Interações de polissacarídeos sulfatados da macroalga marinha Caulerpa cupressoides var. flabellata com cristais de oxalato de cálcio

Texto

(1)MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. INTERAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA MACROALGA MARINHA Caulerpa cupressoides var. flabellata COM CRISTAIS DE OXALATO DE CÁLCIO. DAYANNE LOPES GOMES. NATAL/RN 2017.

(2) DAYANNE LOPES GOMES. INTERAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA MACROALGA MARINHA Caulerpa cupressoides var. flabellata COM CRISTAIS DE OXALATO DE CÁLCIO. Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde.. Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de O. Rocha. NATAL/RN 2017.

(3) Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS Gomes, Dayanne Lopes. Interações de polissacarídeos sulfatados da macroalga marinha Caulerpa cupressoides var. flabellata com cristais de oxalato de cálcio / Dayanne Lopes Gomes. - Natal, 2017. 98f.: il. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha. 1. Urolitíase - Tese. 2. Alga verde - Tese. 3. Estabilização em COD - Tese. 4. COD haleteres - tese. I. Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira. II. Título. RN/UF/BS-CCS. CDU 616.62-003.7.

(4) MINISTÉRIO DA EDUCAÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde:. Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito. i.

(5) DAYANNE LOPES GOMES. INTERAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA MACROALGA MARINHA Caulerpa cupressoides var. flabellata COM CRISTAIS DE OXALATO DE CÁLCIO. Aprovada em: 20 / 07 / 2017. Banca Examinadora:. Presidente da Banca: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha. Membros da Banca Profa. Dra. Julliane Tamara Araújo de Melo Profa. Dra. Vanessa de Paula Soares Rachetti Profa. Dra. Heryka Myrna Maia Ramalho Profa. Dra. Luciana Nunes Menoli Lanza. ii.

(6) Dedico esta obra. A Deus. Obrigada por me abençoar muito mais do que mereço. Quando deixei de olhar tão ansiosamente para o que me faltava e passei a olhar com gentileza para o que eu tinha, descobri que, de verdade, há muito mais a agradecer do que a pedir.. Aos meus pais. Os maiores incentivadores! Papi Soberano (Zeca) e Mami Poderosa (Célia), os apelidos retratam a figura grandiosa que vocês representam na minha vida e agradeço à Deus por tê-los em meu convívio me vendo e me ajudando a trilhar meus caminhos. Quando falamos de herança, legado, futuro, percebo e reconheço isso porque vocês me fizeram enxergar que nenhuma herança é capaz de superar o valor da educação.. iii.

(7) Dedico esta obra. Aos meus filhos. Minha força, meu estímulo, minha superação, minha vida. Helena, Heitor e Heloisa: com vocês aprendo a todo instante, e desses aprendizados o maior deles é saber que eu sempre posso mais.. A Hugo Rocha (Profi), Minha enorme gratidão por todos esses anos de orientação. Agradeço pela dedicação, paciência e, principalmente, pela amizade ao longo desses 11 anos de convivência. Construímos uma relação de muita confiaça e carinho que sei que jamais se apagará. “Vivemos com o que recebemos, mas marcamos a vida com o que damos.” Winston Churchill. iv.

(8) Agradecimentos especiais “Eu reconheço que para ti nada é impossível e que nenhum dos teus planos pode ser impedido”. Jó 42:2. Obrigada meu Deus! Aos meus pais, pelo amor incondicional. Aos meus filhos, por cada interrupção ao tentar elaborar essa tese. Vocês me fizeram valorizar muito mais essa conquista e também foram o meu refúgio onde eu renovava minhas forças e retomava a caminhada. Aos meus irmãos, Dastaev, Dmitryev, Drielle e Dmetryus. Unidos pelo sangue e inseparáveis pelo coração! Sei que posso contar com vocês sempre; Aos meus compadres e comadres, em especial França por oferecer “amor de graça” a nós e principalmente a meus filhos, se sacrificando para que eu mantenha minha jornada diária de trabalho. A minha amigan (Jailma) que tanto me ajuda na vida, você é luz, é calmaria, é inspiração. Espero ser para vocês um pouco do que são para mim; Ao meu esposo Leonardo, pelo companheirismo e paciência. Estando lado a lado, ou a quilômetros de distância, mas sempre concetados a nossa família pelo amor; A toda família Rocha de Medeiros, em especial minha sogra Ceiça, que sempre exaltou a importância das conquistas acadêmicas; Obrigada a todos àqueles do laboratório que fazem ou que já fizeram parte desta história... Jailma (Amigan), Mariana, Sara, Karol, Cinthia, Leandro, Diego (Popó), Leonardo Nobre, Ruth, Rafael, Gabriel, Moacir, Talita, Jefferson, Maíra, Polyana, Sr. Paulo, Raniere, Joanna, Letícia, Kaline, Arthur, Vinicius, Max, Rony, Marília, Monique, Larisse, Mônica, Pablo, Danielle, Almino, Jéssica, Cinthya, Raynara, Adriana, Lucas, Carla, Fernanda (Pôia), Profa. Fabiana, Ana Karina, Ana Karinne (Donana), Fernando, Ivan, Nednaldo, Duda, Edjane, Valquíria. Agradeço de forma especial aos amigos do grupo dos cristais: Kerol, Momoxi, Luquete, Pablito, Rafildo. Vocês são top de line! À UFRN, à Pós-Graduação em Ciências da Saúde e ao Departamento de Bioquímica pela oportunidade de concluir esse curso de Pós-Graduação, assim como as agências Financiadoras CAPES e CNPq. A todos os professores do CCS (UFRN), aos coordenadores e equipe do Programa de Pós-Graduação (PPGCSa). A todos os professores do DBQ (UFRN), em especial, a Profa. Edda Lisboa Leite por ser grande incentivadora e referência pessoal e profissional. Também aos técnicos do DBQ (UFRN), em especial a Ana Katarina e Francisco Freire pelo apoio direto. As professoras da banca de qualificação: Profa. Joana Cristina Tavares e Profa. Ariane Lacerda. Agradeço novamente ao meu orientador Prof. Dr. Hugo Rocha por toda disponibilidade e tempo dispendido nesse trabalho.. Obrigada a todos! v.

(9) “Não é sobre chegar no topo do mundo E saber que venceu É sobre escalar e sentir Que o caminho te fortaleceu”. (Ana Vilela). vi.

(10) RESUMO A urolitíase afeta aproximadamente 10% da população mundial e está associada fortemente a formação de cristais de oxalato de cálcio (CaOx). Atualmente não existe nenhum composto eficiente que possa ser utilizado para prevenir esta doença. No entanto, os polissacarídeos sulfatados (PS) de algas possuem a capacidade de alterar a carga superficial dos cristais de CaOx e assim modificar a dinâmica da cristalização, devido à interação das cargas negativas desse polímero com a superfície do cristal durante sua síntese. Nestre trabalho foi verificado o efeito de quatro populações de PS extraídos da alga verde Caulerpa cupressoides var. flabellata na formação de cristais de CaOx in vitro. Os PS extraídos foram nomeados de CCB-F0.3, CCB-F0.5, CCB-F1.0 e CCB-F2.0. Análises de microscopia eletrônica de varredura e de potencial zeta mostraram que os polissacarídeos extraídos modificam a morfologia, o tamanho e a carga superficial dos cristais de CaOx formados na presença dos PS. Todos os PS de C. cupressoides induziram o aumento da quantidade de cristais CaOx formados. Contudo, com exceção de CCB-F2.0, a presença dos demais PS levou à formação de cristais de CaOx dihidratados (COD), que são comuns em pessoas não formadoras de cálculos. Além disso, esses cristais COD apresentaram morfologia arredondada ou em formato de halteres. As análises de infravermelho, miscroscopia de fluorescência, citometria de fluxo e a análise de composição atômica (EDS) permitiram a proposição de um modelo de interação entre os PS de Caulerpa e os cristais COD. Neste modelo, a distribuição de PS na estrutura do cristal de CaOx ideal para que haja maior estabilização dos cristais COD é de 2:1:1 entre a base: ápice: face. Acredita-se que nessa distribuição os PS consigam evitar a desidratação dos cristais COD, tornandoos mais estáveis. Este estudo é o primeiro passo para entender as interações entre PS de C. cupressoides e os cristais de CaOx, que são a principal causa de cálculos renais.. Palavras-chave. Urolitíase; alga verde; COD halteres; Estabilização em COD.. vii.

