Impacto do NaCl e do ácido salicílico exógeno na fisiologia e bioquímica da planta medicinal macela-da-terra [Egletes viscosa (L.) Less]

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

VALÉRIA CHAVES VASCONCELOS BATISTA

IMPACTO DO NaCl E DO ÁCIDO SALICÍLICO EXÓGENO NA FISIOLOGIA E BIOQUÍMICA DA PLANTA MEDICINAL MACELA-DA-TERRA [Egletes viscosa (L.)

Less]

FORTALEZA 2018

VALÉRIA CHAVES VASCONCELOS BATISTA

IMPACTO DO NaCl E DO ÁCIDO SALICÍLICO EXÓGENO NA FISIOLOGIA E BIOQUÍMICA DA PLANTA MEDICINAL MACELA-DA-TERRA [Egletes viscosa (L.)

Less]

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.Área de concentração: Bioquímica Vegetal.

Orientador: Prof. Dr. Humberto Henrique de Carvalho.

FORTALEZA 2018

B337i Batista, Valéria Chaves Vasconcelos.

Impacto do NaCl e do Ácido Salicílico Exógeno na Fisiologia e Bioquímica da Planta Medicinal Macela-da-Terra[Egletes viscosa(L.)Less] / Valéria Chaves Vasconcelos Batista. – 2018.

95 f. : il. color.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Fortaleza, 2018.

Orientação: Prof. Dr. Humberto Henrique de Carvalho..

1. Planta Medicinal. 2. Sódio. 3. Compostos Orgânicos Voláteis. 4. Metabólitos. 5. Ácido Salicílico. I. Título.

VALÉRIA CHAVES VASCONCELOS BATISTA

IMPACTO DO NaCl E DO ÁCIDO SALICÍLICO EXÓGENO NA FISIOLOGIA E BIOQUÍMICA DA PLANTA MEDICINAL MACELA-DA-TERRA [Egletes viscosa (L.)

Less]

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.Área de concentração: Bioquímica Vegetal.

Aprovada em: ______ /______/______

BANCA EXAMINADORA

____________________________________________________________

Prof. Dr. Humberto Henrique de Carvalho (Orientador) Universidade Federal do Ceará (UFC)

____________________________________________________________

Prof. Dr. Enéas Gomes Filho Universidade Federal do Ceará (UFC)

____________________________________________________________

Dr. Kirley Marques Canuto Embrapa Agroindústria Tropical

A Deus,

Aos meus pais Antonio (in memoriam) e Raimunda de Lima Ao meu amado, Jorge Gomes e

AGRADECIMENTOS

A Adonai ‘Tsebayoth’ que provou que meus sonhos adormecidos podem ser ainda realizados. Meu mestrado é a realização de um sonho de muitos anos atrás. Por isso, todos os dias foram motivação para aproveitar e aprender com as situações de alegrias e desafios ao longo do mestrado e também ter colocado pessoas, literalmente preciosas pra me ajudar: Professores-mestres, doutores, mestres, doutorandos, mestrandos, alunos da graduação, visitantes e funcionários. Baruch Adonai!

Ao meu amado, Jorge Gomes Batista por me compreender, pelo incentivo e paciência. Essa vitória também é sua, pois seu amor, cuidado e carinho foram essenciais.

Aos meus filhos, Ana Beatriz, Antonio Neto e Josué Chaves, pela compreensão da minha ausência e por até me incentivar nos estudos, estudando comigo, vigiando um ao outro pra não incomodar.

A minha mãe Raimunda Vasconcelos de Lima, que me incentivou nos primeiros anos de escola, minha sogra que é uma mãe para mim e todos os meus irmãos, representados por minha irmã, Rosalha Chaves, que compreenderam minha ausência nas “reuniões da Alameda Chaves”.

Ao grupo de oração na terça-feira. Vocês não estudaram fisiologia vegetal, mas só lendo a Bíblia já entende algumas funções. Obrigada pela paciência, o incentivo e orações.

Ao meu orientador Prof. Dr. Humberto Henrique de Carvalho que em todos os momentos, se mostrou presente, incentivando, cobrando, me inspirando a “chegar lá”, obrigada por me respeitar e acreditar, mesmo quando a minha fé era maior que expectativas “das plantinhas”. Muito obrigada pela atenção, ensino, dedicação e paciência, principalmente nos últimos dias. Sou grata por ter tido um mestre como você!

À Universidade Federal do Ceará por ser o lugar de muito aprendizado e crescimento para mim.

Ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica na pessoa do coordenador Prof. Dr. Bruno Anderson Matias da Rocha, representando todos os docentes e colaboradores pela contribuição e conhecimentos transmitidos.

Ao laboratório de Laboratório de Fisiologia Vegetal – LABFIVE na pessoa do professor Dr. Enéas Gomes Filho, pelo exemplo, apoio e conhecimentos adquiridos.

Ao Laboratório Multiusuário Química de Produtos Naturais da Embrapa, representados pelos pesquisadores Dr. Edy Sousa de Brito e Dr. Kirley Marques Canuto. Obrigada a essa equipe (pesquisadores, orientadores, funcionários e alunos) unida e talentosa, por sempre me receber e me ajudar com a realização deste trabalho. Obrigada em especial, Tigressa, Ana Sheila, Fátima, Lorena e Paulo.

À Drª. Rita de Cássia Pereira pela atenção e conhecimentos transmitidos.

Ao professor Dr. Enéas Gomes Filho e Dr. Kirley Marques Canuto por gentilmente aceitarem o convite de compor a banca examinadora deste trabalho.

Aos amigos e colegas de trabalho do Laboratório de Fisiologia Vegetal – LABFIVE na pessoa de Gyedre Araújo, cada um com seu jeito próprio foram especiais pra mim. Obrigada pela convivência, amizade e ensinamentos.

À Cinthia Queiroz, Stelamaris de Oliveira e a Valéria Freitas que com muita paciência me ajudaram nas etapas, pra mim de maior desafio.

À Chayenne de Sá, por nas alegrias e nos desafios estarmos crescendo e sendo fortalecida juntas. Muito obrigada, amada!

Às “Feras da estatística”: Bruno, Dalton, Daniel Coelho e Isa. Obrigada!

À “Galera da sala de estudos" na pessoa do Eliezer Araújo, pela ajuda, torcida e amizade.

Aos inesquecíveis da turma de mestrado 2016.2,“Galera do Bem”: Cinthia Queiroz, Chayenne de Sá, Leonardo Lopes, Halisson Araújo, Mighay Lovena, Paulo Vinicius, Valéria Freitas e Elsa Coutinho(você me disse o que eu precisava ouvir).Vocês fazem parte da minha vitória!

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES);

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará;

Laboratório de Fisiologia Vegetal – LABFIVE, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará;

Laboratório Multiusuário de Química de Produtos Naturais, Embrapa Agroindústria Tropical, Fortaleza, Ceará;

Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Salinidade (INCTSAL);

Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP).

