Adriana Aparecida Sinópolis Gigliolli
Identificação e caracterização bioquímica das esterases
em
Tribolium castaneum
(Coleoptera: Tenebrionidae) e
a relação com a resistência aos inseticidas
Maringá-2008
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
Gigliolli, Adriana Aparecida Sinópolis
G459i Identificação e caracterízação bioquímica das esterases em Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) e a relação com a resistência aos inseticidas / Adriana Aparecida Sinópolis Gigliolli. -- Maringá : [s.n.], 2008.
57 f. : il. color.
Orientadora : Prof. Dr. Ana Silvia Lapenta Co-orientadora: Prof. Dr.Maria Claudia C. R.
Takasusuki
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Maringá, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, área de concentração: Biologia Celular e Molecular, 2008.
1. Insetos (caruncho da farinha de trigo) - Resistência aos inseticidas. 2. Insetos (caruncho da farinha de trigo) - Esterases - Resistência aos inseticidas. I. Universidade Estadual de Maringá, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, área de concentração: Biologia Celular e Molecular. II. Título.
Adriana Aparecida Sinópolis Gigliolli
Identificação e caracterização bioquímica das esterases
em
Tribolium castaneum
(Coleoptera: Tenebrionidae) e
a relação com a resistência aos inseticidas
Orientador(a): Profª Drª Ana Silvia Lapenta
Co-orientador(a): Profª Drª Maria Claudia
Colla Ruvolo Takasusuki
Agradecimentos
A todas as pessoas que colaboraram para a realização deste trabalho, desejo prestar os mais sinceros agradecimentos.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Maringá e ao Departamento de Biologia Celular e Genética onde foram desenvolvidos os experimentos desta dissertação.
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
A minha orientadora Ana Silvia, pela paciência, compreensão e pelos votos de confiança que me fortaleceram durante a realização deste trabalho. Obrigada pelos conhecimentos que me proporcionou e acima de tudo pela amizade em todos os momentos.
A minha co-orientadora e grande amiga Maria Claudia, exemplo de dedicação ao trabalho e a ciência. Te agradeço pela presteza em me orientar, pelas sugestões e incentivo para a conclusão deste trabalho.
Aos membros da banca, Profº Drº Hélio Conte e Profª Drª Mary Massumi Itoyama.
Aos professores Claudete Mangolin, Erasmo Renesto, José Ricardo, Maria de Fátima e Sandra Collet pela convivência e profissionalismo com que me atenderam durante a pós-graduação.
Aos técnicos Sérgio e Valmir que auxiliaram no desenvolvimento desta pesquisa.
Ao colega Narcimário Pereira Coelho, mestrando do Departamento de Química da Universidade Estadual de Maringá, pelo auxílio nos cálculos experimentais necessários na realização deste trabalho.
A Ana Paula, Leandro e Rosimar, pela amizade solidificada durante a graduação, incentivo e confiança. Também a todos os colegas da pós-graduação pelos momentos de alegrias e dificuldades compartilhados.
Com imenso carinho, agradeço a Débora e a Ana Luísa, que me ensinaram muito com seus exemplos e atitudes, amigas do coração que farão parte da minha vida pra sempre.
Ao meu esposo, que esteve ao meu lado em todos os momentos. Obrigada pela motivação diária, por ter acreditado nos meus ideais e por hoje estar compartilhando comigo mais esta conquista vitoriosa.
Aos meus pais, Hélio e Antonia, e minha irmã querida. Obrigada pelo amor, incentivo e confiança.
Enfim, a Deus, a quem nos momentos de incerteza pedi que me mostrasse o caminho certo. A quem pedi forças e me destes dificuldades para fazer-me mais forte, a quem pedi sabedoria e me destes problemas para resolver, a quem pedi coragem e me destes obstáculos para eu superar. Agradeço a este ser supremo, pois recebi mais do que precisava para que eu não desistisse de atingir os meus objetivos.
BIOGRAFIA
“ O valor das coisas não está no tempo em que elas duram, mas na intensidade com que acontecem.
Por isso existem momentos inesquecíveis,
coisas inexplicáveis e
pessoas incomparáveis".
Apresentação
Em consonância com a resolução nº 07/2007-CPBC do Programa de
Pós-graduação em Ciências Biológicas, esta dissertação é composta por dois artigos que
tratam da identificação e caracterização bioquímica das esterases durante o
desenvolvimento de Tribolium castaneum e buscam estabelecer a relação dessas
isoenzimas com a resistência deste inseto-praga ao organofosforado malathion e ao
piretróide cipermetrina. Cada artigo está redigido de acordo com as normas das revistas
a qual serão submetidos para a publicação.