(11) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ANOVA. Análise de Variância. BIOPOL. Laboratório de biotecnologia de polímeros naturais. ºC. Graus Celsius. Ca2+. Cálcio. CaOx. Oxalato de cálcio. COD. Cristal de CaOx Dihidratado. COM. Cristal de CaOx Monohidratado. COT. Cristal de CaOx Trihidratado. CCB-F0.3 Polissacarídeo precipitado com 0,3 volumes de acetona CCB-F0.5 Polissacarídeo precipitado com 0,5 volumes de acetona CCB-F1.0 Polissacarídeo precipitado com 1,0 volumes de acetona CCB-F2.0 Polissacarídeo precipitado com 2,0 volumes de acetona ERPS. Extrato Rico em Polissacarídeos Sulfatados. EDS. Espectroscopia de energia dispersiva. FITC. Isotiocianato de fluoresceína. g. Grama. GAGs. Glicosaminoglicanos. h. hora. Hz. Hertz de frequência. kV. quilovolts. L. Litros. M. Molar. MEV. Microscópio eletrônico de varredura. mg. Miligrama. Min.. Minutos. mL. Mililitros. mM. Milimolar. pH. Potencial de hidrogênio. IV. Infravermelho. MEV. Microscopia Eletrônica de Varredura. PBS. Tampão salino-fosfato. PS. Polissacarídeo (s) Sulfatado (s). rpm. Rotações por minuto. viii.

(12) LISTA DE FIGURAS. Figura 01. Prevalência Mundial da Urolitíase.............................................................. 13. Figura 02. Alga verde Caulerpa cupressoides var. flabellata em exsicata (Foto: Mariana Santana)....................................................................................... 19. ix.

(13) SUMÁRIO RESUMO................................................................................................................................... LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS................................................................................... LISTA DE FIGURAS................................................................................................................... viii ix x. 1. INTRODUÇÃO........................................................................................................................ 12. 2. JUSTIFICATIVA..................................................................................................................... 17. 3. OBJETIVOS........................................................................................................................... 3.1. GERAL................................................................................................................... 3.2. ESPECÍFICOS........................................................................................................ 18 18 18. 4. MÉTODOS............................................................................................................................. 4.1. MATERIAL BIOLÓGICO........................................................................................ 4.1.1. Algas....................................................................................................... 4.2. EXTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA C. cupressoides...... 4.2.1. Obtenção de Extratos Ricos em Polissacarídeos Sulfatados (ERPS)... 4.2.2. Fracionamento do ERPS com concentrações crescentes de acetona... 4.3. SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DOS CRISTAIS................................................ 4.3.1. Ensaio de cristalização de CaOx............................................................ 4.3.2. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Espectroscopia de Energia Dispersiva (EDS)..................................................................... 4.3.3. Medida do Potencial Zeta (ζ) dos cristais de CaOx............................... 4.3.4. Espectroscopia de infravermelho........................................................... 4.3.5. Microscopia de fluorescência para análise da morfologia dos cristais de CaOx................................................................................................ 4.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA......................................................................................... 19 19 19 19 19 20 21 21. 5. ARTIGOS PRODUZIDOS...................................................................................................... 5.1. ARTIGO 1 (SUBMETIDO)...................................................................................... 5.2. ARTIGO 2................................................................................................................ 24 25 57. 6. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES....................................................................... 76. 7. REFERÊNCIAS...................................................................................................................... 78. 8. APÊNDICES 8.1. ARTIGO 3............................................................................................................... 8.2. ARTIGO 4............................................................................................................... 8.3. ARTIGO 5............................................................................................................... 8.4. ARTIGO 6................................................................................................................ 82 84 86 88. 9. ANEXOS 9.1. NORMAS PARA FORMATAÇÃO DA TESE (CCS)............................................... 9.2. NORMAS DA REVISTA PARA SUBMISSÃO (OXIDATIVE MEDICINE AND CELLULAR LONGEVITY)..................................................................................... x. 21 22 22 22 23. 91 94.

