UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
Vanessa Regina Gonçalves
Avaliação Funcional de Genes de Cana-de-Açúcar
Diferencialmente Expressos sob Seca em Plantas Transgênicas
de Arabidopsis thaliana.
Functional evaluation of sugarcane genes differentially expressed
under drought in transgenic plants of Arabidopsis thaliana.
Campinas-SP 2016
Vanessa Regina Gonçalves
Avaliação Funcional de Genes de Cana-de-Açúcar
Diferencialmente Expressos sob Seca em Plantas
Transgênicas de Arabidopsis thaliana.
Functional evaluation of sugarcane genes differentially
expressed under drought in transgenic plants of Arabidopsis
thaliana.
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Genética e Biologia Molecular, na área de Genética vegetal e Melhoramento.
Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Genetics and Molecular Biology, in the area of Plant Genetics and Breeding.
Orientador: MARCELO MENOSSI TEIXEIRA
CAMPINAS 2016 ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA VANESSA REGINA GONÇALVES E ORIENTADA PELO MARCELO MENOSSI TEIXEIRA.
Campinas, [21/12/2016].
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof.(a) Dr.(a). Monalisa Sampaio Carneiro
Prof.(a). Dr.(a). Antonio Vargas de Oliveira Figueira
Prof.(a) Dr(a). Jorge Mauricio Costa Mondego Prof.(a) Dr(a). Cleverson Carlos Matiolli
Prof.(a) Dr(a). Marcelo Menossi Teixeira
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Tentarei agradecer aqui a todas as pessoas que fizeram parte deste trabalho de doutorado:
Agradeço primeiramente aos meus pais, meus avós e meu irmão pela confiança e incentivo em todos os momentos da trajetória de minha vida.
Ao CNPq e Capes pelo apoio financeiro.
Ao meu orientador, professor Dr. Marcelo Menossi por ter me aceitado em seu laboratório e por ter confiado na minha capacidade de iniciar um trabalho totalmente
novo em que eu tinha pouca experiência.
Ao Prof. Dr. Dirk Inzé poraceitar me orientar em seu laboratório no VIB, UGent. À Nathalie Gonzalez por me orientar durante todo o tempo que estive no VIB.
À Andrea Akemi por ter me acompanhado nos primeiros 6 meses. Aos meus amigos e colegas de laboratório: Zé, Rafa, Agustina, César, Tiago, Camila Cunha, Camila Purchatti, Daniela, Lara, Victoria, Claudiana, Giovanna,
Germana.
Aos meus amigos Giane, Max e Thaís por todo apoio e companheirismo. À Isabella Poletto por toda amizade, trabalho, parceria e paciência durante
muitas fases deste trabalho.
Ao meu amigo Valter Alessio que esteve sempre do meu lado em todos os momentos.
Ao Pedro e Lucia por terem participado de algumas fases deste trabalho. Aos meus amigos e colegas do VIB: Dorota, Marieke, Núbia, Tin, Xiaohuan, Jonas, Jasmien, Balkan, Lisa, Gabriela, Hannes, Bianca, Paula, Judith e Raf
Aos meus amigos: Crystalla, YounJeong, Fabiola, Kun, Rahul e Alex, por terem me recebido com tanto carinho.
Aos profissionais e técnicos do VIB: Mattias, Liesbeth, Stijn e especialmente à Katrien por toda a ajuda também nos finais de semana.
A todos os professores e funcionários do departamento de genética e biologia molecular da Unicamp.
Obrigada a todos vocês que foram fundamentais para tornar essa jornada menos difícil e ajudaram na conclusão deste trabalho.
Resumo
Dentre os países produtores da cana-de-açúcar, o Brasil é o maior produtor mundial e pioneiro no uso de energia renovável pelo programa bioetanol. A seca é o estresse abiótico que mais afeta o desenvolvimento das plantas e causa prejuízos na agricultura. Por esse motivo é crescente o interesse em desenvolver novas variedades de cana-de-açúcar mais tolerantes a esse estresse para maior expansão da cultura. A superexpressão gênica em planta modelo é uma das ferramentas para identificar genes envolvidos nas respostas ao estresse hídrico, sendo que essa tecnologia pode auxiliar na produção de cultivares de cana-de-açúcar melhor adaptados a ambientes desfavoráveis. Assim, o principal objetivo desse trabalho foi identificar genes de cana-de-açúcar que podem proteger a planta da seca. Ao todo, 18 genes de cana-cana-de-açúcar foram transformados em Arabidopsis thaliana e a expressão de 15 genes foi confirmada em três eventos independentes de plantas transgênicas. As plantas de Arabidopsis superexpressando os genes de cana foram submetidas ao estresse hídrico severo, por suspensão de rega, e ao estresse hídrico moderado, em que as plantas foram submetidas a uma irrigação limitada. Plantas superexpressando quatro dos genes avaliados foram capazes de se recuperar após o tratamento por suspensão de rega. O estresse osmótico induzido por sorbitol realizado in vitro sugeriu também o envolvimento de um desses genes na tolerância ao estresse osmótico severo. Destas, plantas superexpressando três genes também apresentaram melhor crescimento sob solo com quantidade de água limitada, quando comparadas com as plantas utilizadas como controle. Entretanto, para um dos três genes, apenas uma das linhagens de superexpressão foi bem sucedida ao estresse moderado. Neste trabalho plantas de Arabidopsis transgênicas permitiram a avaliação de genes de cana-de-açúcar envolvidos no estresse por seca. Além disso, mostramos que genes envolvidos na tolerância à seca por suspensão de rega também podem proteger a planta em condições moderadas de estresse, sendo esta uma importante estratégia que ajuda prever o comportamento das plantas no campo.
Among sugarcane producing countries, Brazil is the world's largest producer and pioneer in renewable energy due to a consolidated bioethanol program. Drought is a major abiotic stress that affects plant development and causes damage in agriculture. For this reason, the interest in developing new sugarcane varieties more tolerant to drought is growing to expand the culture. Gene over-expression in a model plant is one of the tools to identify genes involved in water stress responses, and this technology can help the production of sugarcane cultivars better adapted to unfavorable environments. Thus, the main goal of this work was to identify sugarcane genes that can protect plants from drought stress. In total, 18 sugarcane genes were transformed into Arabidopsis
thaliana and the expression of 15 genes was confirmed in three independent transgenic
events. Arabidopsis over-expressing the sugarcane genes were exposed to severe stress by water withholding, and to moderate stress, in which plants were subjected to limited irrigation. Plants over-expressing four genes were able to survive after the water deprivation treatment. Data from in vitro stress assays using sorbitol also suggested the involvement of one of these genes in severe osmotic stress tolerance. Plants over-expressing three genes also grew better under a limit amount of water when compared with plants used as control. However, for one of the three genes, only one over-expression line was successful under moderate stress. In this work, Arabidopsis transgenic plants allowed the evaluation of sugarcane genes involved in drought stress. In addition, we have shown that genes involved in drought tolerance by water deprivation can also protect plants under moderate stress conditions, an important strategy that may help to predict the behavior of plants in the field.
