FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
CENTRO DE PESQUISAS GONÇALO MONIZ
FIOCRUZ
Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia em Saúde e Medicina Investigativa
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO IN BOLUS DA HEPARINA
SÓDICA NO REMODELAMENTO DE PARTÍCULAS
LIPOPROTÉICAS ASSOCIADAS AO TRANSPORTE REVERSO
DO COLESTEROL
JULLIANA STOLZE CONCEIÇÃO GÓES
Salvador – Bahia - Brasil 2015
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
CENTRO DE PESQUISAS GONÇALO MONIZ
Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia em Saúde e Medicina Investigativa
EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO IN BOLUS DA HEPARINA SÓDICA NO REMODELAMENTO DE PARTÍCULAS LIPOPROTÉICAS ASSOCIADAS AO
TRANSPORTE REVERSO DO COLESTEROL
JULLIANA STOLZE CONCEIÇÃO GÓES
Orientador: Ricardo David Couto
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia em Saúde e Medicina Investigativa para obtenção do grau de Mestre.
Salvador – Brasil 2015
Ficha Catalográfica elaborada pela Biblioteca do
Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz / FIOCRUZ - Salvador - Bahia.
Góes, Julliana Stolze Conceição
G598e Efeito da administração In Bolus da heparina sódica no remodelamento de partículas lipoprotéicas associadas ao transporte reverso do colesterol. / Julliana Stolze Conceição Góes.- Salvador, 2015.
92 f.; 30 cm
Orientador: Prof. Dr. Ricardo David Couto.
Dissertação (mestrado) – Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, 2015.
1. Lipoproteína Lipase 2. HDL 3. Doenças cardiovasculares 4. Proteínas I. Título CDU 616.1
“Não sabendo que era impossível, ele foi lá e fez.”
Aos amores da minha vida, meus pais: Janine e João, minha linda avó, Hildete, e minha família, que me ensina todos os dias o significado da palavra amor.
A minha mãe, Janine, por me fazer sempre acreditar, pela paciência, pela companhia nas madrugadas de estudo, pelo maior amor do mundo.
A meu pai, João, grande exemplo de determinação e incentivo aos estudos. Minha linda avó, Hildete, pelo sorriso diário e ensinamentos de vida.
Minha família, base de tudo, em especial minha tia, madrinha, Márcia pelas mensagens de força e coragem e meu tio José pelo exemplo profissional. Ao meu orientador, professor Ricardo David Couto, por acreditar em mim, pela paciência, confiança e ensinamentos; a quem devo todo o meu crescimento profissional.
Aos meus amigos, em especial Marcela Fraga e Vívian Galvão, pelo apoio. A equipe do setor de hemodinâmica do Hospital Ana Neri por toda atenção e carinho.
Aos pacientes que permitiram a realização do estudo.
Às Obras Sociais Irmã Dulce (laboratório), em especial Larissa Barbosa, e ao Hospital Ana Neri (laboratório), pelo apoio ao meu crescimento intelectual. Ao grupo de pesquisa em Dislipidemias da Faculdade de Farmácia da Bahia, especialmente Ana Paula Caires, pelos ensinamentos iniciais.
Ao grupo de Pesquisa do laboratório LETI, CpqGM/Fiocruz, principalmente Nanashara Carvalho, Gisele Leite e Cássio Meira, por todo apoio.
Ao Laboratório DILDA, em especial ao Prof. Ajax Atta, pela colaboração e a Mariana Menezes pela realização das dosagens das apolipoproteínas.
Ao Laboratório CLAB, representado pelo Dr. Clóvis Souza Filho, pelas determinações da haptoglobina.
A Ana Paula Munduruca pela ajuda na coleta das amostras.
Ao Laboratório de Bioquímica Clínica da Faculdade de Farmácia da Bahia. A biblioteca do CPqGM/Fiocruz, em especial a Ana Maria Fiscina, pela colaboração e carinho.
À FAPESB pelo auxílio financeiro.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse trabalho.
Cruz, Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz, Salvador, 2015.
RESUMO
Introdução: as doenças cardiovasculares acometem milhares de pessoas no
mundo. Destas, a doença arterosclerótica está entre as de maior morbimortalidade. Para a avaliação da necessidade de intervenções hemodinâmicas e/ou revascularização miocárdica, há a necessidade da realização do cateterismo (CATE), procedimento de imagem indicado para evidenciar pontos de obstrução e determinar a melhor estratégia cirúrgica. Para a realização do CATE utiliza-se heparina sódica (5000 UI) in bolus. Atualmente, sabe-se que a heparina interfere no remodelamento de partículas lipoproteicas por liberação da lipoproteína lipase (LPL) e da lipase hepática (LH), essa ação pode alterar o transporte reverso do colesterol (TRC), em função de modificações no metabolismo das lipoproteínas. Métodos: foram selecionados por conveniência 20 pacientes, 10 do sexo masculino e 10 do sexo feminino, ambos os sexos, entre 45 e 73 anos, admitidos no Hospital Ana Neri, submetidos à cineangiocoronariografia (CATE). Todas as determinações laboratoriais foram realizadas antes e depois do CATE. Resultados: houve aumento significativo da atividade da lipase e diminuição da concentração dos triglicérides depois do CATE na análise geral e estratificada pelo sexo (p<0,05; Teste t pareado). A razão HDL-C/apoA aumentou significativamente depois do CATE, já a razão LDL-C/apoB não aumentou, nem diminuiu nas análises geral e estratificada por sexo. Enquanto a razão de risco cardiovascular TG/HDL-C diminuiu significativamente, a ApoB/apoA aumentou significativamente na análise geral e estratificada por sexo depois do CATE. As análises de correlações tiveram comportamentos diferentes, sendo a significância estatística encontrada dependente do grupo analisado (geral, masculino e feminino). A concentração do não-HDL-C, semelhante à determinação da haptoglobina, tiveram diminuição significativa na análise geral e no sexo masculino depois do CATE (p<0,05; Teste t pareado), o grupo feminino não mostrou significância. As taxas de incorporação de colesterol livre e fosfolípides não foram significativas depois do CATE. Conclusão: A administração in bolus de heparina sódica interfere no remodelamento de partículas lipoproteicas, sendo este fato evidenciado pelas variações das razões de risco, tais como, HDL-C/apoA, TG/HDL-C. O percentual de incorporação dos fosfolípides e colesterol livre na HDL mostrou-se influenciado em relação ao sexo, o que o torna relevante dado aos resultados encontrados. A utilização de razões de risco e ainda suas correlações mostraram-se melhores indicadores de desfecho sugestivo de doença cardiovascular nessa casuística do que quando avaliados apenas os marcadores séricos do perfil lipídico isoladamente.
Palavras–chave: Lipoproteína Lipase; Lipase Hepática; HDL; Doenças
Cruz, Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz, Salvador, 2015.
ABSTRACT
Introduction: cardiovascular diseases affect thousands of people worldwide.
Of these, the atherosclerotic disease is one of the most morbidity and mortality. To evaluate the need for hemodynamic interventions and / or CABG, the catheterization (CATE) is performed, an imaging procedure to evidence obstruction and to determine the best surgical strategy. To perform CATE, is necessary to use in bolus sodium heparin (5000 IU). Currently, it is known that heparin interferes with the remodeling of the lipoprotein particles by releasing lipoprotein lipase (LPL) and hepatic lipase (HL), this action may alter the reverse cholesterol transport (TRC), by changes in lipoprotein metabolism.
Methods: were selected by convenience 20 patients, 10 male and 10 female,
both gender, between 45 and 73 years old, admitted to the Hospital Ana Neri, who underwent coronary angiography (CATE). All laboratory measurements were performed before and after CATE. Results: were significant increase in lipase activity and decreased concentration of triglycerides after CATE, in the overall analysis and stratified by sex (p<0.05, paired t test). The HDL-C/apoA ratio increased significantly after CATE, since the LDL-C/apoB ratio has not increased or decreased in the general analysis, and stratified by gender. While TG/HDL-C cardiovascular risk ratio decreased significantly, ApoB/apoA increased significantly in the overall analysis, and stratified by sex after CATE. The correlation analysis had different behaviors, and the statistic significance found, were dependent of the group analyzed (generally male and female). The concentration of non-HDL-C, similar to the determination of haptoglobin, had a significant decrease in the overall analysis and in males after CATE (p<0.05, paired t-test), the female group do not show significance. The free cholesterol and phospholipids incorporation rates were not significant after the CATE.