(14) 12 1. INTRODUÇÃO Os rins sãos os órgãos responsáveis pela filtração do plasma, esse é um processo que ocorre de forma permanente e em grande escala (180 L/dia). Nesse processo, muitos íons e outras moléculas pequenas vão passar pelos túbulos renais. Porém, além da alta taxa de filtração, também ocorre uma intensa reabsorção de moléculas, levando à excreção de apenas algo entre 1 e 1,5 L [1]. Nesse contexto, os íons presentes na urina ficam supersaturados. Alguns desses íons tendem a interagir com outros e formar sais insolúveis, um processo comum e natural a todos os indivíduos [2,3]. Esses sais insolúveis vão se associando de forma lenta, e o produto desta associação vai absorvendo cada vez mais íons da solução, o que culmina com o surgimento de estruturas cristalinas em escala nanométrica [4]. A interação entre as cargas dessas nanoestruturas faz com que elas se atraiam e se agreguem, sendo essa agregação uma segunda forma de crescimento de cristais, caracterizada pela rápida deposição de íons e associação a matrizes orgânicas presentes no trato urinário, fazendo com que a estrutura orgânica/inorgânica formada passe a ser chamada de cálculo renal ou urolitíase [5]. Do ponto de vista epidemiológico, o cálculo renal atinge cerca de 10% da população mundial, com maior prevalência nos Estados Unidos [6]. A maior incidência de cálculo renal ocorre em homens, entre 20 e 60 anos de idade e tem uma altíssima taxa de recorrência após a primeira crise renal do paciente [7]. Por acometer uma grande parte da população, a urolitíase gera um grande impacto na economia e, somente no ano de 2010, os custos associados ao tratamento hospitalar da urolitíase no sistema público de saúde brasileiro chegaram a 29,2 milhões no Brasil. Além do alto custo relativo às complicações que a urolitíase pode gerar, existe o impacto econômico direto por acometer uma faixa de idade economicamente ativa (20 aos 60 anos) [8]. Do ponto de vista clínico, estes cálculos podem causar dor suprapúbica, na glande do pênis, disúria, hematúria, jato de urina fraco e entrecortado, dentre outros. Atualmente, o recurso mais utilizado diante de uma crise renal causada pelo cálculo é a analgesia. Já o tratamento tradicional se baseia na eliminação de forma espontânea do cálculo, ou ainda procedimentos mais invasivos e com grau de risco mais crítico, como o cirúrgico tradicional ou bombardeamento a. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(15) 13 laser [9]. Nota-se que mesmo com todos os avanços recentes na medicina ainda não existe um tratamento realmente eficaz para impedir o surgimento dos cálculos renais [10].. Figura 01. Prevalência Mundial da Urolitíase. Em vermelho, destacam-se as prevalências de cálculos renais. Em amarelo, destacam-se o crescimento no número de pessoas com cálculos, principalmente de Oxalato de Cálcio [6].. O estágio de formação dos cálculos que consiste na interação inicial dos íons e na formação das nanoestruturas é chamado de nucleação, pois forma o que virá a ser um núcleo de crescimento do cristal. Esse núcleo formado serve como arcabouço para agregação de íons e moléculas e/ou macromoléculas, que vão levar ao crescimento dos cristais. Existem dois destinos possíveis para esse núcleo formado: ele pode ser eliminado naturalmente ou pode crescer e agregar mais cristais, íons e moléculas orgânicas, formando os cálculos renais [11]. Se ele seguir o segundo caminho, o próximo passo para a formação de cristais é denominado de agregação, que consiste na união de dois ou mais núcleos entre si. Essa agregação resulta em cristais grandes e pesados que podem se precipitar e crescer cada vez mais [12]. Apesar da existência de um mecanismo de formação quase comum a todos os cálculos, estes podem ser formados a partir de diversos componentes como: oxalato de cálcio, fosfato de cálcio, ácido úrico, cistina [10] e cristais derivados de infecção, como estruvita e carbonato de hapatita, além dos cristais mistos [13]. Apesar dessa grande variedade, mais de 70% dos casos de urolitíase são formados principalmente por cristais de oxalato de cálcio (CaOx) [14]. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(16) 14 Três tipos de cristais de CaOx podem ser formados no tecido renal, os cristais de CaOx monohidratados (COM), dihidratados (COD) e trihidratados (COT) [15]. Devido à supersaturação urinária, naturalmente os três tipos de cristais de CaOx se formam em todas pessoas. COD e COT são instáveis e tem uma tendência a se converter em COM, que é o cristal mais estável e o principal cristal detectado na urina de pacientes formadores de cálculos. Porém, em pacientes assintomáticos, o cristal mais encontrado na urina é o cristal do tipo COD [4]. Uma das hipóteses que mostra o papel dos cristais de CaOx na formação dos cálculos renais relata que o COM possui uma carga positiva, que lhes permite interagir com moléculas carregadas negativamente encontradas na superfície celular do epitélio renal, o que leva a sua adesão à superfície da célula e, por conseguinte, endocitose. A presença desses cristais dentro do citoplasma celular provoca estresse oxidativo e lesão celular. Um dos resultados desse processo. é. a. peroxidação. lipídica. da. superfície. celular,. o. que,. consequentemente, provoca a perda de várias moléculas do glicocálice. Este acontecimento é fundamental para a formação de cálculos renais, pois partes dessas moléculas do glicocálice que são perdidas tem como função impedir a interação/adesão de cristais de CaOx com as células. Ou seja, esta perda de glicocálice permitirá que mais cristais COM se depositem na superfície, não sejam endocitados e cresçam. Alguns desses cristais vão se combinando entre si e com outras moléculas para formar cálculos renais, que levam a dano físico no epitélio e lesão [16, 17]. Uma alternativa interessante para a prevenção da recorrência dos casos de urolitíase seria o uso de alimentos ou suplementos que pudessem inibir profilaticamente a formação de cristais [18]. Nessa perspectiva, inserem-se os glicosaminoglicanos. (GAGs),. que. são. polissacarídeos. sulfatados. (PS). encontrados nos tecidos, em sua maioria ligados covalentemente a proteínas, formando os proteoglicanos [19]. No trato urinário, os proteoglicanos da superfície celular são constituídos de moléculas grandes de GAGs que, por serem negativamente carregadas, interagem com os cristais de CaOx. Isto impede a endocitose desses cristais, como também leva à estabilização do cristal na forma COD. Acredita-se que estes cristais associados aos GAGs. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(17) 15 cresçam até um ponto em que o complexo cristal-fragmento de GAG se solte do proteoglicano e, consequentemente, da superfície celular. Uma vez solto, o fragmento do GAG ainda age como estabilizador do cristal, o que justificaria a presença de cristais COD na urina [20]. Apesar desse papel benéfico, o uso dessas moléculas como tratamento apresenta uma série de contraindicações, tais como: i) a sua obtenção a partir de tecido animal, o que implica em alto custo, baixo rendimento e risco de contaminação do paciente; ii) inúmeras atividades são exercidas pelos GAGs dentro do organismo, implicando numa grande chance de ocorrerem efeitos indesejados [19]. Na medicina oriental, algumas algas já são usadas no combate aos cálculos de CaOx [21]. Essas informações sugerem que as algas marinhas são uma potencial fonte de moléculas para o tratamento e prevenção de cálculos renais. Vale salientar que as macroalgas marinhas são fonte de PS e, quando comparadas a animais, as algas produzem grandes quantidades de PS. Semelhante aos GAGs, já foi mostrado que PS de algas também tendem a se associar, por atração eletrostática, às porções positivamente carregadas dos cristais de CaOx em formação, alterando seu padrão de crescimento [22]. Ao longo da última década, foi crescente o número de estudos que avaliou atividade inibidora da formação de cristais de CaOx por PS, especialmente os de algas marinhas [23]. Tanto Zhang e colaboradores (2012) [24] quanto Melo e colaboradores (2013) [25], trabalharam com PS de diferentes algas marrons e obtiveram resultados semelhantes. Zhang e colaboradores trabalharam com um extrato bruto da alga Sargassum graminifolium e foi capaz de inibir nucleação e agregação dos cristais de CaOx in vitro. Ainda, os cristais obtidos tinham morfologia mais arredondada e eram mais estáveis. Já Melo e colaboradores (2013) trabalharam com 4 polissacarídeos purificados da alga Dictyopteris justii. Todos eles foram capazes de inibir o crescimento e a agregação de cristais de CaOx, com destaque para uma glucana sulfatada que também foi capaz de estabilizar cristais do tipo COD. Nos dois trabalhos, o mecanismo de ação dos PS foi semelhante ao observado nos GAGs: interação com o cristal, alteração da carga superficial e estabilização de formas mais estáveis e menos propensas a causar dano.. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(18) 16 Outro grupo de pesquisadores busca correlacionar esse efeito inibidor da formação de cristais de CaOx [26, 27] ou de proteção do epitélio renal contra os danos causados por esses cristais [28] com a quantidade de grupamentos sulfatos existentes nos PS, já que na maioria dos casos são esses grupamentos que conferem a carga negativa do polímero. Por exemplo, PS com baixa massa molecular e diferentes conteúdos de grupamentos sulfato, extraídos de algas marrons (Undaria pinnatifida, Laminaria japonica, Sargassum fusiforme) e vermelhas (Porphyra yezoensis, Gracilaria lemaneiformis, Eucheuma) foram avaliados quando à capacidade de reparar células epiteliais tubulares proximais de rim humano (HK-2) danificadas com oxalato in vitro. Esse estudo mostrou uma correlação positiva entre o conteúdo de sulfato e atividade reparadora do epitélio renal [28]. Essa correlação corrobora com aqueles descritas para PS de algas que apresentam outras atividades biológicas. Porém, nestes estudos também é apontado que o fator mais importante para o PS ser bioativo não é só o fato dele ser sulfatado, mas sim, como estes grupos sulfatos estão distribuídos ao longo da cadeia molécula de PS [29, 30]. Além disso, os tipos de resíduos de monossacarídeos que constituem os polímeros parecem também ter influência sobre as atividades [31]. Ensaios in vivo também mostraram a importância do PS no combate à urolitíase. Veena e colaboradores trabalhando com PS extraídos da alga marrom Fucus vesiculosus mostraram que camundongos hiperoxalúricos suplementados com esses PS tiveram redução do estresse oxidativo em seus organismos, devido ao aumento da atividade das enzimas antioxidantes e consequente diminuição da peroxidação lipídica. Este efeito dos polissacarídeos por conseguinte diminuiu o acúmulo de cristais nos rins dos animais [32] Ainda não foi proposto um mecanismo completo que explique a ação dos PS de algas no processo de inibição dos cristais de CaOx [23]. Todavia, essas moléculas se mostram como uma interessante alternativa na prevenção da formação de cálculos renais e o entendimento das interações dos PS de algas com os cristais de CaOx é imprescindível para que eles possam ser utilizados na terapêutica.. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(19) 17 2. JUSTIFICATIVA O impacto causado pela urolitíase na sociedade é enorme e cada vez mais é necessário encontrar fármacos e mecanismos alternativos para que esse impacto seja reduzido. Os glicosaminoglicanos (GAGs) são polissacarídeos sulfatados (PS) que são encontrados na urina e que são tidos como agente inibidores da formação de cristais de oxalato de cálcio (CaOx). Na década de 1990, vários estudos avaliaram o efeito de GAGs exógenos na formação de cristais de CaOx [33]. Apesar dos resultados terem sido animadores, um fator importante que levou à estagnação das pesquisas: a dificuldade de se obter os GAGs em grande quantidade. Posteriormente, outros PS passaram a ser estudados com a mesma finalidade. Dentre eles, PS de algas marinhas (marrons e vermelhas) que, diferente dos GAGs, são obtidos em grande quantidade. Além disso, muitos desses PS de algas apresentam atividade antioxidante, que é uma atividade procurada em agentes utilizados no tratamento de urolitíase [24, 25, 32, 34, 35]. A alga verde Caulerpa cupressoides é encontrada em grande quantidade no litoral nordestino. Ela sintetiza quatro populações de polissacarídeos, que já foram caracterizadas pela equipe do Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais-UFRN, sob a coordenação do Prof. Dr. Hugo Rocha, e verificou-se que estes têm excelente atividade antioxidante em comparação aos PS encontrados em outras algas do litoral potiguar [30, 36]. Isso associado ao fato de que nenhuma alga verde teve seus PS avaliados como agentes inibidores da formação de cristais de CaOx, faz dessa alga uma excelente escolha para a prospecção de PS com potencial uso no tratamento da urolitiase.. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(20) 18 3. OBJETIVOS. 3.1. GERAL . Verificar o efeito dos polissacarídeos sulfatados (PS) da alga verde Caulerpa cupressoides var. flabellata na formação de cristais de oxalato de cálcio (CaOx) in vitro.. 3.2. ESPECÍFICOS  Extrair PS da alga marinha C. cupressoides utilizando uma metodologia já desenvolvida pelo nosso grupo de pesquisa;  Analisar o efeito dessas populações de PS sobre a formação de cristais in vitro;  Caracterizar os cristais de CaOx formados na presença dos PS de C. cupressoides.. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(21) 19 4. MÉTODOS 4.1.. MATERIAL BIOLÓGICO. 4.1.1. Algas. A alga marinha verde Caulerpa cupressoides var. flabellata (Figura 02) foi coletada na Praia de Búzios, município de Nísia Floresta (litoral sul do Rio Grande do Norte), no mês de março do ano de 2015, em marés baixas entre 0,0 a 0,2 metros a uma temperatura situada entre 28-30°C. As algas foram recolhidas quando já desprendidas do substrato, mas permanecendo flutuando nas águas de maré-baixa. As algas foram acondicionadas em sacos de polietileno e trazidas ao laboratório no mesmo dia da coleta e, lavadas em água corrente, examinadas cuidadosamente para remoção de epífitas, inclusões calcárias e sais, sendo postas para secar em estufa aerada a 45°C. Em seguida, foram trituradas em liquidificador, pesadas e guardadas em frascos de vidro hermeticamente fechados.. Figura 02. Alga verde Caulerpa cupressoides var. flabellata em exsicata (Foto: Mariana Santana).. 4.2.. EXTRAÇÃO. DOS. POLISSACARÍDEOS. SULFATADOS. DA. C.. cupressoides.. 4.2.1. Obtenção de Extratos Ricos em Polissacarídeos Sulfatados (ERPS). Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(22) 20 A obtenção dos ERPS da C. cupressoides seguiu o método aplicado pelo grupo pesquisa que em está inserido esta tese e, mais recentemente, utilizado por Costa e colaboradores (2010) [30] durante a obtenção de ERPS de algas do litoral potiguar. Para tanto, as algas secas e pulverizadas foram tratadas com dois volumes de etanol para despigmentação e delipidação do material. A cada saturação do álcool, que foi observada visualmente, realizava-se a troca deste reagente. Posteriormente, o resíduo foi separado do álcool, e colocado para secar à temperatura ambiente. Após seco, este material despigmentado foi utilizado para a obtenção dos ERPS. Para a realização dessa etapa, foram adicionados dois volumes de NaCl a 0,25 M ao pó delipidado (100 g) e o pH ajustado para 8,0 com NaOH. A esse material foi adicionado a enzima proteolítica prozima (15 mg/g de pó). Essa suspensão permaneceu em banhomaria a 60 °C durante um período de 18 h. Depois, foi filtrado e o sobrenadante submetido a uma centrifugação 10.000 x g por 15 minutos à temperatura de 4 °C. Após a centrifugação, o sobrenadante, que contém os polissacarídeos solúveis, foi denominado de ERPS, sendo seco à pressão reduzida, triturado, pesado e guardado para posteriores análises. 4.2.2. Fracionamento do ERPS com concentrações crescentes de acetona O sobrenadante obtido após proteólise foi fracionado com volumes crescentes de acetona. Este fracionamento foi realizado de acordo com método descrito por Costa (2012) [36]. Os valores de acetona adicionados foram determinados pela turvação da solução, que caracteriza a precipitação de polissacarídeos devido à adição desse solvente. Inicialmente, foi adicionado 0,3 volumes de acetona, sob agitação leve, volume necessário para que se visualize uma turvação da solução. Esta foi mantida em repouso a 4 ºC durante 18 h. O precipitado foi coletado por centrifugação a 8.000 x g por 15 min. a 4 ºC e seco a pressão reduzida. Em seguida, esse procedimento foi repetido utilizando-se 0.3, 0.5, 1.0 e 2.0 volumes de acetona, obtendo-se as quatro populações polissacarídicas, denominadas de CCB-F0.3, CCB-F0.5, CCB-F1.0 e CCB-F2.0, de acordo com o volume de acetona acrescentado.. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(23) 21. 4.3. SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DOS CRISTAIS 4.3.1. Ensaio de cristalização do CaOx Os cristais de CaOx podem ser formados in vitro a partir de Ca2+ e oxalato. Para tal, se mistura de cloreto de cálcio (8 mmol/L), oxalato de sódio (1 mmol/L), cloreto de sódio (200 mmol/L) e acetato de sódio (10 mmol/L), sendo as concentrações finais desta solução semelhantes às das concentrações fisiológicas da urina, quando consideradas separadamente. A formação dos cristais de CaOx foi avaliada a partir da junção dessas soluções formando um meio superconcentrado favorável à formação de cristais de CaOx. Os cristais foram formados na presença dos polissacarídeos (250 µg/mL) ou na ausência (controle) dos polissacarídeos [24]. Após um período de 30 minutos, as soluções contendo estes cristais foram centrifugadas a 5000 x g e o sobrenatante foi descartado. O precipitado, composto principalmente por cristais de CaOx, foi ressuspendido em 0,5 mL de água e uma alíquota de 0,1 mL foi colocada em lâmina histológica e observada em microscópio ótico (600x) imediatamente após a ressuspensão. Foram obtidas imagens de 10 campos diferentes aleatórios para cada lâmina. Em seguida, os diâmetros e tamanhos dos cristais foram analisados utilizando o software NIS Elements AR Ver4.30.01 DU1 64 bit, ano de 2014 (Melville, NY, EUA). As conclusões acerca das aferições dos cristais de CaOx foram obtidas após a realização de experimentos distintos, repetidos quatro vezes.. 