Microinjeção de agonistas Gabaa e Gabab no núcleo accumbens induz ao comportamento ansiolítico e a hiperfagia

Texto

(1)ANA PAULA FRAGA LOPES. MICROINJEÇÃO DE AGONISTAS GABAA E GABAB NO NÚCLEO ACCUMBENS INDUZ AO COMPORTAMENTO ANSIOLÍTICO EA HIPERFAGIA.. Dissertação de Mestrado apresentada ao curso de Pós-graduação em Neurociências da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Neurociências. Orientador: Prof. Paschoalini.. Florianópolis – SC 2007. Dra.. Marta. Aparecida.

(2) ANA PAULA FRAGA LOPES. MICROINJEÇÃO DE AGONISTAS GABAA E GABAB NO NÚCLEO ACCUMBENS INDUZ AO COMPORTAMENTO ANSIOLÍTICO E À HIPERFAGIA.. Esta dissertação foi julgada adequada à obtenção do título: MESTRE em NEUROCIÊNCIAS e aprovada em sua forma final pelo Curso de Pós-Graduação em Neurociências da Universidade Federal de Santa Catarina.. ______________________________________________________ Prof.(a): Dr.(a): Marta Aparecida Paschoalini Depto. Ciências Fisiológicas CBB – UFSC. ______________________________________________________ Prof. Dr. Moacir Serralvo Faria Depto. Ciências Fisiológicas CBB – UFSC. ______________________________________________________ Prof. Dr. Adair R. Soares dos Santos Depto. Ciências Fisiológicas CBB – UFSC. Florianópolis, maio de 2007.

(3) Dedico ao meu filho Lucas, que foi paciente e soube esperar a finalização deste trabalho, para fazer parte da minha vida e de seu pai Fábio. Muito obrigada por existir!.

(4) AGRADECIMENTOS. Agradeço aos meus pais, Jaci e Marlene, que me proporcionaram a vida e sempre foram meus incentivadores. Ao meu irmão André Luís que me ensinou a nunca desistir e, a cada dia, ser uma profissional mais humana. Ao meu marido, Fábio por todos os momentos que me ajudou a tornar está batalha mais tranqüila. Agradeço por compreender a importância desta conquista para minha vida e a entender os muitos momentos de ausências. Muito Obrigada! À vida de cada uma das ratas Wistar que participaram da minha pesquisa e que auxiliaram a finalizar este estudo com êxito. Muito Obrigada! A minha orientadora, professora Marta que confiou em meu trabalho e me mostrou como realizar e transformar esta nova etapa da minha vida em realidade. Ao professor Moacir que também colaborou para o meu crescimento como pesquisadora. Aos amigos Isabel e Sérgio que me ensinaram técnicas de laboratório e com quem compartilhei risos e estresses. Valeu! Aos. IC. Juliano. e. Adriana,. que. aprenderam. e. colaboraram. significativamente com a pesquisa. Aos funcionários, dona Vilma, seu Carlão, Nivaldo e Ana Cláudia que sempre cuidaram dos bastidores dos laboratórios. Muito Obrigada! À convivência com os colegas de outros laboratórios Luana, Márcia, Fábio, Marcos e Eduardo. Valeu!.

(5) A jornada que escolhemos não é de sossego nem mágoas. É o caminhar seguro e valente desfraldando a bandeira da esperança, do otimismo e da convicção! Não faz mal que seja pouco, o que importa é que o avanço de hoje seja maior que o de ontem. Que nossos passos de amanhã sejam mais largos que os de hoje. Atuem agora e vivam o presente Com a certeza de que neste exato instante Está se erguendo o futuro Deixem seus méritos gravados Na história de suas contínuas vitórias! A dificuldade no momento presente Será a glória em seu futuro! Daisaku Ikeda, Poeta laureado no mundo.

(6) RESUMO. Dados da literatura apontam à participação de circuitos gabaérgicos do núcleo accumbens (ACC) no comportamento da ansiedade e no controle da ingestão de alimento em ratos. O objetivo deste estudo foi estabelecer uma associação entre o efeito ansiolítico e a hiperfagia, após a ativação de receptores GABAA e GABAB encontrados na região da concha do ACC. Foram utilizados ratos Wistar fêmeas (200-300g), portando cânulas-guia implantadas bilateralmente 2 mm acima da região da concha do ACC, mantidas com água e ração ad libitum. Os animais foram tratados, bilateralmente, com salina (200 nl), muscimol (MUSC) agonista GABAA (128 e 256 pmol/lado) ou baclofen (BACL) agonista GABAB (128 e 256 pmol/lado) e expostos ao labirinto em cruz elevado (LCE) por 5 min. Imediatamente após esse período, os animais foram transferidos para uma caixa de registro alimentar para avaliação, por 1 h, do consumo de água e alimento. As imagens foram gravadas em VHS e posteriormente foram realizadas as leituras no programa Etholog 2.25. Os resultados mostraram que apenas a dose mais baixa de MUSC reduziu o comportamento de avaliação de risco, que é um indicador etológico do efeito ansiolítico. A dose mais alta não alterou significativamente nenhum dos comportamentos avaliados ou as medidas espaço-temporal. Ambas as doses de BACL reduziram o comportamento de avaliação de risco, caracterizando efeito ansiolítico, e a dose mais alta aumentou o comportamento de imersão de cabeça, sendo que os demais comportamentos ou as medidas espaço-temporal não sofreram alterações com ambas as doses. Em relação ao veículo (0,1 ± 0,1 g), as duas doses de MUSC induziram elevação semelhante na ingestão de alimento (2,2 ± 0,6 g; 2,7 ± 0,4 g), acompanhada por uma redução na latência para iniciar, sem alterar a duração da resposta de ingestão de alimento. Ambas as doses de BACL provocaram hiperfagia (2,6 ± 0,5 g; 5,0 ± 0,4 g) de modo dose-dependente, acompanhada por redução na latência para iniciar e aumento na duração da resposta de ingestão de alimento. Diante desses dados, sugere-se que o comportamento de ansiedade e o comportamento de ingestão de alimento são controlados de forma distinta por circuitos gabaérgicos encontrados na concha do ACC. A hiperffagia induzida pelo MUSC foi mantida sem que ocorresse alteração.

(7) simultânea nos indicadores comportamentais de ansiedade. Além disso, o efeito do BACL sobre a ingestão de alimento apresentou uma relação dose dependente, no entanto o efeito ansiolítico induzido pelo BACL mostrou a mesma intensidade, independente da dose administrada, reforçando a sugestão de que circuitos gabaérgicos do ACC envolvidos no controle de ingestão de alimento estão dissociados daqueles envolvidos no controle da ansiedade.. Palavras-chave: hiperfagia.. núcleo. accumbens,. muscimol,. baclofen,. efeito. ansiolítico,.

(8) ABSTRACT. Data from literature indicate the participation of gabaergic circuits of the nucleus accumbens (ACC) in the anxiety-like behaviors and in the control of food intake in rats. The objective of the present study was to establish an association between anxiolytic effects and hyperphagia after the activation of the receptors GABAA and GABAB found in the region of ACC shell. The experiment used female (200-300g), which were implanted with bilateral guide cannulae 2mm above the region of the ACC shell and kept with water and ration ad libitum. The animals were treated bilaterally with saline (200 nl), muscimol (MUSC) GABAA agonist (128 and 256 pmol/side) or baclofen (BACL) GABAB agonist (128 and 256 pmol/side) and put into to the elevated plus maze (EPM) for 5 min. Immediately after this period, the animals were transferred to a feeding cage for evaluation of the consumption of water and food for 1 h. The images were recorded in VHS and read through the Etholog 2.25 program. The results showed that only the lower dose of MUSC decreased the behavior of risk assessment, which is an ‘ethological’ indicator of anxiolytic effect. The higher dose did not alter significantly any of the evaluated behaviors or the space-time measures. Both doses of BACL reduced the behavior of risk assessment, characterizing anxiety behavior. The higher dose increased the behavior of head dipping and the other behaviors or the space-time measures did not modify with both doses. In relation to the vehicle (0.1 ± 0.1 g), the two doses of MUSC induced similar rise in food intake (2,2 ± 0,6 g; 2,7 ± 0,4 g), followed by a decrease in the latency to initiate, without modifying the answer time of food intake. Both doses of BACL, forced dose-dependent hyperphagia (2,6 ± 0,5 g; 5,0 ± 0,4 way g) followed by a decrease in the latency to start the ingestion and increase in the answer time. Therefore the data, anxiety-like behavior is suggested controls of food intake are controlled of distinct form by gabaergic circuits found in ACC shell. The hyperphagia induced by MUSC, was kept occurred without simultaneous modifications in anxiety behaviors indicators. Moreover, the effect BACL about food intake showed dose-effect relation, however this anxiety-effects induced by BACL showed same intensity, independently of managed dose, intensifying the suggestion with gabaergics circuits of ACC involved in food intake controls, are disassociate those involved in anxiety-control. Keywords: nucleus accumbens, muscimol, baclofen, anxiolytic effects, hyperphagia..

