MF-0406.R-3 - MÉTODO DE DETERMNAÇÃO DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS FORMADORAS DE COLÔNIAS, PELA TÉCNICA “POUR PLATE
Notas:
Aprovado pelo Deliberação CECA nº 3 965, de 16 de janeiro de 2001, Publicada no DOERJ de 23 de janeiro de 2001.
1 OBJETIVO
Definir o método de determinação de bactérias heterotróficas formadoras de colônias existentes em amostras de águas, pela técnica "Pour Plate".
2 DOCUMENTO DE REFERÊNCIA
MN.707 - MANUAL DE AMOSTRAGEM DE QUALIDADE DE ÁGUA.
3 DEFINIÇÃO
Para efeito deste método adota-se a seguinte definição:
Bactérias Heterotróficas - são as bactérias que, além do dióxido de carbono (CO2), necessitam de um ou mais compostos orgânicos para a síntese de seu protoplasto.
4 RESUMO DA TÉCNICA
Consiste na adição do meio de cultura em estado líquido e estabilizado à temperatura de 45 (±1) ºC ao inóculo da amostra.
Volumes decimais adequados da amostra são inoculados em placas de Petri, em duplicatas, adicionando-se a seguir o meio de cultura agar triptona glicose extrato de levedura, previamente fundido e sua temperatura normalizada de 44 a 46 ºC. Após determinado período de incubação é feita a contagem das colônias (expressas em unidades formadoras de colônias), utilizando-se um contador de colônias tipo Quebec.
5 PRINCÍPIO DO MÉTODO
As bactérias podem, sob determinadas condições de nutrição, temperatura e tempo de incubação, se desenvolver formando colônias que serão visualizadas em uma placa de Petri contendo meio de cultura adequado com agar.
6 APLICABILIDADE
Aplicável na avaliação das condições higiênicas das águas potáveis e de piscinas e da eficiência de estações de tratamento de água na remoção de bactérias.
7 INTERFERÊNCIAS
Para evitar interferências, a amostra deve ser coletada de acordo com o MN-707.
O cloro residual presente na amostra pode levar a resultados falsos devendo ser neutralizado no momento da coleta. A temperatura da amostragem e o tempo decorrido entre a coleta e a análise também podem interferir nos resultados. A temperatura da amostra deve ser mantida entre 4 e 10 ºC até o início da análise, que deverá ocorrer no prazo máximo de 30 horas, preferencialmente dentro de 8 horas.
8 APARELHAGEM E MATERIAL
8.1 Os equipamentos e a vidraria necessários para a realização dos testes consistem de:
Autoclave
Incubadora bacteriológica regulada para 35 ± 0,5 ºC Balança com precisão de 0,1 mg
Medidor de pH
Contador de colônias, tipo Quebec Banho-maria regulado para 44 a 46 °C Placas de Petri
Frascos para água de diluição
Pipetas bacteriológicas tipo Mohr de 5 e 10 mL Tubos de ensaio
Estante para tubos de ensaio Bucha de algodão
8.2 Todo material que entre em contato com a amostra deve ser quimicamente inerte, preferencialmente de vidro.
8.3 Todo o material deve ser esterilizado a seco, antes do uso.
9 REAGENTES E SOLUÇÕES 9.1 ÁGUA DESTILADA ESTÉRIL
Água destilada autoclavada
9.2 SOLUÇÃO DE HIDRÓXIDO DE SÓDIO 1 N
Pesar 40 g de hidróxido de sódio (NaOH) p.a, dissolver em pequena quantidade de água destilada estéril, transferir para balão volumétrico e completar o volume a 1000 ml. Guardar em frasco apropriado.
9.3 MEIO DE CULTURA AGAR TRIPTONA GLICOSE EXTRATO DE LEVEDURA (PLATE COUNT AGAR)
Poderá ser utilizado o meio de cultura pronto, encontrado no comércio sob a forma de pó desidratado, ou então preparado no laboratório a partir dos ingredientes básicos.
Pesar e transferir para béquer de 2 litros os seguintes sais: 23,5 g do meio desidratado pronto ou pesar 5,0 g de triptona; 2,5 g de extrato de levedura;
1,0 g de glicose; e 15,0 g de agar.