4.3.2. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Espectroscopia de Energia Dispersiva (EDS) Para se caracterizar a morfologia e composição dos cristais de CaOx na presença dos polissacarídeos de C. cupressoides, foi realizada a microscopia eletrônica de varredura MEV (modelo Hitachi Tabletop Microscope TM-3000, com aceleração de voltagem de 5 kV, frequência de 50/60Hz, magnificação da imagem de 15 à 30000 vezes), e a Espectroscopia de Energia Dispersiva EDS (o equipamento utilizado foi Swift ED TM-3000, fabricante Oxford Instruments detector). As imagens foram geradas com a resolução 1280x960 pixels. Essas. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(24) 22 análises foram realizadas no Departamento de Engenharia de Materiais da Universidade Federal do Rio grande do Norte. 4.3.3. Medida do Potencial Zeta (ζ) dos cristais de CaOx Após 30 minutos do início da formação dos cristais na presença e na ausência dos polissacarídeos, as soluções foram centrifugadas (5000 x g). O sobrenadante foi descartado e o precipitado rico em cristais de CaOx foi ressuspendido em 1,5 mL de água e avaliado no Zeta Plus® (controle de temperatura ativo entre -5°C a 110°C, ±0.2°C, 1 a 4 s/ciclo, faixa de pH: 2 a 12, condutividade: 0 a 7,5 mS/cm, intensidade do campo elétrico: 0 a 3.2 kV/m,) para obtenção do Potencial Zeta.. 4.3.4. Espectroscopia de infravermelho A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectrômetro PerkinElmer de 4400 a 400 cm-1 no Departamento de Química da Universidade Federal do Rio grande do Norte. Os cristais de CaOx controle e os cristais de CaOx formados na presença de cada polissacarídeo de C. cupressoides (~5 mg) foram analisados após secagem em aparelho de Abdenhalden sob a forma de pastilha de KBr contendo P2O5 a 60ºC.. 4.3.5. Microscopia de fluorescência para análise da morfologia dos cristais de CaOx Para melhor compreensão acerca da relação entre a morfologia dos cristais e disposição dos polissacarídeos sulfatados nos cristais de CaOx, as populações polissacarídicas foram marcadas com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Sigma). Resumidamente, 5 mg de cada população foram solubilizadas numa solução 0,1 M de tampão fosfato (PBS) em pH 7,0 contendo 0,1 mg de FITC. A solução foi mantida em ambiente com redução de luminosidade, sob leve agitação, à temperatura ambiente, por 1 hora. Em seguida, o material foi dialisado contra água deionizada em membranas com poros de 6 kDa de diâmetro e, posteriormente, liofilizado. As amostras sem polissacarídeos sulfatados, assim como as amostras de populações marcadas com FITC foram submetidas a nova produção cristais de CaOx e as lâminas montadas conforme. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(25) 23 descrito no item 4.3.1. Para a visualização das imagens (10 campos), foi utilizado o Microscópio TE-Eclipse 300, Nikon, Melville, NY, USA (Objetiva 60x) e as imagens foram analisadas através do software NIS Elements AR Ver4.30.01 DU1 64 bit, ano de 2014 (Melville, NY, EUA).. 4.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA. Todos os dados dos experimentos realizados no item foram expressos como média ± desvio padrão. Foi utilizado o teste de análise paramétrica de análise de variância (ANOVA) seguido do teste de Tukey (Nível de significância de p<0,05) como GraphPad InStat® Software versão 3.05 para Windows 95 (GraphPad Software Incorporation, San Diego, CA, EUA).. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(26) 24 5. ARTIGOS PRODUZIDOS 5.1. Artigo 1 (SUBMETIDO) Interaction of antioxidant sulfated polysaccharides from green seaweed Caulerpa cupressoides var. flabellata with calcium oxalate crystals Periódico: Oxidative Medicine and Cellular Longevity The reference number for the article is 1284653 Fator de impacto: 4.593 ISSN: 1942-0900 (Online version) Qualis: Medicina II – A1. 5.2. Artigo 2 Methanolic Extracts from Brown Seaweeds Dictyota cilliolata and Dictyota menstrualis Induce Apoptosis in Human Cervical Adenocarcinoma HeLa Cells Periódico: Molecules Fator de impacto: 2.861 ISSN: 1420-3049 (Online version) Qualis: Medicina II – B1. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(27) 25 5.1 ARTIGO 1. Interaction of antioxidant sulfated polysaccharides from green seaweed Caulerpa cupressoides var. flabellata with calcium oxalate crystals Dayanne L. Gomes1,2, Karoline R. T. Melo1, Moacir Queiroz Fernandes1, Lucas A. N. C. Batista1, Pablo C. Santos3, Mariana S. S. P. Costa4, Jailma Almeida-Lima1, Rafael B. G. Câmara1, Hugo A. O. Rocha1*. 1. Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL), Departamento de. Bioquímica, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal, Rio Grande do Norte- RN 59078-970, Brazil. 2. Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio. Grande do Norte (UFRN), Natal, Rio Grande do Norte – RN 59078-970, Brazil. 3. Universidade Estadual do Rio Grande do Norte (UERN), Mossoró, Rio Grande do. Norte – RN, 59.610-210, Brazil. 4. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Norte (IFRN),. Macau, Rio Grande do Norte – RN, 59.500-000, Brazil.. Corresponding author: H. A. O. Rocha *. Email: hugo@cb.ufrn.br; Tel.: +55-84-32153416 (Branch line: 207).. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(28) 26 Abstract Urolithiasis affects approximately 10% of the world population and is strongly associated with calcium oxalate (CaOx) crystals. Currently, there is no efficient compound that can be used to prevent this disease. However, seaweeds’ sulfated polysaccharides (SPs) have the ability to change the CaOx crystals surface’s charge and thus modify the crystallization dynamics, due to the interaction of the negative charges of these polymers with the crystal surface during their synthesis. We observed that the SPs of C. cupressoides modify the morphology, size and surface charge of CaOx crystals. Thus, these crystals are similar to those found in healthy persons. In the presence of SPs, dihydrate CaOx crystals showed rounded or dumbbell morphology. Infrared analyzes, fluorescence microscopy, flow cytometry (FITC-conjugated SPs) and atomic composition analysis (EDS) let us propose the mode of action between the Caulerpa’s SPs and the CaOx crystals. This study is the first step in understanding the interactions between SPs, which are promising molecules for the treatment of urolithiasis, and CaOx crystals, which are the main cause of kidney stones. Key words. Urolithiasis; Green algae; COD dumbbell; COD stabilization;. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(29) 27 1. Introduction Urinary lithiasis or urolithiasis is a pathophysiological condition resulting from the formation of kidney stones. The incidence of urinary lithiasis in the world is increasing rapidly. In the last decade, prevalence doubled from approximately 6 to 11% among men and 4 to 7% among women, respectively [1]. One of the major problems with urolithiasis is the risk of developing chronic kidney disease (CKD) and end-stage renal disease (ESRD), a serious form of CKD [2]. This disease has a high social and economic cost, since in the USA alone, CKD treatment exceeds $50 billion a year [3]. In England, according to a recent report published by the National Health Service (NHS) Kidney Care, costs with CKD case management exceeds those of breast, lung, colon and skin cancers combined [4]. Urolithiasis can be influenced directly by the types of formed crystals, as each crystal has its own different ability to bind to the renal epithelium and to initiate the formation of the stones. Calcium oxalate (CaOx) crystals make up about 70% of urinary stones [5], and they are found in three different forms: monohydrate (COM), dihydrate (COD) and trihydrate (COT). The COM crystal is thermodynamically stable, exhibiting monocyclic geometric morphology (which, in optical microscopy, can be visualized with a rectangular shape) and showing greater affinity with the renal epithelium. For these reasons, they are found in kidney stones at a frequency twice as high as that of COD crystals [6,7]. The COD are commonly found in the urine of asymptomatic persons for urolithiasis and present a characteristic tetrahedral bipyramidal morphology, which can be easily visualized by light microscopy [7]. COT crystals show drusiform morphology. They are unstable, and therefore are rarely found in the urine of patients [8]. The formation of these CaOx crystals is derived from a physico-chemical process divided into 3 phases: nucleation, aggregation and crystal growth. The preponderant condition for crystal formation (nucleation) is urinary supersaturation, as due to the high concentration of ions in a solution, the condensation of these salts occurs forming tiny crystals, which are called nuclei. The aggregation occurs by the union of one or more growing nuclei, which form crystals of larger dimension and mass that can precipitate in the renal epithelium, being able to adhere or to be internalized by cells [9]. The growth of the kidney stone occurs