(9) LISTA DE FIGURAS. Figura 1: Desenhos semi-esquemáticos representando cortes coronais (100 µm) do cérebro dos ratos (ATLAS PAXINOS E WATSON, 1998), que ilustram os locais onde as microinjeções bilaterais de VEH (rosa), MUSC 128 pmol (verde), MUSC 256 pmol (azul), BACL 128 pmol (vermelho) e BACL 256 pmol (amarelo) produziram efeito ansiolítico e alteração da ingestão de alimentos na região da concha do ACC. ................................................................................................. 39 Figura 2: Alterações na freqüência do comportamento de avaliação de risco (A) e na freqüência do comportamento de imersão de cabeça (B), observados durante 5 minutos de exposição ao LCE em ratos tratados bilateralmente com veículo (VEH) (n = 22); muscimol (MUSC) agonista GABAA 128 pmol (n = 12) e 256 pmol (n = 10); baclofen (BACL) agonista GABAB 128 pmol (n = 10) e 256 pmol (n = 11) na região da concha do ACC. (*) p < 0,05 em relação ao VEH. ........... 43 Figura 3: Alterações na porcentagem (%) de tempo nos braços abertos (C), na % de entradas nos braços abertos (D) observados durante 5 minutos de exposição ao LCE em ratos tratados bilateralmente com veículo (VEH) (n = 22); muscimol (MUSC) agonista GABAA 128 pmol (n = 12) e 256 pmol (n = 10); baclofen (BACL) agonista GABAB 128 pmol (n = 10) e 256 pmol (n = 11) na região da concha do ACC. ................................................................................................. 44 Figura 4: Quantidade de alimento ingerido, a latência para iniciar a resposta de ingestão de alimentos e a duração da resposta ingestão de alimentos após microinjeção bilateral de veículo (VEH) (n = 22); muscimol (MUSC) 128 pmol (n = 12) e MUSC 256 pmol (n = 10); baclofen (BACL) 128 pmol (n = 10) e BACL 256 pmol (n = 11) na região da concha do ACC em ratos saciados. A avaliação comportamental foi realizada durante 1 hora. Os dados representam à média ± erro padrão. (*) p < 0,05 em relação ao VEH. (#) p < 0,05 em relação ao BACL 128 pmol. ........................................................................................................... 48.

(10) LISTA DE TABELAS. Tabela 1: Comportamentos investigados no LCE ............................................. 33 Tabela 2: Comportamentos ingestivos e não ingestivos investigados na caixa de registro do comportamento alimentar. ................................................................ 34 Tabela 3: Número de entradas nos braços abertos (EA), número de entradas nos braços fechados (EF), número total de entradas (ET), porcentagem de permanência no centro (%TC), freqüência da exploração vertical (EV) e freqüência da auto-limpeza (AL) avaliados em ratos mantidos durante cinco minutos no LCE, e tratados bilateralmente com veículo (VEH); muscimol (MUSC) 128 e 256 pmol; baclofen (BACL) 128 e 256 pmol, na região da concha do ACC............................................................................................................... 45 Tabela 4: Quantidade de água ingerida, a latência para iniciar e a duração da resposta dipsiogênica (média ± erro padrão da média, em segundos) após a microinjeção bilateral do veículo (VEH); muscimol (MUSC) 128 e 256 pmol; baclofen (BACL) 128 e 256 pmol na região da concha do ACC, em ratos saciados. Avaliação comportamental foi realizada por uma hora. ..................... 50 Tabela 5: Latência para iniciar a exibição dos comportamentos não ingestivos (média ± erro padrão da média, em segundos), após a microinjeção bilateral de veículo (VEH); muscimol (MUSC) 128 e 256 pmol; baclofen (BACL) 128 e 256 pmol, na região da concha do ACC. Avaliação comportamental realizada por uma hora. (*) p < 0,05 em relação ao VEH. ....................................................... 53 Tabela 6: Duração dos comportamentos não ingestivos (média ± erro padrão da média, em segundos), após a microinjeção bilateral de veículo (VEH); muscimol (MUSC) 128 e 256 pmol; baclofen (BACL) 128 e 256 pmol, na região da concha do ACC. Avaliação comportamental realizada por uma hora. (*) p < 0,05 em relação ao VEH. ................................................................................................. 56.

(11) Tabela 7: Freqüência dos comportamentos não ingestivos (média ± erro padrão da média, em segundos), após a microinjeção bilateral de veículo (VEH); muscimol (MUSC) 128 e 256 pmol; baclofen (BACL) 128 e 256 pmol, na região da concha do ACC. Avaliação comportamental realizada por uma hora. .......... 58.

(12) SUMÁRIO. 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 14 1.1. RECEPTORES ÁCIDO GAMA - AMINOBUTÍRICO (GABA)A E (GABA)B, E O NÚCLEO. ACCUMBENS (ACC). ................................................................................................... 14. 1.2. ANSIEDADE E O LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO (LCE) .......................................... 23. 1.3. JUSTIFICATIVA ............................................................................................... 26. 1.4. OBJETIVO GERAL............................................................................................ 28. 1.5. OBJETIVO ESPECÍFICO .................................................................................... 28. 2. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 29 2.1. ANIMAIS ........................................................................................................ 29. 2.2. PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS ........................................................................ 30. 2.3. SOLUÇÃO E DOSES ADMINISTRADAS ................................................................. 31. 2.4. INJEÇÕES INTRACEREBRAIS ............................................................................ 31. 2.5. REGISTRO COMPORTAMENTAL NO LCE ............................................................. 32. 2.6. REGISTRO DOS COMPORTAMENTOS INGESTIVOS E NÃO INGESTIVOS ................... 33. 2.7. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ................................................................... 35. 2.8. HISTOLOGIA ................................................................................................... 36. 2.9. ANÁLISE DE DADOS. 3.. RESULTADOS ................................................................................................. 38. 3.1.. LOCAIS ATINGIDOS PELA MICROINJEÇÃO DE VEH, MUSC (AGONISTA GABAA) E BACL. ........................................................................................ 36. (AGONISTA GABAB) NA REGIÃO DO ACC. ...................................................................... 38 3.2.. MICROINJEÇÃO DE MUSC (AGONISTA GABAA) E BACL (AGONISTA GABAB) NA REGIÃO. DA CONCHA DO ACC E SEUS EFEITOS SOBRE O NÍVEL DE ANSIEDADE.. 3.3.. ............................ 41. MICROINJEÇÃO DE MUSC (AGONISTA GABAA) E BACL (AGONISTA GABAB) NA REGIÃO. DA CONCHA DO ACC E SEUS EFEITOS SOBRE OS COMPORTAMENTOS INGESTIVOS E NÃO INGESTIVOS.. ............................................................................................................ 46. 3.3.1. Ingestão de alimento ............................................................................... 46 3.3.2. Ingestão de água ..................................................................................... 49 3.3.3. Comportamento não ingestivo ................................................................. 51 3.3.3.1. Latência para iniciar a exibição: ............................................... 51 3.3.3.2. Duração de exibição: ................................................................ 54 3.3.3.3. Freqüência de exibição:............................................................ 57.

(13) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 13. 4.. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 59. 5.. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 70. ANEXO ..................................................................................................................... 82.