Conclusion: The administration of in bolus sodium heparin interferes in
lipoprotein particles remodeling, by evidences from risk ratios variations, such as HDL-C/apoA, and TG/HDL-C. The percentage of phospholipids and free cholesterol incorporation in HDL shows sex influences, which makes it relevant to the obtained results. The use of hazard ratios and their correlations were better surrogate markers at these casuistic of cardiovascular disease than when serum markers of lipid profile were evaluated alone.
Keywords: Lipoprotein Lipase; Hepatic Lipase; HDL; Cardiovascular Diseases;
Figura 1 Obstrução na artéria coronária descendente anterior.
Cineangiocoronariografia Fonte:
http//www.einstein.com.br
20
Figura 2 Distribuição percentual dos pacientes participantes do estudo segundo a classificação das dislipidemias
41
Figura 3 Frequência dos fatores de risco para doença cardiovascular (DAC) nos 20 pacientes participantes do estudo
42
Figura 4 Avaliação da atividade da lipoproteína lipase antes e após a administração intra-arterial in bolus de heparina durante o CATE, nos 20 pacientes participantes do estudo
43
Figura 4.1 Avaliação da lipoproteína lipase antes e depois da administração intra-arterial in bolus de heparina durante a cineangiocoronariografia determinada por metodologia de química seca (Vitros 250), nos pacientes participantes do estudo, segundo sexo
43
Figura 5 Atividade da lipoproteína lipase e dos níveis séricos de triglicérides antes e depois da administração intra-arterial
in bolus de heparina durante a cineangiocoronariografia
nos 20 pacientes participantes do estudo
44
Figura 6 Análise da Razão HDL-C/apoA nos pacientes participantes do estudo antes e depois da administração intra-arterial in bolus de heparina durante a cineangiocoronariografia
44
Figura 7 Análise da Razão LDL-C/apoB nos pacientes participantes do estudo e separados por sexo, antes e depois da administração intra-arterial in bolus de heparina
45
Figura 8 Razão TG/HDL-C nos pacientes participantes do estudo, antes e depois da administração intra-arterial in bolus de heparina durante a cineangiocoronariografia
48
Figura 9 Análise de correlação linear entre razão TG/HDL-C e razão apoB/apoA antes e depois da administração intra-arterial in bolus de heparina durante a cineangiocoronariografia
46
Figura 9.1 Análise de correlação linear entre razão TG/HDL-C e razão apoB/apoA antes e depois da administração
Figura 10 Análise de correlação linear entre razão TG/HDL-C e VLDL-C (mg/dL) em todos os pacientes participantes do estudo, antes e depois da cineangiocoronariografia
47
Figura 10.1 Análise de correlação linear entre razão TG/HDL-C e VLDL-C (mg/dL) nos pacientes do sexo feminino, antes e depois da administração intra-arterial in bolus de heparina durante a cineangiocoronariografia
48
Figura 11 Razão apoB/apoA antes e depois da administração intra-arterial in bolus de heparina durante a cineangiocoronariografia de todos os pacientes participantes do estudo e segundo sexo
48
Figura 12 Correlação entre lipase e a razão HDL-C/apoA antes e depois da administração intra-arterial in bolus de heparina durante o cateterismo em todos os pacientes participantes do estudo
49
Figura 13 Correlação da lipase com a razão LDL-C/apoB antes e depois da administração intra-arterial in bolus de heparina durante a cateterismo em todos os pacientes participantes do estudo
50
Figura 13.1 Correlação da enzima lipoproteína lipase com a razão LDL-C/apoB antes e após a administração intra-arterial in
bolus de heparina durante a cineangiocoronariografia nos
pacientes do sexo masculino
50
Figura 13.2 Correlação da lipase com a razão LDL-C/apoB antes e depois da administração intra-arterial in bolus de heparina durante a cineangiocoronariografia nos pacientes do sexo feminino
51
Figura 14 Análise de percentual de incorporação de fosfolípides (PL14C) na HDL no geral e estratificado por sexo
52
Figura 14.1 Análise de percentual de incorporação de colesterol livre (CL3H) na HDL no geral e estratificado por sexo
52
Figura 15 Correlação da lipase com percentual de incorporação PL14C na HDL, análise geral e estratificada por sexo
53
Figura 16 Correlação da atividade da lipase com percentual de incorporação CL3H na HDL, análise geral e estratificada por sexo
estudo
Figura 17.1 Correlação de incorporação de fosfolípides (PL14C) na HDL com a razão HDL-C/apoA, antes e após o procedimento, do sexo masculino
55
Figura 17.2 Correlação de incorporação de fosfolípides (PL14C) na HDL com a razão HDL-C/apoA, antes e após o procedimento, do sexo feminino
56
Figura 18 Análise de correlação linear entre percentual de incorporação de colesterol livre CL3H/mL/hora e razão HDL-C/apoA, antes e depois da administração intra-arterial in bolus de heparina durante a cineangiocoronariografia de todos os pacientes participantes do estudo
57
Figura 18.1 Análise de correlação linear entre percentual de incorporação de colesterol livre CL3H/mL/hora e razão HDL-C/apoA, antes e depois do procedimento, do sexo feminino
57
Figura 19 Avaliação do não-HDL-C antes e depois da administração intra-arterial in bolus de heparina durante a cineangiocoronariografia nos 20 pacientes participantes do estudo
58
Figura 19.1 Avaliação do não-HDL-C antes e depois da administração intra-arterial in bolus de heparina durante a cineangiocoronariografia nos pacientes do sexo masculino participantes do estudo
58
Figura 19.2- Avaliação do não-HDL-C antes e depois da administração intra-arterial in bolus de heparina durante a cineangiocoronariografia nos pacientes do sexo feminino participantes do estudo
59
Figura 20 Correlação entre o percentual de incorporação de fosfolípides e não-HDL-C, antes e depois do procedimento, no geral
59
Figura 21 Correlação entre o percentual de incorporação de colesterol livre e não-HDL-C, análise geral e do sexo masculino, antes e depois do procedimento
60
Figura 22 Análise da haptoglobina antes e depois do cateterismo em todos os pacientes e estratificados por sexo
Tabela 1 Perfil lipídico, apolipoproteinas, glicose, marcadores de função renal e atividade da lipase dos pacientes participantes do estudo submetidos à cineangiocoronariografia (CATE)
40
Tabela 2 Fatores e marcadores de risco entre pacientes participantes do estudo que realizaram a cineangiocoronariografia, segundo sexo
apoA apolipoproteína A apoB
CABG
apolipoproteína B
coronary artery bypass graft. CAF-1 quimiocinas 1
CATE cateterismo (cineangiocoronariografia)
CETP proteína de transferência de éster de colesterol CL colesterol livre (não esterificado)
CL3H colesterol livre marcado com trítio CT colesterol total
DCV doença cardiovascular g/mL gramas por mililitro
HDL lipoproteína de densidade alta
HDL-C colesterol da lipoproteína de densidade alta ICAM moléculas de adesão intracelular 1
IDL lipoproteína de densidade intermediária LCAT lecitina-colesterol-acil transferase LDL lipoproteína de densidade baixa
LDL-C colesterol da lipoproteína de densidade baixa LDLox lipoproteína de baixa densidade oxidada LDL-r receptor de LDL
LPL lipoproteína lipase mg/dL miligrama por decilitro PL fosfolipídeos
PL-14C fosfolipídeos marcado com carbono 14 PLTP proteína de transferência de fosfolipídeos Qm quilomícron
TG triglicerídeos
TRC transporte reverso do colesterol U/L unidade internacional por litro VCAM moléculas de adesão vascular
VLDL lipoproteína de densidade muito baixa VLDL-C
1 INTRODUÇÃO ... 15
1.1 DOENÇAS CARDIOVASCULARES ... 15
1.2 CATETERISMO CARDÍACO ... 19
1.3 LIPOPROTEÍNAS... 21
1.4 METABOLISMO DOS QUILOMÍCRONS E VLDL ... 22
1.5 LIPOPROTEÍNA DE BAIXA DENSIDADE... 23
1.6 METABOLISMO DA HDL... 24 1.7 APOA E APOB... 25 1.8 LIPOPROTEÍNA IIPASE... 26 1.9 REMODELAMENTO DA HDL E LIPOPROTEÍNAS... 27 1.10 DISLIPIDEMIAS... 29 2 JUSTIFICATIVA... 31 3 OBJETIVOS ... 31 3.1 GERAL ... 31 3.2 ESPECÍFICOS ... 32 4 PACIENTES E MÉTODOS... 32
4.1 CASUÍSTICA E CÁLCULO AMOSTRAL... 32
4.2 CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DOS INDIVÍDUOS ... 34
4.2.1 Critérios de Inclusão ... 34
4.2.2 Critérios de Exclusão ... 35
4.3 COLETA DAS AMOSTRAS E ADMINISTRAÇÃO DA HEPARINA... 35
4.4 DETERMINAÇÕES LABORATORIAIS... ... 36
4.4.4 Determinação da haptoglobina... 37
4.4.5 Medida percentual de incorporação de colesterol livre e fosfolípides na HDL ... 38 4.4.6 Análises estatísticas ... 38 5 RESULTADOS... 39 6 DISCUSSÃO ... 61 7 CONCLUSÃO... 73 8 LIMITAÇÕES DO ESTUDO... 73 REFERÊNCIAS ... 74
1 INTRODUÇÃO
1.1 DOENÇAS CARDIOVASCULARES
As doenças cardiovasculares acometem milhões de pessoas no mundo, estando entre as doenças que mais levam à morte. É a maior causa de morbimortalidade nos países desenvolvidos e em desenvolvimento (BRASIL.MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011). No Brasil, essas doenças são as principais causas de morte entre homens e mulheres (MANSUR e FAVARATO, 2012); além de a população brasileira estar seguindo a tendência dos países desenvolvidos, cuja característica alimentar é aumento da ingestão de gorduras e sedentarismo. Com o aumento da sobrevida da população e estilo de vida, os transtornos cardiovasculares passaram a ser mais comuns e o interesse em preveni-los vem aumentando a cada dia.
