UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE Pectobacterium sp. EM TUBÉRCULO-SEMENTE DE CULTIVARES DE BATATA
ANDRÉIA IRACI TUMELERO
Dissertação apresentada à Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Passo Fundo para a obtenção de título de Mestre em Agronomia – Área de Concentração em Fitopatologia
UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE Pectobacterium sp. EM TUBÉRCULO-SEMENTE DE CULTIVARES DE BATATA
ANDRÉIA IRACI TUMELERO
ORIENTADORA: PROFa Dra NORIMAR D’ ÁVILA DENARDIN
Dissertação apresentada à Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Passo Fundo para a obtenção de título de Mestre em Agronomia – Área de Concentração em Fitopatologia
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Jesus que me deu a vida, que proporcionou a oportunidade de chegar ao final desta etapa e que colocou em meu caminho pessoas maravilhosas que sempre me incentivaram. A presença constante de sua proteção foi o que me deu força para concluir este trabalho.
Agradeço a minha orientadora Norimar D’Ávila Denardin, que é um grande exemplo de persistência, inteligência, amizade e dedicação. Ela foi e é uma das pessoas que mais me incentivou e sabe o carinho e respeito que tenho por ela.
Agradeço ao meu Pai, Ari Tumelero, que nunca me deixou faltar nada, especialmente carinho e aos meus irmãos que também são maravilhosos. Agradeço a minha mãe, em memória, pois sei que se estivesse aqui estaria muito feliz por mais essa etapa, afinal sempre me incentivou a estudar. Devo muito a minha amada mãe que sempre foi exemplo de vida, e de fé durante os quinze anos que com ela convivi.
Também agradeço aqueles que contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho, disponibilizando os materiais necessários para a concretização do mesmo, especialmente aos produtores de batata-semente, Empresa Bocchi de Ibiraiaras, Empresa Café Bom Jesus de Bom Jesus, Embrapa Clima Temperado de
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Pelotas, à Universidade de Passo Fundo pela liberação de recursos para a compra de reagentes, à Capes pela bolsa, sem a qual este estudo não seria possível.
Agradeço ao professor Dr. Valmir Duarte, que contribuiu com idéias para o projeto de dissertação. Ao Dr. Ruud van den Bulk, do Centre for Plant Breeding and Reproduction Research, Wageningen, da Holanda, pelo envio de artigos relacionados ao trabalho. Agradeço também ao Instituto Biológico de Campinas, na pessoa do professor Júlio Rodrigues Neto e ao professor Beriam que contribuíram de maneira decisiva para o sucesso desse trabalho, fornecendo as bactérias referência e a Enzima Fosfatase Alcalina para a conjugação do antissoro. Sou grata também ao professor Álvaro Rodrigues de Almeida da Embrapa Soja, que nos auxiliou no processo de conjugação do antissoro. Ao José Ricardo Pfeifer Silveira pelo auxílio na metodologia das análises moleculares. Aos funcionários do Biotério Central, da Universidade de Passo Fundo, médicos veterinários: Luis Carlos Kreutz, Fabrício Fioreze e Sérgio Porto, que auxiliaram nos processos de imunização e coletas de sangue dos coelhos para obtenção dos antissoros utilizados neste trabalho. Aos funcionários Sérgio dos Santos Chagas e Cleonice Soveral, pela ajuda constante durante as atividades com os animais, principalmente nos cuidados sanitários e de alimentação. Agradeço também aos estagiários e colegas do Laboratório de Fitobacteriologia, especialmente a Tatiane Dalla Nora, que sempre esteve disposta a auxiliar.
Meus sinceros agradecimentos aos professores do curso que contribuíram para a minha formação. À professora Dileta Cechetti, pelo auxílio na análise estatística.
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Enfim, estendo os meus agradecimentos sinceros a todas as pessoas que de uma forma ou outra contribuíram para o desenvolvimento desse trabalho.
SUMÁRIO
Página
Lista de Tabelas... x
Lista de Figuras... xii
RESUMO ... 1
SUMMARY... 3
1. INTRODUÇÃO... 5
2. REVISÃO DE LITERATURA... 8
2.1 Aspectos gerais sobre Pectobacterium sp. envolvidos com a canela preta e a podridão mole em batata (Solanum tuberosum L.)... 8
2.2 Sintomatologia... 11
2.3 Fontes de disseminação... 12
2.4 Metodologias para detecção e identificação... 13
2.4.1 Métodos de isolamento... 14
2.4.2 Aspectos gerais sobre sorologia... 14
2.4.3 Métodos sorológicos... 16
2.4.4 Métodos moleculares... 19
CAPÍTULO I CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E MOLECULAR DE Pectobacterium sp. ISOLADA DE TUBÉRCULOS DE BATATA-SEMENTE... 21
Resumo... 21
Summary... 22
1 Introdução... 23
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2.1 Tubérculos de batata-semente utilizadas no estudo... 25 2.2 Isolamento de Pectobacterium de tubérculos de batata-semente... 26 2.2.1 Soluções de extração das bactérias... 26 2.2.2 Isolamento de Pectobacterium por meio de câmara úmida e incubação... 26 2.3 Caracterização bioquímica das bactérias isoladas... 27 2.4 Caracterização molecular de Pectobacterium isolados de tubérculos de batata-semente... 28 2.4.1 Extração de DNA... 28 2.4.2 Oligonucleotídeos iniciadores utilizados no estudo... 29 3 Resultados e Discussão... 30
3.1 Isolamento de Pectobacterium sp. de tubérculos de batata semente ... 30 3.2 Caracterização bioquímica das bactérias isoladas... 35 3.3 Caracterização molecular de Pectobacterium isolados de tubérculos de batata-semente... 39 4 Conclusões... 41
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CAPÍTULO II
PRODUÇÃO E UTILIZAÇÃO DE ANTISSORO POLICLONAL PARA Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum atípica, P. carotovorum subsp.
carotovorum e P. chrysanthemi 46
Resumo... 46
Summary... 47
1 Introdução... 48
2 Material e Métodos... 51
2.1 Preparo dos antígenos ... 51
2.2 Imunização dos coelhos... 52
2.3 Técnica de aglutinação e precipitação... 53
2.4 Purificação das imunoglobulinas... 54
2.5 Avaliação da especificidade e da sensibilidade dos antissoros produzidos... .... 54
3 Resultados e Discussão... 57
3.1 Técnica de aglutinação e precipitação... 57
3.2 Avaliação do limite de detecção com células puras para o antissoro produzido... 59
4 Conclusões... 64
CONSIDERAÇÕES FINAIS... 66
LISTA DE TABELAS
Tabela Página CAPÍTULO I Caracterização bioquímica e molecular de
Pectobacterium sp. isolada de tubérculos de batata-semente
1 Presença de bactérias pectolíticas em cultivares de batata-semente básicas...
32
2 Incidência de Pectobacterium sp. em diferentes regiões produtoras de batata-semente... 36
3 Percentual de reações positivas para os testes bioquímicos e fisiológicos para 60 isolados de Pectobacterium sp...
37
CAPÍTULO II Produção e utilização de antissoro policlonal para Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum atípica, P. carotovorum subsp. carotovorum e P. chrysanthemi 1 Esquema de tabela dois-por-dois referente aos resultados positivos e negativos de ELISA para estimar a precisão do teste... 56
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2 Percentual de sensibilidade, de especificidade, de valores preditivos positivos (VPP), de valores preditivos negativos
(VPN) e de precisão para 60 isolados de Pectobacterium sp. mediante DAS-ELISA e ELISA indireto
com antissoro policlonal produzido para Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum atípica (Pcca) e antissoro policlonal comercial (Agdia) para P. chrysanthemi (Pch) com 30 min e 1 h de incubação a 37 oC... 62
LISTA DE FIGURAS
Figura Página CAPÍTULO I Caracterização bioquímica e molecular de
Pectobacterium sp. isolada de tubérculos de batata-semente
1 Produto da amplificação do DNA genômico de estirpes de Pectobacterium por PCR com oligonucleotídeos iniciadores Y1 e Y2 para o gene de pectato liase. 1-Marcador de peso molecular 1 Kb, 2- padrão positivo- Pcc, 3 a 15-estirpes de Pectobacterium sp... 42 2 Produto da amplificação do DNA genômico via PCR com oligonucleotídeos Eca 1f e Eca 2r, para Pectobacterium carotovorum subsp. atrosepticum (Pca), 1- Marcador de peso molecular 1Kb, 2-(1819-Pca-IB), 3-(42Pca-IB), 4-(1692-Pcca-IB), 5 a 15-(estirpes de Pcca Ibiraiaras), 16 controle negativo...
