MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
PAPILOMAVÍRUS HUMANO: RESPOSTA IMUNE E VACINAÇÃO
ANA PAULA FERREIRA COSTA
NATAL/RN 2019
PAPILOMAVÍRUS HUMANO: RESPOSTA IMUNE E VACINAÇÃO
NATAL/RN 2019
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Doutor (a) em Ciências da Saúde.
Orientador: Ana Katherine da Silveira Gonçalves de Oliveira
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS Costa, Ana Paula Ferreira.
Papilomavírus humano: resposta imune e vacinação / Ana Paula Ferreira Costa. - 2019.
65f.: il.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde. Natal, 2019.
Orientadora: Ana Katherine da Silveira Gonçalves de Oliveira.
1. Papillomavirus Humano - Vacina - Tese. 2. Imunoglobulina A - Tese. 3. Imunoglobulina G - Tese. 4. HPV - Tese. I. Oliveira, Ana Katherine da Silveira Gonçalves de. II. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 616-006.5:615.37
Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde:
Profa. Dra. Ana Katherine da Silveira Gonçalves de Oliveira
PAPILOMAVÍRUS HUMANO: RESPOSTA IMUNE E VACINAÇÃO
Aprovada em: ___ / ___ / ______
Banca Examinadora:
Presidente da banca:
Profa. Dra. Ana Katherine Gonçalves
Membro da banca:
Prof. Dr. Guilherme Maranhão Chaves (Membro Interno – UFRN)
Prof. Dr. Gustavo Mafaldo Soares (Membro Interno – UFRN)
Prof. Dr. José Eleutério Jr. (Membro Externo – UFC)
Prof. Dr. José Humberto Belmino Chaves (Membro Externo – UFAL)
À minha família, que tanto me apoiou nesta jornada.
“Quem dera, por um descuido de Deus, vocês
fossem eternos”.
À Deus, por me abençoar muito mais do que eu mereço. Obrigada pelas conquistas alcançadas até o momento e pelas que virão. Por cuidar de mim todos os dias e jamais me permitir desanimar frente aos obstáculos. Por seu amor infinito e pela honra de poder tê-lo em meu coração.
À minha pequena grande família, que tanto amo, que por muitas vezes tolerou minha pressa, minha falta de paciência e minha ausência e que acima de tudo me ensinou o que é amar. Sou grata por todo o carinho e atenção.
Ao meu Pai, José Anastácio Ferreira, pela sua força, que me educou com o mesmo encorajamento e determinação, por todas as palavras sábias e pelo ombro amigo nos momentos difíceis. Sou grata à Deus, pelo Pai maravilhoso que me foi dado.
À minha querida Mãe, Cícera Maria Costa, minha verdadeira amiga, meu porto seguro, meu alicerce, meu AMOR. Agradeço por sempre estar por perto, por me mostrar o caminho da paz, pelas palavras de apoio e de carinho e por estar sempre ao meu lado. Sou grandemente abençoada, por tê-la como mãe.
À minha irmã Imaculada Ferreira, pelo carinho e amor. O apoio das pessoas que amo, é de extrema importância, e o seu, representa muito para mim, eu te amo!
Ao meu pequeno sobrinho Gabriel Ferreira, que eu tanto amo. Estar com você é sempre uma alegria.
À Profa. Dra. Ana Katherine Gonçalves, minha mãe científica! Deus a colocou em meu caminho como um presente, um anjo cheio de luz. Obrigada por todos os ensinamentos, pela paciência e cuidado. Eu jamais teria chegado até aqui sem o seu suporte, muito obrigada.
Ao Prof. Dr. Ricardo Cobucci, pelo incentivo, direcionamento, por todos os ensinamentos e por toda a força nesta caminhada. Gratidão, de coração, por tudo.
Ao Prof. Dr. Paulo César Giraldo, pela confiança e suporte durante todos esses anos de vida acadêmica.
À Profa. Dra. Paula Renata Machado, minha gratidão por todos os ensinamentos e apoio.
Aos amigos que se tornaram irmãos e alicerces nestes anos de doutorado, em especial, Luanda e Tábata, que tornaram minha caminhada mais leve e alegre. Meninas obrigada pelo carinho, pelas conversas e pelo ombro amigo, que tanto precisei.
“Existe um tempo certo para cada coisa, momento oportuno para cada propósito debaixo do céu: Tempo de nascer, tempo de morrer; tempo de plantar, tempo de
colher o que se plantou” [Eclesiastes 3, 1-2 ]
A infecção pelo Papilomavírus Humano (HPV) muitas vezes não induz inflamação ou produção de mediadores imunológicos capazes de inibir a replicação viral. A resposta imune pró-inflamatória e humoral é necessária para romper a tolerância induzida pelo HPV. A revisão sistemática teve como objetivo comparar a segurança da vacina nonavalente (HPV9) versus tetravalente (HPV4) e, os dois ensaios clínicos, tiveram como objetivo descrever o curso da resposta imune a imunoglobulina G/A (IgG/IgA), em mulheres imunizadas, com a vacina bivalente (HPV2), um ano após a vacinação e o outro em mulheres com/sem lesão intraepitelial induzida pelo HPV, não-imunizadas/imunizadas com HPV2. Uma busca eletrônica, por ensaios clínicos randomizados (ECR), que avaliaram efeitos adversos, foi realizada através do PubMed, Embase, Scopus, Web of Science e SciELO. Em relação aos ensaios clínicos, amostras de soro e muco cervical foram coletadas para detecção de IgG/IgA anti-HPV, por ensaio imunoenzimático (ELISA). Os ECR selecionados analisaram 27.465 mulheres que receberam uma das duas vacinas e resultados como dor (OR 1,72; IC95% 1,62-1,82) e eritema (OR 1,29; IC95% 1,21-1,36) ocorreram significativamente mais no grupo HPV9. No entanto, efeitos adversos como: dor de cabeça (OR 1,07; IC95% 0,99-1,15), tontura (OR 1,09; IC95% 0,93-1,27) e fadiga (OR 1,09; IC95% 0,91-1,30), foram igualmente raros entre os grupos HPV4 e HPV9. Nos ensaios clínicos, com mulheres vacinadas, houve reativação de IgG um mês e um ano após a imunização (100%), enquanto o IgA, foi de 95% um mês e 79% um ano depois e embora significativo (P< 0,0001), ambos os anticorpos, diminuíram em amostras cervicais e séricas, um ano após a imunização. No segundo ensaio clínico, houve resultados significativos, quanto a presença de IgA, produzidas pelas mulheres com lesões induzidas pelo HPV (não vacinadas) quando comparadas às mulheres imunizadas e sem lesão (p <0,01). Já a detecção de IgG foi maior no soro imunizado (p <0,01). Portanto, nossas descobertas demonstram que a vacina HPV9 em pacientes do sexo feminino é tão segura quanto a vacina HPV4. A resposta imune, embora significativa, diminui um ano após a imunização, sugestivo de um reforço vacinal, necessário para aumentar os títulos de anticorpos. A IgA em mulheres não vacinadas caracteriza-se como uma possível transudação da circulação sistêmica para a mucosa cervical. O IgG, anticorpo de memória, prova a eficácia da vacina bivalente ao proteger contra a infecção pelo HPV.