Artigo I – Análise genética e caracterização funcional das esterases em Tribolium
castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) e a relação com os mecanismos de
resistência ao malathion – Revista Biochemical Genetics (ISSN 006-2928)
Artigo II – Estudo da toxicidade do malathion e da cipermetrina em Tribolium
castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) e a participação da EST-5 nos mecanismos
Identificação e caracterização bioquímica das esterases em Tribolium castaneum
(Coleoptera: Tenebrionidae) e a relação com a resistência aos inseticidas.
Resumo
Os insetos da espécie Tribolium castaneum, conhecidos popularmente no Brasil como “caruncho”, são pragas que infestam produtos armazenados como sementes, grãos, especiarias, cereais, rações, farinhas e outros, gerando perdas qualitativas e quantitativas na produção e grandes prejuízos econômicos para produtores e comerciantes. O uso intensivo de inseticidas no controle de pragas de grãos armazenados tem contribuído para o desenvolvimento de resistência, por meio de mecanismos fisiológicos, comportamentais e bioquímicos. O mecanismo bioquímico talvez seja um dos mais importantes, uma vez que são realizados por enzimas, tais como as esterases. Duas classes de esterases estão envolvidas na resistência aos inseticidas, as carboxilesterases e as colinesterases. As carboxilesterases atuam na detoxificação metabólica por meio da hidrólise e/ou seqüestro do inseticida. Dentre as colinesterases, as acetilcolinesterase (AChE) é uma enzima que atua nos terminais do impulso nervoso do inseto, hidrolisando o neurotransmissor acetilcolina, sendo que os organofosforados e carbamatos ligam-se covalentemente ao sítio ativo desta enzima causando a morte do inseto. Algumas modificações estruturais no seu sítio ativo podem conferir resistência a estes compostos. Os objetivos do presente estudo foram identificar e caracterizar as esterases nos estágios do desenvolvimento de T. castaneum, determinar a resistência de seis linhagens desta espécie ao organofosforado malathion e ao piretróide cipermetrina, avaliar a ocorrência de resistência cruzada entre esses compostos e o possível envolvimento das esterases nos mecanismos de resistência a esses inseticidas. Para tanto, os insetos foram expostos diretamente aos inseticidas e a mortalidade verificada após 24 horas. Várias concentrações foram testadas e a CL50 estimada para cada
como carboxilesterase. Todas as linhagens foram submetidas à bioensaios com malathion e cipermetrina. A CL50 para o malathion variou de 8,81 a 49,93 µg/cm2 e para
Identificação e caracterização bioquímica das esterases em Tribolium castaneum
(Coleoptera: Tenebrionidae) e a relação com a resistência aos inseticidas.
ABSTRACT
The insects of the species Tribolium castaneum, popularly known in Brazil as “caruncho”, are pests which have affecting the quality of stored-products like seeds, grains, spices, crumbs, rations, maize flour, flours in general, and cereal meals generating qualitative and quantitative losses in the production and great economical damages for producers and merchants. The intensive use of insecticides has contributed for developing resistance through physiological, behavioural and biochemical mechanisms. The biochemical mechanism is one of the most important because they are accomplished by enzymes of the esterase groups. Two classes of esterases are involved in resistance insecticide: the carboxylesterases and cholinesterases. The carboxylesterases act in metabolic detoxification through the hydrolysis or molecule sequestration. Among the cholinesterases, the acetylcholinesterases (AChEs) act on the terminal nerves of insects by hydrolyzing the acetylcholine neurotransmitter. The objectives of the present experiment was to identify and characterise esterases during the stages of Tribolium castaneum development, determine the resistance of six strains to the malathion (an organophosphorate) and cypermethrin (a pyrethroid), evaluate the occurrence of crossed resistance among those composed, and the involvement of esterases in the resistance mechanisms to both insecticide. The insects were exposed directly to the insecticides and the mortality was verified after 24 hours. Several concentrations were tested and the CL50 was estimated for each strain. The survivors of
each treatment were frozen and submitted to the vertical polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) for the analysis of the esterases. The PAGE system permitted the identification of eleven esterases with distinguishing expression during the insect development and among the strains. Four esterases in the adults, EST-1, 2, 3, and 9, were classified in the cholinesterase and EST-5 was classified in the carboxylesterase class. All of the strains were submitted to the treatments with malathion and cypermethrin. The LC50 for malathion varied from 8.81 to 49.93 µg/cm2 and for the