Bem-aventurado o homem que não anda segundo o conselho dos ímpios, nem se detém no caminho dos pecadores, nem se assenta na roda dos escarnecedores.Antes tem o seu prazer na lei do Senhor, e na sua lei medita de dia e de noite. Pois será como a árvore plantada junto a ribeiros de águas, a qual dá o seu fruto no seu tempo; as suas folhas não cairão, e tudo quanto fizer prosperará.

RESUMO

A região Nordeste concentra entre 25 a 30% de solos salinos do Brasil. Muitas plantas medicinais são cultivadas pela população nessas áreas, incluindo a ‘Macela-da-terra’ [Egletes viscosa (L.) Less], da família Asteraceae, que é consumida, principalmente, na forma de chás para tratamento de distúrbios digestivos e intestinais. De modo geral, as plantas desenvolveram mecanismos fisiológicos e bioquímicos para mitigar os efeitos deletérios do sal a fim de manter o crescimento e o desenvolvimento. Vários trabalhos indicam que o ácido salicílico (AS), hormônio natural que estimula o mecanismo de defesa das plantas pode auxiliar na tolerância ao estresse salino. Assim, foram testadas as hipóteses de que o NaCl afeta o desenvolvimento de E. viscosa e que o AS exógeno é capaz de ativar vias metabólicas que ajudam a diminuir os efeitos prejudiciais da salinidade. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar o impacto de duas diferentes concentrações de NaCl (40 mM e 80 mM) e do efeito integrativo do AS na manutenção do metabolismo da planta. Foram caracterizados parâmetros de crescimento, bioquímicos, fisiológicos, compostos orgânicos voláteis (COV’s) e o perfil metabólico. Os efeitos da salinidade sobre as plantas de Macela-da-terra foram acentuados e promoveram diminuição no crescimento (massas frescas e secas), trocas gasosas (fotossíntese, condutância estomática, transpiração e relação entre a concentração interna (Ci) e externa (Ca) de CO2), pigmentos (clorofilas a, b, total e carotenoides), independente da concentração usada. Salinidade também promoveu um acúmulo do íon sódio e diminuição de potássio na parte aérea e raízes. Aproximadamente 20 VOC’s foram identificados e a maioria teve seus teores reduzidos (como trans-Pinocarveol, trans-Carveol e acetato de cis-Isopinocarveila). Por outro lado, vários metabólitos como os aminoácidos (glutamina, prolina, valina, dentre outros) foram aumentados. A interação da salinidade com o SA exógeno não reverteu os efeitos da salinidade sobre o crescimento nem alterou a emissão de COV’s, entretanto todos os parâmetros de trocas gasosas foram aumentados, bem como, houve um aumento nos teores de potássio nas raízes nas duas concentrações de NaCl. Além disso, a interação entre sal e o AS também reduziu os teores de alguns metabolitos como asparagina, glicina e prolina, dentre outros, na concentração de 40 mM, enquanto que a 80 mM poucos metabolitos tiveram seus teores reduzidos, como triptofano, glicina e ácido pirúvico. Assim, foi constatado que o NaCl a 40 e 80 mM são prejudiciais para a E. viscosa, enquanto que a interação com o AS exógeno atua garantindo um acúmulo de metabólitos, promovendo a manutenção de processos vitais como a fotossíntese.

ABSTRACT

The Northeast of Brazil has about 25% to 30% of all saline soils of the country. Several healing plants are cultivated by natives in these regions, including the 'Macela-da-terra' [Egletes viscosa (L.) Less], an Asteraceae family group, largely consumed as teas for digestive and intestinal disorders treatment. In general, plants have developed physiological and biochemical mechanisms to alleviate deleterious effects of salt in order to maintain regular growth and development. Several reports have indicated the salicylic acid (SA) a plant defense phytohormone to improve tolerance to saline stress. Thus, we hypothesized that NaCl affects E. viscosa development and exogenous SA trigger metabolic pathways that help them to reduce the harmful effects of salinity. The aim of this work was to evaluate the influence of two different concentrations of NaCl (40 mM and 80 mM) and the integrative impact of SA in the plant metabolism maintenance. The effects of salinity were accentuated and promoted a decrease in growth parameters (dry and fresh mass), and gas exchange (photosynthesis, conductance, transpiration and Ci/Ca), as well as pigments (chlorophyll a, b, total and carotenoids), regardless of the concentration used. Salinity also promoted an expected accumulation of sodium and decreased of potassium ions in both shoot and roots. Approximately, 20 volatile organic compounds (VOC's) were identified, the majority had their levels reduced, such as trans-pinocarveol, trans-carveol and, trans-pinocarveyl acetate. On the other hand, several metabolites such as amino acids (glutamine, proline, valine, among others) were increased. The interaction of salinity and exogenous salicylic acid did not reverse the effects of salinity on growth nor did it reconstruct VOC emission. However, all gas exchange parameters were increased maintaining photosynthesis, conductance, transpiration, and Ci/Ca, as well as roots potassium ions, in both concentrations of salt. In addition, the interaction between 40 mM of salt and SA also reduced some metabolites such as asparagine, glycine, and proline, among others, whereas at 80 mM a few metabolites were decreased as tryptophan, glycine and pyruvic acid. In conclusion, NaCl at 40 mM and 80 mM are harmful to E. viscosa, the interaction with exogenous AS acts to guarantee an accumulation of metabolites and potassium, promoting the maintenance of vital processes such as photosynthesis.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

A Photosynthetic rate (Taxa fotossintética) ABA Abcisic acid (Ácido abcísico)

CI/CA Internal and external CO2 concentration ratio (Relação de Concentração interna e externa de CO2)

E Transpiration (Transpiração)

EROs Reactive oxygen species (Espécies reativas de oxigênio) GCMS Gas chromatography with mass spectrometry (Cromatografia

gasosa com expectrometria de massas)

gs Stomatal Conductance (Condutância estomática)

LA Leaf Area ( Área foliar)

OEs Essencial oils (Óleos essenciais) RDM Root Dry Mass (Massa seca da raiz) RFM Root Fresh Mass (Massa fresca da raiz) SA Salicylic acid (Ácido salicílico)

SDM Shoot Dry Mass (Massa seca da parte aérea) SFM Shoot Fresh Mass (Massa foliar fresca)

SPME Solid phase Microextraction (Microextração em fase sólida) TBARS Thiobarbituric acid reactive substances (Substâncias

Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico)

LISTA DE FIGURAS

Figura 1A - Egletes viscosa Less...... 18

Figura 1B - Egletes viscosa Less, sem capítulos florais... 18

Figura 2 - Cromatógrafo gasoso acoplado ao espectrômetro de massa... 22

Figure 1 - Steps of the treatment of Egletes viscosa... 34

Figure 2 - Growth measurements of Egletes viscosa plants after 14 days of different treatments... 39

Figure 3 - Egletes viscosa plants after 14 days of different treatments 40 Figure 4 - Ion contents of Egletes viscosa plants after 14 days of different treatments... 42

Figure 5 - Gas exchange responses of Egletes viscosa plants after 14 days of different treatments... 44

Figure 6 - Photosynthetic pigments content of Egletes viscosa plants after 14 days of different treatments... 45

Figure 7 - Hydrogen peroxide (H2O2) and membrane damage of Egletes viscosa plants after 14 days of different treatments... 46

