TÉCNICA DE FLOCULACION EN PORTAOBJETOS DE V.D. R. L. Elaborada en el Laboratorio de Investigaciones y Centro de Adiestramiento
de la Oficina Sanitaria Panamericana, Guutemab, C. A. Preparación del antigeno.-El antígeno que se usa en esta prueba es una solución alcohólica que contiene 0.03% de cardiolipina, 0.9% de colesterol y una cantidad de lecitina purificada lo suficiente para producir una reactividad estándard. Cada lote de antígeno debe ser serológi- camente estandarizado por cuidadosa comparación con un antígeno cuya . reactividad haya sido establecida (1, 2).
El antígeno se distribuye en botellas de vidrio oscuro (que tienen una cubierta interior de papel de estaño o vinilita) con tapa de caucho atorni- hable. Se almacena a la temperatura de la habitación en la oscuridad. Los componentes del antígeno permanecen en solución a temperaturas normaIes, de modo que cualquier precipitado que se observe, indicará alteraciones debidas a factores tales como: evaporación o partículas de sustancias agregadas por medio de las pipetas. Antígenos conteniendo precipitados no deben usarse.
Preparación del suero.-El suero debe ser claro. Se obtiene centrifu- gando sangre total coagulada. El suero se calienta al baño Maria a 56” C durante 30 minutos o a 60”-62” C durante 3 minutos, antes de usarlo. Al sacar el suero del baño María se examina y si contiene precipitados o partfculas extrañas, se debe centrifugar nuevamente. Si las pruebas no se hacen dentro de las cuatro horas siguientes a esta preparación, se deben recalentar nuevamente los sueros a 56” C durante 10 minutos.
Preparación de la solución salina.-La solución salina amortiguada (solución bofer) contiene cloruro de sodio (Q.P.) en una concentración de 1% y es preparada en la siguiente forma:
Formol neutro (pureza de reactivo). . . . 0.05 ml Fosfato de sodio secundario (Na~HPOa f 12
HzO) . . . 0.093 gm Fosfato de potasio, primario (I(H2P04). . . . 0.170 gm Cloruro de sodio, A.C.S.. . . . 10.0 gm Agua destilada. . . . . . l,ooo.o ml Esta solución da lecturas en el Potenciómetro de pH, de 6.0 f 0.1 y debe conservarse en botellas con tapón de rosca o de vidrio esmerilado.
La solución salina al 0.9% se prepara agregando 900 mg de cloruro de sodio seco a cada 100 mI de agua destilada.
Preparación de los portaobjetos.-Se emplean portaobjetos de vidrio de 5 X 7.5 cm con anillos de parafina de un diámetro interior de 15 mm aproximadamente, según los describe Kline (3). Los portaobjetos nuevos se lavan con Bon Amí, se secan y después se limpian con una tela suave. Los portaobjetos usados pueden usarse de nuevo quitándoles la paraiina,
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lavándolos cuidadosamente con jabón y agua abundante y tratándolos como si fueran nuevos.
Durante el proceso de limpieza de los portaobjetos debe tenerse cuidado de tomar éstos por los bordes, evitando así dejar huellas digitales grasosas en las superficies. En los portaobjetos limpios, el suero deberá extenderse fácilmente en el interior de los anillos de parafina y si no se extiende es indicación de que el portaobjetos no está limpio y por lo tanto no debe usarse.
Los anillos se montan en los portaobjetos, transfiriendo parafina fun- dida por medio de moldes de metal. La casa A. H. Thomas y Cía. de Filadelfia, Pensilvania, fabrica dispositivos especiales para hacer anillos de parafina, ya sean manuales o automáticos calentados por electricidad.
Preparación de la emulsión de antígeno.-1. Con una pipeta poner 0.4 ml de solución salina amortiguada en el fondo plano de una botella redonda de 30 ml de capacidad. Estas botellas deben tener tapón de vidrio esmerilado o de caucho atornillable.