Palavras-chave: Imunoglobulina G- imunoglobulina A- HPV- vacina
Human papillomavirus (HPV) infection often does not induce inflammation or production of immune mediators capable of inhibiting viral replication. The proinflammatory and humoral immune response is required to break HPV-induced tolerance. The systematic review aimed to compare the safety of the nonavalent (HPV9) versus tetravalent (HPV4) vaccine and both clinical trials aimed to describe the course of the immune response to immunoglobulin G/A (IgG/IgA) in immunized women, with the bivalent vaccine (HPV2), one year after vaccination and the other in women with / without HPV-induced intraepithelial lesion, non-immunized / immunized with HPV2. An electronic search for randomized controlled trials (RCTs) evaluating adverse effects was performed through PubMed, Embase, Scopus, Web of Science, and SciELO. Regarding clinical trials, serum and cervical mucus samples were collected for detection of anti-HPV IgG / IgA by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The selected RCTs analyzed 27,465 women who received one of the two vaccines and results as pain (OR 1.72; 95% CI 1.62-1.82) and erythema (OR 1.29; 95% CI 1.21-1.36) occurred significantly more in the HPV9 group. However, adverse effects such as headache (OR 1.07; 95% CI 0.99-1.15), dizziness (OR 1.09; 95% CI 0.93-1.27) and fatigue (OR 1, 09; 95% CI 0.91-1.30) were equally rare between the HPV4 and HPV9 groups. In clinical trials, with vaccinated women, IgG reactivated one month and one year after immunization (100%), while IgA was 95% one month and 79% one year later and although significant (P <0.0001), both antibodies decreased in cervical and serum samples one year after immunization. In the second clinical trial, there were significant results regarding the presence of IgA produced by women with HPV-induced (unvaccinated) lesions when compared to immunized and uninjured women (p <0.01). IgG detection was higher in immunized serum (p <0.01). Therefore, our findings demonstrate that the HPV9 vaccine in female patients is as safe as the HPV4 vaccine. The immune response, although significant, decreases one year after immunization, suggestive of a booster needed to increase antibody titers. IgA in unvaccinated women is characterized as a possible transudation of the systemic circulation to the cervical mucosa. Memory antibody IgG proves the efficacy of the bivalent vaccine in protecting against HPV infection.
Keywords: Immunoglobulin G- immunoglobulin A- HPV- vaccine ix
HPV IgA IgG ELISA DNA IST NIC FDA HR LR HPV2 HPV4 HPV9 VLP Papilomavírus humano Imunoglobulina A Imunoglobulina G Ensaio Imunoenzimático Ácido Desoxirribonucleico
Infecções Sexualmente Transmissível Lesão Intraepitelial Cervical
Food and Drug Administration High-risk Low-risk Vacina Bivalente Vacina Tetravalente Vacina Nonavalente Virus-like Particles x
Figura 1- Estrutura dos vírions dos papilomavírus...14
1 INTRODUÇÃO 1.1 PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) 1.2 VACINAS CONTRA O HPV 14 14 16 2 JUSTIFICATIVA 17 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVOS GERAIS 3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 18 18 18 4 METODOLOGIA
4.1 LOCAL DE REALIZAÇÃO DAS COLETAS
4.2 ESTUDO 01 – REVISÃO SISTEMÁTICA E META-ANÁLISE
4.2.1 DESIGN DO ESTUDO 4.2.2 ESTRATÉGIA DO ESTUDO 4.2.3 ANÁLISE DOS DADOS
4.3 ESTUDO 02/03 ENSAIOS CLÍNICOS
4.3.1 POPULAÇÃO DOS ESTUDOS
4.3.2 DETECÇÃO DE IGA E IGG ANTI-HPV-VLP POR ELISA 4.3.3 DETECÇÃO E GENOTIPAGEM DO HPV 4.3.4 ANÁLISE ESTATISTICA 19 19 19 19 19 20 20 20 21 22 23 5 ARTIGOS PRODUZIDOS 24
5.1 ARTIGO 1 - Safety of Human Papillomavirus 9-Valent Vaccine: A Meta-Analysis of Randomized Trials
25
5.2 ARTIGO 2 - Immune Response to Human Papillomavirus One Year after Prophylactic Vaccination with AS04-Adjuvanted HPV-16/18 Vaccine: HPV-Specific IgG and IgA Antibodies in the Circulation and the Cervix
HPV16/18 for non-oncogenic HPV
5.4 OUTRAS PUBLICAÇÕES 51
5.5 CAPÍTULOS DE LIVRO - PUBLICADOS 51
REFERÊNCIAS 53
APÊNDICES 55
APÊNDICE A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 56
APÊNDICE B – Instrumento de coleta de dados 58
ANEXOS 59
ANEXO A – Aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa 60
1. INTRODUÇÃO
A família Papillomaviridae compreende um diverso grupo de vírus de DNA (Ácido Desoxirribonucleico) dupla fita (circular) com forma icosaédarica e não envelopados. As origens desses vírus datam de cerca de 350 milhões de anos atrás e os mais de 300 papilomavírus caracterizados até hoje são estritamente espécie-específicos e acredita-se que tenham coevoluído com seus respectivos hospedeiros [1, 2].
1.1 PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV)
O HPV pertence à família Papillomaviridae e ao gênero Papillomavirus. É um dos vírus sexualmente transmissíveis, não envelopados, mais comuns no mundo e é a principal causa de câncer de colo de útero [3]. Os HPVs possuem tropismo pelo epitélio escamoso da pele e das mucosas como mãos, pés, mucosa oral e/ou genital e a sua replicação ocorre no núcleo das células escamosas epiteliais. A infecção é mais comumente encontrada no trato anogenital de homens e mulheres, causando verrugas genitais (lesão intraepitelial de baixo grau) e/ou Lesões intraepiteliais escamosas de diferentes graus, as quais, em alguns casos, podem progredir para lesões mais graves e culminar no desenvolvimento de câncer (Lesão de alto grau) [4]. A Figura 1 representa a estrutura das partículas infecciosas dos vírus da família
Papillomaviridae.