As doenças cardiovasculares são aquelas que afetam o sistema circulatório, ou seja, os vasos sanguíneos e o coração. É um termo bastante amplo que envolve várias doenças cardíacas e vasculares mais específicas. Como resultado do desequilíbrio dos mecanismos da fisiologia natural do músculo cardíaco, vários sintomas e doenças manifestam-se. Dentre esses estão inclusos as cardiopatias coronárias, acidentes cerebrovasculares, hipertensão, cardiopatias reumáticas, congênitas, vasculopatia periférica e insuficiência cardíaca (OMS, 2011), sendo a doença arterial coronária (DAC) e a aterosclerose as que mais acometem a população. Entre os eventos mais comuns estão os acidentes vasculares cerebrais, infarto do miocárdio, angina do peito e a própria aterosclerose, além disso, pacientes que possuem doenças cardiovasculares podem apresentar um único ou uma gama de sinais e/ou sintomas, sendo que esses podem não ser de origem cardiovascular.
No Brasil, essas doenças são hoje um grave problema de saúde pública, sendo a principal causa de morte no país (BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011), correspondendo em torno de 30% das causas de mortes conhecidas e ainda 31,8% das causas de óbito em adultos no Brasil (DATASUS, 2012; SANTOS, 2001; SOUZA et al., 2001; ROVER, 2010), além de ser alvo de
importantes campanhas e políticas públicas nacionais de promoção e prevenção a saúde.
Juntamente com outras doenças (câncer, diabetes, doença respiratória crônica), as doenças cardiovasculares representaram 80,1% das mortes causadas por doenças crônicas no país (DATASUS, 2011). Em torno de 9,5% das internações são decorrentes de doenças cardiovasculares, o que gera um custo equivalente a 17% dos gastos do Sistema Único de Saúde (SUS) (FARRET, 2005).
Doenças do sistema circulatório foram responsáveis pelas maiores proporções dos custos com internações hospitalares nos últimos anos (PEIXOTO et al., 2004; BUENO et al., 2012). Além disso, observou-se que, com relação aos medicamentos, os vasodilatadores e os anti-hipertensivos são os responsáveis pelos maiores dispêndios, independente da renda dos usuários (MAGALHAES et al., 2001, BUENO et al., 2012), uma vez que doenças do aparelho circulatório atingem grande parte da população brasileira (BUENO et al., 2012). Os fatores de risco dessas doenças são preveníveis, ou seja, permitem prevenção e tratamento, além de possibilitar uma intervenção medicamentosa conhecida e que apresentem custos mais favoráveis.
Os eventos cardiovasculares afetam homens e mulheres na mesma proporção, porém, após a menopausa, as mulheres apresentam risco cardiovascular maior quando comparado os sexos (OMS, 2011). Isso se deve ao fato da diminuição dos hormônios femininos que promovem proteção aos eventos ateroscleróticos (protegendo-as contra a formação das placas de aterosclerose).
Como citado anteriormente, a aterosclerose é uma das doenças cardiovasculares que mais afeta a população, sendo um dos principais responsáveis pelos índices de mortalidade no país. A aterosclerose é uma doença crônico-degenerativa que evolui a partir de dano endotelial nas artérias (LIMA e COUTO, 2006; COUTO et al., 2007; CORRÊA-CAMACHO et al., 2007; FERRAZ, 2008; GALKINA e LEY, 2009), doença multifatorial, lenta e progressiva, que resulta de uma série de respostas celulares e moleculares altamente específicas (SANTOS et al., 2008). Ela é ainda inflamatória crônica que ocorre em resposta à agressão endotelial (XAVIER et al., 2013;
HASHIMOTO et al., 2014), que está associada a inúmeros fatores de risco, tais como o aumento de lipoproteínas aterogênicas (IDL, LDL, VLDL, remanescentes de quilomícrons) (XAVIER et al., 2013). Acomete, principalmente, a camada íntima de artérias de médio e grande calibre (XAVIER et al., 2013). É provocada pelo acúmulo de placas ateromatosas na parede das artérias ao longo dos anos que, normalmente, provocam obstrução levando a alterações hemodinâmicas que impedem o fluxo normal do sangue.
Vários são os fatores de risco para o desenvolvimento da aterosclerose, são eles: hiperlipidemia (valores anormalmente elevados de colesterol, triglicérides ou ambos; elevação de lipoproteínas aterogênicas (LDL, IDL, VLDL, remanescentes de quilomícrons), distúrbios genéticos, hipertensão arterial sistêmica (HAS), tabagismo, diabetes, obesidade, sedentarismo e idade avançada, estresse, entre outros (XAVIER et al., 2013, BUENO et al., 2012). Quando os fatores de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares são avaliados, observa-se que o metabolismo das lipoproteínas apresenta papel central.O controle de apenas um desses fatores de risco já diminui significativamente a morbimortalidade decorrente da aterosclerose.
A formação da placa de ateroma inicia-se com a agressão ao endotélio vascular devido aos fatores de risco citados anteriormente. Em consequência disso, essa disfunção promove o aumento da permeabilidade da íntima endotelial dos vasos às lipoproteínas plasmáticas, o que favorece a retenção das mesmas nos espaços subendoteliais. Nesse momento, as LDL (lipoproteína de baixa densidade) retidas são oxidadas (LDLox). O processo de deposição dessas lipoproteínas na parede arterial é proporcional à concentração dessas lipoproteínas no plasma.
Essas lipoproteínas modificadas prejudicam as funções endoteliais e promovem à indução da expressão das moléculas de adesão (P- e E-selectinas), moléculas de adesão vascular 1 (VCAM), e molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), citocinas, moléculas quimioatrativas, quimiocinas (CAF-1) no endotélio vascular, que exercem papel inicial no recrutamento de monócitos, neutrófilos, linfócitos, através da liberação de fatores inflamatórios e
outros mediadores (KALELA, 2002; TORZEWSKI et al., 2004; VIEIRA et al., 2012)
Depois da aderência dos monócitos, outras moléculas específicas também participam do processo da formação da placa de ateroma. São elas: proteína quimiotática monocitária (MCP-1) e fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CFS), que atraem e ativam os monócitos no espaço subendotelial. Depois da diferenciação dos monócitos em macrófagos, estes são responsáveis por oxidar mais ainda a LDL levemente oxidada, em LDL altamente oxidada transformando os macrófagos em células espumosas (macrófagos modificados; macrófagos repletos de lipídios). Essas são o principal componente das estrias gordurosas, que são lesões macroscópicas iniciais da aterosclerose (XAVIER et al., 2013).