(14) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 1. 14. INTRODUÇÃO. 1.1. RECEPTORES ÁCIDO GAMA - AMINOBUTÍRICO (GABA)A E (GABA)B, E O NÚCLEO ACCUMBENS (ACC). O ácido gama-aminobutírico, GABA é o principal neurotransmissor inibitório do sistema nervoso central, localizado em muitas células neuronais, incluindo interneurônios e células gliais. Pode ativar dois tipos de receptores: os receptores ionotrópicos (GABAA e GABAC), que estão ligados aos canais iônicos de cloreto com sítios de ligação para benzodiazepínicos, barbitúricos e neuroesteróides. E os receptores metabotrópicos (GABAB), que estão acoplados à proteína G (BORMANN, 2000; CHEBIB e JOHNSTON, 1999; BOWERY et al., 2002). O GABA tem um papel importante para as disfunções de ansiedade, em conseqüência da eficácia da ação dos benzodiazepínicos, que agem primeiramente sobre os receptores gabaérgicos no controle da ansiedade (NUTT e MALIZIA, 2001). Pode desta maneira, ser considerado elemento chave na regulação central de funções somáticas e mentais (MÖHLER, 2006), como também na regulação do comportamento emocional (McDONALD et al., 2004). No sistema nervoso central (SNC) as disfunções, na transmissão sináptica dos neurotransmissores gabaérgicos, podem acarretar várias patologias. A hipoatividade, na transmissão sináptica resulta em espasticidade, epilepsia, desordens no sono, ansiedade ou depressão. A hiperatividade está relacionada com.

(15) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 15. a esquizofrenia (BENES e BERRETTA, 2001). Em pacientes com disfunções de ansiedade, vários estudos de neuroimagens mostraram que pode haver redução do número do receptor GABAA que se liga com benzodiazepínicos (MALIZIA et al., 1998; BREMER et al., 2000; GODDARD et al., 2001; TIIHONEN et al., 1997). Estudos recentes sugerem que o neurotransmissor GABA participa de microcircuitos no ACC, tanto para motivação positiva, quanto para a negativa. A positiva representa o comportamento ingestivo e de recompensa. A negativa caracteriza-se como comportamentos aversivos e de medo (REYNOLDS e BERRIDGE, 2001, 2002, 2003). Há autores que defendem o princípio de que o aumento da ingestão de alimento relaciona-se com as microinjeções de agonistas de receptores GABAA, como exemplo o muscimol (BASSO e KELLY, 1999; STRATFORD e KELLEY, 1997; REYNOLDS e BERRIDGE, 2001) e agonistas de receptores GABAB, como o baclofen (MALDONADO-IRIZARRY et al., 1995; STRATFORD et al., 1998 e 1999); STRATFORD e KELLEY, 1997; KELLEY e SWANSON, 1997), quando aplicados na região da concha do ACC. Pesquisas atuais indicam que os receptores de GABAB participam também do controle da ansiedade (CRYAN e KAUPMANN, 2005; PILC e NOWAK, 2005). O baclofen reduz o sintoma em pacientes que sofreram estresse póstraumático; nos pacientes alcoólatras após a retirada do álcool (ADDOLORATO et al., 2002, 2006; AMEISEN, 2005; FLANNERY et al., 2004); na síndrome do pânico (BRESLOW et al., 1989) e em pacientes que sofreram trauma medular (HINDERER, 1990). Os receptores GABAA possuem uma estrutura formada pelo conjunto de cinco subunidades de famílias diferentes, possuindo variantes genéticas (α1–6, β1–.

(16) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 16. 4, γ1–3, ρ1–3, є1, π1, e δ1), e atuam nos canais de cloreto provocando inibição póssináptica. A existência, de pelo menos de dezesseis subunidades distintas, conduz a uma heterogeneidade substancial do receptor de GABAA. Os subtipos mais abundantes do receptor GABAA contêm, no mínimo, um membro das classes α, β, e γ (GRIEBEL et al., 2003). Ao se combinar com o receptor GABAA, o neurotransmissor GABA altera a conformação desse receptor, permitindo a abertura do canal de cloro. Em conseqüência, os íons de cloro penetram na célula, onde sua concentração é menor que no meio extracelular. Com a entrada deste elemento, ocorre. uma. hiperpolarização. da. membrana. pós-sináptica,. dificultando. a. despolarização necessária à geração de um impulso nervoso (HARRIS e ALLAN, 1985; SCHOFIELD et al., 1987). SASAKI e colaboradores (2002) relataram que houve efeito ansiolítico quando ratos testados no labirinto em cruz elevado (LCE) foram tratados com muscimol (MUSC), agonista GABAA. Outros estudos, envolvendo tratamento com agonistas GABAA, demonstraram que os ratos com alteração no gene do ácido descarboxilase glutâmico, uma enzima chave da síntese de GABA, exibem um aumento da resposta de ansiedade no paradigma de medo condicionado e no labirinto em “círculo” elevado (KASH et al., 1999; STORK et al., 2003). Os. ratos. que. expressaram. mutações. nos. receptores. GABAA,. subunidades α1, foram insensíveis aos benzodiazepínicos, retendo a resposta normal para o receptor GABA (RUDOLPH et al., 1999); sugerindo que a atividade ansiolítica dos benzodiazepínicos reside em um, ou em diversos receptores benzodiazepínicos sensíveis ao restante dos receptores GABAA (α2, α3, α5). A diferenciação entre os receptores mutantes de GABAA identificou que a subunidade α2 interfere na atividade ansiolítica do diazepam. Contudo o mesmo não acontece.

(17) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 17. com as subunidades de α3 ou α5 (LOW et al., 2000; CRESTANI et al., 1999 e 2002). De acordo com os dados discutidos por McKERNANN e colaboradores (2000), o ligante local L-838417 de benzodiazepínicos exibiu eficácia em α2, α3 e α5, mostrando ser ansiolítico nos ratos selvagens, mas não em receptores α1. Similarmente, os agonistas parciais que agem no local dos benzodiazepínicos com eficácia em α2, α3 e α5 – porém não na subunidade α1 – apresentaram atividade ansiolítica em roedores (COLLINS et al., 2002). Desta forma, sugere-se que o efeito ansiolítico do GABAA é mediado pela subunidade α2 (RUDOLPH et al, 1999), denotando alvo, altamente seletivo, para a atividade ansiolítica dos benzodiazepínicos. Assim, por sua distribuição estratégica no cérebro, os receptores GABAA estão envolvidos nos mecanismos de respostas à ansiedade, e representam a chave para a ação das drogas ansiolíticas (MÖHLER, 2006). Em contrapartida, há estudo em animais com mutações dos receptores GABAA, subunidades α1e α5, mostrando que os mesmos estão envolvidos com efeitos sedativos (RUDOLPH et al., 1999, 2001; McKERNAN et al., 2000) e cognitivos (COLLINSON et al., 2002; CRESTANI et al., 2002). Os receptores GABAB apresentam subunidades diferenciadas, envolvidas em processos neurofisiológicos e comportamentais (JACOBSON et al., 2006). Esses receptores. GABAB. compreendem. um. complexo. heterodimérico. de. duas. subunidades, 1 e 2, ambos são heteroreceptores pré-sinápticos e pós-sinápticos. Modulam respectivamente a excitabilidade neuronal, através da liberação dos neurotransmissores excitatórios, por ação dos canais de cálcio, e a inibição dos potenciais de ação pela atividade dos canais de potássio (BETTLER et al., 2004; COUVE et al., 2000). A ativação destes receptores envolve uma redução da excitabilidade neuronal, aumentando a permeabilidade do potássio e reduzindo a.

(18) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 18. liberação do neurotransmissor, inibindo a passagem do cálcio pela membrana, tendo por resultado um efeito inibitório dos receptores GABAB (KAUPMANN et al.,1998; OTIS et al., 1993; PFRIEGER et al.,1994). A falta das subunidades de GABAB(1) ou GABAB(2), resulta em uma perda completa da função típica dos receptores GABAB e induz um aumento da ansiedade nos ratos em testes exploratórios de ansiedade (MOMBEREAU et al., 2004a e b, 2005). Um novo modulador, GS39783, do receptor GABAB possui atividade ansiolítica para ratos testados no labirinto em “círculo” elevado (CRYAN et al, 2004). O baclofen também demonstrou efeitos ansiolíticos em diversos estudos préclínicos, incluindo a vocalização ultra-sônica em filhotes de ratos (NASTITI et al., 1991), o beber punido (Teste de Vogel) (SHEPHARD et al., 1992), e o labirinto em cruz elevado (ANDREWS e FILE, 1991 e 1992). O ACC é considerado uma estrutura que possui um papel chave em mecanismos centrais de comportamento positivo de reforço e recompensa. Também está envolvido com o comportamento motivacional negativo, que indica o estresse, o medo e o comportamento defensivo em respostas a estímulos nocivos ou ameaçadores (INOUE et al., 1994; BECK e FIBIGER, 1995; GRAY, 1995; SALAMONE et al.,1997; BERRIDGE et al., 1999; LIBERZON et al., 1999). Essa estrutura constitui uma interface neural entre o sistema límbico e o sistema motor (MOGENSON et al., 1980; ANNETT et al., 1989; CADOR, 1989). Apresenta evidências de sua participação no comportamento motor (ALEXANDER e CRUTCHER, 1990; MEYER et al., 1993; BRISTOW e BENNETT, 1988; SUGITA et al., 1989), de recompensa (ZIMMERMANN et al., 1999; PACKARD et al., 1997; BARDO, 1998; ROBBINS e EVERITT, 1996), nos processos motivacionais (OROFINO et al., 1999; ALVAREZ e RUARTE, 1997; MOGENSON et al., 1980;.