42
3 Produto da amplificação do DNA genômico via PCR com oligonucleotídeos Eca 1f e Eca 2r, para P. carotovorum subsp. atrosepticum 1-Marcador, 2-(1819-Pca-IB), 3-(424-Pca-IB), 4-(1692-Pcca-IB), 5-(1131-Pcc-IB), 6-(1814-Pco-IB), 7-(1383-Pch-6-(1814-Pco-IB), 8 a 11-(Estirpes de Pectobacterium sp.), 12-(424-Pca-IB), 13 e 14-(Estirpes de Pectobacterium sp.) 15-(controle negativo)... 43
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oligonucleotídeos Br1f, Lr1A e Lr1G, para Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum atípica (Pcca), 1- Marcador de peso molecular 1Kb, 2-(1692-Pcca-IB), 3-(Pca-1819-IB), 4-(424-Pca-IB), 5 a 13-(estirpes de Pcca-Ibiraiaras), 14-controle negativo...
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5 Produto da amplificação do DNA genômico via PCR com oligonucleotídeos Br1f, Lr1A e Lr1G, para P. carotovorum subsp. carotovorum atípica (Pcca). 1-Marcador, 2-(1692-Pcca-IB), 3-(1819-Pca-IB), 4-(1131-Pcc- IB), 5 a 9- (Estirpes de Pectobacterium sp.), 10-(863-Pcc- IB, 11-(1383-Pch-IB), 12-(18Pco-IB), 13-(1131-Pcc-IB), 14-(1692-Pcca-IB), 15-controle negativo...
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6 Produto da amplificação do DNA genômico via PCR com oligonucleotídeos Br1f, Lr1A e Lr1G, para P. carotovorum subsp. carotovorum atípica (Pcca). 1- Marcador, 2-(1692-Pcbr-IB), 3-(1814-Pco-IB), 4-(1131-Pcc-IB), 5 a 15-(Estirpes de Pcc isoladas de tubérculos de batata), 16-(controle negativo)...
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7 Produto da amplificação do DNA genômico via PCR com oligonucleotídeos Br1f, Lr1A e Lr1G, para P. carotovorum subsp. carotovorum atípica (Pcca). 1- Marcador, 2-(1692-Pcca-IB), 3-(863-Pcc-IB), 4-(1383-Pch-IB), 5a 15-(Estirpes de Pcc isoladas de tubérculos de batata) 16-(controle negativo)... 45
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CAPÍTULO II Produção e utilização de antissoro policlonal para Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum atípica, P. carotovorum subsp. carotovorum e P. chrysanthemi
1 Limite de detecção de ELISA indireto com antissoro comercial Policlonal para Pectobacterium chrysanthemi (Pch) com células puras de Pch após 30 minutos e 1 hora de incubação a 37 oC... 59
2 Reação de Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Pcc) e P. chrysanthemi (Pch) com antissoro produzido para P. carotovorum subsp. carotovorum atípica (Pcca) e limite de detecção com o respectivo antígeno (Pcca) mediante DAS-ELISA e reações cruzadas com Pcc e Pch... 60
IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE Pectobacterium sp. EM BATATA-SEMENTE.
Autora: ANDRÉIA IRACI TUMELERO
Orientadora: NORIMAR D’ÁVILA DENARDIN
RESUMO: A incidência de canela preta e podridão mole está relacionada à utilização de batata-semente contaminada com pectobactérias, além de outras fontes de contaminação, como rizosfera de plantas invasoras e água de irrigação. Sabe-se que as principais medidas de controle dessas doenças são preventivas, com manejo adequado, como rotação de cultura, erradicação de plantas e tubérculos sintomáticos, uso de cultivares resistentes e principalmente utilização de tubérculo-semente não infectado. Sendo assim, esse estudo visou avaliar a incidência de pectobactérias em batata-semente e caracterizar os isolados através de métodos bioquímicos, sorológicos e moleculares, bem como produzir antissoros para auxiliar na detecção destes patógenos. Dos lotes de sementes analisados, verificou-se a presença de pectobactérias nos cultivares Baronesa, Asterix e Monalisa, dos municípios de Ibiraiaras, Bom Jesus e Pelotas. A caracterização bioquímica desses isolados demonstrou incidência de 53% de Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Pcc), contrastando com 23% de P. carotovorum subsp. carotovorum atípica (Pcca) e 2% de P. chrysanthemi (Pch). Entretanto, 22% dos isolados não foram caracterizados em nível de subespécies. O produto da amplificação do DNA pela PCR com oligonucleotídeos iniciadores Y1 e Y2, para o gênero, Pectobacterium foi característico para 58 estirpes. Com Eca 1f e Eca 2r, exceto para a bactéria-tipo
1819-Pca-2
IB, não houve amplificação de 690 pb para nenhum dos isolados. Da mesma forma, verificou-se inespecificidade com oligonucleotídeos iniciadores, Br1 e Lr1A e Lr1G para Pcca. Por meio da avaliação sorológica dos mesmos isolados, mediante ELISA direto e indireto com antissoros comerciais e produzido para Pcca-424-IB, a sensibilidade foi de 67% e 100% após trinta minutos de incubação com antissoro produzido e comercial, respectivamente. Após 1 h de incubação a sensibilidade do antissoro produzido foi de 100%. A especificidade do método foi de 50% para o soro produzido e 79% para o comercial para Pch. O antissoro produzido foi específico para o gênero, demonstrando ausência de reações positivas com outras bactérias . No entanto, houve reações cruzadas entre as subespécies, o que foi verificado por vários autores.
Palavras-chave: bactérias pectolíticas, detecção, antissoros, ELISA, PCR.
IDENTIFICATION AND QUANTIFICATION OF Pectobacterium sp. IN SEED POTATOES. Author: ANDRÉIA IRACI TUMELERO
Adviser: NORIMAR D’ÁVILA DENARDIN
SUMMARY - The incidence of blackleg and soft rot is related to the use of contaminated seed potatoes with pectobacteria, besides other sources of contamination as roots rhizosphere weeds of plants raiders and irrigation water. It is known that the main measures of control of those diseases are preventive with management crop, as crop rotation, eradication of plants and symptomatic tubers, and use of resistant varieties and mainly by means of the use of healthy seeds. The present study aimed to evaluate the incidence pectobacteria in seed potatoes and to characterize the isolates through biochemical, serological and molecular methods, as well as to produce antisera to aid in the detection of these pathogens. Of the analyzed lots of seeds, the presence of pectobacteria was detected in variety Baronesa, Asterix and Monalisa, from Ibiraiaras, Bom Jesus and Pelotas. The biochemical characterization of the isolates from cultivars demonstrated an incidence of 53% of Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Pcc) contrasting with 23% of P. carotovorum subsp. carotovorum atypical (Pcca) and 2% of P. chrysanthemi (Pch). However, some isolated were not characterized among subspecies. The product of the amplification of the DNA for PCR with primers Y1 and Y2, for the genus was characteristic for great majority of the
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isolates. With Eca 1f and Eca 2r, except to type strain 1819-Pca-IB, there was no amplification of 690 pb for none of the isolates. In the same way, variability was verified with primers Br1 and Lr1A and Lr1G for Pcca. By means of the serological evaluation of the same isolates, throughout the direct and indirect ELISA with commercial antiserum and produced for Pcca-424-IB, the sensibility was of 67% and 100% after 30 min of incubation with the produced antiserum and with the commercial, respectively. After 1 h of incubation the sensibility of the produced antiserum was 100%. The specificity of the method was 50% for the produced serum and 79% for commercial for the Pch. The produced antiserum was specific for the genus, demonstrating absence of positive reactions with other bacteria. However, there were crossed reactions among the subspecies, what was verified by several authors.