Figura 1 – Estrutura dos vírions dos papilomavírus
Fonte: Adaptado de ViralZone. Disponível em: <http://viralzone.expasy.org/all_by_species/5.html>
Apesar do pequeno tamanho, sua biologia molecular é bastante complexa (Fig. 1). O DNA viral encontra-se associado a proteínas semelhantes a histonas, envoltas
por 72 capsômeros constituídos por duas proteínas estruturais, L1 e L2. Esses vírus são capazes de infectar seres humanos e grande número de espécies animais, sendo o homem o hospedeiro mais extensivamente estudado [5].
A transmissão acontece principalmente pela via sexual, através do contato pele a pele (genital-genital, manual-genital, oral-genital), com ou sem penetração, a partir do contato com locais infectados e/ou microtraumatizados diferenciando-o de outras infecções sexualmente transmissíveis (ISTs), que são transmitidas através de fluidos e secreções [6, 7]. O tipo de lesão que se desenvolve também está associado ao tipo do vírus. Em humanos, os HPVs podem causar lesões hiperproliferativas (verrugas) e/ou lesões intraepiteliais cervicais, consideradas de baixo grau (LR-HPV, do inglês,
Low-risk HPV), podendo evoluir para carcinomas escamosos de colo do útero e de
pênis, como principal manifestação clínica, consideradas de alto grau (HR-HPV, do inglês, High-risk HPV) [1]. As lesões hiperproliferativas benignas são associadas aos HPVs de baixo risco oncogênico, como HPV 6, 11, 13, 44 e 47 [8]. Já as lesões intraepiteliais de alto grau, são fortemente associados aos tipos HPVs 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 e 58, classificados como HPVs de alto risco oncogênico [9].
Atualmente, mais de 170 tipos diferentes de HPVs já foram catalogados e regis- trados no International Human Papillomavirus Reference Center, dentre os quais cerca de 40 são encontrados com frequência causando infecções no epitélio de revestimento do trato genital e de outras mucosas do corpo [5, 10]. Estima-se que cerca de 75% da população sexualmente ativa será infectada com o HPV [11]. Mais de 630 milhões de homens e mulheres (1:10 pessoas) estão infectados. Para o Brasil, cerca de 9 a 10 milhões de pessoas estão infectadas por esse vírus e que, e estima-se que, a cada ano, 700 mil novos casos ocorram [12].
Por outro lado, acredita-se que a taxa de prevalência global da infecção pelo HPV é subestimada, em razão da ocorrência de infecções transitórias assintomáticas e das limitações nas metodologias de estudo, sendo controlada e eliminada pela resposta imune do hospedeiro em um período de oito a 24 meses [13]. Já a doença persistente, comumente causadas por vírus HPV tipos 16 e 18, quando dão origem ao câncer de colo de útero, apresentam como sintomas: sangramento vaginal irregular ou anormal, dor pélvica, fadiga, desconforto vaginal, corrimento vaginal com odor forte, dentre outros. Além disso, é possível que sintomas mais graves surjam em estágios mais avançados da doença [14, 15].
1.2 VACINAS CONTRA O HPV
A evolução da infecção pelo HPV e seu impacto na saúde mundial foi primordial para o desenvolvimento de vacinas no combate à disseminação do vírus e o controle das lesões HPV induzidas. Três vacinas, eficazes, estão aprovadas pela Food and
Drug Administration (FDA): a vacina bivalente (HPV2) - (Cervarix®, GSK), que protege
contra o vírus HPV16/18, a vacina tetravalente (HPV4) - (Gardasil®, Merck and Company), que protege contra o vírus HPV6/11/16/18 e a vacina nonavalente (HPV9) - (Gardasil®, Merck and Company), que protege contra o vírus HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58 [16].
As vacinas são compostas por partículas semelhante a vírus (VLPs, do Inglês
vírus-like particles), preparadas pela técnica de DNA recombinante, que cria uma das
proteínas que compõe o capsídeo do HPV, a proteína L1. As VLPs, por sua vez, são capazes de induzir a formação de anticorpos neutralizantes 100 vezes mais, do que os que ocorrem na infecção natural, conferindo proteção contra o vírus do HPV, prevenindo infecções persistentes e verrugas anogenitais, bem como o câncer cervical, vaginal, vulvar e anal, que ocorrem mais tardiamente [17].
A injeção intramuscular da VLP resulta em resposta imune adaptativa eficaz para células T e B, que são capazes de neutralizar as infecções naturais subsequentes [18]. A HPV2 apresenta proteção contra infecção incidente ou persistente pelos sorotipos inclusos na vacina e previne as lesões neoplásicas cervicais relacionadas aos mesmos. Já a HPV4 confere proteção à infecção e lesões citadas acima, assim como prevenção de verrugas genitais e lesões vulvares e vaginais [19]. A HPV9 apresenta um perfil de segurança compatível com a HPV4, com uma cobertura preventiva significativa de cânceres associados ao HPV, variando entre 8% e 18%, dependendo da distribuição local de tipos de HPV de alto risco na população [20].
2 JUSTIFICATIVA
O HPV tem sido bastante estudado devido ao seu potencial carcinogênico. A infecção pelo HPV, persiste, pode acarretar o desenvolvimento de lesões precursoras que, se não forem identificadas e tratadas, podem progredir para o câncer, principalmente no colo do útero, mas também na vagina, vulva, ânus, pênis, orofaringe e boca. As vacinas de HPV têm sido amplamente estudadas. Seus efeitos já documentados no desenvolvimento de imunidade sistêmica contra o vírus, bem como a manutenção desta imunidade ao longo do tempo têm sido base para estudos sobre a utilização das vacinas em pacientes que já tiveram contato com o HPV, que são sorologicamente positivas para o mesmo e, finalmente, para as que possuem lesão ativa.