2. Con una pipeta de 1.0 ml, graduada a la punta, agregar gota a gota 0.5 ml del antígeno directamente sobre la solución salina, mientras se rota continua y suavemente el frasco.*
3. Soplar la última gota del antígeno.
4. Continuar el movimiento de rotación del frasco por 10 segundos más.
5. Usando una pipeta de 5.0 ml, agregar 4.1 ml de la solución salina. 6. Tapar el frasco y agitarlo vigorosamente durante 10 segundos aproximadamente.
7. La emulsión de antígeno así preparada está lista para usarse y puede usarse durante un dia.
Esta cantidad es suficiente para efectuar 250 pruebas aproximada- mente. Puede prepararse de una vez doble cantidad de emulsión de antígeno, usando un frasco de 30 ml y doble cantidad de antígeno y de solución salina. Para agregar los 8.2 ml de solución salina debe usarse una pipeta de 10 ml graduada a la punta. De requerirse una cantidad mayor de emulsión de antígeno, deberá prepararse por lotes separados, los cuales pueden mezclarse y ensayarse después.
Método para distribuir la emulsión de antígeno en los portaobjetos.- La emulsión de antígeno puede distribuirse utilizando una aguja hipo- dérmica calibre 22, bisel regular o de calibre 23 de bisel largo, adaptada a una jeringa de 1.0 6 2.0 ml y que se debe mantener dentro del frasco de la emulsión de antígeno mientras no se esté usando.
Se deben obtener 60 gotas por cada mililitro de emulsión, esto se
Mayo INO] SÍFILIS 511 logra sosteniendo la jeringa horizontalmente de modo que el bisel de la aguja quede hacia abajo, es decir la superficie de goteo es horizontal. Si se aumenta el ángulo en que se sostiene la jeringa, la superficie de caída disminuye y por consiguiente disminuye también el tamaño de la gota.
Ya sea que se use este método u otro, es esencial que la cantidad de emulsión de antígeno usada en cada prueba sea exacta (1/60 ml), pues el numero de partfculas de antígeno por campo microscópico varía proporcionalmente al volumen de la gota de emulsión de antígeno usada, por esta razón es necesario comprobar diariamente el numero de gotas por ml que se obtienen con la aguja que se va a usar.
Cuando el antígeno se ha dejado reposar deberá agitarse suavemente, rodando la botella y llenando y vaciando la jeringa, antes de volverse a usar.
Ensayo preliminar de la emulsión de antígeno.--Cada lote de emulsión de antígeno debe ser primero comprobado con sueros positivos y nega- tivos conocidos, siguiendo la técnica descrita más adelante (Prueba Cualitativa). Estas reacciones deben dar resultados típicamente positi- vos y negativos respectivamente y el tamaño y número de las partículas de antígeno, por campo microscópico, debe ser el óptimo en el suero negativo. Si las partículas de antígeno, en el suero negativo, aparecen muy grandes es debido a mala preparación de la emulsión y en este caso
no debe usarse.
Técnica de la prueba cualitativa.-1. Poner con una pipeta 0.05 ml del suero preparado en uno de los anillos parafinados del portaobjetos.
2. Agregar una gota (1/60 ml) de la emulsión de antígeno a cada suero.
3. Los portaobjetos se rotan durante 4 minutos. Si la rotación se hace a mano, debe hacerse sobre una superficie plana, circunscribiendo un círculo de más o menos 5 cm de diámetro a 120 rotaciones por minuto. Puede usarse también el rotador tipo Boerner, fabricado por A. H. Thomas y Cia. de Filadelfia, Pensilvania, ajustado a 180 revoluciones por minuto.
4. Leer los resultados inmediatamente después de la rotaci6n.* Lectura e informe de los resultados.-Las pruebas se leen microscó- picamente con objetivo débil (100 aumentos). Las partículas de antígeno aparecen como barritas cortas con este aumento. La agrupación de estas partfculas en grumos pequeños o grandes se interpretan como grados de positividad. Asf:
Ausencia de grumos o aspereza leve.. . . . , . . . . Negativa (N) Grumos pequeños.. . . . _ . . . _ . . . . _ . . . Positiva Débil (P.D.) Grumos medianos y grandes. . . . . . . . _ . . . . Positiva (P)
* Se deben incluir siempre sueros conocidos (controles) Positivos, Débilmente
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Se recomienda que solamente los términos Positivo, DEbilmente Posi- tivo y Negativo, sean usados para informar los resultados de estas pruebas.