1 INTRODUÇÃO
A produtividade média de batata em nível nacional no ano de 2002 foi de 18 t/ha, destacando-se os Estados de Minas Gerais e São Paulo com as maiores médias, com 23 t/ha, contrastando com o Rio Grande do Sul que apresentou produtividade média de 10 t/ha, ocupando o segundo lugar em área cultivada, mas o quinto lugar em produtividade (IBGE, 2002). Um dos fatores que contribuem para a baixa produtividade é a utilização de batata-semente de baixa qualidade fitossanitária.
Várias doenças de origem fúngica, virótica e bacteriana afetam a cultura. Entre as principais doenças bacterianas, estão a canela preta e a podridão mole causadas por Pectobacterium carotovorum subsp. atrosepticum (Pca) = (sin. Erwinia carotovora subsp. atroseptica - Eca); P. carotovorum subsp. carotovorum (Pcc) = (sin. E. carotovora subsp. carotovora - Ecc); P. chrysanthemi (Pch) = (sin. E. chrysanthemi - Ech) e P. carotovorum subsp. carotovorum atípica. A principal característica dessas bactérias é a produção de enzimas pectolíticas em grande quantidade, ocasionando rápida deterioração dos tubérculos ou tecidos da haste da planta, sendo praticamente impossível determinar qual a bactéria que está presente apenas através de sintomas. Várias regiões, tropicais e subtropicais apresentam distribuição generalizada desses patógenos. As perdas devido a estas doenças são estimadas entre 10 e 40 % nos campos de produção, podendo durante o armazenamento atingir a 100%.
A podridão mole e a canela preta são doenças de difícil controle e embora a capacidade de sobrevivência destas bactérias no
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solo seja baixa, estas podem sobreviver associadas a rizosfera de várias plantas invasoras. A disseminação dessas bactérias é favorecida por infecções latentes dos tubérculos-semente, principal fonte de inóculo, e pela classificação mecânica de tubérculos. Umidade e temperatura são fatores críticos para o início das doenças causadas por Pectobacterium sp., que diferem quanto à temperatura ótima de desenvolvimento, o que reflete na diversidade de hospedeiros e distribuição geográfica.
A detecção dessas bactérias na fase de latência em tubérculos-semente, é de suma importância no processo de controle da doença. Contudo, além da utilização de semente livre desses patógenos, a redução de perdas na produção poderia ser atingida através de manejo da lavoura e uso de cultivares resistentes. Assim sendo, a diagnose em tubérculos-semente pode auxiliar na redução da incidência da doença. No entanto, faz-se necessário métodos rápidos de detecção, específicos e sensíveis para detectar concentrações entre 102 e 104 ufc mL-1, o que é suficiente para promover o desenvolvimento de epidemia. A identificação de espécies e subespécies de Pectobacterium por meio de métodos bioquímicos na maioria das vezes não é satisfatória, devido a grande variabilidade existente entre espécies, e além disso a interpretação é difícil e necessita dias ou até semanas para a conclusão da análise.
Tendo em vista a importância da utilização de tubérculos-semente livres do patógeno como estratégia de controle da doença, são necessários métodos de detecção rápidos, sensíveis e confiáveis para a diagnose de rotina em laboratórios. Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo avaliar a incidência de Pectobacterium sp. em tubérculos de batata-semente, bem como utilizar métodos
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bioquímicos, sorológicos e moleculares para identificação e quantificação de bactérias e produzir antissoros para aplicá-los mediante ELISA (Enzyme Linked-Immunusorbent Assay) como ferramenta para auxiliar na detecção dessas bactérias.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Aspectos gerais sobre Pectobacterium sp. envolvidos com a canela preta e a podridão mole em batata (Solanum tuberosum L.)
A canela preta e a podridão mole são consideradas doenças de grande importância para a cultura de batata (Solanum tuberosum L.) (Pérombelon & Kelman, 1980; Gumestad & Secor, 1983). As bactérias envolvidas com essas doenças eram pertencentes ao grupo II de Erwinias pectolíticas “soft rot”, hoje classificadas como Pectobacterium de acordo com a proposta de Hauben et al. (1999), seguindo a sugestão de Waldee (1945). O autor sugeriu agrupar as espécies de Erwinia pectolíticas em novo gênero. Na época a proposta não teve aceitação, porque a característica pectolítica não foi considerada suficiente para formação de um gênero à parte. Recentemente a antiga proposta foi analisada, considerando-se o grande número de indivíduos pertencentes ao gênero Erwinia e os vários sintomas provocados pelas diferentes espécies, nos mais variados hospedeiros. Hauben et al. (1999), baseando-se em análises de seqüências de rDNA 16S propuseram a mudança sugerida há vários anos. Sendo assim, as espécies de Erwinias do grupo II foram renomeadas da seguinte forma: Erwinia carotovora (Dye, 1969) - Pectobacterium carotovorum; Erwinia chrysanthemi (Burkholder, 1953) - Pectobacterium chrysanthemi; Erwinia cypripedii - Pectobacterium cypripedii e Erwinia cacticida - Pectobacterium
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cacticidum sendo essas as responsáveis por causarem uma rápida maceração dos tecidos de plantas. As duas últimas possuem distribuição e hospedeiros restritos, não havendo registro de ocorrência no Brasil (Takatsu, 1983). Pectobacterium carotovorum e P. chrysanthemi (Pch) são amplamente distribuídas em diferentes regiões tropicais e temperadas, e infectam várias espécies vegetais (Dickey, 1979; Lumb, et al., 1986).
A espécie P. carotovorum (Jones, 1901) Hauben et al., 1999 está dividida em seis subespécies: P. carotovorum subsp. atrosepticum (van Hall 1902) Hauben et al., 1999 - (Pca); P. carotovorum subsp. carotovorum (Jones, 1901) Hauben et al., 1999 - (Pcc); P. carotovorum subsp. betavasculorum (Thomson et al., 1984) Hauben et al., 1999 - (Pcb); P. carotovorum subsp. odorifera (Gallois et al., 1992) Hauben et al., 1999 - (Pco); P. carotovorum subsp. wasabiae (Goto & Matsumoto, 1987) Hauben et al., 1999 - (Pcw) e P. carotovorum subsp. carotovorum atípica (Duarte et al., no prelo).
P. carotovorum subsp. atrosepticum é mais restrita a regiões temperadas e está mais especificamente associada à cultura de batata. No entanto, pode ser disseminada para regiões de clima quente, através de tubérculos-semente contaminados. Durante muito tempo foi considerado o principal agente causal de canela preta. Entretanto, sabe-se que tanto Pca, Pcc e Pch podem induzir a doença (Pérombelon & Kelman, 1987), porém Pcc não apresenta sintomas característicos de enegrecimento da haste da planta (Ward & De Boer, 1994).
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum é capaz de infectar grande número de hospedeiros, e apresenta ampla distribuição nas regiões temperadas e tropicais, podendo sobreviver
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em diversos ambientes, incluindo rios, lagos e oceanos (Gudmestad & Secor, 1983; Pérombelon & Kelman, 1987).
Recentemente, nova subespécie isolada de plantas de batata com sintomas de canela preta, no Estado do Rio Grande do Sul, foi descrita por Duarte et al. (no prelo). A subespécie foi denominada P. carotovorum subsp. carotovorum atípica. A descrição foi baseada na análise da região intergênica do RNAr 16S e 23S. Essa subespécie apresenta muita semelhança com Pca, sendo até então caracterizada bioquimicamente como tal. As características fisiológicas e moleculares como presença de crescimento a 37 oC, inespecificidade com os oligonucleotídeos iniciadores Eca1f e Eca 2r, ausência de reação com antissoro monoclonal 4F6 para o sorogrupo I de Pca, levaram a tal investigação, sugerindo a caracterização de nova subespécie dentro do grupo, já que Pca não possui habilidade de desenvolver-se a 37 oC e responde especificamente aos testes citados.