by aggregation of preformed crystals or by secondary nucleation of a crystal adhered to the intrarenal structures [10]. The thickness of a crystal is related to the proportion of its faces. The CaOx crystals have three growth faces, and each face differs in size and naming according to the type of crystal referred to: faces Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(30) 28 (101), (010) and (121) for the COM crystals (Figure 1A); and faces (100), (101) and (011) for the COD crystals (Figure 1B). The changes in the CaOx crystal’s face are caused by the other molecules present in the urinary tract, taking into account the fact that the concentration of ions in healthy persons and lithogenic patients is practically the same. These molecules, such as citrate, pyrophosphate, glycosaminoglycans and glycoproteins, present in the renal and urinary ducts, have the function of stabilizing CaOx crystals, mainly in the COD morphology [11, 12]. Recently, seaweeds sulfated polysaccharides (SPs) also begun to be evaluated for their anti-lithic capacity. In a recently published review [13], it was verified that these polymers can inhibit the formation of CaOx renal stone formation in different ways: they inhibit crystallization (both in the nucleation phase [14,15,16] and in growth phase [16, 17]); they inhibit the aggregation phase [14, 15, 16, 17, 18]; they inhibit the occurrence of COM crystals and the transformation of COM to COD [14, 16, 17, 18]; and they inhibit renal tubular cell injury [19,20,21]. The Brazilian coast has a wide diversity of marine seaweed, especially in the Northeast coast; however, few species had their SPs characterized and evaluated for their therapeutic potential. The SPs from Caulerpa cupressoides var. flabellata have been studied by our research group for almost a decade. Initially, we have shown that SPs-rich extract from C. cupressoides exhibited several biological activities, including anticoagulant, antiproliferative and antioxidant activities [22]. Later, four different high molecular weight SPs, named CCB-0.3, CCB0.5, CCB-1.0 and CCB2.0 were obtained from this SPs-rich extract. The SPs CCB-F0.3, CCB-F0.5 exhibited antioxidant activity and significant iron chelating ability [23]. However, the effect of these SPs on the formation of CaOx crystals has not yet been described. It is noteworthy that, so far, no SP of green seaweed had its action on evaluated crystal formation. Based on these considerations, the objective of the present study was to obtain SPs of C. cupressoides (CCB-F0.3, CCB-F0.5, CCB-F1.0 and CCB-F2.0) and to evaluate their effect on crystallization of CaOx in vitro, as well as from the different morphological characteristics of the formed CaOx crystals to propose a model of interaction between the populations of SPs obtained with the CaOx crystals.. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(31) 29 2. Materials and Methods 2.1 Sulfated polysaccharides extraction from green seaweed C. cupressoides After collection, the green seaweed Caulerpa cupressoides var. flabellata Børgesen was cleaned with running water and oven dehydrated at 45 °C. They were sprayed and then treated four times with two volumes of ethanol for depigmentation and delipidation of the material. Two volumes of 0.25 M NaCl were added to the powder obtained, with the pH being adjusted to 8.0. The proteolytic enzyme maxatase (60 °C, for 18 h) was added to this material. The suspension was then centrifuged at 10.000 g for 20 minutes. The precipitate was discarded and the volume of the supernatant was measured fractionated with increasing volumes of acetone, obtaining SPs according to a method established by Costa and collaborators, 2012 [23]. 2.2 Chemical and Physicochemical Analysis The total sugars were determined according to Dubois and collaborators (1956) by the phenol–H2SO4 reaction [24]. The sulfate content was determined based on the gelatin/barium method [25]. Protein quantification was determined using Spector’s method [26]. The SPs were submitted to electrophoresis in order to evaluate the presence of sulfated polysaccharides and to identify the different populations of these [27]. 2.3 Fourier Transformed Infrared (FT-IR) Spectroscopy Analysis The infrared spectra of the CaOx crystals controls formed after incubation with the SPs of C. cupressoides were obtained using infrared spectroscopy via Fourier transform (IRAffinity-1 spectrometer, Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) equipped with the IRsolution 1.20 software. SPs and crystals samples (5 mg) were completely mixed with dried potassium bromide powder (KBr) and then compressed. The sweep frequency range was 4000–400 cm−1. Thirty-two scans at a resolution of 4 cm−1 were evaluated and referenced against air. The Infrared Spectroscopy Analysis was carried out in the Department of Chemistry of the Federal University of Rio Grande do Norte. 2.4 Calcium Oxalate Crystallization Assay The CaOx crystals can be formed in vitro from Ca2+ and oxalate to a mixture of calcium chloride (8 mM/L), sodium oxalate, sodium chloride (200 mM/L) and sodium acetate (10 mM/L) as final concentrations of this solution from physiological concentrations of urine. The formation of the CaOx crystals was evaluated in the presence. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(32) 30 or absence (control) of the Caulerpa’ polysaccharides [15]. After formation of these, the solutions consisting of these crystals were centrifuged at 5.000 x g and the supernatant was discarded. The precipitate is composed mainly of crystals of CaOx, and was resuspended in 0.5 mL of water, and a solution of 0.1 mL was placed on a histological slide and observed under an optical microscope (600x). Images of 10 different fields were obtained for each slide, then the crystal diameters and sizes were analyzed using the NIS Elements AR Ver4.30.01 DU1 64-bit software, year 2014 (Melville, NY, USA). The conclusions about the measurements of the CaOx analyzes were obtained after a trial of distinct experiments, being repeated four times. 2.5 Scanning electron microscopy (SEM) and Dispersive Energy Spectroscopy (EDS) To observe the superstructure and composition of generated crystals in the presence of the SPs of C. cupressoides, a scanning electron microscopy (Hitachi Tabletop Microscope TM-3000 model, with 5 kV voltage acceleration, 50/60Hz of frequency, image magnification from 15 to 30000) and dispersive energy spectroscopy (Swift ED TM-3000, Oxford Instruments detector) images were generated with 1280x960 pixels resolution. The Scanning Electron Microscopy was carried out in the Department of Materials Engineering of the Federal University of Rio Grande do Norte. 2.6 Zeta Potential (ζ) Measurements After 30 minutes of crystal formation in the presence and absence of the polysaccharides [15], the solutions were centrifuged (5000 x g). The crystal concentrate was then suspended in 1.5 mL of water, and the zeta potential of the ζ samples was obtained using a Zeta Plus® analyzer (active temperature control between -5°C at 110°C, ±0.2°C, 1 at 4 s/cycle, pH range: 2 at 12, conductivity: 0 at 7.5 mS/cm, intensity of the electric field: 0 at 3.2 kV/m), Brookhaven instruments, Holtsville, NY, USA.. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(33) 31 2.7 Light microscopy and fluorescence microscopy for the analysis of CaOx crystal morphology To better understand the morphology and arrangement of the SPs in the CaOx crystals, polysaccharide was labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC). 5 mg of each polysaccharide was added to 0.1 mL of phosphate buffer (PBS) at pH 7.0 containing 0.1 mg FITC. The solution was kept in an environment with reduced brightness, at room temperature for 1 hour. The material was then labeled with deionized water in membranes with pores of 6 kDa, and then lyophilized. Samples without SPs, as well as samples of FITC-labeled polysaccharides were not subjected to new production of CaOx crystals and slides, assembled according to item 2.4. Images were captured from different fields under a fluorescent microscope (TE-Eclipse 300, Nikon, Melville, NY, USA). We performed three different experiments.. 2.8 Statistical Analysis All of the data are expressed as the mean ± standard deviation (n = 3). The ANOVA test was performed to check the difference between results. The Student– Newman–Keuls test (p < 0.05) was used to solve similarities found by ANOVA. All tests were performed in GraphPad Prism 5 (GraphPad Softwares, La Jolla, CA, USA).. 