Figure 8 - Primary metabolic profile of Egletes d e viscosa leaves Analyzed by GC-TOF-MS after 14 days of different treatments 48 Figure 9 - Relative abundance of salicylic acid by GC-MS... 59

Figure 10 - Volatile organic profile (VOCs) of Egletes viscosa leaves extracted by SPME and analyzed by GC –MS after 14 days of different treatments... 52

Figure 11 - Two - dimensional - principal component (PC) analysis of primary and volatile metabolites Egletes viscosa leaves after 14 days of different treatments... 55

LISTA DE TABELAS

Table 1 - Metabolites of Egletes de viscosa leaves identified by GC-MS... 50 Table 2 - Volatile chemical compounds of Egletes de viscosa leaves

extracted by HS-SPME and analyzed by GCMS... 53 Table 3 - PCA components score of metabolites. Loading score of

56 primary and volatile matabolites ranked by principal

1 _{INTRODUÇÃO...………..} 15 2 REFERENCIAL TEÓRICO...……….. 17

3 _{HIPÓTESE...………}. 23

4 OBJETIVOS...………... 24

5 SALICYLIC ACID MODULATES PRIMARY AND VOLATILIE

METABOLITES TO ALLEVIATE SALT STRESS INDUCED

PHOTOSYNTHESIS IMPAIRMENT ON MEDICINAL PLANT

EGLETES VISCOSA ………..… 30

6 _{CONSIDERAÇÕES FINAIS ...………..} 79

REFERÊNCIAS ...……….. 80

APÊNDICE A - SUPPLEMENTAL FILE 1. TYPICAL TIC-GCMS

CHROMATOGRAMS ...……….. 24

APÊNDICE B - SUPPLEMENTAL FILE 2. ALL 20 MASS SPECTRAL(M/Z) FRAGMENTATION OF VOLATILES ORGANIC COMPOUNDS IN LEAVES OF EGLETES VISCOSA PROFILING BY

GC/MS ...………... 91

APÊNDICE C - SUPPLEMENTAL FILE 3. PHOTO - SYNTHETIC LIGHT RESPONSE CURVES OF FULLY MATURE LEAVES OF

EGLETES VISCOSA ...………. 97 89

1 INTRODUÇÃO

A salinidade é um dos principais estresses abióticos que limitam a produção de plantas cultivadas e não cultivadas, especialmente em regiões áridas e semi-áridas, como a região do Nordeste brasileiro, e a resposta fisiológica depende das caracteristicas genotípicas de cada espécie. Cerca de 20% de área terreste mundial irrigada é afetada pelo estresse salino ( TAIZ; ZEIGER, 2017). Grande parte das pesquisas busca pelo manejo adequando do solo e da irrigação de modo a preservar os recursos naturais e impedir a redução das áreas produtivas (RASOOL et al., 2013).

A Caatinga encontrado em áreas do Nordeste brasileiro é o bioma semi-árido mais biodiverso do mundo. Possui alguns tipos de vegetação cuja distribuição é totalmente restrita ao Brasil, sendo um dos mais heterogêneos dentre os biomas brasileiros apresentando

4.322 espécies de plantas com sementes, sendo 744 endêmicas deste bioma, o que corresponde a 17,2% do total de táxons registrados (RIZZINI, 1997; FORZZA et al. 2012; GARIGLIO et al. 2010). Algumas plantas medicinais conseguem sobreviver em condições adversas, como as da caatinga, inclusive após longos períodos de estiagem, e em meio à sua sobrevivência produzem um grande número de metabólitos secundários (SILVA, 2000).

O Brasil possui ainda uma grande diversidade de espécies, as quais ainda são pouco exploradas. Entretanto, a quantidade de informação tem aumentado nas últimas décadas (LUCENA et al., 2007), especialmente sobre as plantas medicinais, devido ao seu potencial econômico. A maioria das informações sobre as espécies medicinais, hoje conhecidas e estudadas, foi obtida por meio de levantamentos etnobotânicos (ROQUE et al. 2010; OLIVEIRA et al. 2012; GADELHA et al. 2013). Por isso, considerando a importância de se preservar a diversidade de plantas com finalidades terapêuticas e os escassos estudos fisiológicos e bioquímicos, torna-se de extrema relevância analisar a resposta destas plantas à salinidade e identificar espécies tolerantes e com potenciais para estudo de moléculas e princípios ativos.

Os compostos fenólicos, terpenos e alcaloides são os três grandes grupos de metabólitos secundários que compõem os óleos essenciais, e por serem voláteis podem estar envolvidos na defesa contra estresses bióticos e abióticos (TAIZ; ZEIGER, 2017). A biossíntese desses compostos pode ser influenciada por diversos fatores, como sazonalidade, ritmo circadiano, desenvolvimento, temperatura, disponibilidade hídrica, solos salinos, nutrientes, indução por estímulos mecânicos e ataque de patógenos, que alteram a sua

quantidade e, muitas vezes, até a natureza dos constituintes ativos presentes no tecido (GOBBO-NETO; LOPES, 2007; YANG et al 2018).

No nordeste do Brasil, a planta medicinal Egletes viscosa (L.) Less é uma angiosperma, pertence à família Asteraceae, cresce facilmente em planícies, perto das margens de pequenas lagoas e riachos, sendo popularmente conhecida como ‘macela-da-terra’. É utilizada principalmente na forma de chás para o tratamento de distúrbios digestivos e intestinais (BATISTA et al., 2012; BRAGA,1960). No entanto, pouco se sabe sobre os efeitos de condições ambientais adversas, especialmente o estresse salino na produção de metabolitos secundários e na fisiologia da planta.

Em geral, o metabolismo das plantas pode variar consideravelmente dependendo de diversos fatores, como condições climáticas e de irrigação, o período da colheita, e especialmente, das diferentes fases de desenvolvimento da planta. Os efeitos não são totalmente descritos e variam entre espécies. Dentre as variáveis, se destacam os fitohormônios, que podem afetar a fisiologia das plantas medicinais, tais como condições de coleta, estabilização e estocagem, os quais tem potencialmente grande influência na qualidade e, consequentemente, no valor terapêutico dessas espécies (WINK et al., 2015). O melhoramento e o estudos destas, podem resultar em seleção de indivíduos mais adaptados às condições da caatinga e afetar positivamente a produção biotecnológica, levando à obtenção de matérias-primas uniformes e de alta qualidade.

O ácido salicílico (AS) é um composto antioxidante naturalmente produzido pelas plantas em pequenas quantidades, atuando principalmente na defesa contra patógenos mas também pode regular o crescimento e desenvolvimento (SINGH; USHA, 2003; SAKHABUTDINOVA et al., 2003; NOREEN; ASHRAF, 2008). Em algumas espécies o tratamento com AS interfere na resposta estomática, na taxa de fixação de CO2 e no metabolismo de carboidratos , reduzindo os efeitos nocivos do estresse salino e aumentando sua tolerância (LIU et al. 2014, KHOSHBAKHT; ASGHAREI, 2015).