Sendo a vacinação uma ação profilática, é fundamental dispor de resultados que avaliem a atuação dos anticorpos anti-HPV, cuja produção foi estimulada pela vacina. Apesar de haver um período relativamente prolongado desde o início do uso clínico das vacinas contra o HPV, não há dados baseados em evidências sobre a possível necessidade de uma vacinação de reforço. Assim, este estudo foi concebido para descrever o curso das respostas de IgG/IgA nas secreções cervicais e no soro de mulheres com e sem lesão intraepitelial, bem como evidenciar o benefício do uso das vacinas profiláticas contra o vírus do HPV.
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL:
Avaliar a resposta imune humoral (IgG/IgA) à infecção e a vacinação contra o HPV
3.2 OBJETIVO ESPECÍFICO
Detectar os anticorpos (IgG/IgA) em mulheres vacinas sem lesão versus mulheres não-vacinadas e com lesão intraepitelial de alto e baixo grau induzida pelo HPV;
Avaliar o perfil imunogênico da vacina bivalente - AS04 (16/18) contra outros tipos de HPV não oncogênicos, em mulheres com lesão
intraepitelial induzidas pelo HPV;
Descrever o curso das respostas de IgG/IgA nas secreções cervicais e no soro um ano após a primeira dose intramuscular da vacina bivalente contra o HPV;
Avaliar a partir de uma revisão sistemática, se a vacina nonavalente é tão segura quanto a vacina tetravalente, na população feminina.
4. METODOLOGIA
4.1 LOCAL DE REALIZAÇÃO DA PESQUISA
A pesquisa foi realizada em ambulatórios de genecologia geral do estado do Rio Grande do Norte - RN
4.2 ESTUDO 01 – REVISÃO SISTEMÁTICA E META-ANÁLISE
4.2.1 DESIGN DO ESTUDO
A meta-análise segue as diretrizes de itens de relatório preferenciais para revisões sistemáticas e meta-análises (do Inglês, Preferred Reporting Items for
Systematic Reviews and Meta-Analyses - PRISMA) [21].
Dois pesquisadores (APFC e JMS) realizaram a seleção dos estudos de interesse. Posteriormente, os dados foram extraídos por outros três pesquisadores (APFC, AKS e RNC), de acordo com o protocolo de extração de dados. Eles avaliaram os estudos encontrados com base nos seguintes critérios de inclusão: (1) estudos randomizados controlados (ECR) que avaliaram os efeitos colaterais do HPV4, Gardasil e HPV9 (Gardasil9); (2) experimentos envolvendo mulheres; (3) estudos avaliando os parâmetros de segurança, imunogenicidade e eficácia das vacinas; e (4) estudos que apresentaram protocolos de vacinação semelhantes. Os critérios de exclusão foram os seguintes: (1) estudos envolvendo homens, (2) mulheres grávidas, (3) mulheres que foram vacinadas apenas com a vacina 9-valente e (4) estudos observacionais. Todas as discrepâncias entre esses três revisores foram resolvidas pelo consenso de todos os autores.
4.2.2 ESTRATÉGIA DE BUSCA
A pesquisa foi realizada por uma pesquisa ampla e abrangente de literatura, desde bancos de dados (PubMed, Embase, Web of Science, Scopus e SciELO) até dezembro de 2016. Os seguintes descritores foram utilizados: (HPV OR Human papillomavirus) AND (vaccines OR vaccination) OR (tetravalent HPV vaccine) OR (9-valent vaccine) AND (side effects) OR (adverse events) AND (randomized controlled trial) OR (double blind method) OR (clinical trial). Nenhuma restrição de idioma foi aplicada.
4.2.3 ANÁLISE DE DADOS
Os dados foram inseridos no software Review Manager (RevMan 5.2), que permite ao usuário inserir protocolos e revisões completas, incluindo texto, recursos de estudos, tabelas de comparação e dados de estudos, além de realizar meta-análise dos dados inseridos.
Para avaliar a segurança e eficácia entre as vacinas HPV9 e HPV4, os dados dicotômicos foram extraídos de cada estudo e inseridos em uma tabela de contingência 2 × 2, com subsequente determinação individual da razão de chances (Odds Ration), para obter uma estimativa geral resumida. Modelos de efeitos fixos ou efeitos aleatórios foram escolhidos, dependendo da ausência ou presença de heterogeneidade entre os estudos. A heterogeneidade estatística entre os estudos foi avaliada pela estatística I2 (<25%, sem heterogeneidade; 25% a 50%, heterogeneidade moderada; e >50%, forte heterogeneidade). Quando existia uma heterogeneidade significativa nos estudos incluídos (I2> 50%), um modelo de efeitos colaterais foi utilizado para a análise; caso contrário, o modelo de efeitos fixos foi utilizado [22, 23]. Além disso, usamos o gráfico de funil de Egger para avaliar possível viés de publicação [22].
Um escore de Jadad, baseado nas três subescalas seguintes: randomização (2–0), cego (2–0) e retiradas e desistências (1–0), avaliou a qualidade do estudo. Para cada resposta sim, incerto ou não, os valores de 2 a 0 pontos foram atribuídos, respectivamente. Em nossa análise, julgamos que os estudos avaliados com escore ≥ 3 seriam considerados de alta qualidade. O nível de evidência de cada estudo (Tabela 1) foi definido de acordo com as definições do Oxford Center for Evidence-Based Medicine [24].
Optamos por usar o modelo de efeitos fixos durante a análise estatística, porque esse modelo é aplicado quando há pouca variabilidade entre os resultados dos estudos [25]. Para determinar a OR, foi utilizado um intervalo de confiança (IC) de 95% com valores de P <0,05 considerados estatisticamente significativo.
4.3 ESTUDO 2/3 – ENSAIOS CLÍNICOS
4.3.1 POPULAÇÃO DOS ESTUDOS
Amostras de soro e muco cervical foram coletadas de mulheres incluídas no estudo e divididas em dois grupos de pacientes:
◊ Grupo de mulheres saudáveis e vacinadas – 35 pacientes
◊ Grupo de mulheres com lesão intraepitelial induzidas pelo HPV– 49 pacientes
A idade das mulheres variou de 18 a 35 anos. Todas as mulheres foram informadas sobre os métodos e objetivos da pesquisa e assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) (APÊNDICE A). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes (1.255.691 / 2015 CEP-HUOL) (APÊNDICE B).
Foram estabelecidos como critério de inclusão: O grupo vacinado deveria ter recebido 3 doses da vacina contra o HPV-16/18 (nos meses 0, 1 e 6) e o grupo não vacinado, apresentaria biópsia positiva para lesão intraepitelial de alto ou baixo grau.