(19) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 19. MOGENSON e YANG, 1991), em determinados aspectos de aprendizagem/memória (GAL et al., 1997; HITCHCOTT e PHILLIPS, 1998a e b; SEAMANS e PHILLIPS, 1994), também no controle alimentar (STRATFORD et al., 1998; MALDONADOIRIZARRY et al., 1995; STRATFORD e KELLEY, 1997). Este núcleo pode atuar reforçando a ação das drogas (ROBERTS et al., 1980; HOEBEL et al., 1983; VACCARINO et al.,1985), e a ativação dos receptores de opióides ou de dopamina no ACC resultam em condicionamento de respostas positivas (VAN DER KOOY et al., 1982; CARR e WHITE, 1983; HANLON et al., 2004). O núcleo accumbens é uma estrutura cerebral que pode ser caracterizada por duas sub-regiões distintas: núcleo ou centro (“core”) e região da concha (“shell”). Essas duas sub-regiões apresentam diferenças entre as conexões aferentes e eferentes, na citoarquitetura, nas características histoquímicas e nas respostas funcionais variadas aos estímulos ambientais (DEUTCH e CAMERON, 1992; ZAHM e BROG, 1992; VOORN et al., 1994; KELLEY, 1999). A região do núcleo ou centro conecta-se com núcleos da base, como pálido-ventral, núcleo subtalâmico e substância negra. A região da concha conecta-se com o sistema límbico, hipotálamo lateral, área tegmental ventral, pálido ventromedial e áreas cerebrais autonômicas (HEIMER et al, 1991; ZAHM e BROG, 1992; BROG e SALYAPONGSE, 1993; WRIGHT et al., 1996). As participações das sub-regiões do núcleo e da concha do ACC, no processo do comportamento alimentar, são estudadas profundamente pelo fato de que a estimulação de receptores gabaérgicos na região da concha produz uma intensa hiperfagia. Ressalta-se que isto não ocorre quando a estimulação acontece no núcleo do ACC (STRATFORD e KELLEY, 1997; BASSO e KELLY, 1999). As funções da região da concha do ACC estão envolvidas no circuito cortical e.

(20) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 20. hipotalâmico com o controle de ingestão alimentar, enquanto que a região do núcleo do ACC tem seus circuitos envolvidos com aprendizagem e execução de ações. Ambas as regiões do ACC, núcleo e concha, estão conectadas com os circuitos centrais de controle da percepção gustativa, ingestão de alimento, controle autonômico visceral e somatossensorial (KELLEY, 2004). O striatum ventral caracteriza-se como a área que abriga o ACC e as porções mediais/ventrais do putâmem, além da cabeça do núcleo caudado, sendo o ACC topograficamente superposto à porção do striatum em que o putâmem e a cabeça do caudado encontram-se unidas sob o braço anterior da cápsula interna, conforme HEIMER e colaboradores (2003). É interessante ressaltar que, enquanto o striatum recebe projeções de toda a extensão cortical, o globo pálido se projeta predominantemente para as áreas corticais anteriores (MESULAM, 1987; HEIMER e VAN HOESEN, 2006). Pode, no entanto, também influenciar outros processos perceptivos através da sua interação com áreas corticais mais posteriores. Outros autores conceituam o striatum ventral e o pálido ventral como regiões dos núcleos da base que abrigam o sistema córtico-estriatal-palidal ventral, distinto do clássico sistema córtico-estriatal-palidal dorsal, correlacionando-os com atividades motoras e implicações neuropsiquiátricas (MELLO e VILARES, 1997). O ACC pode ser considerado como uma interface receptora das projeções de células dopaminérgicas situadas na área tegmental ventral (VTA) (FRITSCHY e MOHLER, 1995), que atua como um local de convergência para estímulos procedentes da amígdala, hipocampo, área cingulada anterior e parte do lobo temporal. Deste núcleo, partem eferências para o hipotálamo, área cingulada anterior e lobos frontais. Devido às suas conexões aferentes e eferentes o ACC.

(21) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 21. desempenha importante papel na regulação da emoção, motivação e cognição (KELLEY, 2004). As contribuições de neurônios dopaminérgicos na VTA modulam a atividade de neurônios dentro do ACC. Estes terminais também estão no local de ação das drogas viciadoras, como cocaína e anfetamina, que causam um aumento nos níveis de dopamina no ACC, sendo que quase todas as drogas utilizadas por humanos aumentam os níveis de dopamina no ACC (HARVEY et al., 2002). Há estudos com dopamina e opióides no ACC que estão associados a comportamento alimentar em que a prioridade de incentivo motivacional é o alimento (HEFFNER et al., 1980; HERNANDEZ e HOEBEL, 1988; BLACKBURN et al., 1989; BAKSHI e KELLEY, 1993; SALAMONE et al., 1994; WILSON et al., 1995). A região da concha do ACC tem um papel específico no controle do estado motivacional básico para a sobrevivência, caracterizando uma indicação que o ACC influencia o comportamento de. apetite. e. de. recompensa. (STRATFORD. e. KELLEY,. 1997).. Os. neurotransmissores do ACC estão envolvidos com os processos naturais de recompensa, controle motivacional e ingestão de alimento, além de estarem integrados com a região do hipotálamo (KELLEY et al., 2005). Os circuitos do ACC estão organizados em duas maneiras distintas para alcançar o controle basal clássico do sistema motor: por conexões às estruturas do núcleo pálido que processam informações para o córtex motor (voluntário), e por projeções diretas aos circuitos hipotalâmicos que se comunica com os centros de controle motor e autonômico (KELLEY et al., 2005). Uma inibição funcional dos neurônios do ACC pelos antagonistas glutamatérgicos induz efeito ansiolítico em ratos (MARTINEZ et al., 2002), ou a estimulação pelos receptores GABAA e GABAB (STRATFORD e KELLEY, 1997) seriam suficientes para produzir hiperfagia intensa.

(22) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 22. em animais ad-libitum. Este efeito hiperfágico é semelhante ao encontrado no estudo de BERRIDGE e VALENSTEIN (1991), que utilizaram estimulação elétrica no hipotálamo lateral (HL) ou na experiência usando microinjeções locais dos agonistas do receptor do glutamato (GLU) no HL (DUVA et al., 2001). Recentemente, STRATFORD (2005) utilizou marcadores de proteína FOS para traçar a ativação neuronal após a microinjeção unilateral de MUSC na concha do ACC. Ficou comprovado que houve um aumento significativo na síntese de FOS no mesmo lado da microinjeção, mas não contra-lateral, no HL. Os dados sugerem que os neurônios do HL participam deste circuito neural junto com a região da concha do ACC, o que pode caracterizar como um componente importante do sistema neural envolvido com o controle do comportamento alimentar. Os processos naturais de recompensa, controle motivacional e ingestão de alimento estão diretamente relacionados com os neurotransmissores do ACC (KELLEY et al., 2005) que pode estar integrado com a região do hipotálamo. As pesquisas de STRATFORD e KELLEY (1997), sugerem que o comportamento ingestivo é regulado, em parte, por uma população de neurônios situados na concha do ACC, e a inibição destes neurônios é o evento celular que conduz à resposta de alimentação. Os estudos mostraram que a microinjeção bilateral de agonistas GABAA e GABAB, na concha do ACC, aumentam a ingestão de alimento em ratos saciados. As regiões do cérebro, associadas ao controle do comportamento ingestivo são: pálido ventral, amígdala centro medial, hipotálamo lateral, área tegmental ventral, e núcleo mediano do rafe (HEIMER et al., 1991). KELLEY e colaboradores (2005) postularam a possibilidade de que é a região da concha do ACC que age como uma “sentinela sensorial”. Tem a função do controle motor ou autonômico que podem mediar os comportamentos de ingestão de.