3. Results and Discussion 3.1. C.. cupressoides’s. sulfated. polysaccharides. extraction,. chemical. and. physicochemical analysis In a previous study [23], our group extracted four populations of sulfated polysaccharides from the C. cupressoides seaweed. These populations were named as CCB-F0.3, CCB-F0.5, CCB-F1.0, and CCB-F2.0, respectively. In this work, using the same previously described methodology, we also obtained four polysaccharide populations from C. cupressoides. These samples were subjected to agarose gel electrophoresis in PDA buffer. In figure 2 we showed an electrophoresis slide stained with toluidine blue, the toluidine blue has affinity for SPs. We can see the four populations stained with toluidine blue, indicating that they are constituted of SPs. Different electrophoretic mobility can also be verified: CCB-F0.3, CCB-F0.5 are polysaccharides of low mobility in comparison with the others and CCB-F1.0 presented intermediate mobility, whereas CCB-F2.0 was the population with higher mobility. By comparing our Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(34) 32 data. with. the. electrophoresis. slide. presented. by. Costa. and. colleague [23], we can confirm the identity of the polysaccharides obtained. As observed previously [23], in all extracted SPs, the protein contamination was below 0.1% (Table 1), confirming the efficacy and reproducibility of the extraction methodology. Table 1 revealed a higher sulfate/sugar ratio for CCB-F0.3 (~1.10) and the lowest ratio for CCB-F2.0 (~ 0.72). These values differ from those previously observed [23]; these authors found CCB-F0.5 with higher sulfate/sugar ratio and CCB-F1.0 with the lowest ratio of the four fractions. These data were not surprising, since many authors report changes in the chemical compositions of polysaccharides extracted from the same species of seaweed when collected at different sites [28, 29]. However, seaweed, both in Costa and colleges [23] as in here, were collected at the same site (6 ° 1'8.19 "S - 35 ° 6'33.40" W), which discards this possibility, even though they were collected in different years, which takes seaweed to be exposed to different environmental conditions, leading to changes in the SPs composition. This effect has already been reported by different authors, but these variations are not homogeneous; each species of seaweed responds differently to the environmental changes in the collection site, like the green seaweed Ulva fasciata’s SPs varied in yield, monosaccharide composition and sulfate amount [30]; on the other hand, Delesseria sanguínea’s SPs’ monosaccharide composition and sulfate content have not been affected by the seasonality [31]. In order to evaluate whether the chemical composition differences of SPs in this study interfered with the biological activity described earlier [23], we choose the antioxidant test of iron chelation to verify if the activity of SPs obtained here was similar to that previously described. As seen in Table 1, the iron chelating activity of the samples varied from 34 ± 2% (CCB-F1.0) to 53 ± 1% (CCB-F0.5). These values are similar to those observed by Costa and colleagues [23] and indicates that, despite the differences between sulfate/sugar ratios found in this study and previously published [23], we believe that these variations promote only subtle differences in polysaccharide structure, and these differences are not sufficient to affect the activities of SPs of C. cupressoides. This led us to continue our studies with the obtained polysaccharides.. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(35) 33 3.2 Effect of sulfated polysaccharides C. cupressoides on the formation of calcium oxalate crystals It is possible to mimic the formation of these crystals in vitro [15] and to evaluate the effect of compounds on the formation of these crystals. Based on light field optical microscopy, we can infer the effect of SPs on the formation of crystals by quantification of each type of crystal. The data obtained are summarized in Table 2. When we analyze the data showed in the table, we can see that the presence of polysaccharides increased the amount of crystals formed. In the presence of CCB-F0.3, the amount of crystals increased 12-fold, followed by CCB-F1.0, which increased by approximately 9-fold. However, despite the increase in the amount of crystals, the size of the crystals formed when treated with C. cupressoides seaweed SPs was reduced about four-fold on average, reaching, in some cases, about 1 µm after treatment (Table 2). The CCB-F0.3 again stood out by decreasing 7 times the size of COM and 5 times the size of COD. Wesson and collaborators [32] proposed that anionic compounds tend to increase the number of crystals and decrease their size since these negatively charged compounds interact more with the rich calcium faces of both COM and COD crystals, blocking their growth [32]. In addition, the anionic compounds induce repulsions between the formed nuclei (the nano/micro crystals), preventing the aggregation process, as they are associated with the crystals. These two factors prevent the formation of larger crystals. With respect to the large number of crystals formed in the presence of anionic compounds, we believe that as the ions are not completely consumed during nuclei formation, these are available for the formation of new nuclei. These factors together justify the observation of the large number of small crystals formed in the presence of C. cupressoides SPs. Also, in Table 2, we can see that all obtained SPs (except CCB-F2.0) induced the formation of an amount of COD-type larger than COM-type, and, again, CCB-F0.3 was highlighted, as in the presence of CCB-F0.3, the number of crystals was 209 ± 12.3 units of COD type, much higher than the number of COM type (48 ± 10.9 units), making a ratio of approximately 4 COD for each COM. It is important to emphasize that COM-type crystals, when formed in vivo, can be concentrated in the renal tubular fluid and interact with kidney tubular epithelial cells, giving them enough time to grow on the cell surface or to aggregate mutually so as to form large crystals, which finally leads to the formation of kidney stones. On the other Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(36) 34 hand, COD crystals, due to their morphology, have an area of contact with the minimal renal epithelium and, therefore, bind the cell membrane in a smaller amount [33]. Other SPs of different seaweeds showed the ability to inhibit the formation of COM crystals or to stabilize the dihydrate form of the CaOx crystal (COD). For example, Ouyang and colleagues [14] worked with the edible seaweed Laminaria japonica and found that its native and modified SPs induced the formation of only COD crystals [14]. However, SPs from Dictiopteris justii are able to inhibit the formation of CaOx crystals. In addition, its sulfated glucan was also able to stabilize CaOx crystals in the COD form [16]. There is no hypothesis that explains how SPs stabilize CODs. However, studies with carboxylated polymers with the same net charge showed that they did not influence the COD stability in the same way, and it was proposed that the distribution of the charges around the molecule was a more important factor than the charge alone during this process of stabilization [34]. So, this should probably be an important factor for SPs as well.. 3.3 Morphology of the crystals formed in the presence of Caulerpa polysaccharides For a more detailed analysis of the morphological characteristics of the formed crystals, the images were obtained by scanning electron microscopy (SEM) and were analyzed subsequently. The results are summarized in Figure 3. The images of Figure 3 corroborate with the results of Table 2, showing that there is an increase in the amount of formed crystals, but decreasing their sizes. Still in agreement with Table 2, there are more COD-type crystals in the crystal images formed after incubation with CCB-F0.3, CCB-F0.5 and CCB-F1.0 (Fig. 3C to 3G) when compared to Control crystals (Figures 3A and 3B). The crystals that were formed without the incubation with the SPs (control) had the morphological characteristic of COM and COD, marked by isotropic growth on all the faces of the crystals. Moreover, we observed control only in the crystals of the COT-type (arrow tipped diamond, Figure 3B), i.e., all treatments with seaweed SPs C. cupressoides inhibited the formation of this crystal. Regarding the COD crystals, after treatment, they showed a more rounded shape (without well-defined tips) than the control group. CCB-F0.3 (Figure 3C) induces the formation of nearly round, spherical crystals with the tiny (100) faces, evidenced by the arrow in Figure 3D. The CCB-F2.0 and CCB-F1.0 polysaccharides induce the formation of COD, which assumes the tetragonal bipyramid shape, but with the tips slightly rounded. CCB-F0.5 induces the formation of crystals with tetragonal bipyramid structures Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(37) 35 with thicker (100) faces (white arrow with arrowhead, Figure 3E and 3F); besides, these crystals have rounded edges when compared to COD formed in the control. Still regarding COD crystals, we also observed that both CCB-F0.5 and CCB-F1.0 induces the formation of a mixture of COD crystals, which, in addition to the already described types, also forms dumbbell-shaped crystals. These crystals showed two hemispheres connected with a rod (Figure 3F). COD crystals with traditional bipyramidal structure have the face (101) as the dominant face. According to Thomas and colleagues [35], the COD crystals only take the form of dumbbells