Sumário
Introdução Geral: ... 10
O estresse por seca ... 10
Cana-de-açúcar no Brasil e sua relação com o estresse hídrico ... 11
Estudos moleculares em cana-de-açúcar ... 13
O déficit hídrico pode causar diferentes níveis de estresse ... 14
Ensaios de tolerância in vitro. ... 16
O uso de planta modelo para transformar genes de cana-de-açúcar. ... 17
Transformação de Arabidopsis thaliana em larga escala ... 19
Objetivo Geral:... 21
Objetivos Específicos: ... 21
Capítulo 1 ... 22
Transformação em Larga Escala ... 22
1. Resumo do Capítulo ... 23 2. Introdução ... 24 3. Material e Métodos ... 25 4. Resultados ... 32 5. Discussão ... 45 6. Conclusões ... 46 Capítulo 2 ... 53
Sugarcane Genes Involved in Drought Tolerance. ... 53
1. Abstract... 54 2. Introduction ... 54 3. Results ... 56 4. Discussion ... 60 5. Experimental Procedures ... 63 Capítulo 3 ... 82
Resultados Complementares: Estresse por Seca in vitro ... 82
3. Material e Métodos ... 85 4. Resultados ... 86 5. Discussão ... 91 6. Conclusões ... 92 Discussão Geral ... 93 Conclusão Geral ... 97 Referências Bibliográficas ... 98
Introdução Geral: O estresse por seca
Os efeitos da seca sobre o crescimento e desenvolvimento das plantas têm sido amplamente estudados devido a sua importância para a natureza e a agricultura. Dentre os principais recursos físico-químicos utilizados pelas plantas (água, nutrientes, gás carbônico, oxigênio e luz solar) a água é o recurso mais limitante (Boyer, 1982). Devido ao aumento da temperatura global e a consequente escassez de água, é esperado que os episódios de estresse hídrico sejam mais frequentes ou severos nas plantas cultivadas (Dai, 2013). Atualmente, a redução da disponibilidade hídrica é a principal causa de prejuízos econômicos na agricultura, pois afeta decisivamente o desenvolvimento das plantas. A seca ocorre quando o período de precipitação é abaixo do normal e pode ser definida como a redução na disponibilidade de água no solo (Boyer, 1982).
Em resposta à deficiência de água no solo, as plantas podem apresentar escape da seca (drought avoidance) ou tolerância à seca (drought tolerance). Escape da seca é a habilidade das plantas completarem o seu ciclo de vida antes da seca se tornar severa. Já a tolerância à seca pode ser com alto status hídrico dos tecidos, através de manutenção de absorção de água e redução da perda de água, ou alternativamente, com baixo status hídrico dos tecidos, por manutenção do turgor e tolerância à desidratação ou dissecação (Blum, 2005; Durães et al., 2004; Harb et al., 2010). Normalmente, a estratégia das plantas envolve uma mistura dos tipos de respostas ao estresse, a qual também pode variar de acordo com o genótipo (Chaves, 2002; Verslues et al., 2006).
O fechamento estomático, a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e diversas alterações metabólicas são respostas comuns quando as plantas são submetidas ao estresse hídrico. De uma maneira geral, as plantas evoluíram para responder a déficits hídricos de curto e longo prazo. Em curto prazo, o equilíbrio de captação e perda de água das plantas é regulado principalmente pelo fechamento dos estômatos. Já em longo prazo, ocorrem mudanças no crescimento da raiz e da parte aérea (levando a um aumento da relação raiz/parte aérea), aumento capacidade de armazenamento de água no tecido e da espessura da cutícula (Harb et al., 2010;
para maximizar a absorção de água são da maior importância. Em conjunto, essas respostas levam ao ajuste na taxa de crescimento das plantas, aumentando a capacidade adaptativa o que leva à sobrevivência durante períodos de estiagem. A atividade estomática afetada pelo déficit hídrico influencia a absorção de CO2, e,
consequentemente, a fotossíntese e o crescimento das plantas (Grantz, 1989; Osakabe et al., 2014). Quando em condições de estresse por seca, as plantas produzem o hormônio ácido abscísico (ABA) responsável por atuar na rápida ativação de uma cascata de reações fisiológicas que controlam o fechamento dos estômatos e inibem o crescimento (Osakabe et al., 2014). Assim, as plantas podem desenvolver diferentes respostas morfológicas e fisiológicas quando são submetidas ao estresse por seca.
Cana-de-açúcar no Brasil e sua relação com o estresse hídrico
Existem mais de 90 países produtores de cana-de-açúcar no mundo especialmente em países em desenvolvimento. Dentre esses países, o Brasil é o líder com uma produção anual de 667 mil toneladas de cana colhidas na safra 2015-2016 (Unica, 2016). Além disso, o país é pioneiro no uso de energia renovável através do programa do bioetanol (Goldemberg, 2007; Pippo and Luengo, 2013). A lavoura da cana-de-açúcar continua em expansão no Brasil, sendo o Estado de São Paulo o maior produtor com 52,3% da área cultivada (CONAB, 2016). Apesar da instabilidade climática em algumas regiões, a perspectiva é de crescimento de 2,9% na produtividade para a próxima safra. Atualmente, do total de cana-de-açúcar processada pela indústria sucroalcooleira, 58%se destina à fabricação de açúcar e 42% são utilizados na produção de álcool anidro (CONAB, 2016). Uma das principais questões discutidas são os esforços em obter combustíveis renováveis e menos poluentes, sendo que o bioetanol ajuda a atenuar as emissões de gases de efeito estufa de forma eficiente (Goldemberg, 2007). Por isso, cresce cada vez mais o interesse mundial pela produção do álcool, fazendo da cana-de-açúcar uma das mais importantes espécies vegetais cultivadas em todo o mundo.
A utilização da irrigação em culturas extensivas como a cana sofre limitações práticas e o uso de variedades que necessitem de menor quantidade de água é
importante também do ponto de vista da sustentabilidade ambiental. A seca é um dos principais estresses abióticos que atingem a cultura da cana-de-açúcar, sendo o desenvolvimento de variedades tolerantes um dos objetivos centrais dos programas de melhoramento genético no Brasil. Além disso, variedades tolerantes podem favorecer a expansão da cultura para o Centro-Oeste brasileiro, região caracterizada por altas temperaturas e por uma precipitação hídrica irregular durante o ano (CONAB, 2016). Nesse contexto, é importante conhecer como atuam os mecanismos ativados em resposta aos diferentes tipos de estresses aos quais as plantas estão constantemente submetidas. Esse conhecimento pode contribuir para a identificação de genes alvos potenciais para o melhoramento genético.
A cana-de-açúcar (Saccharum sp.) é um complexo poliplóide pertencente à família Gramineae (Poaceae) e possui um genoma semelhante ao do gênero Sorghum (Guimarães et al., 1997). É uma das mais importantes espécies vegetais cultivadas por possuir grande importância econômica principalmente em regiões tropicais. As variedades modernas foram desenvolvidas a partir do cruzamento interespecífico das espécies S. officinarum e S. spontaneum, seguido por uma série de retrocruzamentos com outras variedades de S. officinarum. Por isso, a cana-de-açúcar apresenta um genoma complexo, com nível de ploidia variável, com muitos eventos de recombinação e translocação, o que dificulta a aplicação das técnicas de melhoramento genético por cruzamentos (Cuadrado et al., 2004; Guimarães et al., 1997).
Em condições extremas, a seca pode desencadear alterações irreversíveis que podem levar a planta à morte. Dentre as alterações morfológicas mais comuns da cana, podemos destacar: a inibição da germinação dos toletes, pois não ocorre a emissão da raiz e consequentemente absorção de água e nutrientes; no palmito ocorre a inibição da formação de novas folhas e consequente redução do índice de área foliar; redução da elongação de folhas e de colmos; enrolamento das folhas (em algumas variedades), que leva à redução na área de captação de luz solar (Inman-Bamber and Smith, 2005). Ao nível celular o estresse hídrico acarreta em redução do tamanho das células e do comprimento dos cloroplastos, aumento da espessura da cutícula superior e inferior, entre outras modificações (Zhang et al., 2015).
Atualmente, a transformação gênica é uma importante ferramenta que pode contribuir para o aperfeiçoamento de programas de melhoramento genético de plantas, como forma de se obter variedades superiores. Na maioria dos casos a transformação genética requer o conhecimento prévio da sequência completa dos genes que serão introduzidos. O arroz foi a primeira cultura a ter seu genoma sequenciado em 2005 (Sequencing Project, 2005). Desde então, outras culturas tiveram seu genoma publicado. Entretanto, o genoma da cana-de-açúcar ainda não foi completamente sequenciado, mas para estudos sobre expressão e regulação, o projeto genoma da cana SUCEST-FUN (http://sucest-fun.org) dispõe mais de 238 mil ESTs e 14 mil clusters no banco de dados (Vettore et al., 2003).