Atualmente, com o desenvolvimento de novas metodologias, um olhar integrado que reúne dados fenotípicos, químicos, fisiológicos e moleculares possibilita ampliar a compreensão e o uso consciente das espécies medicinais. Os estudos sobre a bioquímica e a fisiologia ambiental das plantas medicinas são relativamente escassos e há pouca informação disponível sobre a fisiologia da espécie Egletes viscosa principalmente no que se refere à salinidade. Diante do exposto, esse trabalho visa conhecer o impacto causado pelo NaCl e da interação deste com ácido salicílico exógeno.

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 Egletes viscosa (L.) Less (macela-da-terra)

O principal ecossistema do nordeste brasileiro é o bioma “Caatinga”, ocupando cerda de 11% do território nacional, sendo exclusivamente encontrado no Brasil (GARIGLIO et al. 2010; CARTAXO et al., 2010). Essa região é caracterizada por extensas áreas de planícies áridas, estendendo-se do estado do Piauí ao norte de Minas Gerais (AGRA et al., 2008). Apesar do aspecto seco e árido, a caatinga possui uma flora com grande diversidade de espécies e elevada incidência de endemismo, com uma variada gama de plantas usadas para fins medicinais (CORDEIRO; FÉLIX, 2014).

A utilização de plantas com propriedades terapêuticas tem se propagado ao longo de séculos, principalmente, por ser uma alternativa de tratamento com baixo custo, elevado grau de eficácia e dita com poucos efeitos colaterais, justamente por ser um recurso natural (BADKE et al., 2012). Mesmo em países desenvolvidos, onde o acesso à tratamentos hospitalares de alta tecnologia é mais acessível, o uso de plantas com fins medicinais é historicamente e culturalmente bastante utilizado e vem sendo associado a tratamentos convencionais ou profilaxia (LOPES et al., 2015). Atualmente, muitas substâncias ativas de plantas e seus mecanismos de ação vem sendo descritos e substancias químicas catalogadas, destacando-se os terpenos e os fenólicos (HADDAD-KASHANI, 2012; TAKSHAK, 2018).

Egletes viscosa (L.) Less é uma angiosperma, da família Asteraceae (Figura 1A e 1B), conhecida usualmente como ‘macela-da-terra’. Possui dois quimiotipos descritos pela presença majoritária de acetato de trans-pinocarveíla (quimiotipo A) e pela presença majoritária de acetato de cis-isopinocarveíla (quimiotipo B), características aromáticas e sabor amargo (SILVEIRA; PESSOA, 2005). Encontrada no Nordeste brasileiro, cresce frequentemente às margens de lagoas, açudes, cursos de água do sertão e do litoral. Seus capítulos florais aparecem um a três meses depois do plantio e são usados popularmente na preparação de chás como remédio para doenças digestivas e intestinais. (MATOS, 2000).

Diferentes compostos biologicamente ativos como os flavonoides e terpenos foram evidenciados na planta Egletes viscosa. Seu óleo essencial tem propriedades antibacterianas, antinoceptivo, anticonvulsivo, ao mesmo tempo seus compostos flavonóides possuem caracteristicas antianafiláticas, antitrombóticas, hepatoprotetoras, gastoprotetoras, antidiarreicas, sendo que seus diterpenóides possuem ações antinociceptivas, gastroprotetoras

e propriedades antiespasmódicas, anti-inflamatórias e antiedematogênicas (BATISTA, 2012; AQUINO et al., 2015).

Figura 1A – Egletes viscosa Less

Fonte: Autor, 2018.

Figura 1B - Egletes viscosa Less, sem capítulos florais.

2.2 Estresse salino nas plantas

Um dos tipos de estresse abiótico que mais limita o crescimento, desenvolvimento e a produtividade do vegetal é o salino, sendo responsável por cerca de 20% da área irrigada mundial. Esse estresse gera déficit de água e acúmulo de íons tóxicos, diminuição da ação dos íons em solução, modificando sua nutrição inorgânica, comprometendo os processos fisiológicos das plantas, tais como absorção, deslocamento, captação e distribuição de nutrientes (KIM et al., 2016; PEREIRA, et al. 2017).

A tolerância das plantas à salinidade pode variar entre as espécies e cultivares de uma mesma espécie e depende de outros fatores, como tipo de solo, clima da região, técnica de irrigação e estádio de crescimento. Podem ser classificadas em glicófitas e halófitas. As glicófitas são as menos tolerantes à salinidade enquanto as halófitas são adaptadas à salinidade, conseguindo tolerar altos teores de sais. (MAAS & HOFFMAN, 1977; FLOWERS et al. 2014; DIAS, et al.; 2016). Essas espécies vegetais ao serem submetidas ao estresse salino, respondem com mecanismos de adaptação ou aclimatação. Adaptação é a capacidade de resistência desenvolvida para tolerar o estresse, através da seleção natural, transmitida por gerações, enquanto aclimatação é a capacidade desenvolvida para tolerar o estresse, devido sua exposição prévia, porém é temporária (TAIZ; ZEIGER, 2017). A planta ao perceber o estresse responde sinalizando com uma série de reações metabólicas, desenvolvendo mecanismos de aclimatação, criando defesas para sua sobrevivência resultando no aumento de metabólitos ativos osmoticamente, antioxidantes e aminoácidos específicos como resposta ao estresse salino (PRISCO, et al.; 2016). Dentre esses mecanismos se destacam: (1) exclusão de íons do citosol ou bombeamento do íon para fora da célula através do transporte ativo primário, bombas de H+, associado ao transporte ativo secundário, canais e carreadores, (2) Acúmulo de íons no vacúolo, (3) Manutenção da absorção de íons pelas raízes e transporte para as folhas, (4) síntese de solutos orgânicos compatíveis (osmoprotetores), sem causar toxidez, (5) alteração na estrutura da membrana, (6) ação de enzimas antioxidantes e (7) ação de hormônios vegetais

(ROY et al., 2014; FLOWERS et al., 2015; SILVEIRA et al., 2016).

O aumento no teor do íon sódio pode gerar distúrbios metabólicos, reduzindo a disponibilidade de outros nutrientes na planta. Sua absorção e acúmulos em quantidade elevadas, pode levar a sua toxicidade. Os sinais de toxicidade, como queimaduras ou necrose, aparecem nas bordas foliares e aumentam à medida que o sódio vai se acumulando, a necrose vai se espalhando até a parte internerval da folha. Os distúrbios fisiológicos, carência de nutrientes como potássio e cálcio, podem levar desenvolvimento de estresse hídrico e o

aumento de espécies reativas de oxigênio (EROS) (DIAS, et al., 2016). Assim, em ambientes salinos, as plantas desenvolveram mecanismos fisiológicos e bioquímicos, para sua sobrevivência, mantendo em equilíbrio os processos que controlam o crescimento e o desenvolvimento vegetal, através da homeostase iônica intracelular e redução da toxicidade iônica nas células.

