O S A R C O R P . , C a m b r i d g e , MA, EUA;
• Microscopio confocal Zeiss Axiovert 1 0 0 M , A l e m a n h a ;
• Microscopio invertido, m o d e l o eclipse T S 100, Nikon; J a p ã o ;
• Software ABI Prism 7700 S e q u e n c e Detection S y s t e m s version 1,6, A p p l i e d Byositems, EUA;
• T e r m o c i c l a d o r A B I P r i s m ^ ^ 7 7 0 0 S e q u e n c e Detector, A p p l i e d B i o s y s t e m s , EUA;
• Termociclador m o d e l o M J R e s e a r c h P T E - 2 0 0 , Peltier T h e r m a l Cycler, EUA;
• Termociclador, P T C - 100 P r o g r a m m a b l e T h e r m a l Controller MJ R e s e a r c h , INC, EUA;
• T e r m o c i c l a d o r G e n e A m p ® P C R S y s t e m 9 7 0 0 , PE Applied B i o s y s t e m , EUA;
Materiais e Métodos 19
3.1.2 Principais r e a g e n t e s
• Acrilamida, Siga AIdricli fine C i i e m i c a l s , St. Louis, IVlissouri, EUA;
• A g a r - á g a r purificado para bacteriologia - M E R C K , S ã o Paulo, Brasil;
• A g a r o s e - G I B C O - B R L , G a i t h e r s b u r g , M D , EUA;
• Álcool etílico absoluto p.a. , Labsynth prod p/ Lab. Ltda., S ã o Paulo, Brasil;
• Álcool Iso-propílico - M E R C K , São Paulo, Brasil;
• Ampicilina - S i g m a A l d h c h fine Chemicals, St. Louis, Missouri, EUA;
• Anticorpo S 1 0 0 P - B D T r a n s d u c t i o n Laboratories, EUA;
• Anticorpo s e c u n d á r i o Anti m o u s e polyvalent i m m u n o g l o b u l i n s FITC conjugate - S i g m a AIdrich fine C h e m i c a l s , St. Louis, Missouri, EUA;
• A c . Acético Glacial, p.a , Labsynth Prod, para Laboratório Ltda., S P , Brasil;
• Bacto-triptona - D I F C O I N T E R L A B , São Paulo, Brasil;
• Cloreto de Cálcio - S i g m a AIdrich fine C h e m i c a l s , St. Louis, Missouri, EUA;
• Cloreto de S ó d i o , p.a , Labsynth Prod, para Laboratório Ltda., S P , Brasil;
• Clorofórmio p.a. - M E R C K , São Paulo, Brasil;
• Dimetilsuifóxido ( D M S O ) , M E R C K , S ã o P a u l o , Brasil;
• Etanol p.a. - M E R C K , S ã o Paulo, Brasil;
• Extrato de levedura , select yeast extract, G I B C O B R L , G a i t h e r s b u r g , M D , EUA;
• Fenol p.a. M E R C K , S ã o Paulo, S P , Brasil;
• Formaldeído - S i g m a AIdrich fine C h e m i c a l s , St. Louis, Missouri, EUA;
• Glicose p.a. M E R C K , S ã o Paulo, S P , Brasil;
• H E P E S - S i g m a AIdrich fine C h e m i c a l s , St. Louis, Missouri, EUA ;
• Isopropanol, M E R C K ,São Paulo, Brasil;
• Penicilina-estreptomicina - G I B C O - B R L , G a i t h e r s b u r g , M D , EUA;
• S a p o n i n a , Serva F e i n b i o c h e m i c a G m b H & Co., Heidelberg, A l e m a n h a ;
3.1.3 Principais r e a g e n t e s utilizados para biologia molecular
• A g a r o s e L o w Melting, L M P - L o w Melting Point, Invitrogen Life T e c h n o l o g i e s , C a r l s b a d , California, EUA;
• Big Dye Terminator wersão 2, Applied B i o s y s t e m , EUA;
• BSA (Bovine s e r u m a l b u m i n e ) - P r o m e g a , EUA;
• Brometo de etídeo - P h a r m a c i a Biotech, EUA;
• Cloreto d e Magnésio MgCl2,,Promega, EUA;
• D n a s e i , Invitrogen Life T e c h n o l o g i e s , C a r l s b a d , California, EUA;
• D e o x y n u c l e o t i d e o trifosfato ( d N T P ) mix ( 1 0 m M ) Invitrogen Life T e c h n o l o g i e s , C a r l s b a d , California, EUA;
• Diethyl P y r o c a r b o n a t e ( D E P C ) - S i g m a AIdrich fine C h e m i c a l s , St.