Os estudos sobre base molecular da tolerância à seca em cana-de-açúcar são escassos. Um dos estudos disponíveis mostra plantas de cana submetidas a estresses abióticos e bióticos, como suspensão de rega, ataque de insetos e tratamentos com hormônios que apresentaram diversos genes diferencialmente expressos, com respostas semelhantes às encontradas em plantas de arroz, milho e Arabidopsis
thaliana submetidas aos mesmos tratamentos (Rocha et al., 2007). Outro estudo
comparou a expressão de genes em folhas de variedades contrastantes para o nível de tolerância ao estresse hídrico: SP83-5073, considerada mais tolerante e SP90-1638, considerada mais sensível à seca (Rodrigues et al., 2009). A variedade sensível apresentou expressão diferencial de 432 genes em resposta ao estresse hídrico, enquanto que a variedade mais tolerante apresentou 165 genes diferencialmente expressos. Nas duas variedades, a maioria dos genes foi induzida na condição de seca quando comparados ao nível transcricional observado nas plantas irrigadas. Apenas 91 genes foram comuns entre as duas variedades (Rodrigues et al., 2009).
Desde 2007 nosso grupo faz parte um consórcio de universidades com o objetivo de avaliar as respostas da cana à seca em condições de campo. A abordagem empregada envolve a integração de análises de diversas características agronômicas, fisiológicas, e transcriptômicas, incluindo microtranscritoma. Em um trabalho, foram utilizadas duas variedades de maior tolerância (RB867515 e RB92579) e uma de menor tolerância (RB855536), mantidas em campo sob irrigação ou em sequeiro com análises
realizadas em três fases do desenvolvimento: aos três meses (fase inicial de perfilhamento), aos 7 meses (fase de crescimento) e 11 meses (fase de maturação). As análises do transcriptoma (cerca de 14.000 genes em chips da Affymetrix) foram feitas com folha e entrenó 1 (que contém o meristema apical foliar). No total, 1041 genes apresentaram expressão diferencial quando foram comparadas plantas mantidas sob irrigação e plantas estressadas por seca (Glaucia M. Souza, dados não publicados). Ainda com essas plantas, também foram realizadas análises de microtranscritoma em que alguns candidatos alvos de microRNAs modulados por seca foram identificados (Ferreira et al., 2012; Gentile et al., 2013). Esses e outros dados de genes diferencialmente expressos são uma importante ferramenta, pois possibilitam identificar genes associados às condições de estresses empregadas.
O déficit hídrico pode causar diferentes níveis de estresse
A maior parte do conhecimento sobre genes envolvidos na resposta das plantas contra a seca é baseado em experimentos de estresse hídrico induzido por suspensão total de rega, realizados em condição controlada em laboratório. Um grande desafio da pesquisa relacionada ao estresse abiótico é traduzir para o campo a pesquisa básica de estresse severo feita em Arabidopsis e outros organismos modelos, que buscam esclarecer os mecanismos moleculares pelos quais as plantas detectam e respondem ao estresse abiótico.
Nesses experimentos, os pesquisadores visam principalmente uma análise comparativa entre fenótipos selvagens e transgênicos submetidos às condições extremas de estresse hídrico. O método mais comum é o de estresse progressivo de plantas adultas em que a água é suspensa até serem observados sintomas de murchamento. Esse método é usado para determinar a taxa de sobrevivência entre plantas transgênicas e selvagens (Cha et al., 2015; Yu et al., 2013). Entretanto, na natureza a seca ocorre durante períodos curtos durante os quais as plantas são capazes de sobreviver e completar o seu ciclo de vida. Na agricultura, o sucesso não está apenas na habilidade das plantas de deixar descendentes, mas principalmente na produtividade, sendo que a quantidade limitada de água normalmente resulta na perda de biomassa (Boyer, 1982).
moderado, a condutância estomática reduziu drasticamente em quase 50% no primeiro dia de estresse, mas a fotossíntese foi reduzida em apenas 10% quando comparado com as plantas em condições normais de rega. Sob essas condições, a redução estomática e o crescimento radicular têm o potencial de aumentar a produtividade no campo (Verslues et al., 2006).
Em experimentos com Arabidopsis in vitro, a expressão de vários genes foi afetada pelo déficit hídrico induzido por diferentes concentrações de manitol, sorbitol, NaCl e H2O2 (Claeys et al. 2014). Os resultados mostraram que existe correlação entre
a dosagem do indutor e a resposta das plantas, que tendem a reduzir drasticamente a área da roseta e diminuir a taxa de germinação conforme a dose utilizada. Consequentemente, o padrão de expressão de genes induzidos ou reprimidos em cada uma das condições de estresse muda significativamente, sugerindo que diferentes grupos de genes são ativados dependendo do nível de estresse ao quais as plantas foram submetidas (Claeys et al. 2014).
O padrão de expressão gênica também difere entre estresse hídrico severo e moderado. Dados de microarranjo mostram que em condições moderadas genes relacionados com a expansão celular, como os genes EXPANSIN (EXPA3, EXPA4,
EXPA8, EXPA10 e EXPANSIN-LIKE B1), são induzidos após um dia de tratamento,
mas em condições de suspensão de rega estes genes são reprimidos ou não são diferencialmente expressos (Harb et al., 2010). Uma análise abrangendo trabalhos de seca realizados em solo, envolvendo seca severa e moderada, mostrou que apenas 3.116 genes de um total de 18.613 são comuns à resposta entre os níveis de estresse. Além disso, nesse mesmo trabalho foi observado que 87 genes de um total de 364 foram específicos de folhas jovens sob estresse moderado (Clauw et al., 2015). Isto indica que a resposta ao estresse não muda somente em função ao nível do estresse, mas também de acordo com o estágio de desenvolvimento da planta. Em cana-de-açúcar também já foram observadas diferenças entre expressão gênica em tratamentos de estresse hídrico severo, moderado e leve (Rodrigues et al., 2009). De um total de 432 genes, apenas 6 genes foram comuns aos três tratamentos e 192 foram específicos ao tratamento severo (Rodrigues et al., 2009).
Plantas de Arabidopsis thaliana selvagens cultivadas em constante nível de estresse hídrico moderado resultam na redução gradual da taxa de crescimento chegando até 30–40% de redução de área foliar (Skirycz et al., 2011). Esse mesmo estudo mostra que a sobrevivência sob condições de estresse severo não é um indicativo de que as plantas também serão capazes de obter bom desempenho sob condições de estresse moderado. Linhagens com ganho ou perda de função que demonstram serem maiores do que o selvagem em condições controle, também tendem a manter esse padrão em condições de estresse moderado (Skirycz et al., 2011).
É importante ressaltar que linhagens resistentes ao estresse severo também podem apresentar baixa produtividade. Um exemplo são as linhagens superexpressando os fatores de transcrição AP37 e AP59 de arroz que possuem domínio APETLA2. Enquanto ambas foram tolerantes à seca por suspensão de rega, apenas a superexpressão do gene AP37 apresentou produção de grãos maior (57%) que o selvagem sob condições de seca severa, as plantas com o gene AP59 tiveram uma redução na produção de grãos de até 43% (Oh et al., 2009).
Ensaios de tolerância in vitro.
Apesar dos experimentos de estresse osmótico in vitro não representarem fielmente os experimentos realizados com plantas cultivadas no solo, eles oferecem grandes vantagens em estudos laboratoriais devido à facilidade de manipulação das plantas, a viabilidade de crescer um grande número de plantas em espaço limitado e uma maior reprodutibilidade dos resultados (Verslues et al. 2006; Claeys et al. 2014). Embora seja difícil mensurar o quanto relevante são esses dados quando comparados com os de experimentos em solo, experimentos de seca in vitro e em solo muitas vezes geram fenótipos semelhantes. Em Arabidopsis, a superexpressão do microRNA
miR172c de soja resulta em aumento da tolerância a salinidade e a seca (Li et al.,
2015). Também em Arabidopsis, o experimento conduzido por Brini et al. (2007) mostrou tolerância ao estresse salino in vitro em algumas linhagens e esse fenótipo também é observado quando reproduzido em solo. Além dos trabalhos apresentados, muitos outros mostram resultados semelhantes em resposta ao estresse abiótico
et al., 2014; Zhang et al., 2010). Assim, os experimentos de estresse abiótico in vitro podem ser uma alternativa para o estudo de uma grande quantidade de diferentes linhagens.
