Estudos cristalográficos em macromoléculas biológicas: Aplicações em calgranulina...

U N IV E R S ID A D E

D E S A O P A U L O

IN S T IT U T O

D E F is IC A

D E

5 A O

C A R L O S

E s t u d o s c r is t a lo g r a f ic o s

e m m a c r o m o le c u la s

b io l6 g ic a s :

A p lic a 9 0 e s

e m C a lg r a n u lin a

C d e g r a n u l6 c it o s p o r c in o s ,

T r ip a n o t io n a

r e d u t a s e

d e

Trypanosoma cruzi

e F o s f o lip a s e

A

2

e x t r a id a

d o v e n e n o

d a s e r p e n t e

Bothrops moojeni

LISP

J

IFQSC !S~!

~IIIIIIII ~111111111111IIII ~IIIIII

~Iillill

3-2-001"163

Tese apresentada ao Instituto de

Fisica de Sao Carlos, Universidade de

Sao Paulo, para obtenc;ao do titulo de

Doutor em Ciencias, area de

concentrac;ao Fisica Aplicada.

S a o C a rlo s

-1997-" Estudos cristalograficos em macromoleculas biol6gicas: Calgranulina C de granul6citos porcinos, Tripanotiona redutase de T r y p a n o s s o m a c r u z i e

fosfolipase A2 extraida do veneno da serpente B o t h r o p s

m o o j e n i " / Maria Cristina Nonato - Sao Carlos, 1997

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_UNIV~RSIDADE

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D E S A O P A U L O

In s t it u t o d e F 1 s ic a d e S a o C a r lo s

Av. Dr. Carlos Botelho, 1465 CEP 13560-250 - Sao Carlos - SF Brasil

Fone (016) 272-6222 Fax (016) 272-2218

MEMBROS DA COMISSAO JULGADORA DA TESE DE DOUTORADO DE M A R IA

C R IS T IN A N O N A T O APRESENTADA AO INSTITUTO DE FfslCA DE SAO CARLOS,

UNIVERSIDADE DE SAO PAULO, EM 21/03/1997.

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--~---~---ProY:' Dr. Glaucius Oliva (IFSC-USP)

---~-~----~--~---Profa. Ora. Leila Maria Be amini (IFSC-USP)

Prof. Dr. Aida ~IF-USP)

---~~---Prof. Dr. Carlos Frederico Martins Menck (ICB-USP)

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" E

p r e c i s o a m a r

as

p e s s o a s c o m o

A 6 R A D £ C IM E N T O S

• Ao Prof. Dr. Willian N. Hunter pela oportunidade, paci€mcia e pela importante orientayao durante meu trabalho na Inglaterra;

• Ao Prof. Dr. Richard C. Garratt pela indescritivel ajuda no desenvolvimento deste trabalho e pel a amizade;

• A

Prof- D~ Yvonne P. Mascarenhas pelo apoio ao longo destes anos e pela amizade.

•

A

Prof- Dr" Heloisa Araujo por toda a ajuda com os estudos sobre fosfolipases e pela amizade;

• Ao pesquisador e amigo Christian Schleicher pela colaborayao com os estudos sobre Calgranulina C

• Aos meus amigos do laborat6rio em Manchester: Rachel, Mark, Stefano e Charlie pelas discussoes, ajuda e amizade;

• Aos meus amigos do laborat6rio de Sao Carlos: Paulao, Zac, Portezani, Bia, Bianca, pH, Diet, Dulce, Jorge, Teresa, Pavao, Juan, Gerard. Rodrigo, Frank, Paula Kuser, Valma, Gisele, Carlos, Fred, Silvia, Fontes e Delboni, pelas importantes discussoes, pelo clima agradavel de trabalho e pela amizade;

• Aos meus queridos amigos do outro lade do oceano, Leo, Miguel, Sylvie e Nick por tornarem meus dias na Inglaterra tao especiais;

S U M A R IO

C A P I T U L O

I

- I N T R O D U V A O

C A P IT U L O

II - C A L G R A N U U N A

C D £

G R A N U L O C IT O S

II. 1. Introduyao 10

11.2. Purificayao e cristalizayao 16

11.3. Coleta e processamento de dados 17

11.4. Simetria nao cristalografica 19

II.5. T entativas para a determinayao da estrutura 20

11.5.1Substituiyao Molecular (MR) 20

11.5.2Substituiyao isom6rfica (SIR/MIR) 22

11.5.3Dispersao anomala a multiplos comprimentos de

onda (MAD) 23

C A P IT U L O

I I I

T R I P A N O T I O N A

_{R £ D U T A S £}

D E

TRYPANOSOMA CRUZI

111.1.Introducao 111.2.Cristalizacao

111.3.Coleta e processamento de dados

iliA. Determinacao da estrutura e refinamento 111.5.Resultados cristalograficos

111.6.Discuss6es e conclus6es 111.7.- Referencias

C A P IT U L O

n l -

F O S F O U P A S E

A 2

E X T R A i D A

D O

V E N E N O

D A S E R P E N T E

BOTHROPS

MOOJENI

IV.1. Introducao 63

IV.2. Cristaliza<;ao 66

IV.3. Coleta e processamento de dados 67

IVA. Simetria nao cristalografica (NCS) 68

IV.5. Determina<;ao da estrutura 69

IV.5.1 Substitui<;ao molecular (MR) 69

IV.5.2 Analise do empacotamento 71

IV.5. Refinamento 72

IV.7.1. Purifica980

IV.7.2 Novos ensaios de cristaliza980 IV.7.3. Sequenciamento N-terminal IV.7.4 Refinamento

IV.8. Discussoes e conclusoes IV.9. ReferE3ncias

7 6

7 9

81 81

82

87

C A P iT U L O

V -

COMENTAmos

F IN A lS

APENDICEA

APENDICEB

A P E N D IC E C

APENDICED

APENDICEE

A P E N D IC E f

APENDICE6

L lS T A

D E T A B E L A S

Ponto de precipita~o para a Calgranulina C para diferentes agentes precipitantes. 0 teste foi realizado com uma solu~o de proteina a

1 0 m g / m l em 1mM de sulfato de zinco ( 2nS04) e Hepes (CaH,aN204S)

como soluyao tampao a pH 7.0

Coleta de dados para os cristais na ausencia (cristaI1) e presen<;a (cristal 2) de calcio.

Estatistica da coleta de dados para cristais de Calgranulina C a 2.6A de resolu~o. Cristais #1 e #2 foram crescidos na ausencia e na presen<;a dos ions Ca2+ , respectivamente.

Lista de proteinas extraidas do banco de dados de coordenadas de proteinas (PDB) que apresentam a motivo "EF-hand"( helice-loop-helice).

Comportamento dos cristais diante das solu90es de atomos pesados testadas.

Estatisticas relevantes a coleta de dados. Rs"rr, = 1:

I

I(k)-(I) 11I:1(k) onde I(k) e (I) representam a intensidade de uma dada reflexao e a media das intensidades respectivamente ecr a desvio padrao.

Valores parciais para as parametros termicos Isotr6picos para C53S TR + Gspd. NA e equivalente ao numero de atomos e S a , ao fator de

Uma lista das possiveis liga¢es de hidrogemio formadas entre 0 Iigante N1

-glutationil-espermidina, tripanotiona redutase de T C r u z ie moleculas de solvente. Somente contatos ate 3.5A foram considerados. A and 8 correspondem as diferentes subunidades.

Uma lista das possiveis contatos de Van der Waals formadas entre 0 ligante N1-glutationil-espermidina, Tripanotiona redutase de T C r u z ;e moleculas de solvente. Somente contatos ate 4.oA foram considerados. A and 8 correspondem as diferentes subunidades

Fator de discord6ancia Rrs entre 0 modele e a densidade eletronica para GSPd em ambos sitios ativos para 0 mapa 2Fo-Fc ao nivel de 1.0cr.

Desvios posicionais quanta a superposiyao entre as estruturas C58S TR +Gspd TR, TR nativa e TR complexada com (GSPdh

Estatlsticas relevantes

a

coleta de dados. Rsym

=

2:

I

l(k)-<I)/I:I(k) onde I(k) e (I) representam a intensidade de uma dada reflex80 e a media das intensidades, respectivamente e cr 0 desvio padrao.

Soluyao da substituiyao molecular para dois dimeros. ex, ~ e y definem a rota<;80 e X, Y e Z a transla<;80 a ser aplicada no modele

U S T A

D £

_{F I6 U R A S}

Diagrama esquematico do motivo liEF-hand" de ligayao de calcio (a) simbolizado pela mao direita (b).

Estrutura primaria da calgranulina C. As linhas pontilhadas indicam os dois motivos liEF-hands" (HLH).

Alinhamento sequencial entre proteinas que ligam calcio do tipo S100 usando 0 sistema de Darwin (Gonnet, G.H., 1992). p - C A G C

-Calgranulina C porcina, h - C A G B - Calgranulina 8 humana, h C A G A

-Calgranulina A humana, p - C a B P 9 K - Calbindina-D9k porcina, b - S 1 0 0 / 3

-Cadeia ~ da proteina S100 bovina, h - C A C L - proteina que Iiga calcio

de placenta humana, b - S 1 0 0 L - S100L bovina, h - C A C Y - Calciclina

humana, b - S 1 0 0 u - Cadeia u da proteina S100 humana, h S 1 0 0 P

-SlOOP humana, p - C a [ 1 ] - Cadeia leve da calpactina I p o r c i n a , h - S 1 0 0 D

-S100D humana, h - S 1 0 0 E - S100E humana, p - S 1 0 0 C - S100C porcina.