Os critérios de exclusão para ambos os grupos: (1) qualquer imunodeficiência, doença crônica ou tratamento que possa interferir na resposta imune ao vírus HPV (2) hipersensibilidade sistêmica conhecida a qualquer componente da vacina experimental; (3) recebimento de qualquer outra vacina dentro de 4 semanas; (4) estado da menopausa; (5) grávida ou amamentando e (6) administração de imunoglobulinas ou produtos sanguíneos dentro de 3 meses antes da coleta de sangue.
4.3.2 DETECÇÃO DE IGA E IGG ANTI-HPV-VLP POR ELISA
Os detalhes da preparação do antígeno foram descritos anteriormente Gonçalves e colaboradores [13]. Primeiramente, uma placa de 96 poços foi sensibilizada com 50μL de antígeno (vacina contra HPV-16/18) diluída em tampão carbonato-bicarbonato (Sigma-Aldrich) a uma concentração de 10μg/mL e incubada a 4ºC durante a noite. A placa foi então lavada três vezes com PBS-Tween 0,05% e bloqueada com 100 μL de PBS com 10% de soro fetal bovino (FBS-Gibco) (PBS-FBS). O passo seguinte foi incubado durante 2 h à temperatura ambiente e lavado três vezes com PBS-Tween a 0,05%.
As amostras de muco e soro cervical foram diluídas 1:100, 1:1.000, 1:10.000, 1:100.000, 1:1.000.000 e 1:10, 1:100, 1:1.000, 1:10.000, 1:100.000, respectivamente em PBS FBS, e 50μL dessa diluição foram adicionados a cada poço. Em seguida, as amostras foram incubadas por 2h a 37°C e a placa foi lavada três vezes com PBS-Tween a 0,05%. Em seguida, o anticorpo secundário (IgG anti-humano ou IgA marcado com peroxidase; Sigma-Aldrich) foi diluído 1: 10.000 em FBS a 10%, e 50 μL
foram adicionados aos poços e incubados por 1h a 37ºC. Depois disso, a placa foi lavada cinco vezes com PBS-Tween a 0,05% e depois 50μL do substrato TMB (Sistema de Substrato Líquido 3,3 ', 5,5'-Tetrametilbenzidina; Sigma-Aldrich) foi adicionado aos poços antes da incubação por 30 minutos em temperatura ambiente. A reação foi parada com 50μL de ácido sulfúrico 1N e a absorvância (densidade óptica) de cada poço foi lida usando um leitor ELISA a 450nm com um filtro de referência de 630 nm. Os valores de corte para cada anticorpo / amostra foram os seguintes: IgG / soro, 0,616; IgG / muco, 0,611; IgA / soro, 0,173; e IgA / muco, 0,294 [13].
4.3.3 DETECÇÃO E GENOTIPAGEM DO HPV
O DNA genômico foi extraído e purificado com o Kit Miniprep de DNA / RNA viral de fluido corporal AxyPrep ™ (Axygen, CA, EUA®) de acordo com as instruções do fabricante. A amplificação da reação em cadeia da polimerase por HPV (PCR) foi realizada usando os iniciadores MY09 (5'-CGTCCMAARGGAWACTGATC-3 ') e MY11 (5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3'), como descrito em outros locais [10]. O produto de PCR foi submetido a eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com 1 μg/mL de brometo de etídio e fotodocumentado sob luz UV (aproximadamente 450 pb). As amostras que deram um resultado positivo de PCR foram posteriormente analisadas por genotipagem por HPV. A co-amplificação do gene da β-globina humana foi realizada como controle interno usando os iniciadores GH20 (5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3 ′) e PC04 (5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3 ′) nas mesmas condições do HPV-PCR. Dois tipos de controles também foram incluídos em cada série de reação: 'sem DNA' (controle negativo) e 'DNA positivo para HPV' (controle positivo).
As amostras positivas para o HPV foram genotipadas usando um PCR-RFLP (polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição) como descrito anteriormente [11]. Dez µg/mL de cada amostra de PCR foram digeridos com a enzima de restrição HpyCH4V (New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A genotipagem foi resolvida em géis de poliacrilamida a 8% e determinada por análise de cada banda com o software Labimage 1D (Loccus Biotechnology, São Paulo, Brasil), e a comparação dos pesos moleculares determinou os genótipos com potencial carcinogênico: HR-HPV, UR-HPV (risco indeterminado-HPV) e LR-HPV. Os seguintes tipos foram determinados para esse método de genotipagem: HR (-16, -18,
-31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -52, -53, -56, -58, -59, -66, -68, -73 e -82), risco indeterminado (UR 26) e LR (6, 11, 30, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 62, -64, -67, -69, -70, -72, -74, -81, -83, -84 e -91) (Agência Internacional de Pesquisa do Câncer-IARC).
4.3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada com o Stata 11 (Stata Corporation, College Station, TX, EUA). Para comparação entre os grupos, foi utilizado o teste do qui-quadrado de Pearson e valores de p <0,05 foram considerados significativos. Nas amostras de soro e muco, os valores médios de absorbância de IgG e IgA entre os genótipos de HPV 16/18, 82, 6/11 e 13/61/72/74 foram comparados por análise de variância seguida pelo teste de Tukey (p <0,05). Para analisar o efeito da vacinação na concentração de imunoglobulina em diferentes diluições, foi utilizada regressão linear de efeitos aleatórios. A concentração de imunoglobulina no soro e muco foi considerada a variável dependente, a diluição como variável independente de efeito fixo e a variabilidade interindividual é o componente aleatório do modelo (p <0,05).
5. ARTIGOS PRODUZIDOS
5.1 ARTIGO 01 – Publicado - Safety of Human Papillomavirus 9-Valent Vaccine:
A Meta-Analysis of Randomized Trials Costa APF, Cobucci RNO, da Silva JM, da
Costa Lima PH, Giraldo PC, Gonçalves AK. J Immunol Res. 2017:3736201. doi: 10.1155/2017/373620
Fator de Impacto 3.4. Percentil 70%
5.2 ARTIGO 02 – Publicado - Immune Response to Human Papillomavirus One
Year after Prophylactic Vaccination with AS04-Adjuvanted HPV-16/18 Vaccine: HPV-Specific IgG and IgA Antibodies in the Circulation and the Cervix. Ferreira
Costa AP, Gonçalves AK, Machado PRL, Souza LBFC, Sarmento A, Cobucci RNO, Giraldo PC, Witkin SS. Asian Pac J Cancer Prev. 2018 Aug 24;19(8):2313-2317
Fator de Impacto 2.5. Percentil 56%
5.3 ARTIGO 03 - PLOS ONE - Cross-protective IgG and IgA antibodies against HPV16/18 for non-oncogenic HPV.
ARTIGO 3
CROSS-PROTECTIVE IGG AND IGA ANTIBODIES AGAINST HPV16/18 FOR NON-ONCOGENIC HPV
Ana Paula Ferreira Costa1, Ricardo Ney Cobucci2, Márcia Lopes Consolaro3, Paula Renata Machado4, Rand Randall Martins5, Paulo César Giraldo6, Ana Katherine Gonçalves1,7*.