Pectobacterium chrysanthemi é subdividida em seis patovares: P. chrysanthemi pv. chrysanthemi; pv. dianthicola, pv. dienffenbachae, pv. paradisiaca, pv. parthemii, e pv. zeae (Skerman et al., 1980; Hauben et al., apud Duarte , 1999)
Pectobacterium chrysanthemi tem ampla distribuição em regiões tropicais, subtropicais e zonas mais quentes das regiões temperadas, sendo um importante patógeno para a cultura de batata em regiões quentes (Pérombelon & Kelman, 1980; Bradbury,1986). Algumas estirpes de Pch são específicas para seus hospedeiros e a espécie pode ser classificada em biovares baseada em características fisiológicas e bioquímicas (Singh, et al., 2000). Estirpes de Pch podem ser diferenciadas por métodos sorológicos com base no antígeno O (somático) e H (flagelar). No entanto, podem ocorrer
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reações cruzadas com antígenos semelhantes a Pectobacterium como espécies de Pseudomonas do solo (Van der Wolf, 1993).
2.2 Sintomatologia
Os sintomas causados por espécies de Pectobacterium se devem a produção de grandes quantidades de enzimas que degradam a parede celular das plantas (Collmer & Keen, 1986; Pirhonem et al., 1991; Salmond, 1994). Estes sintomas variam de acordo com as condições do ambiente, resistência ou suscetibilidade do cultivar e parte da planta afetada (Bain et. al., 1990). Além disso, a concentração de oxigênio e a umidade são fatores importantes na intensidade da doença. A presença de oxigênio, auxilia no desenvolvimento de infecções latentes (Pérombelon & Lowe, 1975; De Boer et al., 1978). Essas bactérias podem infectar uma ampla gama de hospedeiros, devido à ausência de especificidade na interação patógeno-hospedeiro, sendo que uma mesma planta pode ser infectada por várias espécies ou subespécies deste grupo de bactérias.
A canela preta ocorre normalmente na haste da planta, a partir de tubérculos-semente infectados e se caracteriza por lesões que variam de coloração marrom a preta. Murcha das folhas e seca da haste podem ocorrer nas fases iniciais da doença (Pérombelon & Kelman, 1987). As infecções tardias, em tecidos mais lignificados, são denominadas talo oco (Souza Dias & Iamauti, 1997). Há grande incidência de pectobactérias associadas a região do estolão dos tubérculos, a exemplo de outras bactérias do sistema vascular como Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus e Ralstonia solanacearum, que também têm os tubérculos como a principal fonte
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de disseminação (De Boer, 2002). Dessa forma, a transmissão da bactéria para a parte aérea ocorre, provavelmente, via estolão.
A podridão mole dos tubérculos é caracterizada pela maceração dos tecidos parenquimatosos, levando ao encharcamento, devido à destruição da lamela média que une as células, ocasionando assim, a perda de água, resultando na não emergência da planta (Elphinstone,1987).
No campo, o desenvolvimento dos sintomas de canela preta ou podridão mole surge a partir de um número entre 102 e 104 ufc mL-1 por semente (Bain et al., 1990). Em ambiente aeróbico, o inóculo inicial responsável pelo desenvolvimento das lesões está entre 106 e 107 ufc mL-1 sob temperatura menor que 30 oC. Já em condições anaeróbicas a infecção ocorre em escala menor. A intensidade da doença varia de acordo com a temperatura, concentração do patógeno e da resistência do tubérculo (Pérombelon & Kelman, 1980).
2.3 Fontes de disseminação
A disseminação de pectobactérias pode ocorrer no solo, através da água de chuva, a partir de tubérculos apodrecidos, no entanto não sobrevive no solo por longos períodos na ausência de água livre e restos culturais (Pérombelon & Kelman, 1980). Tubérculos-semente podem ser infectados através das lenticelas ou por ferimentos durante o plantio. Dessa maneira, os tubérculos tornam-se a principal fonte de disseminação para novas áreas, ou para plantas sadias durante o desenvolvimento da cultura (De Boer & Kelman, 1975 citado por Schaad, 2001; Pérombelon & Kelman, 1980; Pérombelon & Salmond,1995). Deve-se ressaltar que ferimentos nos tubérculos são freqüentes durante a colheita, facilitando o
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desenvolvimento de podridão mole durante o armazenamento, e canela preta no campo (Elphinstone & Pérombelon, 1986). Insetos, podem disseminar os patógenos para tecidos vegetais lesionados. Da mesma forma, a mecanização da produção também é importante na disseminação (Adams et al., 1980; Elphisthone & Pérombelon, 1986).
2.4 Metodologias para detecção e identificação
A diagnose correta do agente causador da doença é pré-requisito para o controle. No entanto, na maioria dos casos, existe grande dificuldade para identificar os patógenos através de métodos rápidos e efetivos (Schaad, 1979; Pérombelon & Kelman 1980). A detecção e identificação de bactérias do gênero Pectobacterium, ao longo de vários anos tem sido realizada através de testes bioquímicos e fisiológicos entre eles: crescimento a 37 oC, degradação de pectato, produção de ácidos a partir de alfa-metil glucosídeo, lactose, maltose, sacarose e trealose e a presença de fosfatase (Schaad, 1988; Pérombelon et al., 1998). Entretanto, esses métodos são morosos, de difícil interpretação, requerendo semanas e até meses para o diagnóstico (Schaad, 1979). Várias metodologias para detecção vêm sendo desenvolvidas visando satisfazer alguns critérios como: sensibilidade, especificidade, detecção de células vivas e rapidez para uso em longa escala. Métodos sorológicos e moleculares são vantajosos no sentido de otimizar análises laboratoriais rotineiras, pois nem sempre faz-se necessário o isolamento do patógeno (Singh et al., 2000).
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2.4.1 Métodos de isolamento
O isolamento de pectobacterias a partir de tubérculos de batata, tem sido feito através de diluição e plaqueamento em meio seletivo cristal violeta de pectato-CVP (Cuppels & Kelman, 1974). Com esse método é possível a contagem de unidades formadoras de colônias, que se apresentam com cavidade característica sobre o meio de cultura após 24 - 48 horas de incubação. Contudo, apresenta baixa sensibilidade devido a presença de grande número de saprófitas associados aos tubérculos de batata, além de outros microrganismos que também produzem enzimas pectolíticas. Além disso, o processo de execução é trabalhoso e exige grande tempo, não sendo o mais indicado para análises rotineiras. Meios de enriquecimento para os extratos de casca de batata também têm sido utilizados para indução de multiplicação celular de bactérias em estado de latência, favorecendo a avaliação do número de unidades formadoras de colônias (ufc) sob meio seletivo (Pérombelon et al., 1987). A indução dos sintomas em tubérculos, também tem sido realizada sob diferentes formas de incubação em ambiente aeróbico ou anaeróbico sob temperatura diferenciada (Bdliya, 1995).
2.4.2 Aspectos gerais sobre sorologia
A estrutura antigênica de uma bactéria consiste basicamente de componentes: capsular, o qual geralmente é constituído por polissacarídeos; flagelar, constituído por proteínas e somático, constituído por complexo lipoprotéico da membrana plasmática (Schaad, 1979).
O lipopolissacarídeo (LPS) é o maior determinante antigênico das bactérias gram negativas, pois é abundante em
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antígenos O, utilizado para determinar o sorogrupo de Pectobacterium carotovorum, bem como de outras fitobactérias. Antissoros produzidos com base no LPS, são usados para a diagnose e detecção dos agentes causais da canela preta e podridão mole em tubérculos de batata (De Boer & McNaughton, 1987).
Um fator importante que determina a qualidade e especificidade do antissoro, é a origem e a saúde do animal utilizado para produzi-lo (Pérombelon et al., 1998). Antissoros mais específicos podem ser obtidos com células fixadas pelo calor, com formolaldeído ou glutaraldeído (Schaad, 1979; Clark, 1981). Além disso, a extração do polissacarídeo da célula bacteriana pode eliminar as reações cruzadas (Schaad, 1979). Estudo realizado por Berquist & Elrod, 1948, citado por Schaad, 1979, possibilitou diferenciar Agrobacterium tumefaciens de A. radiobacter, A. rubi e A. rhizogenes, através da preparação de antígeno tratado a 100 oC por 1 h, ou com etanol absoluto, para obtenção do antígeno somático O.