Projeyao estereogratica ao Iongo do eixo c. seyao polar k=180°, da funyao de auto-rotayao calculadas com dados do cristal 1 no intervalo de 2.6-15A.

Diagrama esquematico para indicar a regra de prote~o biol6gica no metabolismo dos tripanossomatideos e onde a enzima tripanotiona esta envolvida.

Alinhamento sequencial entre TR de T r y p a n o s o m a c r u z i e GR

humana. Os residuos mais importantes para a catalise estao salientados em vermelho.

Vista estereografica da estrutura cristalografica do complexo mutante C58S TR +GSPd.

Distribuic;ao dos fatores de temperatura ao longo das cadeias principais e laterais para ambas subunidades.

Mapa de amissae (omissao (Fobs-Fcalc, cxcalc" mapa calculado excluindo as coordenadas da serina 58) ao nfvel de 3s.

Vista estereografica para GSPd e seu ajuste com 0 mapa de omissao Fobs-Fcalc ( calculo do mapa omitindo as coordendas do ligante no modele ao nivel 3 c r. a) subunidade A b) subunidade B.

Superposi~o entre as moleculas de GSPd para as duas subunidades. Em azul subunidade A e em vermelho subunidade B.

Distribui~o ao longo das subunidades para Rrs (espac;o real), isto e, 0 desvio entre a densidade eletronica e 0 modelo. Em rosa para a subunidade A, em azul para a subunidade B.

Fenilalanina 46 e seu correspondente mapa de amissae Fo - Fe ao nivel de 30-.a) subunidade A, b) subunidade B.

Estrutura tridimensional para C58S TR + Gspd. Em vermelho subunidade A, em azul subunidade B e em amarelo subunidade C.

Sequencia de aminoacidos para TR de T. c ru z i e a correspondente distribuic;ao quanta a estrutura secundaria.

Sitio ativo A para C58S TR + Gspd incluindo residuos fundamentais para a catalise eo ligante Gspd.

Superposic;ao entre os sitios ativos de TR de T. c ru z ; e Gr humana mostrando os residuos cataliticos para as duas enzima

Distribuic;ao eletrostatica para os sitios ativos do complexo mutante C58STR+GSPd de T.c ru z ie GR + GSSG humana.

Estrutura molecular para 0 FAD e 0 NADP+, nucleotideos envolvidos na ac;ao catalitica das enzimas Tripanotiona redutase e Glutationa redutase

Oiagrama esquematico da a9flo da fosfolipase A2 sobre 0 fosfolipideo. Extraido e adaptado de Voet & Voet (1995).

Empacotamento para as moleculas de BM-PLA2 na unidade assimetrica.

Alinhamento sequencial para 10 diferentes fosfolipases: B o t h r o p s a s p e r , pancreatica de porco, N a j a n a j a n a j a , A g k i s t r o d o n , C r o t a l u s a t r o x , Abelha, N a j a n a j a a t r a , B o t h r o p s J a r a r a c u s s u , pancreatica

bovina e humana.

Eletroforese em SOS-PAGE para 0 material enviado (coluna A) e as duas amostras finais depois do procedimento de puifica980 (B e C)

Perfil cromatografico ao longo das fra90es eluidas da coluna Superdex-75. Amostra inicial a 2 m g / m l

Porcentagem de atividade hemolitica para BM-PLA2 sendo que 100% corresponde

a

hem61ise total das celulas.

Alinhamento parcial da sequencia N-terminal entre fosfolipases A2

C r o t a l u s A t r o x e B o t h r o p s m o o j e n i I Niveis de confian9a: A= alta,[6: =

Dimero para fosfolipase A2 de B o t h r o p s m o o j e n i encontrada em sua forma cristalina.

Densidade eletronica para a ponte dissulfeto entre cisteinas 57 e 81. Mapa de densidade ao nivel 1 .0 c r

Tipica curva de solubilidade para uma proteina, como uma fun~o da concentra~o de sal ou qualquer outro parametro. Para melhores resultados a proteina deveria ser subrnetida a urn baixo nivel de supersatura~o que0 necessario para a forma~o do nucleo.

Gota suspensa ("hanging drop") .Tecnica de cristaliza~o de proteinas pelo metoda de difusao de vapor

Diagrama de Harker ilustrando a ambiguidade das fases para um unico derivado

Exemplo de correl;oes ao fator de espalhamento devido ao espalhamento anomalo ( curvas A e B). C corresponde a um oscilador harmonico simples.

Diagrama de Argand mostrando as difrentes contribuil;oes para os fatores de estrutura dos espalhadores anomalos P, normais Q e suas

CAGC

C a B P s

HLH

CACY

CAPL

R M N

FPLC

P D B

S IR

M IR

M R

MAD

PLA_z B M - P L Az

NCS

T R

G R

R B R

GSH

GSSG

T [ S ) z

T[SH]z

DNA

C58STR

+

GSPd

NADPH

FAD

A B R E V I A T U R A S

- Calgranulina C

- Protefnas que Iigam calcio (Calcium Binding Proteins)

- Helice-"Loop"-Helice

- Calciclina

- Proteina que liga calcio de placenta humana

- Ressonancia magnetica nuclear

- Fast Performance Liquid Cromatography

- Banco de dados de protefnas (Protein Data Bank)

- Substituil;:aoisom6rfica simples (Simple Isomorphous Replacement)

- SUbstituil;:ao isom6rfica multipla (Multiple Isomorphous Replacement)

- Substituil;:ao molecular (Molecular Replacement)

- Dispersao anomala a multiplos comprimentos de onda (Multiple

Anomalous Dispersion)

- Fosfolipases do tipo A2

- Fosfolipases A2 extraida do veneno da serpente B o t h r o p s

m o o j e n i

- Simetria nao cristalografica ( Non Crystallographic Symmetry)

- Tripanotiona redutase

- Glutationa redutase

- Refinamento de corpo rlgido (Rigid Body Refinement)

- T r y p a n o s o m a c r u z i

- glutationa reduzida

- glutationa dissulfeto

- tripanotiona reduzida

- tripanotiona dissulfeto

- Acido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid)

-Tripanotiona redutase com sua cisteina 58 substitulda por uma serina

complexada com glutationil-espermidina

- Nicotinamida adenosina dinucleotfdeo fosfato

RESUMO

A cristalografia de raios-X e urn metodo de singular importancia para a determinayao da

estrutura de macromoleculas. A importancia em resolver estruturas de proteinas

continua a crescer em campos variando desde a bioquimica e biofisica basicas ate 0

desenvolvimento farmaceutico e biotecnologia.

o

presente trabalho esta relacionado com os estudos cristalograficos de tres diferentes

moleculas biol6gicas.

Calgranulina C de granul6citos porcinos, uma proteina que liga calcio, supostamente

envolvida em processos celulares regulados, foi cristalizada com parametros de rede

a=b=54.35 e c=141.32A, grupo espacial P3121 ou seu enantiomorfo P3221. Varias

tentativas foram feitas no sentido de se determinar a estrutura por substituiyao

molecular, mas a alta flexibilidade entre os motivos "EF-hands" quando da ligayao ao

ion calcio podem ser responsaveis pelo insucesso dos resultados.

Tripanotiona redutase de T . c r u z i e urn exelente alvo para modelagem de inibidores e

potenciais drogas contra a doenya de Chagas. 0 complexo mutante TR + GSPD foi

cristalizado com parametros de rede a=b=92.7 e c=156.2A, grupo espacial P43 . Urn

conjunto preliminar de fases foi obtido por refinamento de corpo rigido contra as

coordenadas da TR nativa. 0 modelo foi refinado a 2.4A de resoluyao, Rtactor=19.8%.

Fosfolipase A2extraida do veneno da serpente B o th r o p s m o o je n i foi cristalizada

com parametres de rede a=63.1, b=90.5 e c=40.2A e f3=125.10 , grupo espacial C2. A

estrutura foi resolvida por substituiyao molecular usando0 dimero da fosfolipase A2 de

C r o ta lu s a tr o x como modelo. A analise de sua sequencia de aminoacidos e necessaria

A B S T R A C T

X-ray crystallography is a essential method for determination of the structure of

macromolecules. The importance of solVing protein structures continues to grow in

fields ranging from basic biochemistry and biophysics to pharmaceutical development

and biotechnology.

The current work is concerned to the crystallographic studies of three different biological

molecules.

Calgranulin C from pig granUlocytes, a calcium binding protein though to be involved in

regulation of cell process, was crystallized with cell parameters a=b=54.35 and

c=141.32A, space group P3121 or its enantiomorph P3221. Several attempts were made

in order to solve the structure, but the high flexibility between its EF-hands motives while

binding the ion calcium may be responsible for the lack of success in the results.