1) Postgraduate Program in Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil.
2) Department of Gynecology and Obstetrics, Potiguar University, Natal, Brazil. 3) Section of Clinical Cytology, Department of Clinical Analysis and Biomedicine,
Universidade Estadual de Maringa, Maringa-PR, Brazil
4) Department of Clinical Analysis and Toxicology, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil.
5) Department of Pharmacy, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil. 6) Department of Gynecology, and Obstetrics, State University of Campinas,
Campinas, Brazil.
7) Department of Gynecology, and Obstetrics, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil.
Corresponding Author:
Ana Katherine Gonçalves
Address: Major Laurentino de Morais St 1218/1301. Natal -RN, Brazil, Zip code 59020-390, Brazil. Phone: 55-84-32224131
ABSTRACT
The interest in the immunoglobulin G/A (IgG/IgA) antibodies has increased greatly since human papillomavirus (HPV) vaccines have become available worldwide. The aim of the study was to describe the course of IgG/IgA immune response in women immunized with bivalent vaccine and in non-vaccinated with HPV infection, besides evaluated the cross-protection against non-vaccine HPV types. Serum and cervical mucus samples were collected to detection IgG/IgA anti-HPV/VLP (Virus-like Particles) by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The anti-HPV-IgG in immunized serum was higher (p <0.01), while anti-HPV-IgA was detected in cervical mucus of virus-infected (p <0.01). Our analyses also provide additional evidence for cross-protective effi cacy of the HPV-16/18 vaccine against HPV-82, -6, -11, -13, -61, -72 and -74. The IgA antibodies in unvaccinated women characterized as a possible transudation of the systemic circulation to the cervical mucosa. IgG is a long-term response to any viral infection; thus, the IgG proves the efficacy of the bivalent vaccine by protecting against HPV infection. The cross-protective efficacy might provide substantial additional protection against cervical cancer over and above that achieved by efficacy against HPV-16/18.
KEY-WORDS: Immunoglobulin G; Immunoglobulin A; HPV; Vaccine; Cross
INTRODUCTION
Cervical intraepithelial lesions (CIN) and cervical cancer are caused by persistent viral infection with high-risk HPV (HR-HPV) 16/18 which cause 70% of all cervical cancers and types 31, 33, 45, 52, and 58 that cause 20%, while the low-risk HPV (LR-HPV) genotypes, like 6 and 11 cause approximately 90% of anogenital warts [1 - 3].
Safe and highly protective HPV bivalent, quadrivalent and nonavalent vaccines, are currently registered and commercially available and comprise virus-like particles (VLP), which are noninfectious entities with similar structure of the HPV envelop [4]. HPV vaccines stimulate a humoral immune response by exposing the system to VLPs, generating high neutralizing antibody titers 100 times higher than those occurring in natural infections [5].
Additionally, cross-protection is currently a strong focus of research against non-vaccine oncogenic HPV types. Studies indicate that the bivalent non-vaccine, at first, generates a broader cross-protection response against HPV types 6, 11, 31, 33, 39, 45, and 51 [6]. It has been shown that the bivalent HPV-16/18 vaccine induces the production of neutralizing immunoglobulin G / A (IgG / IgA) antibodies, which in turn play an important role in protecting against the HPV [7, 8].
No immune parameter or antibody concentration that correlates with protection has yet been defined. Although HPV-specific antibody levels in response to HPV infection or vaccination have been described previously [9], information on the cervical and serum immune response between HPV-infected women and women immunized with a bivalent vaccine may answer questions in the literature about how local and systemic immune responses occur [10].
This study was designed to describe the course of IgG/IgA antibody responses in cervical secretions and serum of women infected by HPV versus women immunized
with bivalent vaccine (CEVARIX; GlaxoSmithKline Vaccines ®), without HPV, besides, to describe the presence of antibodies against other HPV type in women infected.
MATERIALS AND METHODS Study population
For this cross-sectional study, the cervical and serum samples used were obtained between August 2018 until February 2019 at general gynecologic outpatient clinics. In this descriptive exploratory study, we enrolled a total of 84 women, among them 49 proven to be infected with HPV detected in the DNA test, but not vaccinated and 35 without infection that received 3 doses of the bivalent HPV-16/18 AS04-adjuvanted vaccine (CEVARIX; GlaxoSmithKline Vaccines ®). The women's age ranged from 18 to 35 years. All women were informed about the methods and objectives of the research and signed an informed consent form. The study was approved by the institutional Ethical Committee in Research (1.255.691/2015).
The women included in this study were divided into two patient groups:
◊ Group of healthy, vaccinated and without intraepithelial lesion women - 35 patients (HPV-DNA-negative)
◊ Group of unvaccinated women with HPV-induced intraepithelial lesion - 49 patients (HPV-DNA-positive)
To be eligible for the study, the vaccinated group had to have received 3 doses of the HPV-16/18 vaccine (at months 0, 1, and 6) and negative HPV detection. To the unvaccinated group the inclusion criteria were present positive biopsy for intraepithelial lesion and positive HPV detection. The exclusion criteria for both group were as follows: (1) any immunodeficiency, chronic illness, or treatment that could interfere with the immune response against HPV virus (2) known systemic hypersensitivity to any
components of the trial vaccine; (3) receipt of any other vaccine within 4 weeks; (4) menopausal status; (5) pregnant or breastfeeding and (6) administration of immunoglobulins or blood products within 3 months before blood sampling.
The selected women were evaluated by a standardized questionnaire about age, sexual behavior and ethnicity. Blood and cervical mucus sample were always collected simultaneously. The cervical samples were obtained using a cytobrush for optimal collection of exfoliated cells, which was collected from each participant and the collection brush was placed in a tube containing PBS. The tube was kept at -20 °C until processing for genomic DNA extraction.