Processos de obtenção e purificação da imunoglobulina também influenciam para melhor resultado nos métodos sorológicos. A purificação da IgG do soro geralmente é feita através de precipitação com sulfato de amônio ou sulfato de sódio, seguida por diálise em tampão fosfato. Também pode ser realizada por filtração em coluna de celulose para remoção de contaminantes e lipoproteínas. Esse procedimento aumenta a eficiência dos processos de conjugação com as enzimas. A fosfatase alcalina e a peroxidase são enzimas mais utilizadas em processos de conjugação da IgG. Os procedimentos para conjugação são relativamente fáceis, exigindo a presença de glutaraldeído que auxilia na polimerização formando o acoplamento da enzima a IgG (Clark & Adams, 1981).
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Os antissoros monoclonais são produzidos com base em características específicas da bactéria. Dessa forma, o antissoro é específico para um único epitopo (Stead apud Duncan & Torrance, 1992). A maioria dos processos para obtenção de antissoros monoclonais envolve a imunização, fusão celular, seleção de híbrido, clonagem, expansão, obtenção e purificação do antissoro (Itano, apud, Almeida & Lima, 2001). Os antissoros monoclonais apresentam vantagem sobre os policlonais, pois reagem com único epitopo, conferindo maior especificidade para detecção do patógeno (De Boer & McNaughton, 1987).
2.4.3 Métodos sorológicos
Métodos sorológicos como os de aglutinação para identificação de bactérias fitopatogênicas tornaram-se populares a partir 1930 (Schaad, 1979). Até o momento, os métodos sorológicos mais comuns para detecção e identificação de pectobactérias são: métodos de aglutinação (Graham 1963; Schaad, 1979), dupla difusão em ágar (Vruggink & Maas-Geesteranus, 1975; Allan & Kelman, 1977), imunofluorescência, (Phillips & Kelman, 1982; Vuurd et al., 1998) ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Cother & Vruggink, 1980; Gorris et al., 1994; López et al., 1997; Fraaije et al., 1997) e separação imunomagnética em meio cristal violeta IMS-CVP (van der Wolf et al., 1996). A eficiência da maioria desses testes, em tubérculos de batata-semente, é dependente do sorogrupo da bactéria, quando um único antissoro é utilizado (De Boer et al., 1979). Igualmente, a qualidade e especificidade do antissoro utilizado, também são importantes para a efetividade dos métodos (Bdliya, 1995; Fraaije et al., 1997).
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Reações cruzadas entre as subespécies, Pca e Pcc, são verificadas mediante uso de antissoros policlonais, devido à presença de antígeno flagelar comum em ambas as subespécies. Outras bactérias pectolíticas presentes nos tubérculos ou saprófitas do solo, também podem interferir nos testes sorológicos produzindo reações falso-positivas em vários testes (van der Wolf & Gussenhoven, 1992; van der Wolf et al, 1993). Essas reações são maiores quando o antissoro é produzido com células vivas (Schaad 1979; Jones et al., 1993). Por isso, especificidade de antissoros policlonais para Pca tende ser menor devido a relação sorológica entre as subespécies (Pérombelon et al.; 1998).
De Boer et al. (1979) identificaram mais de nove sorogrupos de Pca baseados na superfície antigênica dentre dezoito sorogrupos de Pectobacterium. Noventa por cento dos isolados na maioria dos países pertencem ao sorogrupo I. Conforme De Boer & Kelman apud Schaad (2001), mais de cinqüenta sorogrupos do grupo carotovorum são descritos até o momento e estima-se que um terço das estirpes isoladas de batata podem ser classificadas nesses sorogrupos. Por outro lado, a diversidade sorológica de estirpes isoladas de outros hospedeiros não é bem conhecida.
O método sorológico ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) vem sendo usado para identificação e detecção de fitopatógenos, com diferentes graus de sensibilidade, (Cother & Vruggink, 1980; van Vuurde & Roozen, 1990; van der Wolf et al., 1994; Gorris et al., 1994; Hyman et al., 1995; Fraaije et al., 1996; Singh et al., 2000; De Boer, 2002) porém, não permite distinção entre células vivas e mortas (Cother & Vruggink, 1990). ELISA é mais utilizado para identificar bactérias e menos comum para quantificação
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da população bacteriana (Jones et al., 1993). Esse método registra a ocorrência do complexo antígeno-anticorpo, através de rápida reação enzimática que o transforma em produto colorido (Chitarra, 2001). A enzima é previamente conjugada com a imunoglobulina, e a adição do substrato nesse complexo produz coloração, que é medida pelo espectrofotômetro sob forma de absorbância com filtro adequado para cor produzida para cada substrato. A intensidade da coloração identifica a presença ou ausência do complexo antígeno-anticorpo (Almeida & Lima, 2001). A especificidade do método depende de tipo do antissoro (monoclonal ou policlonal) e da forma de teste (direto ou indireto). O limite de detecção para Pca nessas variações é em torno de 106 ufc por mL de extrato de pele de batata, e 104 a 105 para Pch, pelo uso de anticorpos policlonais (Hyman & Pérombelon, 1990; Bdliya, 1995). Esse limite está acima do observado para desenvolvimento da canela preta que é de 102 a 103 ufc mL-1 (Bain et al., 1990). A sensibilidade do método pode ser intensificada pelo uso de anticorpos específicos e ainda em alguns casos, pelo tratamento prévio do antígeno através de aquecimento, para o mesmo aderir-se melhor a placa de microtitulação (Bdliya, 1995). A principal vantagem do método ELISA para detecção de bactéria fitopatogênica é a rapidez, comparada com outros métodos de detecção. Sendo por isso, recomendado em diagnoses rotineiras de grande número de amostras (Chitarra, 2001).
De acordo com De Boer (2002) o método sorológico ELISA, é considerado razoável para detecção de pectobacterias a partir de extratos de batata, desde que a amostra seja enriquecida previamente. Dessa forma, o limite de detecção pode atingir o limiar
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observado para o desenvolvimento da doença, sendo considerado efetivo em programas de certificação de sementes.
2.4.2 Métodos moleculares
Através da biologia molecular é possível caracterizar e identificar seguramente, vários patógenos de plantas. A análise baseada no DNA proporciona uma resposta confiável para detecção de patógenos e também possibilita identificar relações genéticas entre indivíduos de uma determinada população, indicando níveis sistemáticos, taxonômicos ou filogenéticos (Louws et al., 1999).
Dentre os métodos moleculares para detecção de fitobactérias, destaca-se a PCR (reação em cadeia da polimerase) que baseia-se na amplificação de determinada seqüência alvo de DNA do microrganismo. Esse método reflete em sensibilidade, especificidade e rapidez, satisfazendo assim os requisitos principais para detecção, identificação e diferenciação de espécies e subespécies de patógenos de plantas. Outra vantagem é detecção do agente causal da doença, diretamente no tecido vegetal (Louws et al., 1999).
A especificidade da técnica é baseada no desenvolvimento de oligonucleotídeos iniciadores específicos produzidos a partir de uma seqüência alvo de DNA conhecido geralmente relacionados a genes de patogenicidade. A reação da PCR consiste em etapas cíclicas de desnaturação da fita de DNA, anelamento dos oligonucleotídeos, extensão da fita de DNA e amplificação mediante ação da enzima DNA polimerase (Vivian, apud Duncan & Torrance, 1992; Louws et al., 1999).
A detecção de espécies de Pectobacterium baseia-se em oligonucleotídeos que amplificam o gene pectato liase (pel)
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responsável pela degeneração dos tecidos vegetais. Estes produzem fragmentos de 434 pares de bases, (pb) os quais também são utilizados para identificação de estirpes de P. chrysanthemi (van der Bulk, 1997; Louws et al., 1999).
Vários marcadores moleculares têm sido utilizados para caracterização de bactérias do gênero Pectobacterium entre eles: RAPD-PCR (random amplified polymorphic – polymerase chain reaction - DNA) (Toth et al., 1999; Hadas et al., 2001), RFLP-PCR (Restriction fragment lengh polymorphism) REP-PCR (repetitive extrgenic palindromic), ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus) Helias et al., 1998, Toth et al., 1999, Oliveira, 2001.