(23) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 23. alimento. Quando a ingestão é muito intensa, ou ocorre uma ameaça repentina do ambiente, o animal aprende a habilidade de parar de ingerir alimentos. Este mecanismo explicaria o porquê a hiperfagia induzida por agonista GABA, ou por antagonista de glutamato (GLU) na concha do ACC é um tanto insensível às propriedades sensoriais do alimento e estas manipulações não realçam respostas instrumentais relacionadas à obtenção de alimento.. 1.2. ANSIEDADE E O LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO (LCE). A ansiedade é acompanhada por alterações comportamentais como esquiva, vigilância, apreensão, nervosismo, pânico e agitação levando à proteção, em situações de perigo (GROSS e HERR, 2004). Os benzodiazepínicos potencializam a ação do GABA, intensificando suas ações em nível pós-sináptico, aumentando a afinidade dos receptores GABAA pelo neurotransmissor e, como conseqüência, a redução da ansiedade, conforme relatado por GRAEFF e BRANDÃO (1999). A ansiedade pode ser vista como uma resposta apropriada, adaptável ao perigo para preparar o organismo a lidar com a situação, ou evitar uma ameaça ambiental em potencial. Disfunções de ansiedade manifestam-se em patologias que podem ser crônicas ou incapacitantes, como distúrbio obsessivo-compulsivo, distúrbio do pânico e outras fobias (CRYAN e KAUPMANN, 2005)..

(24) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 24. Foram estudados alguns testes de ansiedade, realizados em animais. Ressaltamos como exemplos os testes: anti-conflito; etológicos sem punição como teste claro/escuro; interação social; labirinto em cruz elevado (LCE), entre outros. Os testes procuram justificar vários tipos de ansiedade, conforme Manual de Diagnóstico e Estatístico de Doença Mental - IV edição (DSM-IV) (IMAIZUMI e ONODERA, 2000). O comportamento animal é conduzido por um conflito entre a tendência para explorar o novo ambiente e para evitar perigos potenciais. Este conflito tem sido considerado análogo à ansiedade em humanos (GRAY, 1982). O LCE é provavelmente o modelo animal de ansiedade mais conhecido e descrito em detalhes por vários pesquisadores. Na aplicação desta ferramenta, verifica-se que os roedores podem apresentar uma tendência para explorar as áreas menos iluminadas do labirinto, representadas pelos braços fechados (PEREIRA et al., 2005); como também a tendência em evitar locais altos e abertos. Todavia quando tratados com ansiolíticos os animais permanecem mais tempo no braço aberto e exploram mais o labirinto (PELLOW et al., 1985). O modelo tem mostrado sua utilidade, especialmente para a detecção de fármacos ansiolíticos com ação gabaérgica, como os benzodiazepínicos (RODGERS et al., 1997). Para verificar o efeito ansiolítico induzido pelo sistema gabaérgico (DALVI e RODGERS, 1996) a literatura tem indicado, como procedimento tradicional, o modelo animal de ansiedade, LCE.. Apesar de freqüentemente ser usado como. ferramenta para selecionar efeitos ansiolíticos de drogas (HANDLEY e MITHANI, 1984; PELLOW et al., 1985; LISTER, 1990; HANDLEY e McBLANE, 1993), tem sido útil às bases biológicas emocionais relacionadas à aprendizagem, à memória, à dor e a vários tipos de disfunções de ansiedade; tais como fobias e estresse pós-.

(25) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 25. traumático (ADAMEC et al., 1998; FILE et al., 1998; LAMPREA et al., 2000; CAROBREZ et al., 2001; RASMUSSEN et al., 2001; BANNERMAN et al., 2004). Este efeito compreende as proporções de entradas que os animais fazem nos braços abertos ou a proporção do tempo gasto nas partes aversivas, braços abertos, visto que o total de entradas nos braços abertos e fechados indica atividade locomotora (RODGERS e JOHNSON, 1995). O animal, no LCE, está livre para explorar um ambiente constituído por quatro braços elevados, com dois braços abertos opostos (espaços não protegidos) e dois outros braços fechados opostos (espaços protegidos por paredes laterais), formando uma cruz (GRAEFF e GUIMARÃES, 2000). MONTGOMERY (1955) ao correlacionar o comportamento exploratório e o medo em roedores, utilizou, como ferramenta, o labirinto em Y elevado composto por três compartimentos (um fechado e dois abertos). Verificou que os ratos apresentavam um nível de exploração pelos braços fechados maior que nos braços abertos, preferindo consistentemente o braço fechado. Isto foi interpretado como indicativo de que o braço aberto causa um nível maior de medo que o braço fechado (GRAEFF e GUIMARÃES, 2000). Em 1987, LISTER validou, em camundongos, este mesmo modelo (LCE). Concluiu que o modelo serve para testes investigativos de agentes ansiolíticos e ansiogênicos. Os estudos observam que o LCE é válido para outras espécies como: cobaias (REX et al., 1994), ratos selvagens (HENDRIE et al., 1994) e hamsters (YANNIELLI et al., 1996). Em. contrapartida,. os. animais. tratados. com. drogas. ansiolíticas. aumentaram o tempo nos braços abertos, enquanto que os tratados com ansiogênicas ficaram mais tempo nos braços fechados (GRIEBEL et al., 2000;.

(26) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 26. ROSA et al., 2000; HOLMES e RODGERS, 1999; HANDLEY e MITHANI, 1984). O LCE foi descrito por PELLOW e colaboradores (1985), com o tempo determinado de observação por cinco minutos. Os índices de ansiedade testados no LCE dividem-se em: medidas espaço-temporal (porcentagens de entradas e a permanência nos braços abertos) e comportamentos etológicos (avaliação de risco e imersão de cabeça) (RODGERS et al., 1997). O aspecto comportamental significativo para indicar o efeito ansiolítico é a diminuição da freqüência do comportamento de avaliação de risco (GRIEBEL et al., 1997; RODGERS et al., 1997; CAROBREZ e BERTOGLIO, 2005). O comportamento é indicador de redução de ansiedade de acordo com BLANCHARD e colaboradores (1991 e 1993). Os resultados encontrados nos estudos (TAKEDA et al., 1998; SHEPHERD et al, 1994; SETEM et al., 1999) sugerem que o aumento na freqüência do comportamento de imersão de cabeça também pode refletir em estado ansiolítico.. 1.3. JUSTIFICATIVA. Os neurônios gabaérgicos da região da concha do ACC são responsáveis no controle do comportamento alimentar e de recompensa. Microinjeções de agonistas GABAA ou GABAB na região da concha do ACC (STRATFORD e KELLEY, 1997; BASSO e KELLEY, 1999; STRATFORD, 2005; KELLEY et al., 2005) induziram à ingestão. Além do envolvimento com o comportamento de ingestão alimentar, a região da concha ACC relaciona-se também com estados motivacionais.

(27) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 27. como: estresse, medo e respostas defensivas aos estímulos nocivos (BECK e FIBIGER, 1995; BERRIGDE et al., 1999; GRAY, 1995; INOUE et al., 1994; LIBERZON et al., 1999; SALAMONE et al., 1997). O comportamento de ansiedade pode acontecer paralelo à ativação do fator da transcrição, CREB, no ACC (BARROT et al., 2002; CARLEZON, 2005). A projeção dopaminérgica da área tegmental ventral (VTA) para o ACC também pode estar relacionada a diferentes aspectos de medo condicionado (PEZZE e FELDON, 2004). Além disso, (SASAKI et al., 2002; CRYAN e KAUPMANN, 2005) indicam que a concha do ACC pode exercer influências no comportamento de roedores relacionados ao controle da ansiedade. O LCE aponta efeitos ansiolíticos ou ansiogênicos das drogas que agem no complexo de GABAA-benzodiazepínicos de maneira consistente (BOURIN et al., 1992; CLENET et al., 2004; DALVI e RODGERS, 1996; HOGG, 1996). A estimulação cerebral de pacientes com disfunção severa de ansiedade e distúrbio obsessivo-compulsivo mostrou diminuição significativa na severidade dos sintomas, quando o alvo foi à região da concha do ACC (STURM et al., 2003). A estimulação química desta região do ACC com antagonistas glutamatérgicos induziu o efeito ansiolítico em ratos (MARTINEZ et al., 2002). A fim caracterizar melhor a relação entre a resposta de ingestão de alimento e comportamento de ansiedade, o presente estudo avaliou os efeitos das microinjeções de agonistas GABAA (MUSC) e GABAB (BACL), na concha do ACC, na ingestão de alimento e no nível de ansiedade dos ratos fêmeas com alimentação disponível e, testados no labirinto em cruz elevado (HANDLEY e MITHANI, 1984), um modelo animal de ansiedade (HOGG, 1996). Foram usadas fêmeas por estar comprovado cientificamente que as disfunções alimentares e de ansiedade ocorrem.