Trypanothione reductase (TR) from T . c r u z ; is a target enzyme for modeling an inhibitor

for Chagas' disease. The C58S TR + GSPD mutant complex was crystallized with

a=b=92.7 and c=156.2A, space group P43 .A preliminary set of phases was obtained by

rigid body refinement against the coordinates for the native TR. The model was refined

to 2.4A resolution, Rfactor=19.8%

Phospholipase A2 extracted from the venon of the snake B o th r o p s m o o je n ; was

crystallized with cell parameters a=63.1, b=90.5, c=40.2A and B = 1 2 5 .1 ° , space group

C2. The structure was solved by molecular replacement techniques using the dimer of

phospholipase A2 from C r o ta lu s a tr o x as a model. The aminoacid sequence analysis is

~

C A P iT U L O

I

C A P IT u L O I -lN T R O D U I;:A O 2

papel, interrompendo ciclos metab61icos essenciais que podem levar

a

morte do

parasita.

No caso de doen9as vir6ticas, um exemplo e

0

mecanismo com que

0

virus

I n f l u e n z a ,

responsavel pela gripe, ataca a celula-alvo. Conhecemos hoje em dia

como e quais proteinas virais (neuraminidase e hemaglutinina) reconhecem os

receptores (acido sialico) das celulas, no caso do sistema respirat6rio. Foi entao

modelado, a partir de sua estrutura, um inibidor especifico para a neuraminidase, de

forma que, esta agora, nao e mais capaz de reconhecer estas celulas. Este suposto

inibidor ja esta em fase de testes farmacol6gicos (von Itzstein,

e t a l . 1 9 9 3 )

Mas como estaria a cristalografia auxiliando no entendimento destes sistemas

biol6gicos tao complexos?

A resposta e que estrutura e fun9ao estao intimamente correlacionados. Os

segredos dos mecanismos de reconhecimento e resposta das macromoleculas

biol6gicas dependem de suas estruturas quimicas, e com

0

mesmo grau de

importancia, de suas estruturas tridimensionais.

Alem da importancia biol6gica,

0

sucesso da tecnica tem crescido com

0

desenvolvimento do poder computacional. 0 cristal6grafo conta atualmente com

computadores de alta qualidade grafica e de processamento.

A estrutura cristalogratica de uma molecula biol6gica pode ser obtida atraves

da analise do padrao de difra9ao produzida por seus cristais. Esta analise pode ser

sumarizada nos seguintes passos:

'" Purifica9ao e cristaliza9ao

'" Coleta e processamento dos dados

'" Determina9ao da estrutura

4

n e 2

1_{2 0} = 1₀ 2 2 4 (l

+

c a s 2 8 )

a to m s

F (h )

=

I

fje x p (2 7 tih . Xj) j

o n d e F(H)

e

0 f a t o r d e e s t r u t u r a d a r e f le x a o h = (h, k, 1), fj

e x

j s a c 0 f a t o r d e

1 "

-p(x) = - L ..J F (h )e x p [-2 7 ti(h .x

+

ky

+

lz )]

v h

m e d id a s , l(H) ex IF(H)1 2

C A P iT u L O I -IN T R O D U ~ A O 5

se mostrado eficaz nao s6 par minimizar os danos causados pela exposi9ao aos

raios-X, mas tambem por tomar possivel

0

estudo de cristais que nao sac estaveis

na presenl;a do Iiquido-mae (solul;ao na qual

0

cristaI cresceu).

A fonte de radial;ao utilizada tambem e urn fator importante na coleta de

dados. Fontes de alta intensidade, como fontes de radia9ao sincrotron sac hoje

amplamente

utilizadas

em Cristalografia de

Raios-X,

0

que tern

permitido

experimentos bastante avanl;ados. Devido

a

sua alta intensidade,

a radial;ao

sincrotron tern side utilizada para otimizar a coleta de dados e permitir estudos de

amostras (cristais pequenos

e / o u

cela unitarias grandes) que nao poderiam ser

realizados em fontes convencionais.

Outra aplical;ao e a cristalografia resolvida no tempo, que utiliza a distribui9ao

espectral continua da radia9ao sincroton na analise da estrutura ao longo do tempo

atraves de experimentos de difral;ao de Laue. Nestes experimentos e possivel

acompanhar rea90es enzimaticas e processos fotoquimicos.

0

terceiro maior usa da

radial;ao sincrotron em cristalografia de raios-X e a determina9ao de estruturas

cristalinas diretamente das medidas de difral;ao an6mala realizadas a diferentes

comprimentos de onda.

Em todas as fontes de radial;ao sincrotron espalhadas pelo mundo, ha hoje

linhas dedicadas exclusivamente

a

cristalografia de proteinas. No sincrotron

brasileiro, onde as primeiras linhas de pesquisa ja estao em fase de testes, esta

sendo construida uma linha destinada a coleta de dados em monocristais de

proteinas.

Varios sac os esforl;os para minimizar as erros durante a coleta de dados,

que podem levar a problemas posteriores na interpreta9ao dos resultados. No

CAPtruLO I -INTRODUc;itO

o m e t o d o d a s u b s t it u ic ; a o m o le c u la r (~7ft,NI)~qEIQ ). E s t e m e t o d o e b a s e a d o n o

C A P IT u L O I-lN T R O D U C ;:is.O

C A P IT u L O I-lN T R O D m ;;Js.O 8

descrito no apemdice E , a determinac;aoda posic;aodestes atomos pesados podem

levar a obtenc;aode um conjunto preliminar de fases.

o

terceiro e ultimo metoda e

0

chamado metodo da dispersao anomala a

multiplos comprimentos de onda (MAD). Quando os eletrons se encontram em

camadas mais internas do atomo, isto e, mais pr6ximos do nucleo,

0

tratamento

dado ao espalhamento devido a estes eletrons deve ser mais cuidadoso, uma vez

que, a forc;a de interac;ao entre esses e

0

nucleo atomico nao pode mais ser

desprezada e

0

eletron nao pode mais ser tratado como livre. Devido

a

forc;a de

interac;ao com

0

nucleo, existe a introduc;ao de um termo imaginario ao fator de

espalhamento atomico, dependente do comprimento de onda da radiac;ao.

Um modelo inicial construido a partir de uma conjunto preliminar de fases

usualmente contem muitos erros. No sentido de se produzir um modelo com maior

acuracia, e necessario introduzir

0

refinamento cristalogratico tao bem quanta a

reconstruc;ao do modelo atraves de manipulac;oes graticas. Estes passos sac

introduzidos em um processo ciclico de melhora gradual do modelo. Programas de

refinamento modificam

0

modelo com

0

objetivo de melhorar a concordancia entre

as amplitudes dos fatores de estrutura observados e calculados. Devido

a

limitada

resoluc;ao tipicamente obtida em cristalografia biomolecular, a relativa escassez de

dados esperimentais e suprida por informac;oes quimicas, como comprimentos de

ligac;ao e angulos. A reconstruc;ao do modelo manualmente e necessario para

remover erros que nao tem como ser corrigidos pelos programas de refinamento

(A P E N D lC E 6 .).

Quando

a estrutura

cristalografica e submetida

a

analise, residuos

importantes

para

a

catalise,

contatos

intermoleculares

responsaveis

pela

C A P IT u L O I -IN T R O D U C A O 9

podem ser identificadas, mas e importante ressaltar aqui, que a estrutura

cristalografica e uma "foto"da molecula em sua conformac;ao media, e portanto

cautela deve ser tomada para que nao haja uma interpretac;ao errenea dos

resultados.

o

presente trabalho visa 0 estudo cristalografico de tres diferentes moleculas

biol6gicas. No C A P iT U L O II sac apresentados os resultados dos estudos sobre a

calgranulina C de granul6citos porcinos e as tentativas no sentido de se determinar

a sua estrutura. 0 C A P iT U L O III apresenta 0 estudo cristalografico do complexo

mutante C58S Tripanotiona redutase + GSPd de

T.

c r u z i , trabalho este realizado

durante periodo de doutoramento sanduiche na Universidade de Manchester,

Inglaterra, sob a orientac;ao do Prof. Dr. Willian N. Hunter. A enzima Tripanotiona

redutase e um excelente alvo para modelagem racional de inibidores, na busca de

um farmaco contra a doenc;a de Chagas. 0 estudo deste complexo faz parte de um

projeto que visa uma caracterizac;ao meticulosa da enzima. No Q A P ,iT U lO IV

apresentamos os estudos cristalograticos da fosfolipase A2 extraida do veneno da

serpente B o t h r o p s m o o j e n i . Cristais de pequena dimensao foram obtidos, mas a

estrutura pede ser resolvida atraves do metodo da substituic;ao molecular. Os

sucesso da determinac;ao da estrutura e mais um novo resultado quando da

discussao do comportamento destas enzimas durante seu mecanisme de atividade.

Nos apendices (A -< il) se encontra em maior detalhe a teoria relativa

a

determinac;ao da estrutura por cristalografia de raios-X, como uma base para

!!/'

C A P i T u L O

I I

C A L 6 R A N U L IN A

C

D £ 6 R l\N U L O C IT O S

P O R C l N O S

1 1 .1 .IN T R O D U C A O

desde a biomineralizaC;8o em ossos e dentes ate um papel complexo como mensageiro

F i g u r a 1 1 - 1 D i a g r a m a e s q u e m a t i c o d o m o t i v o " E F - h a n d " d e l i g a ~ a o d e c a l c i o ( a ) s i m b o l i z a d o p e l a

m a o d i r e i t a ( b ) .

A f u n 9 8 0 d a c a l m o d u l i n a e m t r a n s d u 9 8 0 d e s i n a i s d e C a2+ t e m s i d e e x t e n s i v a m e n t e

q u e e s t a f o r m a d e i n t e r a 9 8 0 p o d e r e p r e s e n t a r u m m e c a n i s m e g e r a l p a r a a f u n 9 8 0 d e s t a s

p r o t e f n a s c o m o m e d i a d o r e s d e s i n a i s d e C a2+.