A fin de obtener una lectura e interpretación correcta de los resultados es necesario que los técnicos hayan tenido entrenamiento y práctica en la técnica empleada.
La reacción positiva común se caracteriza por el tamaño más 0 menos uniforme de los grumos, ya sean éstos grandes o pequeños. Las reacciones zonales, debidas a un exceso de reactivo componente en el suero, se caracterizan por la irregularidad en el tamaño de los grumos y por la poca cohesión de éstos, a veces mezclados con particulas de antfgeno libre.
Siempre que se sospeche una reacción zonal, el suero debe ser diluído al 1: 5 y 1:25 y repetidas las pruebas. Si las reacciones se encuentran más intensas en las diluciones que en el suero no diluído, el resultado final se considera positivo.
Manera de preparar las diluciones: en dos tubos de ensayo colocar 0.4 ml de solución salina (0.9yo) en cada uno; al tubo No. 1 se le agrega 0.1 ml del suero inactivado, mezclarlo bien y pasar 0.1 ml al tubo No. 2. Técnica de la prueba cuantitativa.-La prueba cuantitativa se efectúa en una serie de diluciones del suero en soluciún salina, haciendo indivi- dualmente en cada dilución la prueba cualitativa.
Las diluciones se preparan de la siguiente manera: en cada uno de 6 o más tubos se colocan 0.5 ml de solución salina fresca (0.9%). Al tubo No. 1 se le agrega 0.5 ml del suero preparado, se mezcla bien el contenido y se transfieren 0.5 ml al tubo No. 2, continuando esta opera- ción hasta el tubo No. 6, que contendrá 1.0 ml, así se obtendrán dilucio- nes al 1~2, 1:4, 1:8, 1:16, etc. Cada dilución de suero es probada como se describe en la técnica de la prueba cualitativa.
Lectura e informe de los resultados.-1. Las pruebas se leen microscó- picamente con objetivo débil (100 aumentos), como se describe en la prueba cualitativa.
2. Se hace la prueba en cada dilución y en aquella que se obtenga una reacción Positiva (no ligeramente positiva), se interpretará como el punto final de la reacción de acuerdo con el siguiente ejemplo:
Diluciones del Suero
Informe 1:2 1:4 1:s 1~16 1:32 1:64
~--~--
P P P P.D. N N Positivo, dilución al 1:s (3)
P P.D. N N N N Positivo, dilución al 1:2 (3)
P.D. N N N N N Positivo, con suero no diluido (3)
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Nota: En ciertos climas en que hay alta temperatura y bajo grado de humedad como sucede en los meses de verano en ciertas regiones, la emulsión de antígeno puede guardarse en refrigeradora. Para evitar evaporación en el portaobjeto, las pruebas deben hacerse y leerse lo más r&pidamente posible.
PRUEBA DE FLOCULACION EN TUBO DE V.D.R.L. Antígeno.-El antígeno se prepara como para la Prueba de V.D.R.L. en portaobjeto.
Preparación de las soluciones salinas.-1. La solución salina amorti- guada V.D.R.L. al 1.0% se prepara como para la prueba de V.D.R.L. en portaobjeto.
2. La solución de cloruro de sodio al 1% no amortiguada se prepara agregando 1 gramo de cloruro de sodio seco a cada LOO ml de agua desti- lada.
Preparach del suero.-El suero debe ser claro. Se obtiene centrifu- gando sangre total coagulada. El suero se calienta al baño María a 56” C durante 30 minutos o a 6OO-62” C durante 3 minutos,‘antes de usarlo. Al sacar el suero del baño María se examina y si contiene precipitados o partículas extrañas, se debe centrifugar nuevamente. Si las pruebas no se hacen dentro de las cuatro horas siguientes a esta preparación, se deben recalentar nuevamente los sueros a 56” C durante 10 minutos.
Preparación de la emulsión de antfgeno.-1. Preparar la emulsión de antígeno como para la Prueba de V.D.R.L. en portaobjeto.