Louis, Missouri, EUA;
e E D T A 2 5 m M , Invitrogen Life T e c h n o l o g i e s , Carlsbad, California, EUA;
• E n z i m a s de restrição EcoRI e X/70I ( P r o m e g a ) SAC I ( P r o m e g a ) . - G I B C O - B R L (Gaithersburg, M D , EUA), P H A R M A C I A ( U p p s a l a , Suecia), N E W E N G L A N D B I O L A B S ( B e v e r i y , M A , E U A ) ; P R O M E G A
• F o r m a m i d a - A m r e s c o , S o l o n , Ohio, E U A ;
• G F X G e n o m i c Blood D N A Purification kit para extração de DNA, A m e r s h a m P h a r m a c i a Biotech INC,EUA;
• I m p r o m II M-MLV Transcriptase reversa, P r o m e g a , E U A ;
• lodeto de propfdeo, S i g m a AIdrich fine C h e m i c a l s , St. Louis, Missouri, EUA;
• Kit E p p e n d o r f Perfect Prep Gel C l e a n u p - Eppendorf A G , H a m b u r g , A l e m a n h a ;
• M a r c a d o r d e peso molecular X, 100bp D N A Ladder, Invitrogen Life T e c h n o l o g i e s , C a r i s b a d , California, EUA;
• Master Mix, E p p e n d o r f A G , H a m b u r g , A l e m a n h a ;
• M O P S (3-[N-Morpholino] propanesulfonic acid) S i g m a AIdrich fine C h e m i c a l s , St. Louis, Missouri, EUA;
• Oligo(dT), P r o m e g a , EUA;
• Platinum Pfx D N A Polimerase e seu t a m p ã o PFX Amplification Buffer lOx, Invitrogen Life T e c h n o l o g i e s , C a r i s b a d , California, EUA;
Materiais e Métodos 21
• S y b e r G r e e n , Applied B i o s y s t e m s , EUA;
• Trizol®, Invitrogen Life T e c i i n o l o g i e s , C a r i s b a d , California, EUA;
3.1.4 Principais r e a g e n t e s para cultura celular
• Cloreto de Cálcio - S i g m a AIdrich fine C h e m i c a l s , St. Louis, Missouri, EUA;
• Dimetilsuifóxido ( D M S O ) , M E R C K , S ã o P a u l o , Brasil;
• Geneticina ( G 4 1 8 ) , Genef/c/n® G I B C O - B R L ,Gaithersburg, M D , E U A ;
• G l u t a m i n a - G I B C O - B R L G a i t h e r s b u r g , M D , EUA;
• H E P E S , S i g m a AIdrich fine C h e m i c a l s , St. Louis, Missouri, EUA;
• Meio d e cultura E A G L E modificado por Dulbelcco ( D M E M ) , G I B C O - B R L , G a i t h e r s b u r g , M D , EUA;
• Penicilina-estreptomicina - G I B C O - B R L , G a i t h e r s b u r g , M D , E U A ;
• Polibreno ( 0 , 8 m g / m L ) B r o m e t o d e hexadimetrina - A L D R I C H , M i l w a u k e e , EUA;.