C A P i T u L o 1 1 - C A L 6 R . A N U L I N A C D E 6 R . A N U L O C r r O S P O R C I N O S 1 2

(Ernst et a I, 1990), proteina de aproximadamente 33kDa, e a grancalcina (Boyhan et a I,

1992) de 28kDa.

Alem destas, granul6citos tambem expressam calmodulina (Jones e t a I, 1982), e

varias CaBPs do tipo 8100, como calgranulinas A e B, supostamente associadas em um

heterocomplexo (Dell'Angelica e t a I, 1996) e a calgranulina C (Dell'Angelicae t a I, 1 9 9 4 ) .

A familia 8100 compreende um grupo de proteinas ligantes de calcio de baixo peso

molecular (10-12kDa) (Kligman&Hilt,1988). Uma marcante caracteristica estrutural da

familia das 8100 € I a presen~ de dois sitios de ligac;aode calcio (Ca2+) na conformac;ao

dos classicos motivos liEF-hands", com 0 N-terminal mostrando um nao usual "loop" de

ligac;aode calcio contendo 14 residuos (Heizmann e Hunziker, 1991).

A func;ao destas CaBPs do tipo 8100 nao sac conhecidas. Algumas protefnas

como a CACY (calciclina) e a CAPL (proteina que liga calcio de placenta humana) foram

associadas ao desenvolvimento de tumores e

a

induc;aode metastase (Muraoe t a I, 1989),

quando sua expressao esta desregulada.

Dois membros da familia 8100 tiveram suas estruturas tridimensionais

determinadas em soluc;ao por tecnicas de RMN (ressonancia magnetica nuclear): ,

calbindina, tambem conhecida como D9K (Kordel e t a I, 1993) e a calciclina, conhecida

como CACY ( Potts e t a I, 1995). Em 1986 a estrutura da D9K foi tambem determinada por

cristalografia de raios-X (8zebenyi e Moffat, 1986). Em todos os casos, as proteinas nao

tinham 0 ion calcio ligado. As proteinas se enovelam em um dominio globular unico

lembrando 0 dominio de ligayao de calcio de calmodulina e troponina C. Contudo, apesar

da alta identidade em termos de estrutura primaria e similaridades estruturais. existem

algumas diferen~s funcionais importantes entre os membros da familia 8100. Calbindina

D9K, por exemplo, e uma proteina 8100 atipica, ja que naG sofre variayoes

conformacionais significantes induzidas por calcio. Isto sugere que D9K pode funcionar

p-CAGC h- CAGB h-CAGA p-CABP9K b-S100~ h-S100D h-CAPL b-S100L h-S100E h-CACY b-S100a h-S100P p-Ca[l] p-S100C p-CAGC h- CAGB h-CAGA p-CABP9K b-S100~ h-S100D h-CAPL b-S100L h-S100E h-CACY b-S100a h-S100P p-Ca[l] p-S100C ... TKLEDHLEGIINIFHQYSVRLGHYDTLIKRELKQLITKELPNTLK ... MTCKMSQLERNIETIINTFHQYSVKLGHPDTLNQGEFKELVRKDLQNFLK ... MLTELEKALNSIIDVYHKYSLIKGNFHAVYRDDLKKLLETECPQYIR ... MSAQKSPAELKSIFEKYAAKEGDPNQLSKEELKQLIQAEFPSLLK ... SELEKAVVALIDVFHQYSGREGDKHKLKKSELKELINNELSHFL. MPAAWILWAHSHSELHTVMETPLEKALTTMVTTFHKYSGEEGSKLTLSRKELKELIKKEL ..CL. ...• MACPLEKALDVMVSTFHKYSGKEGDKFKLNKSELKELLTRELPSFL. ... SSPLEQALAVMVATFHKYSGQEGDKFKLSKGEMKELLHKELPSFV. ... MARPLEQAVAAIVSTFQEYAGRCGDKYKLCQAELKEKKQKELATWT.

... MACPLDQAIGLLVAIFHKYSGREGDKHYLSKKELKELIQKELTI ...

... GSELETAMETLINVFHAHSGKEGDKYKLSKKELKELLQTELSGFL.

... MTELETAMGMIIDVFSRYSGSEGSTQTLTKGELKVLMEKELPGFL.

... PSQMEHAMETMMFTFHKFAGDKGY ...LTKEDLRVLMEKEFPGFL.

... MAKRPTETERCIESLIAIFQKHAGRDGNNTKISKTEFLIFMNTELAAFT.

N.TKDQGTIDKIFQNLDANQDEQVSFKEFVVLVTDVLITAHDNIHKE .

KENKNEKVIEHIMEDLDTNADKQLSFEEFIMLMARLTWASHEKMHE-GDEGPGHHHKPGLGEGTP

... KKGADVWFKELDINTDGAVNFQEFLILVIKMGVAAHKKSHEESHKE .

GP RTLDDLFQELDKNGNGEVSFEEFQVLVKKISQ .

EEIKEQEVVDKVMETLDSDGDGECDFQEFMAFVAMITTACHEFFEHE . GE.MKESSIDDLMKSLDKNSDQEIDFKEYSVFLTMLCMAYNDFFLEDNK . GKRTDEAAFQKLMSNLDSNRDNEVDFQEYCVFLSCIAMMCNEFFEGFPDKQPRKK . GEKVDEEGLKKLMGDLDENSDQQVDFQEYAVFLALITIMGNDFFQGSPARS . PTEFRECDYNKFMSVLDTNKDCEVDFVEYVRSLACLCLYCHEYFKDCPSEPPCSQ . GSKLQDAEIARLMEDLDRNKDQEVNFQEYVTFLGALALIYNEALKG . DAQKDADAVDKVMKELDEDGDGEVDFQEYVVLVAALTVACNNFFWENS . QSGKDKDAVDKLLKDLDANGDAQVDFSEFIVFVAAITSACHKYFEKAGLK . ENQKDPLAVDKIMKDLDQCRDGKVGFQSFFSLIAGLTIACNDYFVVHMKQKGKK . QNQKDPGVLDRMMKKLDLDSDGQLDFQEFLNLIGGLAIACHDSFIKSTQK .

Figura 11-3.Alinhamento sequencial entre proteinas que ligam calcio do tipo 5100 usando 0 sistema

de Darwin (Gonnet, G.H., 1992).p - C A G C - Calgranulina C porcina, h - C A G B - Calgranulina B humana,

h-CAGA-ealgranulina A humana, p - C a B P 9 K - Calbindina-D9k porcina, b - S 1 0 0 P -Cadeia ~ da proteina

5100 bovina, h - C A C L - proteina que liga calcio de placenta humana, b - S 1 0 0 L - 5100L bovina, h

-C A -C Y - Calciclina humana,b - S 1 0 0 a .- Cadeia ada proteina 5100 humana,h - S 1 0 0 P - 5100P humana,p -C a [1 ]- Cadeia leve da calpactina I p o r c in a ,h - S 1 0 0 D -51000 humana, h - S 1 0 0 E - 5100E humana, p

-S 1 0 0 C - 5100C porcina.

Experimentos quanta as propriedades de liga<;ao ao Ca2

CAPITuLo 11- CAL6R.ANULINA C DE 6R.ANULOClTOS PORCINOS 1 5

propriedades da proteina ao se ligar ao ion calcio. Na ausElnciade Zn

2+ ,

CAGC se liga a

um ion Ca

2

+

por monamero, enquanto que na presenc;ade Zn

2+

CAGC se liga a 2 ions

Ca

2

+

por monamero, 0 que e consistente com a presenc;a dos dois motivos liEF-hands"

observados atraves da analise da sequencia de aminoacidos.

Calgranulina C tambem mostra alta afinidade por zinco. Como especula980

podemos notar que a regiao C-terminal (Figura 11-2)possui um motivo His-X-X-X-His

compreendendo os residuos 85 a 89. Estas duas histidinas fariam parte de uma helice em

uma conforma980 tal que favoreceria a liga980 com 0 zinco.

Varias sac as questoes que restam ser elucidadas.

/n v iv o

CAGC se oligomeriza

como um dimero? A Iigayao ao ion Ca

2+

da Calgranulina C e regulada pelo ion zinco?

Qual 0 alva celular para CAGC? Como seria esta varia980 conformacional na presenya

dos ions calcio e zinco? E, qual seria a fun980 da Calgranulina C

em granul6citos

A estrutrura cristalografica tem papel fundamental para ajudar a elucidar estas

questoes.

Cristais de boa qualidade foram obtidos, mas ate 0 presente CAGC nao teve sua

estrutura determinada.

No decorrer do capitulo sera descrito todo 0 trabalho realizado na tentativa de se

determinar a estrutura cristalografica da Calgranulina C de granul6citos porcinos.

Os resultados obtidos foram submetidos e aceitos para publica980 (Nonato

e t a I,

1 1 .2 .P U R IF IC A C A O

E C R IS T A L IZ A C A O

A purifica~o da CAGC (Dell'Angelica e t a I, 1994) 13 feita inicialmente isolando os

granul6citos do sangue fresco por sedimenta~o de Perxan seguida por centrifuga~o por

gradiente de Percoll (Schleicher e t a I, 1993). As celulas extrafdas sac rompidas e

fracionadas em uma coluna de filtra~o em gel Sephadex G-75. CAGC 13 a componente

mais abundante encontrada nas fra90es de 10 a 15 kDa, que ap6s combinadas, sac

levadas a uma cromatografia por troca ienica em uma coluna MonoQ (Pharmacia) em

FPLC (Pharmacia).