2. Agregar cuatro partes de solución de cloruro de sodio al 1% a una parte de la emulsión de antígeno para la prueba de fluculación de V.D.R.L. en portaobjeto. Mézclese bien y déjese reposar cinco 6 más minutos (no más de dos horas) antes de usarse. Esta solución será llamada Emulsión de Antígeno Dilufdo.
Prueba cualitativa.-1. Poner con una pipeta 0.5 ml del suero calen- tado en un tubo de 12 x 75 mm (D.E.).
2. Agregar 0.5 ml de emulsión de antígeno dilufdo a cada suero. 3. Agitar los tubos en la agitadora de Kahn durante 5 minutos. 4. Centrifugar todos los tubos durante 10 minutos a una fuerza equivalente a 2,000 r.p.m. en la Centrífuga International Electric Co., No. 1 ó a 1,700 r.p.m. en la Centrffuga No. 2.
5. Regr&ense los tubos a la agitadora de Kahn y agftense por un minuto exactamente.
514 BOLETfN DE T,A OFICINA SANITARIA PANAMERICANA 2. Repórtense los resultados como sigue:
Positkw Partfculas visibles en un medio claro o ligeramente turbio. Todas las reacciones en las cuales el observador tiene duda acerca dela visibilidad de los grumos, deberán reportarse como negativas.
Negativo: No hay agregación de partículas de antígeno ni grumos visibles. Aspecto ligeramente turbio o granular. Remolino sedoso bien mar- cado al agitar suavemente.
Nota: Los sueros hemolizados o turbios pueden dar lugar a que las pruebas terminadas resulten demasiado turbias para la lectura macroscópica. El líquido de estos tubos puede ser examinado en el microscopio. Pueden reportarse resultados positivos si se observan al microscopio masas grandes de partículas de antfgeno cuando el suero probado no revela partículas extrañas al observarlo al mismo aumento.
Las reacciones zonales, debidas al exceso de elemento reactivo en la composición del suero, pueden aparecer como muy débiles y en raros casos negativas. Siempre que se sospeche una reacción zonal, deberá hacerse otra prueba usando 0.1 ml del suero inacti- vado y 0.4 ml de solución salina en lugar de 0.5 ml del suero original. Si se obtiene un resultado positivo con 0.1 ml de suero, deberá re- portarse el resultado como positivo.
Prueba cuantitativa en suero.-1. Poner con una pipeta 0.5 ml de solución salina 0.9%, recién preparada, en cada uno de 6 o más tubos de ensayo (12 x 75 mm).
2. Agregar 0.5 ml de suero inactivado al primer tubo. Mezclar. 3. Transferir 0.5 ml del primero al segundo tubo. Mezclar.
4. Continuar transfiriendo 0.5 ml de cada tubo al siguiente, mezclando hasta llegar al último tubo, así se obtendrán diluciones del suero al
1:2, 1:4, 1:8, l:lG, etc.
5. Descartar 0.5 ml del ultimo tubo.
6. Agregar 0.5 ml de la emulsión de antígeno dilufdo a cada tubo y proceder como se describe en la prueba cualitativa en suero.
Lectura y resultados de la prueba cuantitativa.-La mayor dilución de suero que produce una reacción Positiva bien definida se interpretará como el punto final de la reacción de acuerdo con el siguiente ejemplo.
Diluciones de Suero
Informe 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64
___---
P P P P N N Positivo, dilución al 1: 16 6 16 dils. (3) P P N N N N Positivo, dilución al 1:4 6 4 dila. (3) N N N N N N Positivo en suero no diluido 6 1 dil”. (3)
P-Positivo. N-Negativo.
Mayo 19601 SfFILIS 515 PRUEBA DE V.D.R.L. PARA LIQUIDO CÉFALORRAQUfDEO
Antígeno.-1. El antígeno se prepara como para la Prueba de V.D.R.L. en portaobjeto.
Preparación de la solución salina.-1 . La solución salina amortiguada al 1.0% se prepara como para la prueba de V.D.R.L. en portaobjeto.
2. Solución de cloruro de sodio al 10%.
a. Disuelvánse 10 gramos de cloruro de sodio seco (Q.P.) en 100 ml de agua destilada.