HPV detection and genotyping
Genomic DNA was extracted and purified with the AxyPrep™ Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit (Axygen, CA, USA®) according to the manufacturer’s instructions. HPV polymerase chain reaction (PCR) amplification was carried out using primers MY09 (5′-CGTCCMAARGGAWACTGATC-3′) and MY11 (5′-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3′) primers as described elsewhere [11]. The PCR product was electrophoresed on a 1.5 % agarose gel, stained with 1 μg/mL ethidium bromide, and photodocumented under UV light (approximately 450 bp). The samples that gave a positive PCR result were further analyzed by HPV genotyping. Co-amplification of the human β-globin gene was performed as an internal control using primers GH20 (5′-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3′) and PC04 (5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′) under the same conditions as the HPV-PCR. Two types of controls were also included in each reaction series: ‘no-DNA’ (negative control) and ‘HPV-positive DNA’ (positive control).
HPV-positive samples were genotyped using a RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) as described previously [12]. 10 μg/mL of each PCR sample were digested with the restriction enzyme HpyCH4V (New England Biolabs, Ipswich,
MA, USA) according to the manufacturer's instructions. The genotyping was resolved on 8% polyacrylamide gels and were determined by analyzing each band with Labimage 1D software (Loccus Biotechnology, São Paulo, Brazil), and comparison of the molecular weights determined the genotypes following carcinogenic potential: HR-HPV, UR-HPV (undetermined-risk-HPV) and LR-HPV. The following types were determined for this genotyping method: HR (-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 and 82), undetermined risk (UR 26) and LR (6, 11, -30, -34, -40, -42, -43, -44, -54, -55, -61, -62, -64, -67, -69, -70, -72, -74, -81, -83, -84 and -91) (International Agency for Research on Cancer-IARC).
IgA and IgG anti-HPV-VLP detection by ELISA
Initially details of the antigen preparation have been described previously [7]. A plate of 96 wells was sensitized with 50 μL of antigen (HPV-16/18 vaccine) diluted in carbonate-bicarbonate buffer (Sigma-Aldrich) at a concentration of 10 μg/mL and incubated at 4ºC for overnight. The plate was then washed three times with PBS-Tween 0.05% and blocked with 100μL of PBS with 10% of fetal bovine serum (FBS-Gibco) (PBS-FBS). Next step it was incubated for 2h at room temperature and washed three times with PBS-Tween 0.05%.
Cervical mucus and serum samples were diluted 1:100, 1:1,000, 1:10,.000, 1:100,000, 1:1.000,000 and 1:10, 1:100, 1:1,000, 1:10,000, 1:100,000, respectively in PBS-FBS, and 50μL of this dilution was added to each well. Following this, the samples were incubated for 2h at 37oC, and the plate was washed three times with PBS-Tween
0.05%. Next, secondary antibody (peroxidase-labeled anti-human IgG or IgA; Sigma-Aldrich) was diluted 1:10,000 in FBS 10%, and 50 μL was added to the wells and incubated for 1h at 37ºC. After this, the plate was washed five times with PBS-Tween 0.05% and then 50 μL of substrate TMB (3,3´,5,5´-Tetramethylbenzidine Liquid
Substrate System; Sigma-Aldrich) was added to the wells before incubating for 30 min at room temperature. The reaction was stopped with 50 μL of 1N sulfuric acid, and the absorbance (optical density) of each well was read using an ELISA reader at 450 nm with a reference filter of 630 nm. The cutoff values was established from the ROC curve [5] and for each antibody/sample were as follows: IgG/serum, 0.616; IgG/mucus, 0.611; IgA/serum, 0.173; and IgA/mucus, 0.294.
Statistical Analysis
Statistical analysis was performed with Stata 11 (Stata Corporation, College Station, TX, USA). The socio-demographic, clinical and different HPV genotype characteristics in the vaccinated and unvaccinated women groups were described in relative and absolute frequency. For comparison between groups, Pearson's chi-square test was used and P values <0.05 were considered significant. In serum and mucus samples, mean absorbance values of IgG and IgA between HPV genotypes 16/18, 82, 6/11 and 13/61/72/74 were compared by analysis of variance followed by the post-test tukey (p <0.05). To analyze the effect of vaccination on immunoglobulin concentration at different dilutions, linear regression of random effects was used. Serum and mucus immunoglobulin concentration was considered the dependent variable, dilution as a fixed effect independent variable, and intraindividual variability is the random component of the model (p <0.05).
RESULTS
We enrolled a total of 84 patients divided into two groups, vaccinated (non-infected) and unvaccinated ((non-infected) women. HPV infection was observed in 58.3% (49/84) of patients.
The ELISA assay for HPV-VLP (HPV-VLPs ELISA) was performed. It was observed that 100% of serum and mucus samples from both groups were positive for
IgG / IgA antibodies when antigen was present. Positivity, however, decreases according to dilutions (Figure 1A/B).
The median absorbance detected in serum samples for anti-HPV-IgG antibodies were significantly higher in vaccinated women compared to unvaccinated women at 1:100, 1:1.000, 1:10.000, 1:100.000 and 1:1.000.000 dilutions, presenting statistical significance (P <0.01). In relation to anti-HPV-IgA antibodies in serum, there was no significant correlation between the groups (P = 0.38) (Figure 1A).
In the detection of anti-HPV-IgA, the median absorbance in cervical mucus samples were statistically higher in unvaccinated compared to vaccinated women at 1:100, 1:1.000, 1:10.000, 1:100.000 and 1:1.000.000 dilutions (P<0.01), while the absorbance detected for anti-HPV-IgG under the same dilution conditions were not statistically significant (P = 0.96) (Figure 1B).
Of the 84 women studied for HPV DNA, 58.3% (49/84), unvaccinated group, were positive for an HPV genotype and 41.6% (35/84), vaccinated group, were negative for HPV DNA. All HPV-positive samples were typed by RFLP. A total of 49 HPV DNA were detected, with 9 different genotypes. The overall frequency of HR and LR HPV types has showed in Table 01.
Naturally acquired anti-HPV IgG / IgA specific antibodies against a single HPV type were analyzed using ANOVA, although without statistically significant, a total of 41% (13/32) showed high concentrations of serum IgG antibodies to HPV16. 66% (2/3) for HPV18, 83% (5/6) for HPV6 and the other types such as HPV82/6/11/61/72/74 had positivity above 50% (Figure 2A). The percentages of mucus IgG detection were 44% (14/32) and above 50% for HPV 6 and 74 (Figure 2B). The IgA antibody positivity in serum was 31.2% (10/32) for HPV16 and 50% for HPV6 and 72 (Figure 2C). Regarding mucus IgA, positivity was 28% (9/32) for HPV16 and 33% for HPV6 (Figure 2D).