2.3 Ácido salicílico

Uma grande variedade de moléculas está envolvida na sinalização celular e resposta das plantas a diversos estresses. De fato, plantas percebem condições de estresses e alteram o fluxo metabólico para ativar diferentes mecanismos de resposta (MEHDY, 1994). Dentre eles, o ácido salicílico ou ácido 2-hidroxibenzóico (AS) é um fitohormônio natural, com função antioxidante, que atua como mensageiro secundário e molécula sinalizadora, induzindo respostas de defesa do vegetal. Ele é capaz de se acumular em plantas sob condições adversas, como ataque de patógeno ou por indução de elicitores químicos que ativam a expressão de genes relacionados a cada estresse (DAT et al., 1998).

Os efeitos AS exógeno a 1,0 ou 2,0 mM vem sendo estudados sobre vários processos fisiológicos, bioquímicos e moleculares. Em condições estressantes por exemplo, AS induziu florescimento, desenvolvimento radicular e trocas gasosas (DONG, et al., 2010;

NAZAR, et al., 2011; BAYAT et al., 2012). Além disso, um aumento significante na biossíntese de compostos secundários foi observado após aplicação do AS ativando a expressão de genes de defesa que codificam enzimas importantes da via de compostos fenólicos, terpenos e flavonoides (ALI et al., 2007).

Na busca pelo aumento da tolerância das plantas aos estresses, diversas estratégias vêm surgindo para evitar perdas na agricultura e horticultura (SENARATNA et al., 2000). O AS exógeno tem se mostrado eficiente em induzir mecanismos de tolerância e aliviar os efeitos do estresse salino em muitas espécies, tais como diminuição no extravasamento de eletrólitos em morango (KARLIDAG et al., 2009), aumento acentuado no teor de óleo de aquênio de girassol (NOREEN; ASHRAF, 2010), maior acúmulo de pigmentos fotossintéticos e teores de K + em tomate (WASTI et al., 2012). O AS promoveu o aumento e o acúmulo nos teores de ácido abscísico (ABA) e prolina em trigo (SAKHABUTDINOVA et al., 2003), diminui o acúmulo de sódio e os níveis de potássio em Arabidopsis thaliana (JAYAKANNAN et al., 2013), diminuindo a peroxidação de lipídeos e mantendo a integridade de membranas em milho (GUNES et al., 2007).

Assim AS tem grande potencial não só para mitigar os efeitos prejudiciais do estresse salino, como aumenta a sua tolerância. A eficácia dos mecanismos de resposta à salinidade depende da espécie e pode variar de acordo com a concentração, modo de aplicação e fase do desenvolvimento. Os efeitos do AS muitas vezes parecem contraditórios, geralmente em baixas concentrações alivia vários tipos de estresses, mas em altas concentrações induz a formação de ERO’s e ao invés de melhorar, em algumas espécies acentua os sintomas do sal (MIURA et al., 2014).

2.4 Compostos voláteis

Os compostos orgânicos voláteis (COVs), com baixo peso molecular (abaixo 300 Da), produzidos pelas plantas, originados de ácidos graxos e aminoácidos correspondem a uma diversidade de moléculas químicas, constituídas principalmente por isoprenos e monoterpenos. Geralmente são líquidos, lipofílicos, de alta pressão de vapor que transpassam a membrana celular, sendo liberados facilmente no solo e no ambiente. Eles têm por função a atração de dispersores e polinizadores de sementes e a defesa de distúrbios externos. (RIFFEL; COSTA, 2015; PICHERSKY et al., 2006).

As plantas podem liberar quantidades maiores de COVs quando submetidas a estresses bióticos, como ataque por patógenos ou herbívoros e/ ou a estresses abióticos como estresses salino, oxidativo e hídrico, dentre outros, resultando em variações na composição química de seus constituintes. Essas variações são dependentes da espécie, comportamento fisiológico e das condições ambientais (RIFFEL; COSTA, 2015).

Os óleos essenciais (OEs) podem ser definidos como substâncias voláteis complexas, lipofílicas, e que são formados através do metabolismo secundário das plantas. Em geral, são líquidos com odor característico. Uma combinação complexa de terpenos, terpenos oxidados, sesquiterpenos e sesquiterpenos oxidados, e moléculas pequenas como alcoóis, aldeídos e cetonas (SIMÕES; SPITZER, 2004).

Sabe-se que as plantas realizam inúmeras reações anabólicas ou catabólicas diferentes durante o metabolismo secundário, sendo estimado que dos 100.000 compostos produzidos por elas, mais de 1.700 sejam voláteis (DICKE; LORETO, 2010). Esses compostos são liberados por quase todos os órgãos e tecidos vegetais, sendo agrupados nas seguintes classes: terpenóides, carotenóides, fenilpropanóides/benzenóides, derivados de ácidos graxos e compostos ramificados (DUDAREVA; PICHERSKY, 2008).

2. 5 SPME

Técnica de microextração por fase sólida em "headspace" (SPME) combina extração e concentração dos compostos voláteis e não voláteis de líquidos em "headspace" (espaço formado pela amostra acondicionada em sistema fechado). Os compostos voláteis da planta são concentrados em uma fibra revestida com adsorvente apropriado e posteriormente desadsorvido termicamente no injetor do cromatógrafo gasoso (Figura 2) para análise e separação dos compostos. HPME é uma técnica eficiente, indicada para amostras de média e alta volatilidade, isenta de solvente. Possibilita o uso direto do tecido vegetal, sem a necessidade de concentração e assim reduzindo as possíveis alterações químicas das amostras como também o tempo da análise (CANUTO et al., 2011; AGUIAR, et al., 2015; CHAVES, et al., 2017).

Figura 2 – Cromatógrafo gasoso acoplado ao espectrômetro de massas.

3 HIPÓTESE

O NaCl afeta o desenvolvimento da planta medicinal Egletes viscosa. A interação do ácido salicílico exógeno com o NaCl é capaz de ativar vias metabólicas que ajudam a diminuir os efeitos prejudiciais da salinidade.

4 OBJETIVOS 4.1 Objetivo geral

Avaliar o impacto de duas diferentes concentrações de NaCl (40mM e 80 mM) e do efeito integrativo do ácido salicílico na manutenção do metabolismo da planta Egletes viscosa.

4.2 Objetivos Específicos

 Avaliar o crescimento da parte aérea e das raízes das plantas em diferentes concentrações de sal e do efeito integrativo com AS;

 Avaliar os parâmetros de trocas gasosas (fotossíntese, condutância, transpiração e Ci/Ca) e pigmentos nas folhas;

 Determinar os teores de peróxido de hidrogênio e peroxidação de lipídeos;  Mensurar os conteúdos de íons sódio e potássio nas folhas e raízes;

 Extrair e Avaliar alterações químicas nas emissões de compostos orgânicos voláteis (VOC’s) por meio de SPME-GC-MS;

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5 SALICYLIC ACID MODULATES PRIMARY AND VOLATILIE METABOLITES TO ALLEVIATE SALT STRESS INDUCED PHOTOSYNTHESIS IMPAIRMENT ON MEDICINAL PLANT EGLETES VISCOSA.