Para os experimentos iniciais de cristaliza9ao, amostras de CAGC purificada na

forma liofilizada foram-nos enviadas pelo Instituto de Qufmica y Fisicoqufmica da

Universidade de Buenos Aires, Argentina, atraves de uma colabora~o com 0 pesquisador

Christian Schleichler.

Como procedimento padrao, os primeiros experimentos de cristaliza~o foram

realizados no sentido de se encontrar condi90es de cristaliza9ao que estejam pr6ximas

das condi90es consideradas ideais, isto 13, condi90es que levem ao crescimento de cristais

adequados para os experimentos de difra9ao.

Para otimizar esta busca, inicialmente 13 feita uma estimativa do ponto de

precipita~o da protefna para diferentes agentes precipitantes, como sulfato de amenia e

polietilenoglicol, dentre outros. Uma vez que a cristaliza9ao, como descrito no APENDlCE.

A , 1 3um estado metaestavel entre a proteina em solu9ao e precipitada, as primeiras caixas

de cristaliza9ao sao montadas variando a concentra9ao do precipitante em tome dos

pontos de precipita9ao previamente estimados. Outro parametro variado 13 0 pH,

Tabela 11-1Ponto de precipita~Ao para a Calgranulina C para diferentes agentes precipitantes. 0 teste foi realizado com uma solu~Ao de proteina a 10mglml em 1mM (j.~.~LJlf~t()c;t~;ziflc:().(?f1~g~)~.ti~p~~. ( q 8 t i '1 I t - J : l ( ) ~ S ) .C:()I1l().~()Iuy~otCll1lpA()CI.pti7. 0

Agente precipitante Formula qufmica Ponto de precipitayao estimado

sulfato de amenio IN§14]?§94 69%

T a b e l a 1 1 - 2C o l e t a d e d a d o s p a r a o s c r i s t a i s n a a u s e n c i a ( c r i s t a I 1 ) e p r e s e n ~ a( c r i s t a l 2 ) d e c a l c i o .

C r is t a l F o t o s n u m e r o d e f o t o s V a r ia ~ a o a n g u la r e n t r e a s t e m p o d e e x p o s i~ o f o t o s

1 S tili 2 9 00

3 0 m in

O s c ila c a o 4 5 2 ° 5 0 m in

~ S till 2 9 00 _{1 5 m in}

O s c ila c a o 6 0 1 .50 _{3 0 m in}

T a b e l a 1 1 - 3- E s t a t i s t i c a d a c o l e t a d e d a d o s p a r a c r i s t a i s d e C a l g r a n u l i n a C a 2 . 6

A

d e r e s o lu ~ a o .C r i s t a i s

# 1 e # 2 f o r a m c r e s c i d o s n a a u s e n c i a e n a p r e s e n ~ ad o s i o n s C a2+, r e s p e c t i v a m e n t e .

R e s o ~ o

( A )

R e fle x o e s

m e d . in d o

R m e r g e C o m p le te z a

1 > 3 0

R e fle x o e s

m e d . in d o

R m e < g e C o m p le te z a

1 > 3 0

8.00 1294 306 0.026 97.7 1103 297 0.046 98.3 0.193

5.70 2026 500 0.043 96.4 2288 525 0.042 98.3 0.025

4.67 2078 586 0.039 98.6 2542 616 0.042 98.7 0.031

4.05 2083 699 0.036 97.4 2768 732 0.040 97.8 0.038

3.62 1980 757 0.042 96.4 2911 806 0.042 98.6 0.039

3.31 2008 829 0.047 94.9 2993 888 0.045 98.0 0.040

3.06 2000 866 0.058 91. 4 3022 937 0.047 96.7 0.043

2.87 1865 857 0.078 86.7 2922 924 0.054 96.5 0.055

2.70 2068 940 0.097 83.3 3099 1027 0.058 94.8 0.064

2.60 2046 898 0.125 77 .9 3019 991 0.068 92.8 0.075

CAPITuLO I I •CAL6RANULlNA C D£ 6RANULOCITOS PORClNOS 19

P a r a m in im iz a r o s d a n o s c a u s a d o s p e la r a d ia l;8 o , a s c o le ta s fo r a m r e a liz a d a s

m a n te n d o o s c r is ta is s o b u m flu x o d e n itr o g e n io g a s o s o c o m te m p e r a tu r a c o n tr o la d a d e

4 ° C . D e s ta fo r m a , u m u n ic o c r is ta I d e c a d a d ife r e n te c o n d il;8 o d e c r is ta liz a l;8 o s e m o s tr o u

s u fic ie n te p a r a fo r n e c e r c o n ju n to s d e d a d o s d e b o a c o m p le te z a .

A s fo to s " s till" ( 0 e 9 0 ° , fo to s e m q u e 0 c r is ta l s e m a n te m p a r a d o ) fo r a m u tiliz a d a s

p a r a a c a r a c te r iz a l;8 o in ic ia l d o s c r is ta is . C r is ta is 1 e 2 s e m o s tr a r a m is o m 6 r fic o s .

A C A G C s e c r is ta liz a c o m p a r a m e tr o s d e r e d e a = b = 5 4 .3 5 ( 2 ) e c = 1 4 1 .3 2 ( 5 ) A . A

p r e s e n 9 8 d o lo n g o e ix o c fo i 0fa to r d e te r m in a n te p a r a a r e s o lu c ;a o d o s d a d o s c o le ta d o s , 2 .6 A .

E m b o r a o s c r is ta is d ifr a ta s s e m b e m , a m a is a lta r e s o lu c ;a o o s p ic o s s e s u p e r p u n h a m e

m e s m o u tiliz a n d o 0 m o d o m a is s e n s iv e l d e le itu r a d a s p la c a s d e im a g e m ( 1 0 0 J lm p o r p ix e l)

n a o e r a p a s s iv e l d ife r e n c ia - Io s .

A p r o m e d ia c ;a o d a s r e fle x 5 e s e q u iv a le n te s d e fin e u n ic a m e n te a s im e tr ia d e L a u e

c o m o 3 m 1 . A a n a lis e d a s e x tin g 6 e s s is te m a tic a s in d ic a a c o n d ic ;a o d e e x is te n c ia p a r a

r e fle x 5 e s d o tip o [= 3 n , 0 q u e e c o m p a tiv e l c o m 0 g r u p o e s p a c ia l P 312 1 o u s e u e n a n tio m o r fo

P 322 1 .

11.4.

S I M E T R I A N A O C R I S T A L O G R A F I C A

A p a r tir d o s d a d o s c r is ta lo g r a fic o s fo i e n ta o p o s s iv e l fa z e r u m a e s tim a tiv a d o n u m e r o

d e m o n 6 m e r o s p o r c e la u n ita r ia e d o c o n te u d o d o s o lv e n te . ( A P E N D IC E B ) . A T a b e la 1 1 - 4

m o s tr a o s v a lo r e s e s tim a d o s p a r a a d e n s id a d e d o c r is ta l ( D c ) e a p o r c e n ta g e m d e s o lv e n te

(VvN) e m fu n c ;a o d o n u m e r o d e m o le c u la s d e p r o te fn a ( n )

T a b e la 1 1 - 4C a lc u lo d o n u m e r o d e m o h flc u la s d e C A G C p o r c e la u n ita r ia

D c ( g /c m3)

1 .0 7

1 .1 5

1 .2 3

VwN

7 8 .4

5 6 .7

3 5 .1

n ° d e M a th e w s ( J .h D a )

5.68

2 .8 4

1 .8 9

U m m o n 6 m e r o n a u n id a d e a s s im e tr ic a c o r r e s p o n d e r ia a u m a a lta p o r c e n ta g e m d e

s o lv e n te , 0 q u e e in c o m u m p a r a c r is ta is q u e d ifr a ta m b e m c o m o o s d e c a lg r a n u lin a C . O s

v a lo r e s e n c o n tr a d o s p a r a 0 d im e r o e tr im e r o s e e n c o n tr a m d e n tr o d e u m a fa ix a d e v a lo r e s

e le m e n to s d e s im e tr ia n a o c r is ta lo g r a fic a fo i e n ta o c a lc u la d a a fu n t;8 o d e a u to - r o ta t;8 o ( F ig u r a

1 1 - 4 ) u tiliz a n d o 0 p r o g r a m a A M o R e ( N a v a z a , 1 9 9 4 ; A p e n d ic e D )

F ig u r a 1 1-4 P r o je ~ A o e s te r e o g r a fic a a o lo n g o d o e ix o c , s e A o p o la r k = 1 8 0 ° , d a fu n ~ A o d e a u to - r o ta ~ a o

c a lc u la d a s c o m d a d o s d o c r is ta l1 n o in te r v a lo d e 2 .6 - 1 5 A.

11.5.