DISCUSSION
The presence of anti-HPV-IgG/IgA antibodies were observed in this study. High anti-HPV-IgG levels in serum and cervical mucus from both groups were detected. However, IgG antibodies were statistically significant in the serum of vaccinated women. The presence of IgG antibodies is strongly associated with the fact that HPV-16/18 AS04-adjuvanted vaccine improves the humoral immune response by inducing a polyclonal anti-HPV-IgG antibody response, providing protection against cervical HPV infections [13]. Similar to previous studies [14. 15], the immune response detected after immunization indicates that antibodies exhibit strong neutralizing activity.
The anti-HPV-IgA antibody levels were lower than IgG antibody, however, in cervical mucus samples of unvaccinated group, a statistical significance was observed. It is noted by Monroy et al. [16], that after natural infection, anti-HPV-IgA antibodies are detectable in the cervix, especially in persistent HPV infections. IgA's role in mucosal immunity neutralizes intracellular viruses [7], often preventing viral particles from infecting the cervical basal cell layer in the transformation zone [13]. Despite low levels, the IgA detection can be due a possible transudation of the systemic circulation to the cervical mucosa, contributing to a protective environment in the cervix [17]. On the other hand, low antibody levels in cervical mucus may be due to the shorter half-life of IgA as compared with IgG at this site and the longer time required for antibody formation [5], suggesting that antibody development following a natural infection can be a slow process and does not necessarily occur in all women [18]
Natural immunity to HPV is not as protective as vaccination [19]. Natural antibody levels are considerably lower than those observed in vaccination. Although the minimum antibody titer required for protection is not defined, recent studies [20, 21] have shown that anti-HPV antibodies acquired by natural infection provide
protection as long as naturally acquired titers are high. Vaccination is not effective in patients with prevalent HPV infection, but the possible therapeutic benefit of the licensed HPV vaccines in reducing recurrent lesions in previously infected persons has been studied [22 - 24]. The antibodies evoked by HPV vaccination during the follow-up post treatment for HPV-linked disease is recommended to reduce the risk of reactivation/re-infection or a new HPV infection, without adverse events or adverse reactions [23, 24].
The effector mechanism of the bivalent vaccine was mainly associated with a humoral response, as well as, providing greater cross-protection over other HPV types [25]. The cross-protection of the HPV-16/18 vaccine was observed by Wheeler et al. [26] and Jenkins et al. [27]. against persistent HPV-33, -31, -45, -51 and -52 associated infection, as well as highlighting a possible prophylactic effect against new infections and lesions. Although our study addresses other types of HPV (81, 6, 11, 13, 61, 72, and 74), the presence of antibodies can be explained due the effectiveness of cross-protection may differ across populations.
In conclusion, the introduction of HPV vaccination may be necessary to increase antibody titers and to reduce the risk of HPV infection. The high levels of IgG prove the efficacy of the bivalent vaccine by protecting against infection. Overall, we anticipate that there is a cross-protective efficacy to HPV 82, 6, 11, 13, 61, 72 and 74 exist might provide substantial additional protection against cervical cancer and low grade intraepithelial lesion over and above that achieved by HPV-16/18. Although further studies on the subject are needed, it can be argued that these immune mechanisms contribute and may provide protection against HPV.
ACKNOWLEDGMENT
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Table 01: The frequency of HPV genotypes, including high-risk (HR) and low-risk (LR) in HPV DNA-positive women. HPV genotype Frequency n % HR 16 32 88.8 18 3 8.3 82 1 2.7 Total HR 36 100 LR 6 7 53.8 11 1 7.6 13 1 7.6 61 1 7.6 72 2 15.3 74 1 7.6 Total LR 13 100
Total HPV DNA detected 49 100
Figure 2: Absorbance of anti-HPV-IgG / IgA antibodies in serum and cervical mucus induced by HPV infection. A / B: IgG/IgA titers in serum samples. C/D: IgG / IgA Titers in cervical mucus samples.
5.4 OUTRAS PUBLICAÇÕES
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5.5 CAPÍTULOS DE LIVROS – PUBLICADOS
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APÊNDICE A – Termo de Consentimento Livre Esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO - (TCLE) Esclarecimentos
Este é um convite para você participar da pesquisa: “SIGNIFICADO CLÍNICO DA
PRESENÇA DE ANTICORPOS E PROLIFERAÇÃO CELULAR EM MULHERES INFECTADAS PELO PAPILOMA VÍRUS HUMANO”, que tem como orientadora
Professora Doutora Ana Katherine da Silveira Gonçalves. Esta pesquisa pretende estimar o significado clínico e valor prognóstico dos anticorpos anti-HPV e proliferação celular no soro sanguíneo.
O motivo que nos leva a fazer este estudo é averiguar o real valor preventivo da vacinação em relação à infecção pelo HPV e, principalmente, ao desenvolvimento do câncer cervical, ainda prevalente na população feminina sendo uma importante causa de morte por câncer entre as mulheres.
Caso você decida aceitar o convite, será solicitada os dados gerais do participante bem como, a coleta de sangue e material cérvico vaginal, para a realização dos exames de detecção molecular do HPV, quantificação das citocinas e determinação dos níveis de anticorpos anti-HPV. As medidas e os exames laboratoriais são muito importantes, auxiliando na detecção de sinais precoces de risco às doenças virais. A coleta de dados e das amostras será realizada pela pesquisadora responsável Ana Paula Ferreira Costa, em uma sala destinada na Maternidade Escola Januário Cicco, com duração de 40 minutos aproximadamente.
Há chances de exposição das informações e perda das amostras. Para minimizar tais riscos, as amostras de sangue serão acondicionadas em um refrigerador entre 2 a 8ºC do Laboratório de Pesquisa em Imunopatologias do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte até o momento das análises. Além disso, a identificação dos pacientes nas amostras será feita mediante o uso de códigos com letras e números, remetendo ao tipo de amostra, técnica para processá-la. Ademais, apenas 1 pesquisador terá acesso aos nomes dos pacientes, sendo este responsável por organizar e identificar as amostras, bem como analisá-las.
Dessa forma, os resultados encontrados nesse estudo constituirão uma prévia fundamental para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e ferramentas prognósticas aos indivíduos infectados pelo vírus.