(28) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 28. predominantemente em mulheres (PALANZA, 2001). A decisão de utilizar microinjeções dos agonistas GABA na região da concha do ACC deu-se em razão desta região exibir influências significativas na ingestão de alimento, em ratos (STRATFORD e KELLEY, 1997; KELLEY et al., 2005).. 1.4. OBJETIVO GERAL. Verificar a participação de receptores GABAA e GABAB através da aplicação de microinjeções de muscimol e baclofen na região da concha do ACC, em ratos Wistar fêmeas, e estabelecer uma possível relação entre o comportamento de ansiedade – efeitos ansiolíticos/ansiogênicos – investigados no labirinto em cruz elevado, e a resposta do comportamento de ingestão de alimento.. 1.5. OBJETIVO ESPECÍFICO. Avaliar o efeito da administração local bilateral de muscimol (MUSC 128 e 256 pmol/lado) agonista GABAA e baclofen (BACL 128 e 256 pmol/lado) agonista GABAB na região da concha do ACC, sobre o comportamento de ansiedade e o comportamento de ingestão de alimento em ratos Wistar fêmeas..

(29) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 2. 29. MATERIAIS E MÉTODOS. 2.1. ANIMAIS. Foram os utilizados ratos Wistar (Rattus norvegicus) fêmeas (n = 112). A média do peso corporal variou entre 210-300 g; todos provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). As fêmeas foram submetidas a sete dias de adaptação, alojados em uma sala com temperatura controlada entre 21± 2ºC, num ciclo de claro-escuro de doze horas (luz das sete as dezenove). Foram distribuídos em grupos (n = 5) e mantidos em caixas polipropileno (49x34x16cm), forradas com maravalha, tratados com água e alimento granulado (CR-1 Nuvilab) ad libitum. Durante a pesquisa, os ratos eram manipulados somente para limpeza das caixas, a cada dois dias. Os experimentos realizados, nesse estudo, estão de acordo com os princípios éticos de experimentação animal, postulados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal. Os protocolos de experimentação, foram aprovados pelo Comitê de Ética ao Uso de Animais (PP0034 / CEUA 23080009946 / 200698) da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)..

(30) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 2.2. 30. PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS. Para a implantação da cânula-guia, os animais receberam anestésico com mistura de xilazina/quetamina (5 mg/kg; 140 mg/kg) injetada por via intraperitoneal. Na seqüência, houve a adaptação ao aparelho estereotáxico: a cabeça foi fixada por intermédio de barras posicionadas no conduto auditivo e na presilha dental. Após a assepsia com álcool iodado, realizou-se incisão longitudinal no escalpo, expondo a calota craniana. A porção exposta foi raspada e seca para garantir a adesão do acrílico. A seguir, duas cânulas-guia confeccionadas a partir de um segmento de agulha hipodérmica, com 0,7 mm de diâmetro externo e 15 mm de comprimento, foram posicionadas bilateralmente, 2 mm acima da região do ACC, atendendo as coordenadas descritas por PAXINOS e WATSON (1998): AP - 1,4 do bregma, anterior a linha interneural; L – 0,08 para cada lado da sutura sagital; DV – 0,55 abaixo da dura mater. As cânulas foram fixadas à calota craniana por meio de parafusos, envolvidas por acrílico auto-polimerizável. Ao final do procedimento cirúrgico, os animais retornaram ao biotério do laboratório. Mantidos individualmente em caixas de polipropileno com temperatura controlada, foram habituados ao manejo, durante sete dias. Após esse período, iniciaram-se os procedimentos de ambientação na caixa de registro do comportamento alimentar, por aproximadamente trinta minutos ao dia, durante dois dias consecutivos..

(31) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 2.3. 31. SOLUÇÃO E DOSES ADMINISTRADAS. As drogas e doses utilizadas foram administradas em conformidade com o protocolo experimental pertinente: •. VEH - Solução de NaCl 0,9% estéril, livre de pirogênios, pH 7,4; volume de 200 nl.. •. MUSC - agonista dos receptores GABAA, nas doses 128 e 256 pmol.. •. BACL - agonista dos receptores GABAB, nas doses 128 e 256 pmol.. 2.4. INJEÇÕES INTRACEREBRAIS. Para a manipulação da injeção intracerebral das drogas, ou do veículo, utilizou-se agulha injetora (0,3 mm de diâmetro), que foi introduzida na cânula-guia e conectada por tubo de polietileno, à micro-seringa Hamilton (capacidade de 1ul). A agulha injetora excedeu o tamanho da cânula-guia em 2 mm. Com o objetivo de minimizar variações na pressão intracerebral, as soluções foram administradas bilateralmente no período de um minuto. Manteve-se o volume injetado de 200nl, para qualquer uma das condições de tratamento..

(32) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 2.5. 32. REGISTRO COMPORTAMENTAL NO LCE. O labirinto em cruz elevado (LCE) constitui-se de duas passarelas de madeira, dispostas perpendicularmente, formando uma cruz simétrica (quatro braços de cinqüenta centímetros de comprimento por dez de largura). Os braços opostos são fechados por paredes laterais de vidro fumê de quarenta centímetros de altura, enquanto os outros dois ficam abertos, circundados por uma pequena borda de vidro (um centímetro), para reduzir a ocorrência de quedas. Na junção entre os quatros braços delimita-se uma área central de dez centímetros quadrados. O labirinto, como um todo, encontra-se elevado a cinqüenta centímetros do solo. Como fonte de iluminação do experimento, se utilizou quatro lâmpadas fluorescentes (15W cada), dispostas em forma de cruz, cem centímetros acima do labirinto. O nível médio da iluminação nos braços abertos e os braços fechados eram 373 e 284 lux respectivamente, com um gradiente de 89 lux da iluminação entre o braço aberto e fechado. Os comportamentos investigados (HALFORD et al.,1998) abaixo listados, foram gravados em VHS, sendo as variáveis posteriormente transcritas com o auxílio do Programa Etholog 2.25 (OTTONI, 2000), observando a freqüência dos comportamentos (auto-limpeza, exploração vertical, avaliação de risco e imersão de cabeça) o número de entradas nos braços abertos e fechados e o tempo de permanência no centro e em ambos os braços..

(33) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 33. Tabela 1: Comportamentos investigados no LCE Auto-Limpeza Exploração Vertical. limpeza, como: limpar a cabeça, as unhas, ou coçar o corpo. Quando o animal estiver explorando o ambiente apoiado somente nas patas traseiras, estando as patas dianteiras livres e não apoiadas na base do LCE (ereto).. Avaliação de Risco. Movimento no qual o animal investiga em sua volta com as patas traseiras fixas, na base do LCE, e as dianteiras se movem e retornam a posição com a cabeça observando ao redor.. Imersão da Cabeça. 2.6. Quando o animal apresenta comportamento típico de auto-. Movimento de cabeça, para fora e para baixo nos braços abertos e no centro do LCE.. REGISTRO. DOS. COMPORTAMENTOS. INGESTIVOS. E. NÃO. INGESTIVOS. Para o registro do comportamento alimentar, se utilizou uma caixa confeccionada em vidro transparente de quatro milímetro de espessura, possuindo as medidas de comprimento e de largura similares aos da caixa de hospedagem (49 x 34 cm). A medida de altura é (quarenta centímetros) para evitar fugas. O chão da caixa e três paredes laterais foram cobertas com plástico adesivo preto. Uma parede lateral permaneceu com vidro transparente, onde se colocou um espelho com angulação para impedir que o animal visualizasse sua imagem refletida durante o experimento; contudo sem alterar a visualização lateral do seu comportamento e o registro em VHS. A análise dos registros ocorreu posteriormente com o auxílio do programa Etholog 2.25. Levaram-se em consideração os seguintes aspectos:.