TENTATIVAS

PARA A DETERMINACAO

DA ESTRUTURA

o

m e to d a d a s u b s titu i9 a o m o le c u la r , im p le m e n ta d o n o p r o g r a m a A M o R e ( N a v a z a ,

1 9 9 4 ) , fo i e x a u s tiv a m e n te u tiliz a d o n a te n ta tiv a d e s e d e te r m in a r a e s tr u tu r a d a

Tabela 11-5Lista de proteinas extraidas do banco de dados de coordenadas de proteinas (PDB) que apresentam 0 motivo "EF-hand"( helice-loop-he lice).

Protefnas que ligam calcio

calmodulina parvalbumina

modelos (Protein Data Bank)

1c11,1deg, 1trc, 10sa, 1clm, 1cln,2bbm, 3cln 1cdp,4cpv,5cpv,2pa1 ,4pa1, 1pa1,3pa1 ,3pat,5pa

1,1 rtp 1rro, 10md

4icb, 3icb,4bod, 2bca, 2bcb, 1cb1 1top,4tnc, 1cta, 1ctd, 5tnc

2sep,2sas 1rec 1scm Oncomodulina

Calbindina D9K troponina C

protefna que liga calcio do sarcoplasma recoverina

11.5.2Substituicao

isom6rfica

(SIRIMIR)

Tabelall:6e,:()m p0rtam ento dos cril;tail;~iarltedal;solu~oesdE!atom os pel;Cldostestadas.

Composto concentr8C;8o obserV8c;6es

Pt(NH3h C b 1 mM se dissolveu ap6s 24h de banho

(CH3COzhSm.xH20 1mM se dissolveu ap6s 24h de banho

(CzH30z)2Hg 1mM se dissolveu ap6s 24h de banho

U02(CzH30Z)2+2H20 1mM quebrou imediatamente ap6s ser mergulhado na soluyao

3CdS04.8H20 1mM se dissolveu ap6s 24h de banho

C A P I T u L O I I-C A L 6 R A N U U N A C D E 6 R A N U L O C r r O S P O R C I N O S 2 3

o

cristal banhado na solu980 de K2PtCI4 , unico que resistiu ao experimento, foi

levado a coleta de dados. Os dados coletados para 0 possfvel derivado foram

promediados contra os dados da protefna nativa e mostraram uma pequena varia980 para

o valor do R m e r g e , de 5.6% para 7.4% , mudan98 esta muito pequena para a presen98 de

um derivado.

Nenhuma nova condi980 foi testada por falta de disponibilidade de amostra

purificada para cristaliza980

11.5.3Dispersae anomala a multiples cemprimentes de enda (MAD)

Outra tentativa foi a coleta de dados no sfncrotron em Hamburgo com 0 objetivo de

se determinar a estrutura pelo metodo de dispers80 anomala a mUltiplos comprimentos de

onda. 0 fon zinco foi utilizado nas condi90es de cristaliza980 e as fortes evidencias

bioqufmicas indicadas na introdu980 sugeriam que este pudesse estar ligado as moleculas

de protefna do crista!. Desta forma a aplica980 do metodo seria possfvel devido a

presen9a do zinco como espalhador anomalo.

Na tentativa de reduzir os danos causados por radia980, foram utilizadas tecnicas

em criocristalografia , onde os cristais sac banhados em uma solu98o criogenica e a coleta

para os varios cristais feita a aproximadamente -170°C.

Os cristais que haviam side transportados desde de 0 Laborat6rio de Cristalografia

de Proteinas do IFSC, se mostraram de ma qualidade comparados com os experimentos

realizados "em casal', isto

e,

perderam muito sua capacidade de difratar. N80 foi posslvel

coletar ao menos um unico conjunto completo de dados (aproxidamente 18 cristais foram

submetidos a coleta). Associamos este problema a varia980 de temperatura e a agitar;80

1 1 . 6 A N A L I S E D O S R E S U L T A D O S E P E R S P E C T I V A S F U T U R A S

Determinar a estrutura da Calgranulina C e sem duvida nenhuma muito importante

para

0

entendimento do mecanisme de atuayao das proteinas que ligam calcio e sua

variayao conformacional na presenca do ion calcio. Os insucessos obtidos atraves do

metodo da substituiyao molecular e mais uma evidencia da liberdade conformacional

destas proteinas. A calgranulina C pode apresentar uma variayao conformacional quando

comparada com todas as proteinas que ligam calcio que ja tiveram suas estruturas

tridimensionais determinadas seja por cristalografia de raios-X ou por ressonancia

magnetica nuclear.

Cristais na presen98 e ausencia de calcio nas condi~oes de cristalizayao foram

obtidos. No sentido de se examinar possivel diferen98s entre os dois conjuntos de dados,

estes foram promediados (Tabela 11-3).A estatlstica resultante mostra diferen98s somente

a

baixa resoluyao (abaixo de

8A),

que pode ser explicada devido ao espalhamento do

solvente originario de dois diferentes meios de cristalizayao. Este resultado sugere que os

dois cristais podem ser identicos. Considerando a alta afinidade da proteina em se ligar

aos ions Ca

2

+

(Dell'Angelica et ai,

1994),

e razoavel supor que os procedimentos de

purificayao nao removeram os ions de calcio Iigado

a

proteina. Alternativamente, a ligayao

ao calcio pode nao ser suficiente para produzir varia~oes conformacionais grandes

0

suficiente para resultar em significantes diferen98s na intensidade entre os dois conjuntos

de dados.

Experimentos de purificayao ja foram iniciados em nosso proprio laboratorio. Desta

forma a grande quantidade de material exigida pode agora ser obtida com mais facilidade,

possibilitando experimentos como a obten~ao de derivados isomorficos, quando novas

1 1 . 7 .R E F E R E N C I A S

Boyhan, A, Casimir, C.M., French, J.K. Teahan, C.G., and Sega, A W.(1992)

J.

B io I. C h e r n .

267,2928-2933

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~

C A P i T u L O :

III

TRIPANOTIONA

REDUT

ASE

Df:

TRYPANOSOMA CRUZ!

o

parasita Trypanosoma

cruzi

(T.

CruZI)

e um protozoario flagelado da Ordem dos

kinetoplastidas, Subordem tripanossomatida, agente causador da doen~ de Chagas, doen~

endemica na America do Sui e America Central. De acordo com as estatisticas (Moncayo,

1993; W orld Health Organization, 1991), 18 milhoes de pessoas estao infectadas com

T. cruz;

e aproxidamente 45 mil mortes ocorrem anualmente.

Os principais orgaos atacados pela doen~ de Chagas sac: 0 musculo cardiaco, 0

musculo Iiso do sistema digestivo e os glanglios, levando a uma hipertrofia do musculo

cardiaco ou alargamento do es6fago ou c6lon (mega sintomas). A quimioterapia disponivel

C A P IT uL o 111- T R IP A N O T IO N A R £D U T A S E D E ToCRUZl 28

efeitos colaterais, e e somente efetivo nos estagios precoces da doen98. Embora milhares de

drogas tenham side testadas contra este parasita, nenhuma ainda provou ser suficientemente

apta para uso gera!.

Recentes pesquisas sobre processos metab61icos basicos do parasita (Fairlamb, 1989)

e sua comparayao com a bioqufmica do hospedeiro tem apontado algumas importantes

diferen98s que podem ser utilizadas na busca de drogas antitripanocidais mais eficazes.

Um exemplo e 0 estudo do cicio metab6lico de tiol e poliaminas. A maioria, se neo

todas as celulas, contem altas concentray5es (milimolares) de ao menos um tiol de baixo peso

molecular. Na maioria dos organismos eucariotos a maior componente e a glutationa (GSH,

L-y-glutamil-L-cisteinil-glicina). GSH possui importantes papeis para 0 metabolismo celular,

incluindo funy5es regulat6rias, de proteyao e como cofator. Com 0 auxflio da enzima

glutationa redutase (GR) , GSH mantem 0 correto balan~ tiol-redox intracelular e tem sido

associado ao controle da sfntese de DNA e regulayao da atividade enzimatica. GSH tambem

serve para proteger a celula contra danos oxidativos atraves da procura de radicais livres e

pela remoyao enzimatica de per6xidos pelas peroxidases dependentes de glutationa e

glutationa-S-transferases. A ultima classe de enzimas tambem funciona como desintoxicante

de certos xenobi6ticos.

Embora tripanossomatfdeos e leishmanias contenham GSH, estes neo contem

glutationa redutase, que em outras celulas e a enzima responsavel em manter a glutationa

dissulfeto (GSSG) na sua forma reduzida (GSH, Figura 1II-1A; Ghisla & Massey, 1989). Ao

contrario, estes organismos reduzem GSSG e outros dissulfetos por intermeclio de uma troca

nao enzimatica tiol-dissulfeto com tripanotiona, um ditiol de baixo peso molecular unicamente

encontrado nestes organismos (Fairlamb, 1985). Tripanotiona (N1,N8_

bis[glutationil]esperimidina) e mantida dentro da celula como 0 ditiol (T[SHh), devido a a~o

A bioslntese da tripanotiona (Figura 111-2)vem da glutationa (tiol) e espermidina

(poliamina) via 0 intermediario N1-glutationil-espermidina (GSH-SPD). Estudos em Crithidia

'H •••~~H 0

o H

N H SH ~HJ,

,

HH'

I t

S H ( ~ H a ) 4

~ NH

• H

H ~ 0

H

coo' 0

~

-H 0

+H,N N-...~ ..•o

o ) H ~

S ( C H a ) ,

\ I

\

NH+

I 1

S ( C H a ) .