As células espumosas são componentes bastante importantes da placa aterosclerótica, pois promovem a progressão da mesma através da manutenção da produção de citocinas pró-inflamatórias, além de promoverem a migração, adesão e sequestro de linfócitos T. Esses linfócitos desencadeiam resposta imune, além de secretarem mais ainda citocinas adicionais (IL-1, TNF-α), fatores de crescimento, entre outros, que vão desencadear a proliferação de células musculares lisas da camada média arterial (LEAL et al., 2002; KALELA, 2002; CORRÊA-CAMACHO et al., 2007). Essas células migram para a camada íntima e passam a produzir, além de fatores de crescimento e citocinas (reforçando o recrutamento de células inflamatórias, que vão contribuir para a expansão do ateroma), matriz extracelular que irá formar parte da capa fibrosa (rica em colágeno) da placa aterosclerótica (XAVIER et al., 2013).
A placa é constituída por componentes da matriz extracelular, núcleo lipídico (rico em colesterol) e elementos celulares. As placas podem ser estáveis, quando há predomínio de colágeno (capa fibrosa espessa), escassas em células inflamatórias e núcleo lipídico menor, ou podem ainda ser classificadas como instáveis, as quais apresentam atividade inflamatória intensa, grande atividade proteolítica, núcleo lipídico grande e capa fibrosa fina.
O rompimento dessa capa promove a exposição de material lipídico altamente trombogênico, provocando a formação de trombo (aterotrombose), ocasionando complicações agudas da aterosclerose. Esse processo é um dos
principais determinantes das manifestações clínicas da aterosclerose, tais como: síndrome coronária aguda, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral (XAVIER et al., 2013; KALELA, 2002; GALKINA e LEY, 2009).
1.2 CATETERISMO CARDÍACO
O Cateterismo (CATE), também conhecido como cineangiocoronariografia, cinecoronariografia, angiografia coronária ou ainda estudo hemodinâmico, é um exame invasivo, realizado por hemodinamicistas, ou seja, médicos capacitados para o desenvolvimento de técnicas hemodinâmicas e de cardiologia intervencionista. Trata-se de um exame utilizado para confirmar a presença de obstruções das artérias do coração. É ainda utilizado para determinar a exata localização da obstrução que está causando o evento isquêmico e, dessa forma, planejar o melhor tratamento (de SOUZA et al., 2011).
O exame permite determinar as seguintes informações sobre a doença: identificação da gravidade e localização da doença; característica da lesão; comprometimento dos ramos laterais; tamanho/diâmetro do vaso; possíveis locais para colocação de pontes na artéria coronária; além de progressão e extensão da doença (de SOUZA et al., 2011).
As vias de acesso utilizadas são a braquial, femoral e radial (MATTOS et al., 2008). Este método utiliza contraste iodado, que é injetado nas coronárias durante a filmagem.
Figura 1 – Filme obtido a partir do procedimento de cineangiocoronariografia que mostra
obstrução na artéria coronária descendente anterior indicada pela seta vermelha. O local da seta indica ausência de circulação evidenciada pela falta de preenchimento do vaso pelo contraste. Cineangiocoronariografia. Fonte: http//www.einstein.br. Acesso 10 de novembro de 2013.
Os cateteres são introduzidos em um braço ou na região inguinal (femoral) através do vaso sanguíneo (veias ou artérias) até alcançar o coração. Os cateteres são tubos longos, finos e flexíveis e o exame é praticamente indolor, sendo necessário, na maioria dos casos, apenas anestesia local. Durante o procedimento, no início, é introduzido heparina sódica, 5.000 unidades in bolus, ou seja, quando a dose é administrada de uma única vez em tempo menor ou igual a um minuto.
O cateterismo pode ser feito de forma eletiva, quando o paciente é agendado (nível ambulatorial, quando não há urgência médica), ou emergencial, como o próprio nome diz, em situações de emergência e risco. O paciente não precisa internamento prévio para realização do procedimento e o internamento posterior ao exame só existirá, salvo as exceções e complicações, quando a punção ocorre na região inguinal. O tempo médio de do procedimento dura em torno de 20 minutos, com ressalva dos casos mais graves e complicados.
As complicações relacionadas ao cateterismo cardíaco são as principais limitações desta técnica diagnóstica, e podem variar desde eventos adversos
leves e transitórios até eventos graves, como infarto do miocárdio (IAM) ou morte(KENNEDY, 1982; CHANDRASEKAR, 2001).
1.3 LIPOPROTEÍNAS
Os lipídios podem ser obtidos através da dieta ou sintetizados pelo próprio organismo, processo conhecido como síntese de novo, sendo o principal local de síntese o fígado. Os lipídios podem ser armazenados (tecido adiposo) ou utilizados imediatamente como fonte de energia (STRYER, 1987; FIEGENBAUM, 2001), além disso, os lipídios e outras moléculas apolares para serem veiculados no plasma precisam ser transportados sob a forma de lipoproteínas, pois são insolúveis em meio aquoso (XAVIER et al., 2013).
As lipoproteínas são partículas esféricas formadas por monocamada lipídica, onde a porção polar/hidrofílica dos fosfolipídios volta-se para o meio aquoso (sangue), e a porção não polar (hidrofóbica) para o centro da partícula. Junto à porção polar reúnem-se também proteínas, chamadas de apolipoproteínas (apos) (FIEGENBAUM, 2001; XAVIER et al., 2013). As apos possuem funções tanto estruturais quanto metabólicas. Cada lipoproteína tem uma ou mais apoproteínas em sua composição (FIEGENBAUM, 2001; LIMA et al., 2007).
As lipoproteínas são classificadas por suas propriedades físico-químicas, origem, composição, densidade, tamanho. Basicamente, existem quatro grandes classes separadas em dois grupos: ricas em triglicérides (TG) e as ricas em colesterol (XAVIER et al., 2013).
As lipoproteínas ricas em TG são maiores e menos densas e esse grupo é composto pelos quilomícrons (possuem importante papel no transporte de triglicérides exógeno, pois são responsáveis pelo transporte de lipídios da dieta para a circulação sanguínea), e pelas lipoproteínas de muito baixa densidade, VLDL, que participam do transporte dos triglicerídeos endógenos, ou seja, transportam os TG do fígado para os tecidos extra-hepáticos. Já o grupo das lipoproteínas ricas em colesterol é composto pelas lipoproteínas LDL (lipoproteína de baixa densidade) e pela HDL (lipoproteína de alta densidade), sendo a primeira responsável pelo transporte de colesterol do fígado para
outros tecidos e a segunda dos tecidos periféricos e outras lipoproteínas para o fígado, respectivamente (SANTOS, 2012; XAVIER et al., 2013).
1.4 METABOLISMO DOS QUILOMÍCRONS E VLDL
Os quilomícrons são constituídos por 80 a 95% de triglicérides, dois a quatro porcento de colesterol esterificado (CE), três a seis porcento de fosfolípides (PL), um a três porcento de colesterol livre (CL) e um a dois porcento de proteínas (REDGRAVE, 1983). Por ser rico em triglicérides e apresentar teor protéico muito baixo, menor do que dois porcento, os quilomícrons apresentam densidade muito baixa (<0,94g/cm3).
Os quilomícrons são responsáveis por transportar lipídios da dieta para a circulação sanguínea. A sua formação depende da quantidade e da natureza dos lipídios absorvidos, sendo que esta aumenta com a quantidade de triglicérides absorvidos. Dentro das mucosas intestinais ocorre interação dos quilomícrons com outras lipoproteínas, principalmente HDL, onde estas doam apoliproteínas C (CII e CIII), e E, e perdem apoA-I e apoA-IV, além de fosfolípides (PATSCH, 1998). As apoliproteínas ligadas aos quilomícrons são: apoA-I, apoA-II, apo-IV, C-II, C-III, E e apoB-48.