ABSTRACT

Plant responses to salinity have been long investigated. Nevertheless, how leaf metabolism is affected and what is the role of salicylic acid (SA) during salt stress remains elusive. Here we evaluated the influence of exogenous SA application on the growth and metabolism of the therapeutic plant Egletes viscosa (L.) Less. under salt stress condition. Salinity decreased plant biomass, leaf gas exchange, and photosynthetic pigment content. Principal component analysis revealed that both SA and salt altered leaf metabolite profile when analyzed isolated or in combination. Salinity increased several amino acids contents. By contrast, slight changes in the level of organic acids and sugars were observed. Exogenous SA increased the content of almost all volatile organic compounds (VOC’s) identified. The integrative effect of salt and exogenous SA did not reverse the effects of salinity on the plant biomass nor did it restore VOC´s profile. However, SA was able to remobilize K+ and the excess of Na+ from roots to shots to avoid H2O2 overproduction in salt-stressed plants, which leads to a higher net photosynthetic rate. Taken together, our results suggest that SA is effective in mitigating the effect of salt stress by modulating leaf primary metabolism and the portioning of Na+ and K+ among roots and shoots.

INTRODUCTION

Plant metabolism is modified by several adverse conditions, as an acclimation mechanism or as a result of the antagonistic relationship between the use of primary metabolites for growth and secondary metabolites for defense (Blanch et al., 2007). Salinity is one of the main abiotic limiting stress factor for the production of cultivated and uncultivated plants, especially in arid and semi-arid fields. Physiological responses depend on the phenotypic plasticity and genotypic characteristics of each species (Bisbis et al., 2018; Parihar et al., 2015). The majority of crops is highly salt sensitive, in which decreased biomass and yield are commonly observed (Zörb et al., 2019). Indeed, salt compromise key plant physiological processes, such as seed germination (Alencar et al., 2015), leaf gas exchange (Mittal et al., 2012), water balance (Romero-Aranda et al., 2001), nutritional status (Keutgen and Pawelzik, 2009), and, consequently, plant growth and yield (Semiz et al., 2012). Thus, understanding the mechanisms by which plants acclimate and tolerate salt-stress is of fundamental importance to obtain salt-tolerant genotypes. In turn, it can then be used to improve plant agricultural in salt-rich areas such as the Caatinga biome (Agra et al., 2008; Santos et al., 2017), a typical dryland Brazilian ecosystem encompassing 0.9 million km2 of area and a population of 25 million (Haro and Ferré, 2018; J. M. C. Silva et al., 2018).

Integrated to the ecosystem, metabolites play an important role in plant acclimation under several types of challenges (Akula and Ravishankar, 2011). The developmental stages, the season of harvest, mineral availability, drought, salinity, and others stress factors are all powerful to influence the synthesis of metabolites such as terpenes (Wüst, 2018; Yang et al., 2018). The information from (a)biotic stresses are perceived by the plant, then physiological responses are triggered according to the prevailing environmental condition, in which phytohormones are key for this plant-environment communication (Akula and Ravishankar, 2011). For instance, salicylic acid (SA) is an antioxidant phytohormone naturally produced by plants. Beyond its involvement in both local and systemic defense response against pathogens, SA can also reduce the harmful effects of salt stress by modulating leaf gas exchange with the atmosphere and plant carbohydrate metabolism (Miura and Tada, 2014; Sah et al., 2016; Wang et al., 2010). Furthermore, exogenous application of SA has been reported to reduce oxidative stress promoted by salt, especially at low concentrations (Belkadhi et al., 2014; Ma et al., 2017; Mimouni et al., 2016; Noreen and Ashraf, 2010). This suggests that SA may be important for plant salt stress acclimation. However, the mechanisms by which SA coordinates plant salt

stress responses via primary and secondary metabolites remain unclear. Given its ability to study plants with non-sequenced genome and follow a considerable large number of metabolic phenotypes, metabolomics approaches have been widely used to investigate plant stress responses (Obata and Fernie, 2012). It is mainly applied to determine the relationship between physiological and environmental changes with the use of advanced analyses methods (Gargallo-Garriga et al., 2018; Lavergne et al., 2018; Shen et al., 2019). Among them, solid phase microextraction (SPME) is highlighted for the extraction of volatile organic compounds (VOC’s), which does not induce modifications in its emissions due to temperature (Aguilar et al., 2016; Alpendurada, 2000; F. A. N. Silva et al., 2018; Vas and Vékey, 2004). There is a possible application of VOC’s released from leaves in agriculture, as a natural and eco-friendly answer to protect plants from pathogens and environmental pressures, and improve crop production (Brilli et al., 2019). Moreover, gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) is an efficient technique that has been employed for analysis of a range number metabolites, including volatile and primary metabolites, especially sugars, amino acids and organic acids (Azevedo et al., 2006; Burzynski-Chang et al., 2018; Fernandes et al., 2009; Mamedes-Rodrigues et al., 2018).

The therapeutic, annual and aromatic herbaceous Egletes viscosa (L.) Less is found throughout South America and belongs to the Asteraceae family. Usually known as “macela-da-terra”, the plant spreads easily on the edges of small lakes and rivers, including the entire northeastern area of Brazil (Azevêdo et al., 2010; Lima et al., 1996; Matos, 2007; Silva and Andrade, 2013; Staudt et al., 2017). The leaves and flower buds are consumed mainly as a tea for digestive and intestinal disorders treatment, all of it thanks to the popular medicinal knowledge (Fagg et al., 2015; Pio et al., 2018; Ribeiro et al., 2014). Phenolic compounds, terpenes, and alkaloids are the three major groups of secondary metabolites used against diseases, in which terpenoids are commonly identified in the plant Asteraceae family (Yatoo et al., 2018). Recently, a phytochemical study reported the isolation of several compounds of E. viscosa flower bud’s infusion including caffeic acid derivatives, flavonoids, and diterpenes (Rodrigues et al., 2019). Pharmacological studies have reported anticonvulsants, and anti-bacterial properties for its essential oil, as well as anti-inflammatory, anti-anaolathic, antithrombotic, hepatoprotective, uroprotective, anti-diarrheal, antispasmodic, and antinociceptive properties (de Oliveira Garcia et al., 2007; Matos, 2007; Santos et al., 2012; Silva-Filho et al., 2007). Indeed, terpenes found in E. viscosa provided scientific confirmation for gastroprotective (Guedes et al., 2008), dermatitis (Calou et al., 2008), and

anti-neurogenic inflammation (Melo et al., 2006). Physiological and agronomical studies involving E. viscosa are scarce, it becomes important to improve the capacity of active principles yield in the leaves and flower buds from both cultivated chemotypes. A few reports have been describing only about physiological seed maturation and germination (Bezerra et al., 2003), the use of gibberellic acid and 6-benzalaminopurine on in vitro growth (Diniz et al., 2003), as well as how different harvest times affect biomass production, and quantitative or qualitative components of essential oil (Bezerra et al., 2008). Nowadays, through the advancement of new methodologies, it is possible to increase our perception and conscious use of species, starting a new era in the study of therapeutic plants that goes beyond popular knowledge.

Here, we have integrated phenotypic, biochemical, metabolic, and physiological approaches to investigate the response of a non model plant to isolated and integrated SA and salt stress. We hypothesized that NaCl affects the development of E. viscosa and the interaction with exogenous SA can alter volatile and primary metabolites that help to diminish the harmful effects of salinity.