Preparación del liquido céfalorraquídeo.-1. Centrifúguese y decán- tese cada líquido céfalorraquideo. Los líquidos céfalorraquídeos visible- mente contaminados o que contienen sangre no resultan satisfactorios para la prueba.
2. Inactfvese el líquido céfalorraquídeo a 56O C durante 15 minutos. Déjese enfriar a la temperatura ambiente antes de probarlo.
Preparación de la emulsión de antígeno sensibilizado.-1. Prepárese emulsión de antígeno como se describe para la prueba de V.D.R.L. en portaobjeto.
2. Agréguese un volumen de solución de cloruro de sodio al 10% a un volumen de la emulsión de antígeno de la prueba de V.D.R.L. en porta- objeto.
3. Mézclese bien, y déjese reposar por lo menos 15 minutos, pero no más de dos horas antes de usarse.
Prueba cualitativa del lfquido céPalorraquídeo.-1. Poner con una pipeta 1.0 ml de liquido céfalorraquídeo inactivado en un tubo de ensayo de 13 x 100 mm. Inclúyanse en la prueba controles de líquido céfalorra- quídeo positivo y negativo.
2. Agréguense 0.2 ml de emulsión de antígeno sensibilizado a cada líquido céfalorraquídeo. Vuélvase a mezclar la emulsión de antígeno sensibilizado inmediatamente antes de su uso, invirtiendo el frasco varias veces.
3. Agítese la gradilla de tubos en la agitadora de Kahn durante 15 minutos.
4. Centrifúguense todos los tubos durante 5 minutos a 1,800 revolu- ciones por minuto en la centrífuga No. 1 ó a 1,600 revoluciones por minuto en la centrffuga No. 2 (Centrifugas 1.E. Co.).
5. Vuélvanse a agitar los tubos en la agitadora de Kahn durante 2 minutos exactos.
Lectura e informe de I.a prueba cualitativa.-1. Léanse los resultados inmediatamente después de la segunda agitación, sosteniendo los tubos cerca de la sombra que proyecta una lámpara de escritorio y que tenga un fondo oscuro.*
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2. Repórtense los resultados de la siguiente manera:
Positivo: Partículas bien definidas suspendidas en un medio acuoso trans- parente o turbio; hay agregación.
Negativo: No hay agregación, dispersión completa de las particulas, apa- riencia turbia o ligeramente granulada.
Rxeba cuantitativa del liquido céfalorraquídeo.-1 . Modo de preparar las diluciones del liquido céfalorraquídeo.
a. Poner con una pipeta 1.0 ml de solución de cloruro de sodio al 0.9% en cada uno de los cinco o más tubos de ensayo.
b. Agregar 1.0 ml del liquido inactivado al tubo No. 1, mezclar bien, y trans- ferir 1.0 ml al tubo No. 2.
c. Continuar mezclando y transfiriendo de cada tubo al siguiente hasta que el último tubo contenga 2 ml. Descartar 1.0 ml del último tubo. Las dilu- ciones serán de 1:2, 1:4, 1:s; 1:16, 1:32, etc., respectivamente.
2. Probar cada una de las diluciones del líquido céfalorraquídeo como se describe en la prueba cualitativa del liquido céfalorraquideo.
REFERENCIAS
(1) Harris, Ad; A. A. Rosenberg; y L. M. Riedel: A Microflocculation Test for Syphilis Using Cardiolipin Antigen : Preliminary Report, Jour Ven. Dis.
Inf .,
jul. 1946, No. 267, Vol. 27, p. 169-174.
(2) Harris, Ad.; A. 8. Rosenberg; y E. Del Vecchio; The V. D. R. L. Slide Flocculation Test for Syphilis. II. A Supplementary Report, Jour. Ven. Dis. Inf., mzo. 1948.
(3) Kline, B.S. : “Microscopic Slide Precipitation Testa for the Diagnosis and
Exclusion of Syphilis,” Williams & Wilkins Co., Baltimore, Maryland.
(4) Harris, Ad; A. A. Rosenberg; y E. Del Vecchio: A Macroflocculation Test for Syphilis Using Cardiolipin-Lecithin Antigen, Jour. Ven. Dis. Inf., 29, obre.
948.