• R o d a m i n a B - S i g m a AIdrich fine Chemicals, St. Louis, Missouri, E U A ;
• Soro Fetal Bovino, ( S F B ) Invitrogen Life T e c h n o l o g i e s , C a r i s b a d , California, EUA;
• Tripsina - G I B C O - B R L , G a i t h e r s b u r g , M D , E U A
• T r y p a n blue 0 , 4 % (corante vital) - G I B C O - B R L , G a i t h e r s b u r g , M D . E U A ;
3.1.5 O l i g o n u c l e o t í d e o s
SI OOP: Sintetizado pela e m p r e s a Invitrogen™ , b a s e a d o no trabalho de Becker e cols., d e 1992 c o m as s e q ü ê n c i a s a seguir e utilizado para a construção do vetor retroviral:
P 1 : C 2 N B S P 5' - C T A C T C G A G C A T A T G A C G G A A C T A G - 3' s e n s e P2: 2 N B S P 5' - T T A G A A T T C G G A T C C A G G G C A TOA T - 3' anti-sense
cmssÃo mmmL DE mmíA N-ÜCLEAP^SP-ÍPEÉ
S 1 0 0 P : Este par d e primers foi d e s e n h a d o pelo sistema d e software Primer Express oligo design software da Applied B i o s y s t e m s , sintetizado por IDT Integrated D N A T e c h n o l o g i e s , Inc. e utilizado para os ensaios de P C R e m t e m p o real:
P3: 5' - A A T T G C T C A A G G A C C T G G A C G 3' - s e n s e P4: 5' - G C A T C A T T T G A G T C C T G C C T T C 3' - anti-sense
Ciclofilina A: Sintetizado por IDT Integrated D N A T e c h n o l o g i e s , Inc. e utilizado para os ensaios de P C R e m t e m p o real c o m o g e n e e n d ó g e n o .
P 1 : 5' CAA A T G C T G G A C C C A A C A C A 3' - sense P2: 5' T T G C C A A A C A C C A C A T G C T T 3' - anti-sense
3.1.6 Vetor Retroviral
C o m o vetor para a transferência gênica utilizamos o vetor retroviral p L X S N , que c o n t é m e l e m e n t o s derivados de retrovirus murine, do vírus da leucemia murina d e M o l o n e y ( M o M u L V ) e do vírus de s a r c o m a murine de M o l o n e y ( M o M u S V ) , e é d e s i g n a d o para transferência e e x p r e s s ã o gênica. Por m e i o de técnicas d e DNA r e c o m b i n a n t e , os g e n e s no g e n o m a viral necessários para a reprodução do M o M u L V , g e n e s gag, pol e env, f o r a m removidos e no sítio de policlonagem é inserido o g e n d e interesse (Fig.3.1). O q u e sobra do retrovírus s ã o seus e l e m e n t o s regulatórios: as repetições terminais longas ( L T R ) , que f u n c i o n a m c o m o sinais de integração do provirus e p r o m o t o r e s da transcrição, e u m sinal de e m p a c o t a m e n t o para permitir que o R N A transcrito seja a c o m o d a d o e m u m a partícula viral. Para a p r o d u ç ã o d o s vetores retrovirais contendo o g e n de interesse, é utilizada u m a linhagem celular de empacotamento contendo o s g e n e s gag, pol e env i n c o r p o r a d o s ao g e n o m a d e s t a s células. O vetor retroviral d e s p r o v i d o d o s g e n e s para a replicação viral não é c o m p e t e n t e para a replicação, e por isso não é c a p a z de produzir mais vírus c o m p e t e n t e s dentro da célula-alvo.
Portanto, o vetor a g e c o m o u m agente final de transferência gênica, d e i x a n d o u m a cópia de sua s e q ü ê n c i a no g e n o m a da célula-alvo.
Materiais e Métodos 23
S P C
Figura 3.1 V e t o r retroviral p L X S N c o m s e u s e l e m e n t o s principais:
- 3'LTR e 5'LTR s e q ü ê n c i a s de D N A d o vírus d a leucemia murina ( m o M u L V ) - n e o ' g e n e que confere resistência à n e o m i c i n a
- A m p ' g e n e que confere resistência à ampicilina - S V 4 0 p r o m o t o r do "Simian vírus"
- f Psí+ sinal de e m p a c o t a m e n t o viral
- S P C sítio d e policlonagem 5 ' - E c o R I , H p a I, X H O I, S a m HI - 3'