MATERIALS AND METHODS Plant growth conditions

Seeds of Egletes viscosa, (L.) Less, an Asteraceae (Composition) were purchased from the trade in Fortaleza-CE, Brazil, and sown in vermiculite and substrate (2:1). After germination, seedlings were moved to a greenhouse of Federal University of Ceará located in Fortaleza-Ce, Brazil (3°44'40"S 38°34'26"W) classified with Aw weather (Köppen, 1948), following average environmental conditions: 63.5% relative humidity, 12-h photoperiod, day/night temperature of 32/26°C.

Nine weeks old seedlings were selected by uniformity, vigor, and sanity, then transferred to plastic containers (10 L of capacity) in a hydroponic system to acclimation. Clark nutrient solution in half strength was renewed every two days, to provide macronutrients [(NH4)2SO4; KH2PO4; KNO3; KCl; Ca(NO3)2; MgSO4], micronutrients and Fe-EDTA (Clark, 1975). Moreover, pH solution was adjusted daily to 6.0 with 1.0 M NaOH or 1.0 M HCl. After 16 days of acclimation, two plants were transferred to each 3L plastic containers disposed to completely randomized design and 5 replications of each treatment (one SA concentrations and two NaCl concentrations). Salinity imposition was performed by adding NaCl in two steps of 20 mM and 40 mM per day to avoid osmotic shock, totaling 40 and 80 mM of NaCl, respectively (Miranda et al., 2017). A manual pump was used to spray 5 ml/per plant of 1.0 mM exogenous salicylic acid or H2O as control treatment on both adaxial and abaxial surface

in the first and second days (Elhindi et al., 2017). It was re-sprayed in the seventh and eighth days after the beginning of salt treatment. Plants were kept under such conditions by 14 days (Figure 1), Clark solution was renewed every two days to keep up suitable mineral levels and pH was adjusted daily as previously described.

The biological samples were used as fresh, dry or frozen in liquid Nitrogen and kept at -80 °C. Further analyses were carried out at Plant Physiology Laboratory (LABFIVE) of Biochemistry and Molecular Biology Department. Solid phase microextraction (SPME) and Gas Chromatographic were performed at Multiuser Chemistry of Natural Products Laboratory of Embrapa Tropical Agroindustry in Fortaleza – CE.

Figure 1- Steps of the treatment of Egletes viscosa .

Growth parameters evaluation

Plants of E. viscosa were separated in shoots and roots. Shoot and root fresh mass (SFM and RFM, respectively) were measured using electronic balance. Thereafter, they were stored in paper bags and oven-dried at 60 °C for 72h, after that time shoots and roots dry mass (SDM and RDM, respectively) were taken, as well as the ratio of tissues. The leaf area was determined with an area integrator LI-3100 Area Meter, Li-Cor., Inc., Lincoln, Nebraska, USA (LI-COR, 1996).

Gas exchange measurements and photosynthetic pigments

Gas exchange measurements were performed on fully expanded leaves, after 14 days of treatments, under 380 µmol-1 of CO2, and 1.000 µmol photons m2 s-1 of PPFD. The data were collected between 9 and 11 h on the day, being measured the net photosynthetic rate (A), stomatal conductance (gs), transpiration rate (E) and the ratio of internal and external CO2 concentration (Ci/Ca). For these measurements, a portable infrared gas analyzer (IRGA, mod. LI-6400XT, LI-COR, Lincoln, USA) was used, carrying a light source with an intensity of 1000 μmol m-2

s-1 (ADC, LI-COR, Lincoln, USA; LICOR, 2017). Chlorophyll a, b and carotenoid concentrations were determined by spectrophotometric method (Wellburn, 1994). Leaf tissue extraction was done with dimethyl sulfoxide saturated CaCO3 for 24 h. Soon after, the samples were incubated at 65 °C in a water-bath for 45 min. The absorbance of the supernatant was measured at the following wavelengths: 665, 649 and 480 nm and expressed as mg g-1 dry mass (DM).

Leaf and root Ion content

Inorganic ions (Na+ and K+) determinations were performed by homogenizing 50 mg of dried leaf or root tissues ground with a mortar and pestle added to 5mL of deionized water. Thereafter, the homogenate was maintained in a water-bath at 75 °C shaking it in every 15 min, and then 15 min centrifuged at 3,000 g. The clear supernatant was used for ions quantification by flame photometry (Micronal®, model B462) and the values were expressed in μmol g-1

Lipid peroxidation and hydrogen peroxide evaluation

Lipid peroxidation of leaves was determined after 14 days of treatments by thiobarbituric acid reactive substances (TBARS). A fresh 0.3g crushed sample was homogenized in 4mL trichloroacetic acid (TCA) (0.1%) for 3 min at 4°C (Cakmak and Horst, 1991). To 250 μl aliquot of the supernatant was added 1 ml 10% TCA containing 0.5% TBA. The mixture was heated at 95°C for 30 min and then quickly cooled in an ice-bath.Then the homogenate was centrifuged at 3,000 g for 10 min at 25°C. The malondialdehyde (MDA) was measured from absorbance readings at 532 nm (TBA reaction with MDA) and 600 nm (TBA reaction with other substances) performed in a microplate spectrophotometer (Synergy ™ Mx Model, BioTek) and the MDA reactive concentration was calculated from the molar extinction coefficient (ԑ = 155 mM -1 cm -1) using the Lambert-Beer equation (A532-A600)/ԑ. The values were expressed in μmol g-1

FM. Hydrogen peroxide (H2O2) content was extracted according to described above and determined by monitoring the absorbance of potassium iodide at 390 nm (Sergiev et al., 1997). The H2O2 content in E. viscosa leaves was quantified by spectrophotometric readings at 390 nm by reference to a standard curve prepared with H2O2 solutions (Ingram, 1976) and expressed as µmol g-1 FM.

Extraction and analysis of leaf metabolites using GC-MS

After 14 days of different treatments, leaves were harvested, immediately frozen in liquid nitrogen and kept at -80 °C. Then they were used to perform a non-volatile metabolic profile. The extraction and derivatization of polar metabolites were performed as previously described (Lisec et al., 2006) with slight modifications. Approximately 100 mg of fresh tissue was ground into a powder and added to water:methanol:chloroform at 1:2.5:1 (v/v/v) as well as 30 L of the internal standard ribitol (0.2 mg mL-1

). The mixture was shaken at 70 °C for 15 min by 350 RPM, then centrifuged at 10,000 g for 10 min by 4 °C. Then, 150 L of the resulting upper (polar) phase was taken and dried in a SpeedVac for further derivatization and analyzed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). Samples were derivatized through the addition of 20 L (0.5 mL of pyridine containing methoxyamine hydrochloride 10 mg mL-1). The mixture was shaken at 37 °C for 2h by 350 RPM and addition 35L N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (MSTFA). Both chromatogram and mass spectral analysis were evaluated using the TagFinder program (Luedemann et al., 2008) and Xcalibur™ 2.1 software.