O uso de planta modelo para transformar genes de cana-de-açúcar.
Arabidopsis thaliana é a planta modelo mais utilizada para a análise funcional de
genes, mesmo que a planta doadora do gene de interesse seja evolutivamente distante, como nos casos de milho, arroz, entre outras monocotiledôneas (Dong, 2001; Murakami et al., 2007). Apesar de mono e dicotiledôneas serem fundamentalmente diferentes, grande parte das proteínas possui funções conservadas (Koornneef and Meinke, 2010; Rine, 2014).
Genomas de plantas cultivadas normalmente são grandes e complexos, as quais normalmente possuem ciclo de vida longo e a maioria é de difícil transformação. Além do genoma ainda pouco conhecido, a cana-de-açúcar possui ciclo de vida longo, grande porte e poliploidia, o que dificulta seu processo de transformação (Ming et al., 2001). Em contraste, plantas de Arabidopsis são utilizadas como organismo modelo em estudos de genética básica e biologia molecular devido principalmente: ao seu ciclo de vida curto, pelo porte pequeno, que limita a exigência de instalações laboratoriais, por ser autógama, por produzir uma grande quantidade de sementes e pelo genoma pequeno e sequenciado (Koornneef and Meinke, 2010). Além disso, Arabidopsis possui amplos recursos genéticos disponíveis, como mutantes de inserção para diversas características, mapas físicos e genéticos de seus cromossomos e alta eficiência de transformação via agrobactéria. Assim, Arabidopsis é um modelo útil para estudos de tolerância à seca por manipulação genética, sendo que o conhecimento gerado dentro do laboratório pode ser transferido para espécies em condição de campo.
Desta maneira, utilizar a tecnologia de superexpressão de genes em planta modelo é uma alternativa para a caracterização funcional de genes de cana-de-açúcar envolvidos nas respostas da planta a diferentes tipos de estresse. O homólogo em cana-de-açúcar de NOD26-like intrinsic protein 2 (SspNIP2), quando superexpresso em tabaco, resulta em tolerância a salinidade em plantas adultas (Park et al., 2015). Além
disso, o conteúdo relativo de água nas folhas das plantas transgênicas foi maior quando comparado com as folhas de plantas selvagens ao longo do tratamento (Park et al., 2015). Também em plantas de tabaco transgênicas, o gene Scdr1de cana-de-açúcar quando superexpresso aumenta a tolerância das plantas ao estresse por irrigação com solução de manitol e NaCl, também devido a maior retenção de água nas linhagens transgênicas (Begcy et al., 2012).
Diversos autores já mostraram alguns fenótipos em Arabidopsis devido à expressão ectópica de genes de plantas cultivadas, sendo a maior parte desses estudos sobre genes envolvidos na resposta das culturas à seca. A superexpressão dos genes de trigo que codificam uma H+-PPase (TVP1) e um Na+/H+ antiporter (TNHX1) em Arabidopsis aumenta a resistência das plantas sob médias e altas concentrações de NaCl, além de aumentar a tolerância das plantas ao estresse hídrico quando comparadas com plantas selvagens (Brini et al., 2007). Outro exemplo é o gene
OsMYB3R-2 de arroz cuja superexpressão em Arabidopsis leva ao aumento de
tolerância à seca, ao frio e à salinidade (Dai et al,. 2007). Em condições de estresse severo por suspensão total de rega, 85% das plantas sobreviveram após uma semana de reidratação; enquanto que apenas 26% das plantas selvagens se recuperaram do tratamento (Dai et al,. 2007). A tabela 1 resume alguns dos dados já descritos na literatura.
Planta de interesse econômico Ortólogo nativo superexpresso Fenótipo observado Referência
Mamona LEC2 Induz a maturação
de sementes (Kim et al., 2014)
Pimenta pCaSRP1 Rápido crescimento
e tolerância à seca (Kim et al., 2010) Arruda-Caprária GoPIP1 Aumenta a razão de
roseta/raiz, causa Sensibilidade à seca
(Li et al., 2015)
Algodão GhRAV1 Sensibilidade ao
ABA, NaCl e à seca (Li et al., 2015)
Trigo TaSnRK2.8 Aumenta o
comprimento da raiz primária e tolerância à seca, ao frio e à salinidade
(Zhang et al., 2010)
Soja miR172c t Tolerância à
salinidade e seca (Li et al., 2015)
Arroz OsMYB3R-2 Tolerância à seca,
frio e salinidade (Dai et al,. 2007) Trigo TVP1 e TNHX1 Tolerância à
salinidade e seca (Brini et al., 2007)
Por meio dos estudos de ganho de função em Arabidopsis já foi possível identificar genes de interesse com uma potencial aplicação econômica se manipulados em plantas cultivadas. Por exemplo, SNAC1,que aumenta tolerância à seca e salinidade das plantas transgênicas adulta de arroz (Hu et al., 2006) e ZmNF-YB2, que confere tolerância à seca no milho em experimento realizado em campo (Nelson et al., 2007).
Transformação de Arabidopsis thaliana em larga escala
Nem sempre a geração de mutantes por perda de função de um único gene mostra um fenótipo claro, pois muitos genes são redundantes, com mais de uma cópia. Assim, a caracterização por ganho de função é uma alternativa que permite identificar a relação entre a função e o fenótipo principalmente quando o gene pertence a famílias gênicas (Kondou et al., 2010). A transformação em larga escala em Arabidopsis é uma
ferramenta importante para o estudo de ganho de função (Ichikawa et al., 2006; Kondou et al., 2010; Weiste et al., 2007; Xiao et al., 2010). O primeiro estudo denominado “The FOX-hunting system” foi publicado por Ichikawa et al. 2006, no qual 10.000 cDNAs não redundantes e completos de Arabidopsis foram inseridos em um vetor de superexpressão controlada pelo promotor forte CaMV 35S, as construções foram transformadas em Arabidopsis gerando 15.547 linhagens transgênicas e 1487 fenótipos alterados.
Uma ferramenta importante para os estudos em larga escala é o sistema Gateway (Life Technologies), que facilita a transferência de fragmentos de DNA entre vetores através da recombinação entre sítios específicos (sítios att). O sistema Gateway é um método rápido e direcional de clonar genes e promotores (Curtis and Grossniklaus, 2003). Portanto, a associação da clonagem em larga escala, utilizando o sistema Gateway, com a transformação de uma espécie modelo Arabidopsis thaliana, pode viabilizar a análise funcional de um grande número de genes de cana induzidos por seca.
Dentre as ferramentas que podem ajudar na compreensão de sistemas complexos em resposta de defesa a estresses, o uso de linhagens com ganho ou perda de função de plantas modelos como Arabidopsis thaliana é a alternativa mais eficiente. A tecnologia Gateway e o sistema em larga escala de transformação podem permitir que muitas linhagens transgênicas de Arabidopsis sejam avaliadas para uma característica de interesse agronômico em curto prazo. A elucidação desses mecanismos moleculares de resistência ao estresse hídrico pode ser útil para a melhoria dos rendimentos das culturas por manipulação genética. Considerando que a cana é uma cultura que muitas vezes sofre com a seca, as descobertas em Arabidopsis poderão levar ao desenvolvimento de novas variedades de cana-de-açúcar mais resistentes aos diferentes níveis de estresse.
O objetivo geral foi aprofundar a caracterização funcional de genes de cana-de-açúcar que podem proteger a planta da seca, de forma a identificar genes com potencial biotecnológico para produção de cana com maior tolerância à seca.
Objetivos Específicos:
1. Selecionar e clonar 192 ESTs de cana-de-açúcar em vetor Gateway para estabelecer um sistema em larga escala.
2. Obter um grande número de linhagens transgênicas superexpressando diferentes genes de cana em Arabidopsis thaliana, para identificar em curto prazo genes que conferem tolerância à seca.
3. Avaliar as linhagens transgênicas em condições severas e moderadas ao estresse hídrico em solo para identificar plantas tolerantes e sem efeitos colaterais deletérios.