CAPÍTULO I
CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E MOLECULAR DE Pectobacterium sp. ISOLADA DE TUBÉRCULOS DE
BATATA-SEMENTE
Andréia I. Tumelero & Norimar D. Denardin Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária
Universidade de Passo Fundo
Caixa Postal 611, 99001-970 Passo Fundo, RS
RESUMO - A produtividade média brasileira de batata é considerada baixa, devido em grande parte, ao uso de batata-semente contaminada com vários agentes causais de doenças. Nesse sentido, esse estudo visou a avaliar a presença de Pectobacterium sp., agente causal da canela preta e podridão mole, em batata-semente, através de isolamento e caracterização dos isolados por meio de métodos bioquímicos e moleculares. Para tanto, avaliaram-se tubérculos- semente de sete cultivares oriundos de várias regiões produtoras, através incubação em câmara úmida sob condições aeróbias e semi-anaeróbias, e através de método de extração em solução salina e solução enriquecida. A caracterização molecular das estirpes foi realizada com oligonucleotídeos iniciadores Y1 e Y2 para o gene de pectato liase; Br1, Lr1A e Lr1G para Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum atípica (Pcca) e ECA 1f e ECA 2r para P. carotovorum subsp. atrosepticum (Pca). Isolaram-se 107 bactérias pectolíticas dos sete cultivares. Destes, 60 isolados foram
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caracterizados como Pectobacterium sp. através de métodos bioquímicos e confirmados mediante PCR com Y1 e Y2. A caracterização bioquímica indicou 53% de P. carotovorum subsp. carotovorum (Pcc), 23% de Pcca e 2% de P. chrysanthemi e 22% não identificados, entre essas subespécies. Outras bactérias pectolíticas também foram detectadas. A amplificação de DNA, mediante utilização de oligonucleotídeos iniciadores específicos para Pcca e Pca, apresentou bandas inespecíficas para as subespécies. Fragmentos únicos de 690 pb não foram verificados, indicando ausência de Pca entre as estirpes.
Palavras-chave: PCR, bactérias pectolíticas, detecção
BIOCHEMICAL AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF Pectobacterium sp. FROM SEED POTATO TUBERS SUMMARY - The Potato Brazilian average of productivity of potatoes is considered low largely due, to the use of potato seed contaminated by several causal agents of diseases. In that sense, that study aimed to evaluate the presence of Pectobacterium sp., causal agent of the blackleg and soft rot, in cultivars of seed potato, through the microbiological method, as well as to characterize the isolated by means of biochemical and molecular methods. A total of seed tubers were evaluated from different cultivars originated from several producing areas, through incubation in humid chamber under aerobic and semi-anaerobic conditions, and through the extraction method in saline and half enriched solution. The molecular characterization of the isolates was accomplished with primers Y1 and Y2 for the pectato gen; Br1, Lr1A and Lr1G for P. carotovorum subsp. carotovorum
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atípica (Pcca) and ECA 1f and ECA 2r for P. carotovorum subsp atrosepticum (Pca). Hunched seven pectolitic bacterias were isolated from different cultivars. Of these, sixty isolates were characterized as Pectobacterium sp. through biochemical methods and confirmed by means of PCR with Y1 and Y2. The biochemical characterization indicated 53% of P. carotovorum subsp carotovorum (Pcc), 23% of Pcca and 2% of P. chrysanthemi and 22% not identified among those subspecies. Other bacterias pectolytic were also detected. The amplification of DNA by means of the specific primers goes Pcca and Pca, presented non-specific bands unspecific goes the subspecies. Only fragments of 690 pb were not verified, indicating absence of Pca among the strains.
Key words: PCR, bacterias pectolytic, detection.
1 INTRODUÇÃO
A batata é considerada a quarta fonte de alimento, ultrapassada apenas pelo arroz, milho e trigo. É excelente fonte de proteína, vitaminas e sais minerais (EPAGRI, 2002).
A produtividade média brasileira é considerada baixa comparada com outros países. Na maioria dos casos isso se deve ao uso de semente com baixa qualidade fitossanitária e a falta de manejo adequado. Vários patógenos, entre eles, bactérias, fungos e vírus são disseminados por sementes selecionadas pelo próprio agricultor. Na maioria das vezes os menores tubérculos são utilizados para plantio e estes apresentam probabilidades de contaminação.
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As principais doenças bacterianas na cultura são a murchadeira cujo agente causal é Ralstonia solanacearum e a canela-preta/talo-oco e podridão mole incitadas por Pectobacterium sp., ambas disseminadas principalmente por tubérculos semente (Lopes & Quezado-Soares, 1997). Para Pérombelon & Kelman, 1987, o desenvolvimento dos sintomas causados por Pectobacterium sp., dependem de condições favoráveis de umidade e temperatura. Um número de 102 ufc é o suficiente para o desenvolvimento de lesões. O período para o desenvolvimento de podridões depende da ação da temperatura. Sob temperaturas menores que 30 oC e em condições aeróbicas é necessário número maior, entre 106 e 107 ufc. Segundo Pérombelon & Kelman (1980) a concentração inicial de bactérias para iniciar lesões, diminui com o aumento da temperatura.
A detecção de Pectobacterium sp. em tubérculos de batata é feita através de métodos baseados na indução dos sintomas, isolamento em meio seletivo e testes fisiológicos e bioquímicos para a identificação de espécies e subespécies, no entanto estes testes são de difícil interpretação para análises rotineiras (Schaad, 1979). Métodos sorológicos e moleculares também têm sido efetuados para detecção a partir de extratos vegetais. Entre os métodos moleculares mais utilizados destaca-se a PCR (Polymerase Chain Reaction), que é baseada na amplificação de várias cópias de uma seqüência específica de DNA, através de reação enzimática. Oligonucleotídeos que amplificam genes de enzimas pectolíticas são utilizados para identificação de espécies de Pectobacterium.
Nesse sentido, esse estudo teve como objetivo avaliar métodos de extração, para detectar presença de pectobactérias em estado de latência, em tubérculos de batata-semente básicas, bem
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como caracterizar os isolados do gênero através de métodos bioquímicos e moleculares.
2 MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi conduzido no Laboratório de Fitobacteriologia da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Passo Fundo, no período de março de 2001 a março de 2003.
2. 1 Tubérculos de batata-semente utilizadas no estudo Os cultivares utilizados neste experimento foram oriundos dos seguintes municípios:
Empresas Município Cultivar
Café Bom Jesus Bom Jesus Asterix
Monalisa Embrapa Clima Temperado Pelotas Baronesa Monte Bonito Macaca Embrapa SNT Canoinhas (SC) Monalisa
Bocche Ibiraiaras Monalisa
Baronesa Cooperativa Silveira Martins Monalisa Asterix Macaca Araucária
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2.2 Isolamento de Pectobacterium de tubérculos de batata-semente 2.1.1 Soluções de extração das bactérias
Nesse estudo foram utilizadas duas soluções para extração das bactérias, solução fisiológica a 0,85% e meio líquido enriquecido com polipectato de cálcio (Sigma). As amostras constituíram de 10 tubérculos, totalizando 20 tubérculos de cada cultivar, para cada tratamento, sendo que destes foram retirados uma camada de aproximadamente 2 mm de espessura. O peso de cada amostra, em média, foi de 50 g para 550 mL das soluções de extração, as quais foram divididas em dois erlemeyers para incubação a 20 oC sob agitação a 150 rpm durante 24 horas.
Para cada solução de extração foram realizadas Diluições sucessivas até 10-8 sendo 100 µL das diluições 10-4, 10 -5, 10-6, 10-7, e 10-8 semeados em meio de cultura cristal violeta de pectato – CVP (Cuppels & Kelman, 1974). Seis placas de cada diluição foram preparadas, sendo três incubadas a 28 oC e três a 37 oC. Colônias que formaram cavidade em CVP, suspeitas de Pectobacterium, foram transferidas para meio de cultura 523 de Kado & Heskett (1970) e submetidas a testes bioquímicos para caracterização da espécie e subespécie.
Os dados das médias foram analisados e expressos em unidades formadoras de colônias (ufc).