~ ~H + H H 0 H COO· 0

Figura 111·1.Formula estrutural dos substratos glutationa (A) e tripanotiona (B) J antes e depois da

r

T[S],

T io l H :20 2 R a d ic a is

d is s u lfe to p e r 6 x id o s Iiv r e s

I

.

o r g lin ic o s

1--

L

T [S H h

I

10; m e ta is p e s a d o s

F ig u r a 1 1 1 - 3D ia g r a m a e s q u e m a tic o p a r a in d ic a r a r e g r a d e p r o te ~ a o b io l6 g ic a n o m e ta b o lis m o d o s

53 58

1 MMSKI PDLVVIGAGSGGLEAAWNAATL YKKRVAVIDVQMVHGPPPPSALGG

1

_ _

.l·PKKLMVTGAQYMEHLRESAGPGWEFD lACRQEPQPQGPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAEL GARAAVVESHK LGG~PKKVMWNTAVHSEPMHDHADYG FP

I

IOIRTTLRAEWKNLIAVKDEAVLNINKSYDEMPRDTEGLEPPLGWGSLESKNVVNVRESADPASAVKERLETEHILLASGSWPHMPNIPGIEHCISSNEAFYL101SCEGKFNWRVlKE~YVSRLNAIYQNNLTKSH IEIIRGHAAFTSDPKPTIEVSGKKYTAPHILIATGG MPST PHESQIPGASLGITSDGFFNL

1201PEPPRRVLTVGGGFISVEFAGIFNAYKPKDGQVTLCYRGEMILRGPDHTLREELTKQLTANGIQIL201EELPGRSVIVGAGY IAVEMAGILSALGSKTSLKI RHDKVLRSPDSMI STNCTEELENAGVEVLKPSQVKEVKKTLSGLEVSMVTAVPGRLPVMTMIPTKENPAKVELNADGSKSVTFESGKKMDFDLV

1301301DVDCLLWAIGRVPNTKDLSLNKLGIQTDDKGHIIVDEFQNTNVKGIYAVGDVCGKALLTPVAlAAGRKLAHRLPEYKEDSKLDYNNIPTVVPSHPPIGTVMM AIGRSPRTKDLQLQNAGVMIKNGG VQVDEYSRTNVSNIYAIGDVTNRVMLTPVAINEAAALVDTVFG TTPRKTDHTRVASAVPSIPPIGTC

1401GLIEEVASKRYEV401GLTEDEAIHKYGIENVKTYSTSFTPMYHAVTKRKTKCVAVYLSSFTPLMHKVSGSKYKTPVAKIITNHSDGTVLGVHLLGDNAPEIIQGIGICLKLNAKISDFYNTIG\fVMLMVCANKEEKVVGIHMQGLGCDEMLQGFAVA VKMGAYKADFDNTVAl{il>!fYSSEELVTLR'rSAEELCSMRT

I

501PSYYYVKGEKMEKP501

F ig u r a 1 1 1-A lin h a m e n to4 s e q u e n c ia I e n tr e T R d e Trypanosoma cruz; e G R h u m a n a . O s r e s id u o s m a is im p o r ta n te s p a r a a c a ta lis e e s U io s a lie n ta d o s e m v e r m e lh o .

, .C

,r-.

_{i ~ ~}

_i)

C A P iT U L o ill-T R IP IlN O T IO N A R E D U T A S E D E T o C R lJ Z J 32

Segundo, os compostos podem ser enzimaticamente reduzidos e enta~ reoxidados pelo

oxigenio molecular, sabre 0 cicio redox. Muitos destes compostos tem atividade tripanocidal

contra T . c r u z i in v itr o comprovando sua capacidade de atuar como um substrato do cicio

redox.

Do ponto de vista de desenho de drogas, tripanotiona a um excelente alvo para a

modelagem de inibidores especificos. TR e seu substrato tripanotiona sao essenciais para a

sabrevivencia da celula do protozoario, unicamente encontrada nestes parasitas e a

especifica com relac;ao ao seu substrato quando com parada com a enzima analoga humana,

a glutationa redutase. Desta forma, a razoavel buscar um composto quimioterapeutico que

possa ser reconhecido pela TR do parasita, mas nao pelo hospedeiro.

Neste sentido, tada e qualquer informac;ao a respeito da enzima pede ser importante

quando da modelagem de inibidores. Estudos bioquimicos e cristalograficos tem side

realizados e detalhes estruturais em nivel atomico da tripanotiona redutase (Zhang, Y. et ai,

1993; Zhang, Y. et ai, 1995) ja se encontram na Iiteratura.

o

objetivo deste projeto a mais um passe na caracterizac;ao da TR. Atravas de estudos

de mutagenese sitio dirigido (Borges, et ai, 1995) e da determinac;ao da estrutura

cristalografica da enzima nativa e de diferentes complexos (Hunter, W.N. et ai, 1992; Bailey,S.

et ai, 1993; Bailey,S. et ai, 1994), TR tem side caracterizada, residuos associados

a

sua

func;ao tem side identificados, e a variac;ao conformacional diante da ligac;ao com diferentes

substratos (T[S]2,[GSPd]2) obseNadas, mas nao havia nenhuma evidencia do comportamento

da enzima durante a ligac;ao do substrato, isto a, quando 0 substrato se encontra Iigado a

enzima.

Neste sentido 0 projeto visou 0 estudo cristalografico da mutante C58S TR + GSPd,

onde a enzima Tripanotiona redutase teve sua cisteina catalitica 58 ( destacadas na Figura

-glutationil-espermidina,

0

substrato precursor da tripanotiona no cicio metab6lico das poliaminas (Figura

111-3).A estrutura foi determinada utilizando difra9Bo de raios-X em monocristais a

2 .4 A

de

CAPITuLO 111- TRlPANOTlONA R£DUTASE DE To CRUZ! 34 ( F ig u r a 1 1 1 - 5 )c r e s c e r a m a d im e n s c 5 e s d e a p r o x im a d a m e n t e O . 5 x O.5 x 1 . 0 m m e m t o m e d e u m a

s e m a n a .

111.3Coleta e processamento dos dados

C r is t a is d o c o m p le x o m u t a n t e C 5 8 S T r ip a n o t io n a R e d u t a s e + G S P d p e r t e n c e m a o

g r u p o e s p a c ia l P 4 3 , p a r a m e t r o s d e c e la d e a = b = 9 2.7, c = 1 5 6.2 A c o m u m d f m e r o n a u n id a d e

a s s im e t r ic a .

O s c r is t a is d if r a t a m a t e 2 . 3 A d e r e s o lu c ; : a o,e m b o r a c o m a a n a lis e d a s e s t a t f s t ic a s d e

in t e g r a c ; : a o e p r o m e d ia c ; : a o d o s d a d o s, s o m e n t e d a d o s a t e 2.4A t e n h a m s id o u t iliz a d o s n o

C A P I T u L O 1 1 1 - T R I P A N O T I O N A R E D U T A S E D E ToCRUZl 3 5

O s p rim e iro s d a d o s fo ra m c o le ta d o s a 2 .6 A d e re s o lu y a o , u s a n d o ra d ia y a o s in c ro tro n

c o m c o m p rim e n to d e o n d a ( A ) d e 0 .9 2 A . A s 1 2 5 6 1 0 re fle x 6 e s m e d id a s fo ra m p ro m e d ia d a s e m 4 9 1 6 6 re fle x o e s in d e p e n d e n te s p a ra u m R s y md e 0 .0 5 8 (c o n ju n to d e d a d o s I). E s te s

d a d o s fo ra m s u p le m e n ta d o s p o r n o v a s m e d id a s re a liz a d a s a 2 .3 A d e re s o lu y a o u s a n d o u m

c o m p rim e n to d e o n d a d e 1 .1 5 A (c o n ju n to d e d a d o s II) n u m to ta l d e 5 5 4 2 5 re fle x o e s m e d id a s

p ro m e d ia d a s e m 2 9 8 8 3 re fle x O e s in d e p e n d e n te s , R s y md e 0 .0 8 8 .

A m b o s c o n ju n to s d e d a d o s fo ra m c o le ta d o s n a e s ta y a o P X 9 .5 d a F o n te d e R a d ia y a o

S in c ro tro n , L a b o ra t6 rio d e D a re s b u ry , u s a n d o a p la c a d e im a g e m (3 0 0 m m ), M A R c o m o

d e te to r. Q u a tro c ris ta is fo ra m u tiliz a d o s , e v a ria s tra n s la 9 5 e s a o lo n g o d o s e u e ix o m a io r fo ra m

n e c e s s a ria s d e s d e q u e o s c ris ta is s e m o s tra ra m s e n s iv e is

a

in te n s a ra d ia y a o d o fe ix e .

A lg u m a s im a g e n s n a o fo ra m u tiliz a d a s d e v id o a m a q u a lid a d e c a u s a d a p e lo d a n o p a r

ra d ia c a o . O s d a d o s fo ra m p ro c e s s a d o s u s a n d o 0 p ro g ra m a M O S F L M (L e s lie e t a i, 1 9 8 6 ) e 0

p a c o te d e p ro g ra m a s C C P 4 (C C P 4 , 1 9 9 4 ), p a ra c a d a p o s iy a o tra n s la c io n a l d o s c ris ta is

s e p a ra d a m e n te . U m to ta l d e 1 7 0 1 5 5 re fle x O e s fo ra m m e d id a s , d o s q u a is 5 0 4 1 0

in d e p e n d e n te s , 9 8 .1 % d o s d a d o s a 2 .4 A d e re s o lu y a o , R s y m

=

0 .0 8 3 . E s ta tis tic a s re le v a n te s

a

c o m p le ta c o le ta d e d a d o s s a o a p re s e n ta d a s n a T a b e la 1 1 1 -1 .