4. Avaliar as linhagens transgênicas em condições severas e moderadas ao estresse osmótico realizado in vitro com a finalidade de complementar os dados sobre o papel desempenhado pelos diversos genes.
Capítulo 1
1. Resumo do Capítulo
A transformação gênica em plantas é uma importante estratégia nos estudos de tolerância ao estresse hídrico. Os sistemas em larga ou mini escala podem facilitar a identificação de genes de cana-de-açúcar envolvidos na tolerância à seca e devem contribuir para o desenvolvimento de variedades superiores melhor adaptadas a ambientes desfavoráveis. Essas metodologias recentemente desenvolvidas permitem que um grande número de genes seja avaliado simultaneamente empregando plantas transgênicas de Arabidopsis thaliana. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um sistema em larga escala partindo de um conjunto de 192 genes de cana, utilizando como modelo A. thaliana. Nós desenvolvemos 144 pares de primers para a amplificação individual dos genes e 50 clones distintos foram identificados; destes, 47 estavam na orientação correta. As análises revelaram que houve um grande número de colônias correspondente a um mesmo gene, bem como muitos genes com apenas um único clone representado. Assim, cada construção em vetor de destino pGWB608 foi transformada separadamente em Arabidopsis, resultando em 15 genes transformados. Todos os dados relatados neste trabalho são informativos e relevantes para a tecnologia de transformação em larga escala.
2. Introdução
A agricultura no Brasil contribui de forma importante para o fornecimento de energia no país. Uma das razões da cana ser um mercado em expansão é de que atualmente 42% da energia renovável da agricultura são compostas pela biomassa da cana-de-açúcar. (OCDE (Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico) and FAO (Food and Agriculture Organization), 2016). No entanto, a cana é afetada por diversos estresses abióticos como a seca, o que faz necessário a produção de cultivares que apresentem um melhor desempenho sob rega reduzida ou chuvas escassas.
Microarranjos de cDNA permitem identificar um grande número de genes candidatos envolvidos na regulação por seca (Seki, 2001; Singh et al., 2002). Alguns são genes fatores de transcrição, proteínas de transporte, quinases, mas a maioria ainda possui função pouco ou completamente desconhecida e a compreensão da função dessas proteínas podem resultar em variedades mais tolerantes ao estresse hídrico (Rocha et al., 2007; Rodrigues et al., 2009).
Uma das maneiras de acelerar a caracterização dos genes de cana-de-açúcar é utilizando sistemas em larga ou mini escala (Fujita et al., 2007; Higuchi-Takeuchi et al., 2013; Nakamura et al., 2007). A tecnologia “FOX-hunting system” pode ter muitas aplicações em diversos tipos de triagem de genes candidatos. Num estudo de mini escala, uma biblioteca de 43 fatores de transcrição responsivos ao estresse salino revelou que a superexpressão do gene de arroz AtbZIP60 em Arabidopsis thaliana aumenta tolerância ao estresse (Fujita et al., 2007).
Dentre os motivos que levam Arabidopsis thaliana a ser considerada uma planta modelo está a facilidade de transformação, sendo que uma única planta pode ser capaz de gerar até 20.000 sementes em poucas semanas (Tissier et al., 1999). Por causa de seu pequeno porte e facilidade de manipulação é possível analisar parâmetros fenotípicos de um grande número de plantas, tais como: taxa de germinação, área total da roseta, produção e tamanho das flores, produção total de sementes por síliqua, comprimento de raiz (Boyes et al., 2001). Também é possível expor uma grande quantidade de plantas a estresses com diferentes níveis de seca, frio e salinidade com a finalidade de identificar quais são as condições críticas de cada estresse capazes de
provenientes da própria Arabidopsis, de outras espécies de plantas (Dai et al., 2007; Kim et al., 2010) ou até mesmo de leveduras (Miranda et al. 2007) é uma técnica eficiente na identificação de genes que conferem maior tolerância ao estresses abióticos (Dai et al., 2007; Yu et al., 2015).
Assim, neste trabalho buscamos desenvolver um sistema em larga escala empregando Arabidopsis como modelo para caracterizar genes de cana-de-açúcar de diversas famílias, a fim de se observar o ganho de função através do fenótipo.
3. Material e Métodos
3.1. Identificação de genes de cana-de-açúcar associados à tolerância à seca
Para a seleção dos genes a serem clonados e transformados foram utilizados genes de cana-de-açúcar diferencialmente expressos em folhas em resposta à seca, identificados em ensaios de microarranjos DNA realizados pelo grupo liderado pela professora Glaucia Souza (IQ/USP, dados não publicados), de macroarranjos (Rodrigues et al., 2009), bZIPs induzidas por ABA (Schlögl et al., 2008) e de dados de microarranjos de arroz (Rabbani et al., 2003).
Com base nestas listas de genes diferencialmente expressos, foram escolhidos aqueles cujas sequências estavam completas no banco de dados SUCEST-FUN (Sugarcane Expressed Sequence Tag) (http://sucest-fun.org), ou apenas com a primeira metionina (Met) presente. Para as sequências que possuíam o primeiro aminoácido e não continham o códon terminador, foi solicitado ao BCCCenter (UNESP, Jaboticabal) o sequenciamento completo da região codificante. A análise foi realizada através do alinhamento da sequência de aminoácidos e de nucleotídeos de cana-de-açúcar com sequências de espécies próximas, como sorgo, milho ou arroz, obtidas no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), utilizando os programas Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), (Altschul et al., 1990), BioEdit (Hall, 1999) e Clustal W (Thompson et al., 1994).
Foram desenvolvidos oligonucleotídeos diretos e reversos (primers forward e
reverse) baseados na sequência dos genes e do alinhamento dos clones encontrados
no SUCEST, para a posterior amplificação por reação de polimerase em cadeia (PCR) da região codificante de todos os genes selecionados. Ao primer forward foi incluída a sequência CACC, na terminação 5’, que garante a incorporação direcional em até 90% do produto da reação de PCR no vetor de entrada, descrito no item 4.4. A temperatura de anelamento de cada primer foi analisada através da ferramenta OligoAnalyzer3.0 (http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx/oligocalc.asp).
3.3. Amplificação por PCR
Os primers elaborados acima foram usados para amplificar os genes selecionados através da preparação de extração de plasmídeo dos clones adquiridos do BCCCenter (UNESP, Jaboticabal). Para a reação de amplificação foram utilizados
primers forward e reverse 0,2 M; dNTPs 0,2mM, tampão 5x Phusion HF com 7,5 mM
de MgCl2 e DNA polimerase Phusion High-Fidelity (Thermo-Scientific). Em alguns
casos, quando o fragmento gênico continha regiões com alto teor de GC, foram usados o tampão 5x Phusion GC e DMSO (5%). A Tabela 2 apresenta o programa padrão utilizado na reação de amplificação pela técnica de PCR.
Tabela 2- Programa padrão utilizado na reação de amplificação via PCR.
Temperatura Tempo Número de ciclos 98°C 30s 1x 98°C 10s 58°C à 63°C 30s 3x 72°C 60s/Kb 98°C 10s 28x 55°C à 60°C 30s 72°C 60s/Kb 72°C 10 min 1x
etídeo, juntamente com o marcador de peso molecular Gene Ruler 1kb Plus (Thermo-Scientific). A visualização foi feita no transluminador MiniBIS Pro (Bio America Biotech). Foram selecionados apenas fragmentos com um só produto amplificado e de tamanho correto. Para a quantificação dos produtos obtidos foi usado o espectrofotômetro NanoDrop (Thermo-Scientific).