Acrescentar 1 000 mL de água destilada fria, deixando em repouso durante aproximadamente 15 minutos. Aquecer agitando freqüentemente até completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. Se necessário, ajustar o pH com solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1N. Distribuir volumes de 15 mL em tubos de ensaio de tamanho adequado. Tampar com bucha de algodão recoberta com gaze e esterilizar em autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
9.4 SOLUÇÃO ESTOQUE A
Dissolver 34,0 g de fosfato monobásico de potássio (KH2PO4) p.a em 500 mL de água destilada estéril, ajustar o pH para 7,2(± 0,1) com solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1N e completar o volume para 1 000 mL com
água destilada estéril. Colocar em frascos adequados e guardar na geladeira.
9.5 SOLUÇÃO ESTOQUE B
Dissolver 81,1 g de cloreto de magnésio (MgCl2.6 H2O) p.a em 1 000 mL de água destilada estéril. Colocar em frascos adequados e guardar na geladeira.
9.6 ÁGUA DE DILUIÇÃO FOSFATADA
Pipetar 1,25 mL da solução estoque A e 5,0 mL da solução estoque B e diluir em água destilada, completando o volume a 1 000 mL.
Distribuir em frascos de diluição quantidades que assegurem, após autoclavação a 121 ºC, durante 20 minutos, volume de 90 (±2) mL.
10 ENSAIOS
10.1 Antes de iniciar o trabalho, as bancadas devem ser desinfetadas com desinfetante que não deixe resíduo.
10.2 Preparar as placas de Petri em duplicatas para cada volume da amostra a ser inoculada e proceder as suas identificações com o número dado pelo laboratório.
10.3 Homogeneizar a amostra, no mínimo 25 vezes, agitando vigorosamente o frasco.
10.4 Preparar diluições da amostra em água de diluição fosfatada.
10.5 Com uma pipeta estéril de 1 mL e com os cuidados de assepsia, transferir 1 mL da amostra e das diluições, em duplicatas, para as placas de Petri correspondentes.
10.6 Após inoculação de todos os volumes requeridos da amostra e diluições, e no espaço de tempo inferior a 20 minutos, entreabrir cada placa e acrescentar 15 mL do agar triptona glicose extrato de levedura, previamente fundido e estabilizado em banho-maria (44 a 46 ºC), tendo o cuidado de flambar a boca do tubo antes de verter o meio às placas.
10.7 Homogeneizar o inóculo com o meio contido na placa, com movimentos circulares moderados, para evitar a projeção do conteúdo para fora da placa.
10.8 Após a solidificação do meio, incubar as placas a 35 (±0,5) ºC, em posição invertida, durante 48 (±3) horas. Para águas engarrafadas, as placas deverão ser incubadas, na mesma temperatura, por período de 72 (±4) horas.
10.9 Após a incubação, selecionar as placas em duplicatas que tenham entre 30 e 300 colônias e efetuar a contagem nessas placas com o auxílio de um contador de colônias tipo Quebec. Se todas as diluições apresentarem contagens inferiores a 30, contar as placas em duplicatas correspondentes à menor diluição.
11 RESULTADO
11.1 Calcular a média aritmética das contagens e multiplicar o resultado pela diluição utilizada nessas placas.
11.2 Se todas as placas de todas as diluições inoculadas tiverem mais de 300 colônias, considerar o resultado como maior que trezentos (> 300). Caso haja necessidade de contagem exata, solicitar nova amostra.
11.3 Se, porém, de todas as diluições inoculações, nenhuma placa apresentar colônia, considerar o resultado como menor que um (< 1) multiplicado pela diluição correspondente.
11.4 Expressar o resultado em unidades formadoras de colônias de bactérias heterotróficas por mililitro (u.f.c./mL).
12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
12.1 AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard methods for the examination of water and wastewater. 16th. ed., Washington, D.C., 1985. 12.2 U.S.A. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. Microbiological
methods for monitoring the environment. Water and wastes. EPA - 600/8 - 78017, Cincinnati, Dec. 1978.