O Catabolismo dos quilomícrons se inicia com a ação da lipoproteína lipase (LPL). Essa enzima inicia o processo de hidrólise dos quilomícrons (BLANCHETTE-MACKIE, 1973; LIMA e MARANHÃO et al., 2004; HUSSAIN et al., 2005) e após esse processo, os quilomícrons dão origem aos remanescentes de quilomícrons, partículas menores. As apo-C são transferidas nesse processo. Os quilomícrons remanescentes são removidos rapidamente, em torno de minutos, pois são reconhecidos, captados e absorvidos pelos receptores de LDL, receptor B/E e LRP (LIMA e MARANHÃO et al., 2004; SANTOS e MARANHÃO, 1999) e proteínas relacionadas a esses receptores nos hepatócitos (STRYER, 1987; LIMA e MARANHÃO et al., 2004). Eles ainda transportam para o fígado o colesterol plasmático de origem alimentar que pode ter vários destinos: ser utilizado na síntese de membranas celulares, síntese de outras lipoproteínas de origem hepática ou ainda serem excretados na bile na forma de ácidos biliares (BROWN et al., 1981).
Estudos prévios (ZILVERSMITH et al., 1979) já mostravam que os quilomícrons remanescentes são lipoproteínas aterogênicas e sua remoção mais lenta está relacionada diretamente com DAC (LIMA e MARANHÃO et al., 2004).
Semelhante ao metabolismo dos quilomícrons, a VLDL (lipoproteína de muito baixa densidade) é catabolizada e sofre a ação da lipoproteína lipase (LIMA e MARANHÃO et al., 2004). As apoliproteínas presentes na VLDL são: apoB-100, apo E, apo C-I, apo C-II, apo C-III, onde a lipase é ativada também pela apo C-II ligada a partícula de VLDL. A ação da lipase sobre as VLDL forma VLDL remanescentes, também conhecidas como IDL (lipoproteínas de densidade intermediária), que podem ser captadas pelo fígado e metabolizadas ou originar as LDL, que permanecem maior tempo na circulação, em torno de dois dias. Importante ressaltar que, durante a etapa de hidrólise dos triglicérides nas VLDL, ocorre também troca de triglicérides por ésteres de colesterol entre as HDL e β-VLDL (remanescentes de VLDL), em função da ação da proteína de transferência de colesterol esterificado (CETP), parte essa integrante do transporte reverso do colesterol (TRC) (SANTOS et al., 2014).
1.5 LIPOPROTEÍNA DE BAIXA DENSIDADE (LDL)
A lipoproteína de baixa densidade é o principal transportador de colesterol do plasma para os tecidos. É formado por núcleo hidrofóbico contendo colesterol esterificado e resíduos de triglicérides, sendo esse núcleo envolto por uma camada monofásica de fosfolípides e colesterol livre. Seu conteúdo de triglicérides é apenas residual, resultante do catabolismo das VLDLs pela ação da lipase (WIKINSKI, et al., 2010). A LDL é formada por apenas uma apolipoproteína, a apoB-100, apo esta reconhecida pelos receptores específicos (receptores para LDL) e que exerce papel fundamental no metabolismo dessa lipoproteína (FIEGENBAUM, 2001; WIKINSKI et al., 2010; SANTOS, 2012; XAVIER et al., 2013).
A remoção dessa lipoproteína pelo fígado ocorre por endocitose através dos receptores B/E. No interior das células essas partículas são digeridas, suas macromoléculas sofrem hidrólise originando principalmente colesterol livre e
ácidos graxos de cadeia longa. O colesterol livre pode então ser esterificado, por ação da ACAT (acil coenzima A: colesterol aciltransferase) para armazenamento (XAVIER et al., 2013).
A quantidade de receptores específicos para a LDL é diretamente proporcional à necessidade fisiológica, ou seja, quando os tecidos necessitam de mais colesterol eles aumentam a expressão desses receptores na superfície celular, que então captam as lipoproteínas do plasma. Quando a necessidade do colesterol é menor, a expressão é diminuída (FIEGENBAUM, 2001).
Em condições de stress oxidativo, as partículas de LDL não removidas fisiologicamente da circulação são facilmente oxidadas, o que as atribui importante papel na aterogênese (FIEGENBAUM, 2001; SANTOS et al., 2014).
1.6 METABOLISMO DA HDL
A HDL é uma lipoproteína que desempenha importante papel no metabolismo endógeno das lipoproteínas e transporte reverso do colesterol. Elas são sintetizadas e secretadas a partir do fígado e intestino. Dentre as lipoproteínas plasmáticas ela possui a maior densidade e menor tamanho, além de ser a que possui a meia-vida mais longa, em torno de cinco a seis dias, quando comparada a todas as outras lipoproteínas (BACHORIK et al., 1999). Segundo Gotto et al. (1983) a HDL é constituída por 45 a 55% de proteínas, 26 a 32% de fosfolípides, 15 a 20% de colesterol esterificado, três a cinco porcento de colesterol livre e dois a sete porcento de triglicérides.
O principal conteúdo protéico da HDL é representado pelas apolipoproteínas AI, AII e AIV, além das apos C-I e C-III (DUCHATEAU et al., 1997), sendo a AI e AII as principais, correspondendo a aproximadamente 70 e 20% do conteúdo protéico, respectivamente.
A HDL pode ser dividida em quatro subclasses: HDL1, HDL2, HDL3, HDL4, sendo as subclasses dois e três encontradas em maior concentração no plasma (EISENBERG, 1984; LIMA e MARANHÃO, 2004). Essa classificação é basicamente em função do tamanho de partícula. As diferenças no tamanho da partícula de HDL são atribuídas à quantidade de ésteres de colesterol,
presentes no seu interior, fosfolípides e apoproteínas presentes na sua superfície (BARTER, 2003).
Como dito anteriormente, a síntese da HDL ocorre principalmente no fígado, onde, inicialmente, sua forma é discóide e com alto conteúdo de colesterol livre, além de fosfolipídio e apoliproteínas, sendo a apoA-I e apo E as principais. As HDL sintetizadas no intestino possuem apenas apoA. As HDL apresentam inúmeras funções, sendo uma das principais, a de armazenar apo-C e apo E, que serão utilizadas no metabolismo da VLDL e quilomícrons.
A HDL desempenha inúmeras funções, sendo a principal, o efeito antiaterogênico propiciado pelo transporte reverso do colesterol (TRC): propriedade de transportar ésteres de colesterol dos tecidos periféricos para o fígado. A diminuição da concentração do HDL-C está inversamente relacionada com as doenças cardiovasculares, onde, diminuição da concentração plasmática de HDL-C é um fator de risco para o surgimento de doenças cardiovasculares (BARTER et al., 2003; SVIRIDOV et al., 2008). Algumas outras funções da HDL são: ação antioxidante, inibição da agregação plaquetária e estimulação da produção de óxido nítrico.
1.7 APOA E APOB
A apoliproteína A (apoA) é a principal constituinte da HDL e sua concentração sérica está intimamente relacionada com a concentração do colesterol da HDL. Existem duas formas de apo A, sendo apoA-I e apoA-II. A apoA-I corresponde a quase 70% do conteúdo protéico da HDL e a apoA-II menos, em torno de 20%. Elas são de extrema importância para o metabolismo do HDL. A apoA-I é importante cofator para a LCAT (lecitina colesterol aciltransferase), além de importante contribuição no papel antioxidante da molécula de HDL (JOY e HEGELE, 2008; PODREZ, 2010).
Segundo Goldstein (1977) a apoliproteína B (apoB) é um componente de várias lipoproteínas, importante no uso para predição de risco, sendo risco semelhante à partícula de LDL. Sua principal atuação é como ligante no reconhecimento celular e catabolismo da lipoproteína de baixa densidade (LDL) pelos receptores de LDL (BROWN e GOLDSTEIN, 1986; DANTAS et al.,
2006). Semelhante a apoA, existem duas formas de apoB, são elas: apoB-48 e apoB-100, sendo essa última a principal apoproteína das LDL. A apoB-100 é sintetizada no fígado e está presente nas lipoproteínas VLDL, IDL e LDL, principais partículas aterogênicas (PARCKARD, 1997; XAVIER et al., 2013). Cada lipoproteína possui apenas uma molécula de apoB. Já apoB-48 é sintetizada no intestino e está relacionada com os quilomícrons e seus remanescentes, sendo um dos seus componentes.