3.4. Clonagem no vetor de entrada para superexpressão
Após a amplificação das sequências codificantes dos genes de cana-de-açúcar, cada alíquota de produto de PCR foi misturada e clonada no vetor Gateway de entrada, sem a necessidade de purificação dos produtos de PCR. A reação de ligação foi feita na razão molar de 2:1 de produto de PCR: vetor pENTR/D-TOPO (Life Technologies, Figura 1), de maneira direcional, utilizando a enzima topoisomerase. Após 30 minutos, a reação de ligação foi então transformada em E. coli. quimicamente competente OneShot Mach1 (Life Technologies), de acordo com as instruções do fabricante. A transformação foi incubada em placas contendo meio LB sólido com kanamicina (50
Figura 1-Estrutura esquemática do vetor de entrada. Estrutura esquemática do vetor de entrada pENTR/D-TOPO. O vetor de entrada contém os sítios attL 1 e attL 2 e resistência ao bactericida kanamicina (Invitrogen, 2012).
3.5. Clonagem no vetor de destino
Posteriormente, foi feita a extração de plasmídeo de colônias de E. coli resultantes da transformação do vetor de entrada através da técnica de mini-prep. O Mix desta extração foi usado em reação de recombinação através da enzima LR Clonase (Life Technologies), juntamente com o vetor de destino pGWB608 (Figura 2) (Nakamura et al., 2010). Após 3 horas, a reação foi transformada novamente em E. coli One Shot Mach 1. A transformação foi plaqueada em meio LB sólido e espectinomicina (100 g/ml) e incubada overnight em estufa à 37°C.
Figura 2- Estrutura esquemática do pGWB608. O Cassete Gateway é composto por P35S-attR1-Cmr-ccdB-attR2-6xHis-TNOS. Seleção bactericida a
espectinomicina (Spcr) e ao herbicida glufosinato de amônio (PNOS:bar).
3.6. Sequenciamento das colônias
Cada produto da extração de plasmídeo foi quantificado no NanoDrop, diluído a uma concentração de 100 ng/µl e enviado para sequenciamento de DNA pela empresa Macrogen. Para análise dos eletroferogramas foi utilizado o programa ChromasPro 2.31 (http://en.bio-soft.net/dna/chromas.html).
3.7. Clonagem em Agrobacterium tumefaciens GV3101
Cada um dos genes encontrados no sequenciamento na orientação correta foi transformado individualmente em Agrobacterium tumefaciens GV3101. Após descongelar as células, 1 g do plamídeo resultante da recombinação em vetor pGWB608 foi adicionado as células competentes de Agrobacterium tumefaciens e, em seguida, os tubos foram congelados em nitrogênio líquido. Posteriormente, a agrobactéria foi descongelada à 37°C e 1 ml de LB líquido foi adicionado ao extrato de células. As células em meio de cultura foram incubadas à 28°C, sob agitação, por 3 horas. Depois de crescidas, as células foram transferidas para placas contendo LB sólido com 100 mg/ml de espectinomicina, 50 mg/ml de gentamicina e 30 mg/ml de rifampicina. As placas foram incubadas no escuro por 3 dias à 28°C.
3.8. Transformação de Arabidopsis thaliana
As sementes de Arabidopsis foram germinadas diretamente em solo e vermiculita na proporção 3:1 ou em placas contendo meio Murashige-Skoog (MS). Posteriormente, foi feita a vernalização através da incubação à 4°C no escuro por 3 ou 4 dias. As plantas foram crescidas com temperatura de 22°C à 24°C e 16 h de luz (~120 E m-2 s-1). Para transformação de cada construção foram utilizados 3 potes contendo aproximadamente 10 plantas por pote de 15cm2 (Figura 3). Após 5 semanas de germinação, a primeira inflorescência foi cortada para estimular o crescimento de inflorescências múltiplas.
Para a germinação em placas com meio MS foi necessário esterilizar a superfície das sementes com vapor de cloro. As sementes foram colocadas em tubos de microcentrífuga marcados a lápis dentro de um dissecador contendo um béquer com 200 ml de água sanitária. A cada 1 hora foi colocado 1 ml de ácido clorídrico no béquer e o gás de cloro foi mantido por 4 horas. Para a germinação direta no solo, esse procedimento não foi necessário.
A transformação foi realizada em Arabidopsis thaliana pertencente ao ecótipo Columbia de acordo com o método de floral dip (Clough and Bent, 1998). No primeiro dia, é realizado um pré-inóculo a partir de uma única colônia obtida na transformação de Agrobacterium em 5 ml de meio líquido YEB contendo 100 mg/ml de espectinomicina, 50 mg/ml de gentamicina e 30 mg/ml de rifampicina.O pré-inóculo foi incubado à 28°C sob agitação. No segundo dia, 2 ml do pré-inóculo foram diluídos em 200 ml de meio YEB contendo os mesmos antibióticos e nas mesmas concentrações. O inóculo foi incubado por 16 h à 28C. No terceiro dia, após o inóculo atingir um valor de densidade ótica (OD600) entre 0,8 e 2,0, foi adicionada uma solução fresca de sacarose
a 5% com 0,03% de Silwet L-77 em um volume 4x maior que o volume de
Agrobacterium crescidas.
Após a transformação, as plantas foram deitadas e cobertas com um filme plástico por até 24 h para maior eficiência de transformação. Após esse tempo, as plantas foram colocadas em pé novamente e mantidas na sala de crescimento à 22°C por mais 3 ou 4 semanas até a coleta das sementes.
Figura 3- Potes com Arabidopsis thaliana. Plantas 2 semanas após a germinação, em potes contendo 10 plantas.
3.9. Seleção das plantas transgênicas T1
As plantas transgênicas obtidas da transformação (geração T0) foram selecionadas através de sua resistência ao herbicida glufosinato de amônio (Finale). Optamos pela seleção realizada com herbicida diretamente em solo através de uma solução contendo 0,1% de Finale e 0,01% de Silwet L-77 aplicada a cada 4 dias. Após 2 semanas, as plantas selecionadas foram transferidas separadamente em potes contendo solo e vermiculita.
3.10. Confirmação das plantas transgênicas T1
As folhas das plantas transgênicas foram coletadas para extração de DNA e, em seguida, uma reação de PCR com primers do vetor pGWB608 foi realizada para confirmar a inserção do gene de interesse. Após os eventos serem confirmados, as plantas continuaram a crescer sob as condições normais de 16 h de luz e assim que as primeiras inflorescências começaram a surgir, estas foram isoladas através do sistema Arasystem (Arasystem, Bélgica). Após aproximadamente 6 semanas, as sementes T2 foram coletadas. As plantas dos eventos não confirmados por PCR foram descartadas.
3.11. Produção de linhagens homozigóticas T3.
Nesta etapa, nós tentamos selecionar 6 eventos independentes para cada gene para a produção de linhagens T3 homozigóticas. As sementes T2 foram semeadas em
placas contendo meio MS com 50 M de glufosinato de amônia para selecionar as plantas transgênicas. Através desta técnica, foram selecionados os eventos que tiveram a proporção 3:1 de plântulas desenvolvidas e plântulas apenas com os cotilédones, respectivamente. Isso indica que a planta transgênica tem somente uma única cópia do gene inserido. As placas foram incubadas sob 16 h de luz (100 mol m-2s-1) e após duas semanas foi verificada a segregação.
Foram selecionadas 10 plantas de cada linhagem da geração T2 com apenas uma cópia do gene de interesse para serem cultivadas. A geração T2 teve suas sementes T3 coletadas individualmente para a identificação das repetições homozigóticas; as sementes foram semeadas em placa contendo o mesmo meio MS seletivo conforme descrito anteriormente. A maioria dos indivíduos de cada evento apresentou homozigose na proporção 1:2.
4. Resultados
4.1. Seleção de genes associados à tolerância à seca.
Neste trabalho, nós selecionamos 192 genes induzidos por seca em folhas (Tabela Suplementar 1). Como o genoma de cana não é totalmente sequenciado, foram escolhidos genes que possuíssem sequência transcrita completa (ou com pelo menos a primeira metionina), de acordo com o alinhamento feito entre a sequência dos genes de cana obtidos no banco de dados SUCEST-FUN e de espécies com sequências homólogas encontradas no NCBI. A Figura 4 mostra a distribuição da classificação de acordo com a possível função dos genes selecionados identificada através da análise da Ontologia Gênica (Gene Ontology - GO). A maioria dos genes possui funções desconhecidas. A segunda maior está relacionada com respostas de estresses, adicionalmente alguns fatores de transcrição também foram encontrados.