111.4

D e te rm in a ~ io

da estrutura e refinamento

O s c ris ta is d o c o m p le x o m u ta n te C 5 8 S T R + G S P d s e m o s tra ra m is o m 6 rfic o s a o s d a

C A P I T u L O I I I · T R I P A N O T l O N A R E D U T A S E D E ToCRUZI

T a b e la 1 1 1 -1E s ta tis tic a s re le v a n te s a c o le ta d e d a d o s . R s y m

=

L

I

I(k )-(I) 1 1 L 1 (k )o n d e I(k ) e (I) re p re s e n ta m a In te n s id a d e d e u m a d a d a re fle d o e a m e d ia d a s in te n s id a d e s re s p e c tiv a m e n te e( J

o d e s v io p a d rA o .

R e s o l u y a o

(A )

R e f l e x o e s I n d e p e n d e n t e s

1 > 3 0 ' ( % )

7.14 1824 0.053 96.4

5.22 3018 0.057 98.2

4.31 3857 0.054 99.1

3.75 4528 0.062 99.4

3.37 5097 0.074 99.1

3.08 5588 0.097 98.7

2.86 6076 0.137 99.0

2.68 6493 0.173 98.7

2.53 6906 0.244 98.7

2.40 7023 0.307 95.1

C A P I T u L O 1 1 1 - T R I P A N O T I O N A R E D U T A S E D E ToCRUZ/ 37

u m p ro to c o lo d e re s fria m e n to le n to n o q u a l a te m p e ra tu ra s im u la d a d o s is te m a fo i re d u z id a d e

2 0 0 0 K p a ra 3 0 0 K e m p a s s o s d e 5 0 K n o te m p o d e 0 .5 fs (R fa c to r=2 2 .6 % ).

F o ra m e n ta o c o n s tru id o s o s p rim e iro s m a p a s d e d e n s id a d e e le tr6 n ic a (2 IFc b s

I -

IFc a lcI

e IFo b s l- IF c a lc !)e e x a m in a d o s n a s e s ta c ;O e s g ra fic a s a tra v e s d o p ro g ra m a g ra fic o 0 (J o n e s

et

aI,

1 9 9 1 ), p ro g ra m a e s te u tiliz a d o e m to d a s a s m a n ip u la c ;O e s g ra fic a s d o m o d e lo .

O s p rim e iro s m a p a s ja m o s tra v a m c la ra d e n s id a d e p a ra p a rte d o lig a n te (G s p d ) e m

a m b a s s u b u n id a d e s . A m u ta ~ o (C 5 8 S ) e 0 lig a n te (G S P d ) fo ra m in c lu id o s n o re fin a m e n to e

s e in ic io u a m o d e la g e m p a ra a s re g i6 e s o n d e a m a p a d e d e n s id a d e n a o c o in c id ia c o m a

m o d e lo .

N o q u a rto c ic io , a v in c u lo d e s im e tria n a o c ris ta lo g ra fic a (e ix o d e o rd e m 2 ) fo i lib e ra d o

e a s d u a s s u b u n id a d e s re fin a d a s in d e p e n d e n te m e n te . A s a Q u a s fo ra m id e n tific a d a s c o m o

p ic o s d e a ltu ra m a io r q u e 3 c r ( o n d e c r e o d e s v io p a d ra o d o m a p a ) e m m a p a s d ife re n c ;a

(I

F o b s l

-lF c a lc !) u tiliz a n d o a p ro g ra m a P E A K M A P (C C P 4 , 1 9 9 4 ).

A p 6 s 4 c ic lo s d e re fin a m e n to p o s ic io n a l e d o s fa to re s d e te m p e ra tu ra (A P E N D IC £ 6 )

c o n ju n to d e d a d o s IIfo i in c lu id o n o re fin a m e n to . U m a u m e n to n o fa to r d e d is c o rd a n c ia (R fa cto r)

c ris ta lo g ra fic o p a ra 2 1 .6 fo i v e rific a d o .

C ic lo s d e re fin a m e n to p o s te rio re s in c o rp o ra n d o v in c u lo s in d iv id u a is , fa to re s d e

te m p e ra tu ra e a d i~ o c o n s e rv a tiv a d e m o le c u la s d e s o lv e n te fo ra m u tiliz a d o s p a ra c o m p le ta r

a re fin a m e n to . 0 m o d e lo fin a l p o s s u i u m fa to r d e d is c o rd a n c ia d e 1 9 .8 % c o m a d e s v io d a

g e o m e tria id e a l d e 0 .0 1

A

p a ra c o m p rim e n to s d e lig a ~ o , 2 .0 0 0 p a ra a n g u lo s d e lig a ~ o e

2 3 .40

p a ra a n g u lo s d ie d ric o s . A T a b e la 1 1 1 -2in c lu i a s e s ta tis tic a s d e re fin a m e n to d o c o m p le x o

C ic io R e s o lu ~ o R -fa c to r r.m .s m o le c u la s

A in ic . - fin . c o m p o (A ) a n g . ( 0 ) d e a Q u a

1 2 . 6 2 4 . 1 - 2 1 . 5 0 . 0 0 6 1 . 4 4 5 a 2 - 3 2 . 6 2 5 . 1 - 1 9 . 8 0 . 2 1 1 2 . 8 5 5 9 1 4 - 5 2 . 4 2 0 . 0 - 2 3 . 3 0 . 0 0 9 4 . 4 1 8 1 1 5 6 - 2 6 2 . 4 2 3 . 3 - 1 9 . 8 0 . 0 1 0 2 . 0 0 0 2 6 5

111.5Resultados

cristalograficos

o

m o d e lo fin a l c o m p re e n d e u m d fm e ro , d u a s m o le c u la s d e F A D , d u a s m o le c u la s d e

N1-g lu ta tio n il-e s p e rm id in a (G s p d ) e 2 6 5 m o le c u la s d e s o lv e n te tra ta d a s c o m o a to m o s d e

to ta l d e 7 8 7 4 a to m o s n a o h id ro g e n io s c o m u m p a ra m e tro te rm ic o is o tr6 p ic o m e d io , Ba v =

T a b e la 1 1 1-3 .V a lo re s p a rc ia is p a ra o s p a ra m e tre s te rm ic o s is o tr6 p ic o s p a ra C 5 3 5 T R + G s p d . N A e e q u iv a le n te a o n u rn e ro d e a to m o s e Ba v a o fa to r d e te m p e ra tu ra m e d io e m (A2). M C e q u iv a le a c a d e ia pli':l~ ipC lI ..~.S .~.a.C :C lciE Jia.IC ltE JrC lI •.Y C lI~ ~ s..c:a.Ic:~ IC lci()S.H~ ~ ':lci~. E 5 " " , t ; ~ 9 J : ,.~ ~ r : » ~.( ~ ~ r : » ~ , 1 9.~ ) .

S u b u n id a d eA S u b u n id a d e B A g u a s T o ta l

M C S C G s p d F A D M C S C G s p d F A D

N A 1 9 3 1 1 7 8 7 2 9 5 3 1 9 3 5 1 7 9 2 2 9 5 3 2 6 5 7 8 7 4

Ba v

2 6.1 3 1 . 1 5 3 . 7 1 6 . 3 3 3.7 3 8.4 _{7 2.6 2 5.3 3 8 . 1 3 4.9}

. .. . . . • • • •••• •• •• •• • • • ••• • • • • • . ?• . • . ••• ... ,_{. .............},...,..,.•.... , ...,...

~

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[ 3 0 :·lr·ir.i··H····~·J~n··t'.·f"··!'fl·.rft;\·ft-tH ~ti;.HHH,~·¥\l1r1tll.:;;1~i'-,:iIH··Jyl:·,,H .~...H_~.._.HiH H.. 0 '- ~: ~ ".".~ _~ ~ ~~1JJ VI: ;'1 ~i l~.: , " l.:,fl.t ~~A li ~tilJ::,' ":;J"~~~I '-,

20 .,'H ·••··l~ r'··H" ..H _H H !H ~H .~ . ..,~_H _H H HIo..¥H-·.a··.•.~··,··V V .····,.-+ ~·t;H : r,.~v; .

!

10 .:.:.H H····I··H~H H..H + .H__H _.H l.~ :H H..~~ !:'.LHH.H H.I;.._ ~H H H_.l.H..:H H~ .]..YH\ .

-

·

f

:

Hr .

Figura 111-8Mapa de omissao (Fobs-Fcalc, acalc, mapa calculado excluindo as coordenadas da serina 58) ao nivel de 30".

, . ~ ; :. u 'c. rB l ! ~T ! [C A

IF s rI, i - .D ~L:o '

F ig u ra 1 1 1 -9V is ta e s te re o g rM ic a p a ra G S P d e s e u a ju s te c o m 0 m a p a d e o m is s a o F o b s -F c a lc ( c a lc u lo d o

m a p a o m itin d o a s c o o rd e n d a s d o lig a n te n o m o d e le a o n iv e l3 a . a ) s u b u n id a d e A b ) s u b u n id a d e B .

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