Tanto a apoA e apoB possuem importante papel na predição do risco cardiovascular, pois a apoB está presente em partículas aterogênicas, enquanto que a apoA está presente na HDL, partícula antiaterogênica. Dessa forma, a razão apoB/apoA é um importante marcador de risco cardiovascular (SOUZA et al., 2007).
1.8 LIPOPROTEÍNA LIPASE
A lipoproteína lipase (LPL) é uma enzima sintetizada e secretada por células parenquimatosas de vários tecidos extra-hepáticos, desses os principais tecidos são o muscular e o adiposo (QUINN et al., 1982) e transportada para as células endoteliais na superfície dos vasos (WANG e ECKEL, 2009). A LPL é um dos componentes da família das lipases com função de hidrolisar os triglicérides encontrados nas partículas de lipoproteínas (KORN ED, 1955; de CARVALHO et al., 2009), o que a torna uma enzima chave no metabolismo e transporte das lipoproteínas ricas em triglicérides. (TASKINEN, 1987; ECKEL, 1989; de CARVALHO et al.; 2009).
A LPL Localiza-se nas paredes dos capilares sanguíneos, fixada ao endotélio por cadeias de proteoglicanos e de heparan sulfato. Está presente ainda no coração, tecido adiposo, baço, pulmões, medula renal, aorta, diafragma, glândulas mamárias lactantes e no fígado de recém-nascidos. Ela apresenta como reguladores fisiológicos os próprios triglicerídeos e as apolipoproteínas C-II e C-III, uma aumentando a atividade e a outra inibindo, respectivamente. (de CARVALHO et al., 2009). Esse aumento da atividade pela apo C-II acontece através da capacitação da enzima em hidrolisar os
triglicérides, tornando as partículas menores, em função da liberação de ácidos graxos que serão absorvidos nos tecidos periféricos.
Estudos prévios já demonstravam que a deficiência dessa enzima provoca hipertrigliceridemia grave (HAVEL e GORDON, 1960; YOUNG et al., 2011; TAKATA et al.; 2010). Há uma correlação significativa entre a capacidade de um tecido de incorporar ácidos graxos dos triglicérides das lipoproteínas e a atividade da enzima lipase lipoprotéica. Como dito anteriormente, a LPL desempenha um importante papel no metabolismo dos lipídeos. Ela hidrolisa os triglicérides dos quilomícrons e das lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL), o que leva a produção, respectivamente, de quilomícrons remanescentes e lipoproteínas de densidade intermediária (IDL) (rica em ésteres de colesterol) com diminuição progressiva do diâmetro dessas partículas.
O sangue normal não contém quantidades significativas dessa enzima, entretanto, após a injeção de heparina, a lipase lipoprotéica é liberada da sua ligação com heparan sulfato na circulação e o processo é acompanhado pela diminuição da lipemia. Segundo Quinn et al. (1982), o receptor de lipase é uma substância “heparin like”, onde existe uma grande afinidade de ligação de heparina com as lipases. A heparina então faz com que as enzimas que estão aderidas a superfície do endotélio sejam rapidamente liberadas na circulação sanguínea. A injeção da heparina no homem pode aumentar em até 1.000 vezes a atividade da lipase (BEISEGIEL et al., 1991).
1.9 REMODELAMENTO DA HDL E LIPOPROTEÍNAS
O metabolismo plasmático das lipoproteínas apresenta papel importante na gênese das doenças cardiovasculares. A HDL em seu efeito antiaterogênico mostra relação inversa entre o colesterol removido no transporte reverso (HDL-C) e a doença cardiovascular aterosclerótica, por outro lado, o LDL-C apresenta efeito contrário. Alterações no tamanho, na composição e funcionalidade da HDL podem comprometer esse papel, interferindo nas suas propriedades antiaterogênicas (SVIRIDOV et al., 2008).
Entre as classes das lipoproteínas, a transferências entre os lipídios ocorre de forma bidirecional, havendo, normalmente, favorecimento ou diminuição de determinada classe de lipídios (FEITOSA et al., 2009), onde esse processo é diretamente dependente da concentração e estrutura das lipoproteínas receptoras e doadoras (FERRETI et al., 2006).
O Transporte reverso do colesterol (TRC) é definido pela capacidade da HDL transportar colesterol, principalmente os ésteres de colesterol, dos tecidos periféricos para o fígado, onde lá serão excretados na bile e/ou utilizados para a formação de novas lipoproteínas, vitamina D e hormônios (van ECKARDSTEIN et al., 2001; NOFER et al., 2002; LIMA e COUTO, 2006). Ele representa uma via metabólica protetora para as doenças cardiovasculares ateroscleróticas. Diversas apoproteínas e proteínas de transferência participam desse processo, sendo elas: lecitina colesterol aciltransferase (LCAT), proteína de transferência de colesterol esterificado (CETP), lipase hepática (LH) e proteína transportadora de fosfolípides (PLTP) (PIRILLO et al., 2013; XAVIER et al., 2013). Essas são responsáveis por ações de remodelamento da partícula de HDL, além de auxiliarem no transporte e trocas de moléculas entre as lipoproteínas plasmáticas (BARTER et al., 2003). Cabe ressaltar também que, além das proteínas de transferências e enzimas, existe um conjunto de moléculas efetoras, tais como, apoliproteínas, lipídios, entre outros, que auxiliam no TRC.
Vários são os interferentes endógenos que podem influenciar o TRC, entre os quais: dislipidemias, que podem comprometer as concentrações das lipoproteínas, tanto no seu aumento, quanto diminuição comprometendo assim as funções metabólicas da HDL, como, por exemplo, na hipertrigliceridemia; onde modificações das características físico-químicas das lipoproteínas comprometem a ações de proteínas e enzimas que atuam no metabolismo dessa partícula; além de distúrbios metabólicos em geral (GRIGORE et al., 2008; TREGUIER et al., 2011). Desses, citamos a haptoglobina (glicoproteína que possui, entre outras propriedades, ação antioxidante e imunomodulatória) em função da sua importância por sua ação moduladora da LCAT, onde se liga no sitio da hélice seis da apoA-I, o que resulta na redução da taxa de esterificação do colesterol por inibição da LCAT in vitro e redução do transporte
reverso do colesterol em humanos (ASLEH et al., 2006). Fato esse importante na regulação geral do TRC por alterar a ação conjunta das proteínas de transferência associadas a esse mecanismo, dentre elas a CETP (POWELL et al., 1990).
A ação hidrolítica da lipase lipoprotéica (LPL) resulta na depleção do conteúdo de triglicérides (TG) no centro hidrofóbico dos quilomícrons e VLDL (IDL e HDL rica em TG), produzindo diminuição progressiva do diâmetro dessas partículas. Os fosfolipídios da monocamada superficial são transportados para a HDL, o que mantém a relação centro/monocamada apropriada para a manutenção dos diâmetros dessas partículas esféricas. Durante esse processo, a apo C e, em menor grau, a apoE são transferidas para a HDL. Os produtos desta série de eventos são lipoproteínas “remanescentes” que contêm seu complemento original de apoB, de apoE e pouca apo-C. A apoA-I e a apoA-II também são removidas e transferidas das outras partículas para serem incorporadas à HDL (LIMA e COUTO, 2006; ECKEL, 1989).
1.10 DISLIPIDEMIAS
A dislipidemia é caracterizada por concentrações anormais de lipídios ou lipoproteínas no sangue (DIAZ, 1997), sendo considerada um dos principais fatores de risco associados às doenças cardiovasculares (FUENMAYOR et al., 2013), com ênfase na presença do aumento das concentrações do colesterol da lipoproteína de baixa densidade (XAVIER, et al., 2013).
As dislipidemias são decorrentes de distúrbios em qualquer fase do metabolismo lipídico que repercutam em valores séricos aumentados ou diminuídos em relação aos considerados desejáveis para o colesterol total (CT), colesterol de LDL (LDL-C), triglicérides (TG), colesterol não HDL (não-HDL-C), colesterol HDL ((não-HDL-C), sendo esse último, principalmente, valor abaixo do desejável (SANTOS et al., 2001,ROVER et al., 2010).