(34) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 34. quantidade de alimento ou água – refere-se à diferença entre a quantidade (em gramas) de ração ou água (ml), apresentada no início do registro e a existente ao final do registro (sessenta minutos), incluindo os resíduos que ficaram fora do comedouro; a latência – tempo em segundos para realizar, pela primeira vez, as respostas comportamentais – e a duração (em segundos) de execução dos comportamentos apresentados abaixo, com base na tabela de HALFORD e colaboradores (1998).. Tabela 2: Comportamentos ingestivos e não ingestivos investigados na caixa de registro do comportamento alimentar. Ingestão de. Quando o animal aproxima-se do comedouro e manipula a. Alimento (comer) ração, roendo e ingerindo-a. Ingestão de Água (beber) Exploração do Alimento Exploração não Locomotora. Exploração vertical. Manutenção (auto-limpeza). Locomoção. Quando o animal se aproxima do bebedouro e lambe sua ponta. Quando o animal cheira ou manipula a ração, sem ingeri-la. Quando o animal estiver ativamente explorando o ambiente com a cabeça, seja cheirando o ar ou o chão, sem tirar as quatro patas do local onde se encontra. Quando o animal estiver explorando o ambiente apoiado somente nas patas traseiras, estando as patas dianteiras livres e não apoiadas no fundo da caixa (ereto). Quando o animal apresentar comportamentos típicos de auto-limpeza, como: limpa a cabeça, as unhas, ou coçar o corpo. Quando o animal estiver deambulando pela caixa, sem apresentar qualquer outro dos comportamentos já citados..

(35) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. Imobilidade. Avaliação de Risco. 2.7. 35. Quando o animal permanecer imóvel (tempo > 5 segundos), sem apresentar qualquer outro comportamento já citado. Movimento no qual o animal investiga em sua volta com as patas traseiras fixas ao chão e as patas dianteiras se movem e retornam a posição, com cabeça observando ao redor.. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS. Os procedimentos experimentais foram realizados das onze e trinta minutos às dezesseis horas. Sete dias após a cirurgia, na caixa de registro do comportamento alimentar, as fêmeas estiveram sujeitas à ambientação por aproximadamente trinta minutos ao dia, durante dois dias consecutivos. Como procedimento inicial, se aplicou microinjeção bilateral de VEH, MUSC (128 e 256 pmol) ou BACL (128 e 256 pmol) no ACC. Em seguida, durante cinco minutos, no LCE, o animal foi colocado no centro do labirinto com a cabeça voltada para um dos lados dos braços fechados, permitindo a exploração. Após cada exposição do animal, o LCE era limpo com tecido umedecido em solução de álcool vinte por cento (20%), para evitar pistas odoríferas. O resultado dos registros referente ao comportamento (tabela 1) sofreu análise posteriormente. Após a exposição ao LCE, os animais foram colocados na caixa de registro do comportamento alimentar (tabela 2) por uma hora. Salientamos que era usado um animal para cada tratamento..

(36) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 2.8. 36. HISTOLOGIA. Ao final dos experimentos, os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (50mg/kg, i.p.) e perfundidos transcardialmente com salina 0,9%, seguido de formol 10%. O posicionamento das cânulas-guia foi verificado por meio da microinjeção de 200 nl de azul de Evans. Depois de dissecados, os cérebros permaneceram imersos em formol 10% por um período de sete dias. Após este período, sofreram cortes em fatias de 100 µm de espessura, através de vibrótomo.. As. fatias,. após. serem. montadas. em. lâminas. gelatinizadas,. permaneceram secando cerca de uma semana. Na seqüência, receberam um corante através do método de Nissl. Retornaram ao processo de secagem por igual período de tempo, antes de serem analisadas ao Microscópio Óptico (MO). A reprodução gráfica dos cortes e dos pontos da microinjeção, analisados ao MO, ocorreu a partir do atlas do cérebro de rato PAXINOS e WATSON (1998).. 2.9. ANÁLISE DE DADOS. Os dados foram analisados por intermédio de análise de variância (ANOVA) de uma via. A variável independente foi o tratamento (VEH, MUSC ou BACL nas doses 128 e 256 pmol). As variáveis dependentes foram os comportamentos (auto-limpeza, exploração vertical, avaliação de risco e imersão de cabeça), mais o número de entradas nos braços aberto e fechado, e a porcentagem.

(37) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 37. de tempo nesses braços e no centro. Os comportamentos ingestivos (quantidade, latência e duração): ingestão de alimento e ingestão de água, e comportamentos não ingestivos (latência e duração): exploração de alimento, exploração não locomotora, exploração vertical, auto-limpeza, locomoção, imobilidade e avaliação de risco. As diferenças entre as médias foram avaliadas pelo teste de Tukey para N desiguais; valores de p < 0,05, considerados significantes..

(38) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 38. 3. RESULTADOS. 3.1. LOCAIS ATINGIDOS PELA MICROINJEÇÃO DE VEH, MUSC (AGONISTA GABAA) E BACL (AGONISTA GABAB) NA REGIÃO DO ACC.. A análise histológica mostrou que do total de cento e doze ratos, sessenta e cinco tiveram a cânula-guia implantada na região da concha do ACC (Figura 1). A região ventromedial do ACC, que coincide com a região da concha, apresentou hiperfagia e alterações comportamentais que sinalizaram redução na ansiedade em ratos, após tratamentos com os agonistas gabaérgicos. Não foram incluídos na análise estatística as fêmeas cuja histologia revelou outros sítios de microinjeção, como região límbica e septo hipocampal, ou quando não houve acerto bilateral na região da concha do ACC. Abaixo relacionamos os animais divididos em grupos, e a quantidade de drogas administradas: •. vinte e dois (22) animais receberam microinjeção de VEH;. •. doze (12) animais receberam microinjeção de 128 pmol de MUSC;. •. dez (10) animais receberam microinjeção de 256 pmol de MUSC;. •. dez (10) animais receberam microinjeção de 128 pmol de BACL;. •. onze (11) animais receberam microinjeção de 256 pmol de BACL..

(39) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 39. Figura 1: Desenhos semi-esquemáticos representando cortes coronais (100 µm) do cérebro dos ratos (ATLAS PAXINOS E WATSON, 1998), que ilustram os locais onde as microinjeções bilaterais de VEH (rosa), MUSC 128 pmol (verde), MUSC 256 pmol (azul), BACL 128 pmol (vermelho) e BACL 256 pmol (amarelo) produziram efeito ansiolítico e alteração da ingestão de alimentos na região da concha do ACC..

(40) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. LISTA DE ABREVIATURAS DO DESENHO SEMI-ESQUEMÁTICO. AcbC: região do núcleo do ACC AcbSh:. região do concha do ACC. LAcbSh: região do lateral do ACC VP: pálido ventral ICj: Ilhas de Calleja mfba: forebrain medial aca: parte anterior da comissura anterior VDB: parte diagonal da região límbica SHi: núcleo septo hipocampal LSI: parte intermediária do núcleo septal lateral LSV: parte ventral do núcleo septal lateral LSD: parte dorsal do núcleo septal lateral LV: ventrículo lateral gcc: “joelho” do corpo caloso fmi: fórceps menor do corpo caloso cg: cíngulo LSS: parte lateral do estriado MS: núcleo septal medial Cpu: caudado/putamen Tu: tubérculo olfatório E: ependima. 40.

(41) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 41. 3.2. MICROINJEÇÃO DE MUSC (AGONISTA GABAA) E BACL (AGONISTA GABAB) NA REGIÃO DA CONCHA DO ACC E SEUS EFEITOS SOBRE O NÍVEL DE ANSIEDADE.. A ANOVA de uma via mostrou alterações significantes na freqüência dos comportamentos de avaliação de risco (AR) [F (4,60) = 9,35; p =0,000006] e de imersão de cabeça (IC) [F (4,60)=4,71; p =0,0022], após microinjeção de VEH, MUSC ou BACL na região da concha do ACC em ratos. A microinjeção bilateral de MUSC, na menor dosagem (128 pmol), diminuiu a freqüência do comportamento de AR (Figura 2A), no entanto, não se verificou modificação, nesse comportamento, em ratos tratados com maior dosagem (256 pmol). As doses de BACL administradas (128 e 256 pmol) induziram a uma acentuada diminuição na freqüência do comportamento de AR (Figura 2A). A microinjeção bilateral de BACL, no ACC (dosagem de 128 pmol), provocou aumento na freqüência do comportamento de IC em relação ao VEH. A dose de BACL (256 pmol), as doses de MUSC (128 e 256 pmol) induziram um leve aumento do comportamento, todavia não foi estatisticamente diferente do VEH (Figura 2B). A análise de variância mostrou que não houve diferença significante entre os tratamentos para porcentagem de tempo nos braços abertos [F (4,60) = 2,21; p = 0,07] e para a porcentagem de entradas nos braços abertos [F (4,60) = 2,17; p = 0,08] (Figuras 3C e 3D). Em relação aos outros comportamentos: freqüência da exploração vertical (EV) e a freqüência da auto-limpeza (AL), além do número de entradas no braço aberto (EA), número de entradas no braço fechado (EF), número total de entradas.