Volatile organic compound extraction by SPME and identification by GC-MS

To capture volatiles organic compounds after 14 days of treatments we use a 1.0 cm divinylbenzene/Carboxen/polydimethylsiloxane (DVB/CAR/PDMS) 50/30 µm fiber stable Flex (Supelco, Bellefonte, PA). Fresh leaves (1.05 ± 0.07 g) were placed into 20 mL vials, results were adjusted to 1.0 g of FM. Thereafter 8mL of Mili-Q water (Merck Millipore®) and 3g of oven-dried NaCl (80ºC/24h) were added into each vial. The time of capture was 30 min and 15 min of equilibrium. The analyses were done by quadruplicates, two control vials composed by 8mL of H2O and 3g of NaCl, or an empty vial (Cappelaro and Yariwake, 2015; Damasceno et al., 2010; F. A. N. Silva et al., 2018).

Compounds separation, identification, and analysis were performed by CG-MS equipment, Agilent GC-7890B /MSD-5977A (quadrupole) model, electron impact of 70 eV, HP-5MS metilpolissiloxano (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm, Agilent) column, Helio gas flow of 1.00 mL.min-1, injection temperature of 260°C and detector of 150 °C, transfer line temperature of 280°C. Chromatographic run was set from 40 °C, heating ramp of 7 °C. min-1 to 260 °C, to followed by 5 min at the end of the run (36.5 min). Identification of compounds was carried out by analysis of spectral mass fragmentation exhibited and database library supplied by equipment (NIST, version 2.0, 2017 – 287.324 compounds), also by comparison with Kovats index (KI), obtained through retention index and a serial mixture of homologue standards alkanes (C7-C30) and literature databases (Adams, 2007; NIST, 2016). The proportion of each compound on the leaves was performed by normalization of their respective peak areas (F. A. N. Silva et al., 2018).Chromatograms obtained from each treatment were normalized by peak areas, comparing linear retention index from a standard mix of n-alkanes and/or data from a library.

Statistical analysis

The experimental design was completely randomized with factorial arrangement 3x2, consisting in three growth conditions (absence of NaCl, presence of NaCl 40 mM and 80 mM) and two salicylic acid treatments (absence or presence of SA 1.0 mM). Experimental conditions were composed by 5 replicates, been two different biological plants per replicate. Data are represented as the mean ± standard deviation (SD). The significant difference between means was compared by one-way analyses of variance (ANOVA) and Tukey test (P ≤ 0.05) using SISVAR software, version 5.6 (Ferreira, 2011). Figures were made using SigmaPlot

software, version 10.0 (SISTAT software, Inc.). Principal component analysis (PCA) was performed in the MetaboAnalyst 3.0 (Xia et al., 2015).

RESULTS

Salt stress reduces plant growth

The development of E. viscosa was negatively affected by NaCl(Fig. 2), regardless of concentration, when it was compared to control plants (without salt and SA). Shoot fresh mass (SFM), shoot dry mass (SDM), root fresh mass (RFM), and root dry mass (RFM), as well as leaf area (LA), were all reduced by 40 and 80mM of NaCl (Fig.2A-D, F).Additionally, at 80mM NaCl the values of RFM and LA were lower than the values at 40mM NaCl. On the other hand, salinity did not change the RDM/SDM ratio (Fig. 2E). The presence of exogenous salicylic acid (SA), without salt, promoted a slight increase of SDM, RDM, RDM/SDM ratio, and LA. Considering plants exposed to 40mM NaCl, exogenous SA was not able to change the effects of salinity in the SFM, SDM, and LA (Fig. 2A, B, F); whereas, RFM and RDM, as well as RDM/SDM ratio, were decreased (Fig. 2C, D, E). In plants exposed to 80mM NaCl, exogenous SA was also not able to change the effects of salinity in SFM, RDM, and LA. However, the SDM and RFM were decreased (Fig. 2B, C), whilst the RDM/SDM ratio was notably increased (Fig. 2E). The phenotype of each treatment was also presented ( Fig. 3).

0 6 12 18 24 30 BaCa Aa Ba Aa Aa 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 1 mM SA 0 mM SA Ba Cb Aa Ba Ab Aa 0 3 6 9 12 Ca Ba Bb Aa Ab Aa 0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 Ba Bb Ab Aa Aa Aa SFM (g .pla n t -1 ) SDM (g .pla n t -1 ) R FM (g .pla n t -1 ) R D M (g .pla n t -1 ) A B C D L A (cm 2 .pla n t -1 ) 0 140 280 420 560 Ca Cb Ba Aa Ba Aa R D M/ SDM 0.00 0.12 0.24 0.36 0.48 Aa Bb Ab Aa Aa Cb E F NaCl (mM) NaCl (mM) 0 40 80 0 40 80 Source: Author, 2018.

Figure 2. Growth measurements of Egletes viscosa plants after 14 days of different treatments. A) Shoot fresh mass (SFM); B) Shoot dry mass (SDM); C) Root fresh mass (RFM); D) Root dry mass (RDM); E) Leaf area; and F) Ratio of RDM/SDM. Different capital letters indicate significant differences due to saline stress treatment (0, 40 mM, and 80mM of NaCl), while different lowercase letters indicate significant differences due to salicylic acid (SA) treatment (0 and 1.0 mM), according to Tukey test (P≤ 0.05). Bars represent means of five biological replicates ± standard deviation.

A

B

C

D

E

F

Source: Author, 2018.

Figure 3. Egletes viscosa plants after 14 days of different treatments. A) Control (without stresses); B) Salicylic acid (SA) 1.0 mM; C) 40 mM NaCl; D) 40 mM plus SA 1.0mM; E) 80 mM NaCl; F) 80 mM NaCl plus SA 1.0mM.

Salicylic acid alters K+ and Na+ accumulation in leaves roots of salt stressed plants

The contents of Na+ ion in leaves and roots of salt-stressed plants (without SA) were increased as NaCl concentration was increased in nutrient solution (Fig. 4A, B). On the other hand, contents of K+ ion were reduced in leaves and roots of salt-stressed plants as NaCl concentration was increased (Fig. 4C, D). The ratio of K+/Na+ was also impaired by salinity in both leaves and roots (Fig. 4E, F). Additionally, the effects of salinity impairing K+ contents and K+/Na+ ratios were accentuated at 80mM than at 40 mM. The application of exogenous SA in plants, without salt, promoted a slight decrease of roots Na+ content; however, it was not changed in leaves (Fig. 4A, B). Further, exogenous SA also favored a decrease of K+ content, in both leaves and roots (Fig. 4C, D), as well as the ratio of K+/Na+ in roots (Fig. 4F), although the ratio of K+/Na+ was slightly increased in leaves (Fig. 4E). Application of exogenous SA in interaction with 40mM NaCl promoted an increase of both Na+ and K+ contents in roots (Fig. 4B, D), although they were not changed in leaves, as well as K+/Na+. Further, considering the interaction of NaCl 80mM and SA, the Na+ content was strongly induced in leaves and decreased in roots (Fig. 4A, B), whilst K+ contents were increased in both leaves and roots (Fig. 4C, D), but no significative changes were observed in K+/Na+ ratio in both leaves and roots.