As lipoproteínas e o colesterol por elas transportados têm importante papel como indicadores de risco cardiovascular, principalmente quando associados a fatores ou marcadores de risco (KAWAMOTO et al., 2005;
GARDENER et al., 2009; SANTOS et al., 2001). Como exemplos dessa importância há HDL-C e o LDL-C. A concentração da primeira é inversamente associada ao desenvolvimento de aterosclerose, além de participar do TRC, importante passo metabólico na prevenção da também aterosclerose (BARTER, 1994; FEITOSA et al., 2009; SEASON et al., 2011). Por outro lado, a LDL é a principal partícula carreadora de colesterol do plasma humano (JONES, 2001), além de estar fortemente associada ao desenvolvimento da aterosclerose, a concentração elevada dessa lipoproteína e a presença de modificações em sua estrutura (lipoproteína de baixa densidade oxidada - LDL-ox), são marcadores de risco importantes de doenças cardiovasculares (MEDEIROS et al., 2009; GRUNDY et al., 1995; GORDON et al., 1981).
Há alguns anos apenas o LDL-C era considerado o principal responsável do risco aterosclerótico, hoje se sabe que baixas concentrações de HDL-C, elevadas concentrações de triglicérides, seguido do colesterol não HDL, entre outros, também são relevantes para avaliação do risco cardiovascular.
Quanto à classificação etiológica, as dislipidemias podem ser de dois tipos: primária e secundária. As primárias (geneticamente determinadas) são aquelas que apresentam apenas alterações séricas nos valores das lipoproteínas, podendo ainda ser classificadas genotipicamente ou fenotipicamente.
Na classificação genotípica as dislipidemias podem ser causadas por um só gene (monogênica) ou pela associação de múltiplas mutações (poligênica). Já a classificação fenotípica se baseia nas determinações bioquímicas do CT, LDL-C, HDL-C e TG, podendo ser de quatro tipos bem definidos: Hipercolesterolemia isolada (elevação isolada do LDL-C (≥ 160 mg/dL)); hipertrigliceridemia isolada (TG≥ 150 mg/dL) influenciando no aumento do número ou volume de partículas ricas em TG, como VLDL, IDL e quilomícrons; hiperlipidemia mista, onde se tem valores aumentados de LDL-C (≥ 160 mg/dL) e TG (≥150 mg/dL); HDL-C baixo (redução do HDL-C, homens < 40 mg/dL e mulheres < 50 mg/dL) isolada ou em associação a aumento de LDL-C ou TG. Já a dislipidemia secundária apresenta-se como consequência das doenças de base ou ao uso de medicamentos (XAVIER et al., 2013).
2 JUSTIFICATIVA
Baixas concentrações de HDL-C, associados frequentemente à hipertrigliceridemia, são diretamente proporcionais e relacionados ao maior risco de desenvolvimento da aterosclerose. A diminuição da atividade da LPL tem sido implicada no desenvolvimento da aterosclerose por sua atuação no metabolismo lipoprotéico, hidrólise de triglicérides em quilomícrons, VLDL, IDL e, ações no remodelamento da HDL, ajudando indiretamente com o efluxo do colesterol e fosfolipídios das lipoproteínas (VIEIRA et al., 2011; LIMA e COUTO, 2006).
Com uma melhor compreensão do mecanismo de remodelamento da partícula de HDL e dos agentes implicados nesse processo, será possível identificar melhores métodos de apoio diagnósticos para o acompanhamento e avaliação terapêutica da doença arterial coronariana. Sendo assim, em função da participação da LPL no remodelamento das partículas lipoproteicas, este trabalho tem o intuito de avaliar o efeito da administração intra-arterial in bolus de heparina sódica (5000 UI), procedimento padrão para realização da cineangiocoronariografia, no remodelamento de partículas lipoproteicas associadas ao transporte reverso do colesterol em indivíduos submetidos à cineangiocoronariografia.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Analisar o efeito da administração intra-arterial in bolus de heparina sódica (5.000 UI) na atividade da lipoproteína lipase (LPL) e no remodelamento de partículas lipoprotéicas associadas ao transporte reverso do colesterol em indivíduos submetidos à cineangiocoronariografia.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar a atividade da LPL antes e depois da administração intra-arterial de 5.000 unidades in bolus de heparina sódica;
Avaliar experimentos de incorporação de colesterol livre (CL3H) e fosfolípides (PL14C) na fração HDL após precipitação de partículas contendo apoB, com o intuito medir a capacidade da HDL receber colesterol livre e fosfolípides, como medida auxiliar para o entendimento do remodelamento de partícula e TRC;
Determinar os marcadores do perfil lipídico associados ao remodelamento de partículas lipoprotéicas e alguns dos seus moduladores (haptoglobina);
Determinar marcadores sugestivos de risco cardiovascular associados ao perfil lipídico nessa casuística.
4 PACIENTES E MÉTODOS
4.1 CASUÍSTICA E CÁLCULO AMOSTRAL
A seleção dos pacientes foi por conveniência, por se tratar de procedimento realizado em hospital de referência para doenças cardiovasculares. O delineamento do estudo foi experimental “antes e depois”, com a participação de 20 pacientes, sendo 10 do sexo masculino e 10 do sexo feminino, entre 45 e 73 anos, admitidos no Hospital Ana Neri, Salvador, para a realização de cineangiocarionografia.
Inicialmente foram selecionados por conveniência, a partir dos critérios de elegibilidade acima elencados, 30 pacientes, porém durante amostragem e coleta de dados para o estudo, houve perda de seguimento. Participaram do estudo apenas 20 pacientes de ambos os sexos, 10 mulheres e 10 homens. A distribuição do número de pacientes estratificado por sexo não foi intencional, ou seja, ao final da coleta de amostras havia exatamente 10 homens e 10 mulheres participando no estudo.
Os pacientes foram selecionados a partir de agendamentos eletivos, procedimento agendado conforme dados da regulação/Sistema Vida (Sistema Integrado de Saúde Pública) ou via solicitação médica prévia. Todos os participantes foram informados e orientados detalhadamente sobre os objetivos do estudo, bem como todos os procedimentos e riscos envolvidos no protocolo da pesquisa e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Este projeto foi autorizado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Maternidade Climério de Oliveira da UFBA (CEP/MCO/UFBA), ofício nº 379, ref. V/Of. nº 02/2005, 27/09/2005 e, Parecer/Resolução Aditiva n° 029/2014, prorrogado até 20 de Junho de 2016.
O Termo de Consentimento Livre e Esclarecido foi assinado pelo próprio paciente ou, para aqueles que por algum motivo estavam impossibilitados de assinar o termo no momento da autorização, o responsável foi esclarecido e conjuntamente com o paciente decidiram ou não participar do estudo.
Tendo em vista as diferenças e variação do efeito antiaterogênico da HDL entre os sexos, efeito mediado pelos estrogênios (ABPLANALP et al., 2000; SUMEGOVA et al., 2006), e da variação na concentração desse hormônio em função da idade feminina, os dados do estudo foram estratificados por sexo, masculino e feminino. Além disso, estudos sobre o heparan-sulfato em modelo animal mostram diferenças estruturais, bioquímicas e funcionais importantes entre os sexos, que afetam diretamente a sua atividade biológica (MURALI et al., 2011), podendo essas diferenças levarem a diferentes respostas à ação da heparina.
O número amostral de participantes do estudo foi baseado em trabalhos anteriores submetidos ao mesmo tipo de técnica, ou seja, para o procedimento de cineangiocoronariografia e mesmo desenho de estudo para as variáveis estudadas (SANTOS et al., 1995), em função da dificuldade de alocação de pacientes no protocolo e do desconhecimento da variância dos marcadores foco do estudo.
O cálculo amostral foi refeito para obter poder de teste mínimo de 80%, capaz de identificar diferenças absolutas de 7,86 unidades entre os pares analisados utilizando desvio padrão máximo para o cálculo da incorporação de colesterol livre e de fosfolípides de 10% (para valores observados em
população ambulatorial dita sadia). O nível crítico escolhido para significância foi de 0,05 (5%), para intervalo de confiança de 95%, para teste pareado, ou seja, dados dependentes. Cumpre ressaltar que em função do poder do teste ter sido obrigatoriamente de apenas 80%, 20% dos testes serão não significantes, o que pode ter causado erro tipo II (β), involuntariamente nesse percentual de pacientes da casuística (GraphPadStatMate 2.0).