2.2.2 Isolamento de Pectobacterium por meio de câmara úmida e incubação
A amostra constituiu de 30 tubérculos de cada cultivar, sendo dividida em sub-amostras de dez tubérculos por avaliação. Para tanto, os tubérculos semente foram lavados em água corrente para
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retirar o excesso de terra. Em cada tubérculo foram feitos ferimentos nas lenticelas com palitos de madeira esterilizados. Cada sub-amostra foi colocada em câmara úmida e submetida a incubação durante seis dias a temperatura de 28 oC. O delineamento experimental constou de blocos inteiramente casualizados com três repetições. As avaliações foram realizadas diariamente através de incidência de tubérculos com maceração típica de podridão mole. Os dados das médias foram analisados e expressos em percentagem. O isolamento das bactérias foi realizado através da inoculação de amostra do tecido macerado em meio de cultura 523 de Kado e as colônias típicas de pectobactérias foram colocadas em frutos de pimentão e batata para verificação de maceração, as quais após foram submetidas a testes bioquímicos para identificação da espécie e/ousubespécie.
Outro método de detecção foi realizado mediante incubação em ambiente semi-anaeróbico. Amostras foram preparadas e avaliadas conforme descrito anteriormente, somente adicionou-se óleo de soja sobre os tubérculos, para proporcionar ambiente semi-anaeróbio.
2.3 Caracterização bioquímica das bactérias isoladas A identificação dos isolados suspeitos de Pectobacterium foi realizada através de testes de maceração em batata e em frutos de pimentão verde e também através da determinação do metabolismo oxidativo/fermentativo (peptona 2,0 g; NaCl 5,0 g; K2HPO4 0,3 g; azul de bromotimol 0,03 g; ágar 3,0 g e água destilada 1,000 mL). Os isolados foram submetidos à temperatura de 37oC, a qual restringe o crescimento de Pca.
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Na diferenciação das subespécies, foram realizados testes bioquímicos para determinação da fonte de carbono. Os açucares utilizados foram: α-metil glucosídeo, lactose, maltose, glicose e sacarose (Schaad, 1988).
Os isolados caracterizados no gênero foram preservados em gel de goma xantana 1%, acrescido de polivinilpirrolidona 1,5% e armazenados em temperatura em torno de 4 oC (Tumelero & Denardin, 2001).
As estirpes de referência 424-IB, 1383-IB e 1131-IB também foram incluídas nestes testes para padrões das reações.
2.4 Caracterização molecular de Pectobacterium isolados de tubérculos de batata-semente
Os isolados, caracterizados como Pectobacterium (Hauben, et al., 1999) conforme metodologia de Schaad, 1988, foram submetidos à análise molecular através da PCR, para identificação das subespécies. As bactérias 1819-IBSBF-Pca (UK), 424-IBSBF-Pca, 1131-IBSBF-Pcc, 863-IBSBF-Pcc (Denmark), 1383-IBSBF-Pch, 1814-IBSBF-Pco (France) e 1692-IBSBF-Pcca (Brazil), oriundas do Instituto Biológico de Campinas, foram utilizadas neste estudo para os padrões das reações.
2.4.1 Extração de DNA
Os isolados de Pectobacterium sp., preservados em goma xantana (1%) + polivinilpirrolidona (1,5%), e as bactérias tipo do Instituto Biológico foram cultivadas em meio de cultura 523 de kado durante 24-48 horas. Após as células foram suspensas em tampão de extração TE8 (50 mM Tris, pH 8, 20 mM EDTA) e submetidas a
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centrifugação a 13.000 rpm por 5 min. O sobrenadante foi retirado e as células foram ressuspensas no mesmo tampão e submetidas a 70 oC durante 15 min. Após atingir a temperatura ambiente, adicionou-se proteinase K e sarkosil (10%), seguido por incubação a 50 oC por 15 min. Após adicionou-se igual volume de fenol-clorofórmio (50:50) e submetido a centrifugação por 15 min a 13.000 rpm. O DNA foi coletado, em tubo novo e precipitado com clorofórmio-álcool isoamílico (24:1), mediante centrifugação a 13.000 rpm por 15 min. Após adicionou-se etanol 70% para lavagem e ressuspenso em água milique (Boucher, 1987).
2.4.2 Oligonucleotídeos iniciadores utilizados no estudo Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados para o gene pel usados para identificação do gênero foram: Y1 (5’-TTA CCG GAC GCC GAG CTG TGG CGT-3’) e Y2 (5’-CAG GAA GAT GTC GTT ATC GCG AGT-3’). Os ciclos usados na PCR foram: 94 oC/10 min (94 oC/60 s, 67oC/60 s, 72 oC/30 s) 25X, 72 oC/10 min e 4 oC durante vinte minutos (Darrasse et. al., 1994).
Para Pectobacterium carotovorum subsp. atrosepticum os oligonucleotídeos iniciadores utilizados foram: ECA1f (5’-CGG CAT CAT AAA AAC ACG-3’) e ECA2r (5’-GCA CAC TTC ATC CAG CGA-3’), os quais produzem um fragmento de 690 pb. A amplificação do DNA foi realizada através dos seguintes ciclos: 94 oC/4 min (94 oC/45 s, 63 oC/45 s, 72 oC/45 s) 35X, 72 oC/4 min e 4 oC para a finalização (De Boer & Ward, 1995).
Também foram utilizados oligonucleotídeos iniciadores específicos para Pcca Br1f (5’-GCG TGC CGG GTT TAT GAC CT-3’) e Lr1A (5’-CAA GGC ATC CAC CGT-CT-3’) e Lr1G (5’-CAG
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GGC ATC CAC CGT-3’). A amplificação do DNA foi realizada seguindo: 94 oC/2 min (94 oC/45 s, 62 oC/45 s, 72 oC/90 s) 25X, 72 oC/10 min e 4 oC para a finalização (Duarte, et al., 2002).
Cada reação de PCR foi formada com 10 µL, contendo: Tampão de PCR (10 X), 1 µM de cada oligonucleotídeo, exceto Lr1A e Lr1G para Pcca que a concentração foi de 0,5 µM de cada oligonucleotídeo; 2 mM de MgCl2, 0,1 mM de dNTPs, 0,5 U Taq DNA polimerase, (Gibco/BRL) 1 µL do DNA a ser analisado e água ultrapura para diluição dos reagentes em suas respectivas concentrações. A amplificação do DNA foi realizada em termociclador Minicycler TM MJ Research.
A eletroforese foi realizada em gel de agarose 1,5% em TBE Tris-HCL, Ácido Bórico e EDTA 0,5 M e corado com brometo de etídio. O resultado da amplificação foi visualizado em um transluminador usando luz UV e as fotos foram registradas com máquina fotográfica, com filtro para UV.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Isolamento de Pectobacterium sp. de tubérculos de batata- semente
Dos 1050 tubérculos, 570 foram avaliados através do método de incubação, e destes, 136 apresentaram maceração.
Por meio de diluição e plaqueamento em CVP, e dos tubérculos macerados, isolaram-se 107 bactérias pectolíticas. No entanto, Pectobacterium sp. foram detectadas em sementes oriundas de três municípios, Ibiraiaras, Pelotas e Bom Jesus, através de soluções de extração e plaqueamento em meio seletivo CVP (Tabela 1
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e 2). Nos demais lotes analisados, foram detectados outras bactérias pectolíticas. Conforme Pérombelon et al. (1979), é comum a presença de outras bactérias pectolíticas, além de Pectobacterium sp. em lenticelas de tubérculos de batata. Os gêneros comumente isolados são: Bacillus, Flavobacterium, Pseudomonas e Clostridium sp. Sendo assim, Campos, 1982 também verificou a presença de Clostridium em tubérculos avaliados, durante o armazenamento. A incidência da bactéria foi de 83%, contrastando com 13% de Pca e 39% de Pcc.