Figura 4- Classificação da função. Classificação da função gênica de acordo com o GO (Gene Ontology) realizada no ano de 2016.
4.2. Amplificação de regiões codificantes e clonagem.
Para amplificação do gene completo o primer forward precisava iniciar na primeira metionina e o reverse alinhar-se no último aminoácido antes do códon de parada. Contudo, não foi possível escolher regiões com condições ideais para um bom desempenho de amplificação de todos os genes. Alguns dos pares de primers forward e reverse apresentaram grandes diferenças nas temperaturas de anelamento. Além disso, alguns primers apresentaram altos valores de teor de GC (maiores que 70%), o que facilita a formação de grampos e dímeros de primers. Outra dificuldade encontrada foi que alguns genes continham grandes quantidades de GC ao longo de toda sequência. Em alguns casos, esse problema foi resolvido com o uso de um tampão específico para regiões ricas em GC e com a adição de DMSO, usado para inibir a formação de estruturas secundárias e dímeros de primer na reação de PCR (Jensen et al., 2010).
Para conseguir a sequência completa do EST e para nos certificarmos da identidade dos clones comprados, todos foram sequenciados. Entretanto, devido à baixa qualidade do sequenciamento de alguns clones, ao todo obtivemos 179 clones com sequências completas. Além disso, em aproximadamente 30% dos clones, o
5,2% 15,6% 26% 23,9 % 8,3 % 7,3% 5,7% 6,2% 2,1%
sequenciamento não correspondeu ao clone esperado, indicando erro de endereçamento das placas. Devido a esses problemas, foi possível desenharmos pares de primers para 144 genes.
Numa primeira série de amplificações, dentre 96 clones que foram testados, 84 deram resultado positivo. Entretanto, mesmo com várias tentativas de otimização das reações de PCR, não foi possível amplificar todos os genes. Todos os fragmentos correspondentes às regiões codificantes completas dos 84 genes amplificados foram misturados e clonados no vetor de entrada pENTR/D-TOPO (Life Technologies). Após transformação em E. coli, 192 colônias foram escolhidas ao acaso e o DNA foi sequenciado.
Das 192 sequências obtidas, 161 estavam com o eletroferograma adequado para serem analisadas. Dentre os 84 genes, 47 (60%) foram amostrados pelo menos uma vez. Destes, 39 (82%, ou 46,4% dos 84 genes iniciais) apareceram no sequenciamento na orientação correta (direcional) pelo menos uma vez. Segundo o fabricante, a taxa esperada de inserções corretas é de 90%, mas que pode cair para 50% em alguns casos. Isso ocorre devido ao fato de a sequência CACC na região 5´ do primer forward influenciar a entrada do gene na orientação correta. Caso o primer tenha alguma complementaridade (GTGG), a eficiência da entrada direcional reduz até se tornar aleatória (50%). Como para desenhar os primers foi necessário escolher regiões exatas de início e fim nas sequências dos genes, para alguns dos primers forward e reverse observamos um pouco de complementariedade algumas vezes. Além disso, também tivemos colônias com dímeros de primers clonados (13,8%).
Para avaliar a existência de alguma tendência com relação ao tamanho dos fragmentos clonados corretamente, foi feita a análise de representatividade dos genes (Figura 5). A média geral de tamanho dos genes amplificados foi de 877 pb, enquanto que a média dos fragmentos que entraram no vetor de entrada foi de 1000 pb. De acordo com o gráfico abaixo é possível verificar que houve um número muito baixo de fragmentos pequenos (menor que 500 pb) que entraram no vetor. Apesar dos produtos de PCR terem sido quantificados de forma equimolecular (a quantidade em massa leva em consideração o tamanho da molécula), houve uma preferência para entrada de fragmentos com média de 500 pb a 1500 pb.
Figura 5- Análise do da representatividade dos genes de distintos tamanhos clonados no vetor de entrada. O número de genes em cada classe de tamanho para os 84 genes iniciais está mostrado em azul. O número verificado entre os genes clonados (47 genes) é mostrado em vermelho.
A Figura 5 representa a primeira tentativa de clonagem em vetor de entrada e foi verificada a preferência para a entrada de fragmentos acima de 500 pb. Para corrigirmos essa tendência foi feita uma segunda tentativa empregando os 144 pares de primers. Ao todo foram amplificados 91 genes e os insertos amplificados foram agrupados em 5 formas diferentes (Tabela 3), sendo que em 4 delas os genes foram separados por tamanho para tentar corrigir o problema de preferência de entrada de fragmentos acima de 500 pb e em uma delas correspondeu a mesma categoria total novamente (todos os genes independente do tamanho do fragmento), mas desta vez foi usada a mesma massa de DNA de cada inserto, independente do tamanho, de forma a aumentar a representação molecular dos fragmentos de menor tamanho, para corrigir a distorção observada na Figura 5.
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Tabela3-Genes agrupados de acordo com seu tamanho em pb para a segunda clonagem no vetor pENTR/D-TOPO.
Categoria Tamanho (pb) Quantidade de genes A < 500 pb 27 B 500 a 1000 33 C 1000 a 1500 13 D > 1500pb 18 T Total 91
O resultado da preparação de extração de DNA plasmidial de cada categoria é mostrado na Figura 6. É observada uma heterogeneidade de fragmentos, como esperado, pois são diversos plasmídeos diferentes em cada categoria. A extração dos plasmídeos foi feita em duplicata para cada categoria.
Figura 6- Gel de extração de DNA plasmidial. A: < 500 pb, B: 500 a 1000 pb, C: 1000 a 1500 pb, D: > 1500, T: Total, 1: clones selecionados da primeira clonagem da placa de sequenciamento 1, 2: clones selecionados da primeira clonagem da placa
4000
1500 pb 4000 pb
Cada categoria foi clonada no vetor de destino separadamente e as ligações foram transformadas em E. coli. Duas placas de 96 amostras foram sequenciadas e 184 sequências estavam com o eletroferograma adequado para análise (categoria T; B e parte da categoria A). Como os fragmentos não foram purificados para conseguir uma melhor eficiência de clonagem, também foi possível encontrar alguns dímeros de primer que ao todo somaram 9,8% do sequenciamento. A análise indicou que dentre os 91 genes na categoria inicial, 50 (54,9%) apareceram no resultado de sequenciamento pelo menos uma vez, dos quais 47 genes (51,6% do total inicial) apareceram no sequenciamento na orientação correta (direcional) pelo menos uma vez.
Para esta segunda tentativa de clonagem, novamente observamos um grande número de clones correspondente a um mesmo gene, mas também foram observados muitos genes com apenas um único clone representado, o que indica que não foi possível identificar todos os genes que foram clonados no vetor de destino. De acordo com a Figura 7 é possível observar que os 10 primeiros genes correspondem a apenas 4,8% das sequências, enquanto que os últimos 10 genes correspondem a 53,6% das sequências.
Figura 7- Distribuição do número de cópias de cada gene de ca amostras sequenciadas. No
vezes que cada gene foi sequenciado.
A Figura 8 evidencia o número de genes que foram cl sequenciamento dos clones derivados da
entrada de fragmentos de acordo com o tamanho quand foram quantificados de forma equimolecular.
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Distribuição do número de cópias de cada gene de ca . No eixo X está o número do gene e no eixo Y o foi sequenciado.
A Figura 8 evidencia o número de genes que foram clonados e identificados pelo ciamento dos clones derivados da categoria T. Não houve uma preferência para entrada de fragmentos de acordo com o tamanho quando os produtos de PCR não foram quantificados de forma equimolecular.
' ( " ' ( ! !" ! !' !( " "" " "' "( ) )" ) )' )(
Distribuição do número de cópias de cada gene de cana nas e no eixo Y o número de
onados e identificados pelo T. Não houve uma preferência para o os produtos de PCR não
Figura 8- Porcentagem para a categoria T. Número de genes sequenciados e o número total de genes em porcentagem somente para a categoria T. Foi considerada a frequência de cada gene encontrado (total de 92 clones sequenciados e confirmados).