4.2 CRITÉRIOS DE SELEÇÃO
4.2.1 Critérios de Inclusão
Os pacientes selecionados para o estudo preenchiam os seguintes requisitos:
- Ambos os Sexos;
- Idade entre 40 e 75 anos;
- Termo de Consentimento Livre e Pré-esclarecido (TCLE) assinado;
- Diagnóstico associado de Normolipidemia ou Dislipidemia confirmada por análise do perfil lipídico;
- Realização das determinações laboratoriais nos Laboratórios Clínicos dos Hospitais da rede UFBA (Hospital Ana Neri (HAN) e Hospital Universitário Professor Edgard Santos (HUPES);
- Realização do procedimento de cineangiocoronariografia (administração de 5000 UI heparina sódica in bolus durante procedimento) no Hospital Ana Neri - Bahia;
- Procedimento agendado via solicitação médica ou pelo Sistema Vida (Sistema Integrado de saúde Pública - SUS) para realização da cineangiocoronariografia.
4.2.2 Critérios de Exclusão
Os pacientes excluídos foram aqueles que, por autorrelato, verificação dos prontuários ou exames laboratoriais prévios, se enquadravam em um ou mais critérios descritos abaixo:
- Indivíduos internados;
- Indivíduos portadores de disfunção renal (creatinina sérica > 2,0 mg/dL, conforme informações contidas nos prontuários, obtidas junto à equipe médica ou após a realização dos exames laboratoriais realizados para esta pesquisa. - Indivíduos realizando outros procedimentos coronariográficos diferente de cineangiocoronariografia (A dose de heparina descrita para o experimento é de 5.000 UI).
4.3 COLETAS DAS AMOSTRAS E ADMINISTRAÇÃO DA HEPARINA
Dos pacientes selecionados, foram coletadas amostras de sangue antes e depois da administração intra-arterial in bolus de heparina sódica (Hemofol®, Cristália) na dosagem de 5.000 UI (SANTOS et al., 1995). Tanto a primeira amostra de sangue (pré), quanto depois (pós) foram centrifugadas para a obtenção de soro e plasma, sendo as coletas realizadas em tubo seco para obtenção do soro e tubo com anticoagulante EDTA para a obtenção do plasma.
A coleta foi realizada no tempo zero (antes de iniciar o CATE) e cerca de 20 minutos depois da administração, pois a meia vida da heparina sódica está entre 23 a 134 minutos (SWAN et al., 2000) seguindo também os critérios utilizados no desenho do estudo de Santos et al. (1995), independente do procedimento cardíaco ter sido finalizado.
As amostras de plasma e soro (pré e pós-administração da heparina sódica) foram então encaminhadas para determinações no laboratório clínico e de pesquisa.
4.4 DETERMINAÇÕES LABORATORIAIS
4.4.1 Determinação do Perfil Lipídico
Amostras de soro e plasma antes e depois da administração da heparina sódica durante o cineangiocoronariografia foram utilizadas para as determinações laboratoriais. As concentrações de colesterol total (CT), suas frações e triglicérides (TG), foram determinadas no soro utilizando-se conjuntos diagnósticos da marca Johnson & Johnson (Ortho Clinical Diagnostics®), metodologia de reflectância (química seca) em autoanalisador bioquímico modelo Vitros 250.
A metodologia de química seca (Johnson & Johnson) consiste em não utilizar água no procedimento. São utilizados pequenos slides, cada um de uso único, constituídos por elementos sólidos em múltiplas camadas, que permitem a análise de inúmeros parâmetros bioquímicos.
As concentrações do colesterol de VLDL e LDL foram calculadas pela fórmula de FRIEDEWALD (FRIEDEWALD et al., 1972), (1), onde o valor do LDL-C foi estimado pela diferença entre o colesterol total e a somatória do HDL-C e VLDL-C. O VLDL-C (2) foi calculado pela divisão do valor da concentração sérica de triglicérides por cinco, ou seja, valor estimado a partir da concentração de triglicerídeos. (CORDOVA et al., 2004). Isso é possível, pois, considerando indivíduos normais e pacientes com todos os tipos de hiperproteinemias (exceto o tipo III, raro), a razão da massa de triglicerídeos em relação à de colesterol na VLDL é relativamente constante e em torno de 5:1 (SILVA e ANDRADE, 2012).
(1) LDL-C = [CT– (HDL-C + VLDL)], para as amostras que
obtiverem resultado de triglicérides inferiores a 400 mg/dL.
4.4.2 Determinação da Atividade da Lipoproteína Lipase
As concentrações da lipase total foram determinadas nas amostras de soro antes e depois de 20 minutos da administração de heparina sódica (5.000 UI) in bolus, administradas durante a cineangiocoronariografia (SANTOS et al., 1995). Essas determinações foram também realizadas por química seca e os resultados obtidos em U/L.
A utilização de amostras soro-controles fornecidas pelo Programa Nacional de Controle de Qualidade (PNCQ), da Sociedade Brasileira de Análises Clínicas, além de controles próprios do fabricante (Verificador de desempenho nível I e II, aparelho Vitros, Johnson & Johnson) validaram os resultados obtidos durante as determinações.
4.4.3 Determinação da Concentração de apoA e apoB
As concentrações de apoA e apoB foram determinadas em amostras de soro antes e depois da cineangiocoronariografia por imunonefelometria, através do analisador automatizado IMMAGE® (BeckmanCoulter, USA). Este método determina a taxa de aumento da dispersão da luz causada por partículas em suspensão numa solução provenientes dos complexos formados durante a reação antígeno-anticorpo. O valores de referência utilizados foram apoA (90 a 170 mg/dL) e apoB (107 a 214 mg/dL).
4.4.4 Determinação da Haptoglobina
As determinações de haptoglobina foram realizadas nas amostras de soro pré e pós a administração da heparina, utilizando o método de nefelometria, citado anteriormente, para avaliar a capacidade de incorporação do colesterol livre na HDL. O valor de referência utilizado foi de 16 a 200 mg/dL.
4.4.5 Medida Percentual de Incorporação de Colesterol LIVRE (CL3H) E Fosfolípides (PL14C) na HDL
A incorporação de CL3H e PL14C foi determinada a partir de modificações no método de substrato exógeno (CHANNON et al., 1990). Uma alíquota de 500 microlitros de plasma obtido das amostras dos participantes do estudo foi bimarcada com 1microlitro de lipídios radioativos (um microlitro para cada marcador: CL3H e PL14C), com atividade final de cerca de 0,7microCi/mL. Após a marcação, as amostras foram mantidas por uma hora no gelo e submetidas à incubação por 3 horas a 37ºC, sob agitação. Ao final desse tempo, as amostras foram colocadas novamente no gelo por cinco minutos, com o intuito de parar a reação.
Passado esse tempo, as partículas que continham apoB foram precipitadas utilizando 625 microlitros de precipitante convencional para lipoproteínas contendo apo B (Fosfotungstato 0,4mmol/L e Cloreto de Magnésio 20mmol/L, LABTEST, Brasil), seguido de centrifugação e coleta do sobrenadante contendo HDL para determinação das contagens e cálculo dos percentuais de CL3H e PL14C, que foram incorporados nas partículas. Os resíduos não incorporados presentes no sedimento resultante com lipoproteínas que contêm apoB, VLDL e LDL, foram desprezados.
A radioatividade presente em cada amostra foi determinada por cintilação líquida utilizando o leitor de microplacas CHAMELEON™V – Hidex e solução cintiladora (Ultima Gold – PerkinElmer, Boston, USA). As leituras foram feitas com cada marcador isoladamente e a incorporação do colesterol livre e fosfolípides foram expressas como porcentagem de CL3H e PL14C, incorporados por hora para a HDL (% CPM incorporado-HDL/h).
4.4.6 Análises Estatísticas
Durante a análise descritiva os dados foram testados para tipo de distribuição, paramétrica ou não paramétrica, a partir da realização do teste de D’Agostino. Ainda na análise descritiva, os dados foram testados para presença de outliers utilizando-se o teste de Grubbs. Da análise inferencial,