Em relação à incidência de podridão mole em tubérculos verificou-se maior percentagem de tubérculos macerados quando os mesmos foram incubados em ambiente semi-anaeróbico (Tabela 1), principalmente nos cultivares Monalisa e Asterix, oriundos de Bom Jesus e Baronesa provenientes de Ibiraiaras. Vários autores relatam que a podridão mole pode ser mais intensa, sob condições de anaerobiose. A baixa concentração de oxigênio, contribui para um decréscimo na resistência do tubérculo, favorecendo a ação de bactérias pectolíticas (De Boer & Kelman, 1978). O desenvolvimento de pectobactérias é maior em condições aeróbicas do que anaeróbicas Pérombelon & Lowe (1975).
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Tabela 1. Presença de bactérias pectolíticas em cultivares de batata-semente básicas
Resultados semelhantes aos encontrados no presente estudo, também foram verificados por Benelli, 2002. que constataram a presença de pectobactérias nos cultivares Asterix, Baronesa, Monalisa e Achat, das mesmas regiões. A contaminação de sementes no Canadá, segundo De Boer, 2002 varia conforme a classe da semente, sendo que para sementes de segunda geração, a incidência verificada foi de 9%, contrastando com 30% para sementes de sétima geração, confirmando que a bactéria é transmitida para tubérculos-progênie.
Conforme a Tabela 1, nos cultivares provenientes de Silveira Martins, não foi detectada a presença de bactérias pectolíticas, mediante os métodos testados. Comparando-se os diferentes métodos
Percentagem de tubérculos macerados UFC/grama de pele de tubérculo em meio CVP
Método
A B C D
Município Cultivar Incidência Incidência 28 oC 37 oC 28 oC 37 oC
Monalisa 6,6% 26% 1,5 x 10 9 1,6 x 10 11 1,5 x 10 10 2,5 x 10 11 Bom Jesus Asterix 10% 26% 1 x 10 9 1,3 x 10 9 1,1 x 10 9 1,3 x 10 9 Ibiraiaras Monalisa 15% ND 0 0 0 0 Baronesa 6,6% 16% 9,3 x 10 8 1,5 x 10 9 3 x 10 8 8 x 10 8 Macaca 30% ND 0 0 0 0 Baronesa 5% ND 1 x 10 9 1,4 x 10 9 6 x 10 8 9,3 x 10 8 Pelotas Monte Bonito 20% ND 0 0 0 0 Canoinhas Monalisa 20% ND 0 0 0 0 Monalisa 0 0 0 0 0 0 Asterix 0 0 0 0 0 0 Macaca 0 0 0 0 0 0 Silveira Martins Araucária 0 0 0 0 0 0
Método A = Incubação em câmara úmida durante seis dias
Método B = Incubação em câmara úmida em ambiente semi-anaeróbico com óleo vegetal durante seis dias Método C = Incubação de camada de tubérculos em solução fisiológica durante 24 h
Método D = Incubação de camada de tubérculos em meio líquido enriquecido durante 24 h ND = Não determinado
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utilizados para isolamento de pectobactérias a partir de tubérculos semente, considera-se como efetivo o método que utiliza soluções de extração e plaqueamento em meio seletivo cristal violeta de pectato-CVP, pois o isolamento da bactéria pectolítica é facilitado devido à hidrólise do polipectato de cálcio que induz à formação de uma cavidade típica no meio de cultura. Embora trabalhoso, permite estimar o número aproximado de unidades formadoras de colônias. No entanto, a presença de saprófitas pode inibir a formação dessa cavidade. Para vários autores o isolamento de baixas concentrações de pectobactérias a partir de tecidos vegetais ou do solo é facilitado mediante uso de meios de enriquecimento (Pérombelon, 1971; Cuppels & Kelman, 1974; Burr & Schroth, 1977; Pérombelon et al., 1998). Da mesma forma, a utilização de meio seletivo e temperatura diferenciada de incubação podem favorecer o desenvolvimento dessas bactérias. O meio CVP, é dos mais efetivos para isolamento, e associado a temperatura diferenciada de incubação, pode selecionar a subespécie presente (Pérombelon & Hyman, 1986; De Boer & Kelman citado por Schaad, 2001). Sendo assim, Pérombelon & Hyman, 1986, relatam que Pch, não forma cavidades a 27 oC, ao contrário de Pca. Já temperatura em torno de 37 oC favorece tanto o desenvolvimento de Pcc, como Pch. Contudo, a formação da cavidade está diretamente relacionada à quantidade de enzima pectolítica produzida pela bactéria (Pérombelon & Hyman, 1986).
Em relação à temperatura de 28 oC e 37 oC para incubação não foram observadas diferenças na formação de cavidades sobre o meio CVP, ou seja, não houve diferença no número de unidades formadoras de colônias. Da mesma forma, uso de solução de extração e meio enriquecido não influenciaram no número de unidades
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formadoras de colônias (Tabela 1), sugerindo que se o tubérculo estiver contaminado, a bactéria se desenvolverá, independente do meio ser enriquecido ou não. Jones et al., 1994, citado por Pérombelon et al., 1998 afirmam que há probabilidade de 90% para detectar um tubérculo contaminado em amostras de 5, 10 e 22 tubérculos, quando o nível de infecção é de 37, 20 e 10% respectivamente.
O processo de isolamento de pectobactérias a partir de tubérculos incubados em câmara úmida, foi dificultado pela metodologia utilizada, pois nem sempre foi verificada maceração típica de pectobacterias. Da mesma forma, as características culturais sobre o meio 523 de Kado, e maceração em frutos de pimentão verde ou batata, nem sempre foram observadas. A utilização de um meio de cultura seletivo poderia facilitar este processo. Conforme Kelman & Dickey, citado por Saettler el al., 1989, o meio de cultura casoamino acids hydrolizate peptone glucose-CPG proporciona a diferenciação das colônias de pectobactérias com 24 a 48 h de incubação. O processo é facilitado pelo uso de lupa com iluminação oblíqua, pois as colônias mostram-se pequenas e com coloração semelhante a cor gelo. Dessa forma é possível distinguir Pectobacterium sp. de Pseudomonas sp. e outras bactérias saprófitas comuns no solo. Igualmente, a adição de 2, 3, 5 cloreto de trifenil tetrazolium sob o meio CPG, auxilia na diferenciação das colônias de pectobacterias. Outro meio de cultura que auxilia no processo de isolamento de pectobactérias é o meio B de King. Nesse meio, as colônias apresentam-se com bordos irregulares e com brilho opaco, diferente de algumas espécies de Pseudomonas pectolíticas, que produzem um pigmento fluorescente. (Fraaije et al., 1996)
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Fraaije et al. (1997) obtiveram concentrações entre 104 e 105 ufc mL-1 mediante diluição e plaqueamento em meio CVP, comparado com concentrações de 104 para ELISA e 107 a 108 para PCR. No entanto, após o enriquecimento dos extratos de pele, a concentração detectada diminuiu para 10 ufc mL-1 para PCR e imunofluorescência e para 102 ufc mL-1 com diluição e plaqueamento. No presente estudo, concentrações em torno de 108 a 1011 ufc mL-1 foram detectadas (Tabela 1). Resultados semelhantes foram encontrados por Robinson & Foster, 1987, que detectaram concentrações na faixa de 107 ufc em tubérculos semente.
3.2 Caracterização bioquímica das bactérias isoladas Dos 107 isolados, 60 pertenciam ao gênero Pectobacterium, sendo que 53% foram identificados como Pcc, 23% como Pcca, 2% como Pch, e desses, 22% não se enquadraram em nenhuma subespécie do gênero (Tabela 2). Tais isolados não foram identificados, sendo classificados como intermediários, ou seja, com características bioquímicas comuns, como por exemplo, alguns isolados utilizavam sacarose como fonte de carbono e não utilizavam os demais açúcares ou seja, maltose, glicose e lactose. Deve-se levar em consideração que a identificação das subespécies varia de acordo com a fonte de carbono metabolizada, além de outras características bioquímicas e fisiológicas Schaad (1988) (Tabela 3). Dessa maneira, Pca utiliza lactose e produz reações variáveis para maltose. Pcc também metaboliza a lactose e pode ou não utilizar a glicose. Já Pch utiliza a glicose e produz reação variável para a lactose, enquanto Pcca utiliza todas as fontes de carbono citadas. (Tabela 3) Vários autores isolaram pectobactérias com características de Pca e Pcc (Thomson et