Entretanto, dos 92 clones sequenciados da categoria T, apenas 29 genes correspondentes aos genes de cana-de-açúcar foram identificados (Figura 9). Assim, apesar de não ter ocorrido preferência por tamanho na clonagem, alguns insertos estão mais representados nas colônias de E. coli transformadas, conforme o observado quando se avaliam em conjunto a representatividade dos insertos nas demais categorias (Figura 6). ! ! " " ) # $ $ $! *
Figura 9- Distribuiçã
mostra a distribuição do número de cópias de cada g somente para a categoria T. No eixo X está o gene gene foi representado no sequenciamento.
4.3. Transformação de
A proposta inicial deste trabalho era de também tra através de um inóculo constituído por um
cada uma delas contendo um dos genes de cana pGWB608. Entretanto, devido aos resultados observad transformar as construções confirmadas
posteriormente Arabidopsis thaliana
evitaríamos que duas ou mais construções contendo o entrassem num mesmo evento tra
foram selecionados em solo através de spray de herb (Figura 11). ! " ) + ' , ( ! " )
Distribuição do número de cópias para a categoria mostra a distribuição do número de cópias de cada gene de amostr
T. No eixo X está o gene e no eixo Y a frequência em que o foi representado no sequenciamento.
Transformação de Arabidopsis thaliana
A proposta inicial deste trabalho era de também transformar Arabidopsis t
através de um inóculo constituído por um pool de um grande número de construções, cada uma delas contendo um dos genes de cana-de-açúcar inseridos no vetor pGWB608. Entretanto, devido aos resultados observados em E. coli
construções confirmadas primeiro em Agrobacterium tumefaciens
Arabidopsis thaliana individualmente (Figura 10). Dessa forma também
evitaríamos que duas ou mais construções contendo os genes de cana
entrassem num mesmo evento transgênico. Os eventos transgênicos de Arabidopsis foram selecionados em solo através de spray de herbicida Finale junto com Silwet L
) + ' , ( ! " ) + ' , ( ! ! !! !" !) ! !+
o do número de cópias para a categoria T. O Gráfico tras sequenciadas frequência em que o
Arabidopsis thaliana
de um grande número de construções, açúcar inseridos no vetor
E. coli, optamos por Agrobacterium tumefaciens e
individualmente (Figura 10). Dessa forma também s genes de cana-de-açúcar nsgênico. Os eventos transgênicos de Arabidopsis icida Finale junto com Silwet L-77
Figura 10- Crescimento de Arabidopsis thaliana. Crescimento das plantas de Arabidopsis para transformação. A: Arabidopsis com inflorescências múltiplas. B e C:Arabidopsis após transformação com Agrobacterium.
Figura 11- Seleção das plantas de Arabidopsis pós-transformação. Seleção direta no solo com 0,1% de Finale.
De 18 construções gênicas transformadas em Arabidopsis, 15 apresentaram eventos nos quais as inserções de DNA foram confirmadas por PCR. Para esta confirmação, utilizamos um primer forward localizado no promotor 35S (AACGATCGGGGAAATTCGAGCTC) e um primer reverse no terminador NOS (CTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT). Como controle positivo da extração de DNA foi
utilizado um par de primers (forward CATGAACGCTTCTTCAACGA e reverse AGGTGGATTGGACACCAGAG) que amplifica uma região gênica de cópia única GLK 1 de Arabidopsis thaliana. Além disso, também enviamos para sequenciamento pelo menos um dos fragmentos amplificados de cada construção obtida para confirmar o gene inserido e checar possíveis contaminações.
Após os eventos serem confirmados, as plantas continuaram a crescer sob as condições normais de 16 h de luz e assim que as primeiras inflorescências começaram a surgir, estas foram isoladas através do Arasystem. Após aproximadamente 6 semanas, as sementes T2 foram coletadas. As plantas dos eventos não confirmados por PCR foram descartadas.
5.4- Confirmação de homozigose: geração T3
Após a coleta das sementes T2, foi executada a análise de segregação independente e a proporção 3:1 foi verificada para identificar eventos de cópia única (Tabela Suplementar 2). Os eventos confirmados foram cultivados e as sementes T3 de cada repetição foram coletadas individualmente para a identificação de homozigotos (Figura 12). As plantas sensíveis foram observadas pelos cotilédones esbranquiçados (característica típica de plantas sensíveis ao herbicida) e os indivíduos em homozigose foram identificados (proporção 1:2). Assim, foram selecionados somente os eventos homozigóticos e de cópia única para as análises fenotípicas por serem mais estáveis quanto à expressão gência. Os demais eventos foram descartados.
Figura 12- Análise de homozigotos. Sementes na geração T3 devem demonstrar a segregação 1:2 (homozigoto/heterozigoto) correspondente ao gene inserido, conforme o esperado para genes com cópia única. A: repetição de um evento em heterozigose (plantas sensíveis ao herbicida marcadas com setas em vermelho). B: repetição em homozigose.
A Figura 13 resume todos os dados deste primeiro capítulo. Ao final de todo o processo, 15 construções contendo um dos genes escolhidos de cana-de-açúcar foram transformadas e confirmadas em Arabidopsis thaliana. Com a finalização do trabalho, foram iniciadas as etapas de análise de fenótipo que serão descritas no capítulo 2.
Figura 13- Fluxograma dos resultados dos experimentos. A Figura mostra o número de primers desenvolvidos, taxa de clonagem, transformação e linhagens transgênicas usadas para a fenotipagem.
Pares de Primers para 144 genes
91 Amplificados 47 em Vetor de Destino 25 Agrobacterium tumefaciens 3 genes com eventos em T1 não confirmados por PCR 18 Arabidopsis thaliana 15 genes com 3 eventos cada em T1confirmados por PCR Segregação deT2 T3 Confirmada por RT-PCR Análises de Estresses
O primeiro trabalho publicado por Ichikawa et al. (2006) sobre o sistema de “FOX-hunting” mostrou que esta metodologia pode ter diversas aplicações. Nessa técnica, um pool de construções gênicas contendo o promotor 35S (CaMV 35S) são transformadas em Arabidopsis thaliana; após os fenótipos de interesse serem observados em plantas T2, o DNA dessas plantas é extraído para identificação de qual gene foi inserido no genoma.
A análise de fenótipos realizada através de knockout em Arabidopsis thaliana nem sempre contribui para a definição da função de um gene, possivelmente devido à alta redundância em seu genoma (Riechmann et al., 2000). O objetivo desse trabalho foi realizar um processo semelhante ao “Fox-hunting”, já que a maioria dos genes de cana selecionados pertence a famílias multigênicas. Assim, seríamos capazes de gerar um grande número de plantas transgênicas com ganho de função, o que possibilitaria testes de tolerância ao estresse hídrico em larga escala e facilitaria a identificação de fenótipos com potencial de também serem aplicados com sucesso no campo.
Um total de 47 genes foi clonado direcionalmente no vetor de destino. Ao longo do processo de clonagens em pool, foram identificadas tendências para a entrada de fragmentos gênicos. A Figura 5 mostra uma grande tendência para entrada de fragmentos acima de 500 pb, apesar do pool de DNA conter o mesmo número de moléculas para todos os genes inseridos no pool. Por esse motivo, novas clonagens foram feitas com categorias de pool gênicos separadas por tamanho de fragmento e a massa de DNA utilizada foi a mesma para todos os produtos amplificados. Além disso, também foi feito uma categoria com o número total de genes (categoria T) também contendo a mesma massa de DNA para todos os genes, a Figura 8 mostrou que o problema de preferência de clonagem para tamanhos de genes maiores foi solucionado. Entretanto, de acordo com as Figuras 7 e 9 é possível observar ainda preferências para alguns genes serem clonados, de modo que o problema de preferência para entrada de genes nos vetores não foi completamente resolvido.
De acordo com Weiste et al. 2007, trabalho que também utilizou pools de clonagem, foi necessário sequenciar 120 plantas de Arabidopsis para encontrar 32 fatores de transcrição de resposta ao etileno, sendo que alguns genes também foram