(42) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 42. (ET), e a porcentagem de permanência de centro (%TC) não apresentaram alterações relevantes (Tabela 3)..

(43) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 43. AVALIAÇÃO DE RISCO 6. Frequência / 5 min. 5 4 3 2. *. 1 0. VEH. MUSC 128. MUSC 256. *. *. BACL 128. BACL 256. A. IMERSÃO DE CABEÇA. Frequência / 5 min. 30. 20. * 10. 0. VEH. MUSC 128. MUSC 256. BACL 128. BACL 256. B. Figura 2: Alterações na freqüência do comportamento de avaliação de risco (A) e na freqüência do comportamento de imersão de cabeça (B), observados durante 5 minutos de exposição ao LCE em ratos tratados bilateralmente com veículo (VEH) (n = 22); muscimol (MUSC) agonista GABAA 128 pmol (n = 12) e 256 pmol (n = 10); baclofen (BACL) agonista GABAB 128 pmol (n = 10) e 256 pmol (n = 11) na região da concha do ACC. (*) p < 0,05 em relação ao VEH..

(44) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 44. TEMPO NOS BRAÇOS ABERTOS. % Tempo nos braços abertos. 50. 40. 30. 20. 10. 0. VEH. MUSC 128. MUSC 256. BACL 128. BACL 256. C. BACL 256. D. ENTRADA NOS BRAÇOS ABERTOS 60. % Entradas nos braços abertos. 50. 40 30 20. 10 0. VEH. MUSC 128. MUSC 256. BACL 128. Figura 3: Alterações na porcentagem (%) de tempo nos braços abertos (C), na % de entradas nos braços abertos (D) observados durante 5 minutos de exposição ao LCE em ratos tratados bilateralmente com veículo (VEH) (n = 22); muscimol (MUSC) agonista GABAA 128 pmol (n = 12) e 256 pmol (n = 10); baclofen (BACL) agonista GABAB 128 pmol (n = 10) e 256 pmol (n = 11) na região da concha do ACC..

(45) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 45. Tabela 3: Número de entradas nos braços abertos (EA), número de entradas nos braços fechados (EF), número total de entradas (ET), porcentagem de permanência no centro (%TC), freqüência da exploração vertical (EV) e freqüência da auto-limpeza (AL) avaliados em ratos mantidos durante cinco minutos no LCE, e tratados bilateralmente com veículo (VEH); muscimol (MUSC) 128 e 256 pmol; baclofen (BACL) 128 e 256 pmol, na região da concha do ACC.. EA. EF. ET. %TC. EV. AL. 3.4 ± 0.7. 5.6 ± 0.8. 9.1 ± 1.5. 11.8 ± 2.3. 7.1 ± 1.3. 2.7 ± 0.7. 5.8 ± 1. 8.9 ± 1.2. 14.7 ± 2. 14.8 ± 1.8. 9.4 ± 2. 2.5 ± 0.5. 3.3 ± 1. 4.8 ± 0.8. 8.1 ± 1.6. 9.4 ± 1.9. 6.8 ± 2.1. 2.1 ± 0.7. 7.3 ± 1.1. 9.4 ± 1.1. 16.7 ± 2.1. 20.5 ± 1.9. 12.3 ± 2.2. 1.7 ± 0.5. 5.3 ± 1. 5.3 ± 0.7. 10.7 ± 1.6. 15.6 ± 2.7. 7.9 ± 1.3. 2.1 ± 0.6. VEH (n = 22) MUSC 128 (n = 12) MUSC 256 (n = 10) BACL 128 (n = 10) BACL 256 (n = 11).

(46) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 3.3.. 46. MICROINJEÇÃO DE MUSC (AGONISTA GABAA) E BACL (AGONISTA GABAB) NA REGIÃO DA CONCHA DO ACC E SEUS EFEITOS SOBRE OS COMPORTAMENTOS INGESTIVOS E NÃO INGESTIVOS.. 3.3.1. Ingestão de alimento. A ANOVA de uma via mostrou que houve alterações significantes na quantidade de alimento ingerido após a microinjeção de VEH, MUSC ou BACL em doses equimolares (128 e 256 pmol) na região da concha do ACC [F (4,60) = 19,53; p = 10−6 ]. Da mesma forma, apontou diferenças significantes entre os tratamentos na latência para iniciar e na duração da resposta da ingestão de alimento [F (4,60) = 15,62; p = 10−6 ], [F (4,60) = 17,71; p = 10−6 ] respectivamente. A Figura 4 evidencia que os animais tratados com MUSC e BACL na região da concha do ACC, apresentaram aumento na quantidade de alimento ingerido. O consumo médio de alimento nos animais tratados com MUSC 128 pmol (2,3 ± 0,6 g), MUSC 256 pmol (2,7 ± 0,4 g), com BACL 128 pmol (2,6 ± 0,5 g) e BACL 256 pmol (5,0 ± 0,4 g) ficaram acima do valor médio observado no VEH (0,1± 0,1 g). O tratamento com MUSC (128 e 256 pmol), em relação ao VEH, aumentou aproximadamente trinta vezes a ingestão de alimento, independente da dose. Provocou uma diminuição similar na latência para iniciar a resposta de.

(47) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 47. ingestão de alimento, independente da dose. As doses não alteraram a duração da resposta de ingestão de alimento (Figura 4). As dosagens de BACL (128 e 256 pmol) provocaram hiperfagia. A dose menor aumentou aproximadamente trinta vezes e a maior em cinqüenta vezes a resposta de ingestão de alimento, estabelecendo uma relação dose/efeito. A latência para iniciar a resposta hiperfágica diminuiu após o tratamento com as doses de BACL (128 e 256 pmol). Embora tenha ocorrido uma redução na latência, ela não foi diferente estatisticamente entre as doses. A duração da resposta de ingestão de alimento foi maior após a injeção de BACL (128 e 256 pmol) no ACC. No entanto, a duração induzida pela dose de 256 pmol foi mais intensa que aquela observada com o tratamento de 128 pmol (Figura 4)..

(48) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 48. INGESTÃO DE ALIMENTO 7 6. *#. GRAMAS. 5 4. *. 3. *. *. MUSC 256. BACL 128. 2 1 0. VEH. MUSC 128. BACL 256. LATÊNCIA DA INGESTÃO DE ALIMENTO. SEGUNDOS. 3000. 2000. *. *. *. 1000. *. 0. VEH. MUSC 128. MUSC 256. BACL 128. BACL 256. DURAÇÃO DA INGESTÃO DE ALIMENTO 1000. *#. SEGUNDOS. 800. 600. *. 400. 200. 0. VEH. MUSC 128. MUSC 256. BACL 128. BACL 256. Figura 4: Quantidade de alimento ingerido, a latência para iniciar a resposta de ingestão de alimentos e a duração da resposta ingestão de alimentos após microinjeção bilateral de veículo (VEH) (n = 22); muscimol (MUSC) 128 pmol (n = 12) e MUSC 256 pmol (n = 10); baclofen (BACL) 128 pmol (n = 10) e BACL 256 pmol (n = 11) na região da concha do ACC em ratos saciados. A avaliação comportamental foi realizada durante 1 hora. Os dados representam à média ± erro padrão. (*) p < 0,05 em relação ao VEH. (#) p < 0,05 em relação ao BACL 128 pmol..

(49) GABA NO ACC INDUZ EFEITO ANSIOLÍTICO E HIPERFAGIA FRAGA LOPES, A.P.. 49. 3.3.2. Ingestão de água. A ANOVA de uma via mostrou que não houve alterações significantes na quantidade de água consumida após a microinjeção de VEH, MUSC ou BACL em doses equimolares (128 e 256 pmol) na região da concha do ACC [F (4,60) = 0,93; p = 0,44]. Também não houve alteração significante na latência para iniciar e na duração da resposta de ingestão de água [F (4,60) = 0, 99; p = 0,41], [F (4,60) = 0,82; p = 0,51] respectivamente (Tabela 4)..