when the ratio between faces {100} and {101} is greater than 1, that is, the face (100) grows much more than the face (101). These authors also demonstrated that the presence of polyacrylate (PAA) also promotes the formation of COD crystals in the form of dumbbells. This indicates that COD crystals in the form of dumbbells can be formed in the presence of some anionic compounds. However, we still do not know what SP’ structural features are required for this to occur. Regarding COM crystals, when formed after treatment with C. cupressoides's SPs, they were smaller and had structure with the faces {100} dominating. There was an increase in growth in the direction [010] rather than growth in the direction [100]. This makes COM have edges and tips with less sharp angles, as they are shaped like an ellipse (oval in the form of a plaque). Thus, the morphological characteristic assumed by COM crystals after incubation with C. cupressoides's SPs is advantageous, as while leaving the edges of their faces with a slight angle (rounded), the possible interaction of these crystals in renal epithelium can be decreased, which will consequently favor its passage in the urinary tract, thus reducing the formation of kidney stones. In agreement with our hypothesis, there are studies that analyzed the crystals of CaOx contained in the urine of lithogenic patients, and they verified that the COM crystals had edges and tips with sharp angles and concluded that these are important factors for the anchorage of these crystals in the renal epithelium [33, 36].. 3.4 FT–IR spectrum analyses The COM and COD crystal FT-IR spectra are showed in Figure 4. We can observe that the main difference between these spectra is the region between 3040 and 3500 cm1. . While in COM crystal spectra, there are at least five prominent bands (Figure 4) in this. same region. In COD crystal spectra, there is only one great intensity band around 3485 cm-1 (Figure 4 – COD spectra). Other typical signal of COM crystal were observed around Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(38) 36 947, 885 and 663 cm-1 (Figure 4 – COM spectra), whereas characteristic COD signals were observed at 916 and 609 cm-1. Both spectra are similar with those previously described for COM and COD crystals [37, 38]. Since we observed that more COD crystals were formed in the presence of CCBF03 and more COM crystals were formed in the presence of CCB-F2.0, these samples were chosen to perform infrared analysis. In these spectra of the crystals formed in the presence of CCB-F0.3 and CCB-F2.0, there are bands around 1232-1256 cm-1, which indicate asymmetric vibration S=O [39], and the bands around 1150 e 1025-1033 cm-1 are indicative of vibration associated to C-O-S-O [40]. These bands were also observed in the spectra of the crystals obtained in the presence of the other SPs (data not shown) and confirm the presence of SPs CCB-F0.3, CCB-F0.5, CCB-F1.0 and CCB-F2.0 in CaOx crystals. Spectra analysis also allows noticing that, in the presence of CCB-F0.3, there is a predominant formation of COD crystals, since a single band was observed in the region between 3040 and 3500 cm-1. However, in the CCB-F2.0 spectra, it was possible to observe multiple bands in this region, indicating that SPs are mainly complexed with COM crystals. These data thus corroborate with those obtained by microscopic analyzes. 3.5 Zeta potential The zeta potential (ζ) of crystals formed in the presence of C. cupressoides’ SPs was measured in order to verify if changes in the number and/or morphology of crystals were associated with changes in the surface charge of these crystals. The results are shown in Table 3. The ζ mean value of untreated CaOx crystals was + 8.85 ± 3.30 mV. This positive profile of crystal charge surface can be mainly related with the presence of calcium ions in crystal structure. All SPs decreased the zeta potential of CaOx crystals, ranging from 25.82 ± 6.36 mV in the presence of CCB-F0.3 to -68.70 ± 12.01 mV in the presence of CCB-F2.0. An interesting fact is that the increase of crystals ζ did not correspond to the sulfate/sugar ratio (Table 1), that is, polysaccharide with high amounts of sulfate groups did not promote formation of crystals with lower ζ value. Other authors have already noted this fact [15, 16], and it is proposed that SP associated with crystal tends to assume a conformation that allows it to have higher or lower exposition of its charged groups. Therefore, it is a situation where, in a negatively charged polysaccharide, it may assume Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(39) 37 a conformation in which its charges are not so exposed in the crystal surface, resulting in ζ of the crystal being closer to zero. The ζ increases with the presence of SPs of C. cupressoides, which explains part of the formation of many small crystals. The elevated negative charge on crystal surface would lead to repulsion of other crystals and would block crystal aggregation and growth. This interference in crystal aggregation/growth has also been observed by other authors while working with other seaweeds SPs [15, 16]. In those works, the authors also report formation of many small crystals and elevated crystal negative charge. Zeta potential analyzes provide us great indications that SPs interact with CaOx crystals structure. However, there are no studies that actually prove direct binding between SPs from seaweed and CaOx crystals. Despite, this connection is well described for other molecules that also have negative charges in their structure, such as polyacrylate [35], osteopontin [41, 42], glycosaminoglycans [43], and citrate [44], for example. Therefore, it can be confirmed, based on the data presented here and compared with those in the literature, that SPs seaweeds are able to alter the surface charge of CaOx crystals and thereby modify their crystallization dynamics. 3.6 Fluorescence and flow cytometry analyzes of CaOx crystals and FITC-labeled SPs. In another set of experiments, the SPs were covalently conjugated to the FITC, as described in Methods (item 2.7), and used as fluorescent probes with goal to observe binding of SPs to the formed crystals. To this end, FITC-labeled polysaccharides were incubated with the supersaturated solutions inducing the formation of CaOx crystals, and the crystals resulting from this incubation were analyzed by flow cytometry and fluorescence microscopy. As control, crystals formed in the presence of fluorescently unlabeled SPs were used. As expected, crystals formed in the presence of unfluorescent SPs were not detected by flow cytometry. However, using this technique, we verified that 90% of crystals formed in the presence of fluorescent SPs showed positive FITC signal. When those crystals were analyzed by fluorescence microscopy, we noticed that they appear marked by FITC (green) in almost all of their totality (Figure 5); besides, we were able to differentiate formed COM and COD crystals. These data give evidence that SPs are interacting with entire crystalline network, probably with calcium present in these crystals.. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(40) 38 3.7 Stabilization of COD crystals The data presented so far showed that, with the exception of CCB-F2.0, all other SPs of C. cupressoides induce higher amount of COD crystals in comparison to the positive control. In addition, SPs gave COD crystals’ higher stability. This behavior has already been observed by Escobar and colleagues [45], in the presence of other sulfated (dermatan sulfate, oversulfated heparin and keratan sulfate) and phosphorylated (phosphorylated chitosan) polysaccharides. Interestingly, there was a greater formation of COM crystals when these authors used desulfated dermatan, chitosan and hyaluronic acid (carboxylated, but not sulfated polysaccharide). These results show the importance of sulfate groups in polysaccharides for the stabilization of COD crystals [45]. However, not every sulfated polysaccharide promotes stabilization of COD crystals, as shown by Melo and colleagues [16] and also by our results, since CCB-2.0 induces more COM formation. This shows that the SP’s COD stabilizing effect is not merely a charge effect, but it also depends on how charges are distributed across the polysaccharide chain. Moreover, these data show that COD formed in the presence of the different C. cupressoides’s SPs may take different forms, which seems to indicate that SPs can stabilize COD in different ways, perhaps because they associate with crystals in different faces. In order to confirm this hypothesis, the surfaces of the COD crystals obtained after the incubation with the SPs studied here had their atomic composition characterized through the spectroscopic chemical microanalysis of X-rays by energy dispersion (EDS). The sulfur atoms were quantified at different points of the crystals: apex, face and base (Figure 6A). The sulfur found on the surface of the crystals should represent the sulfate (SO42-) groups of SPs, since CaOx is composed only of calcium, carbon and oxygen, so some considerations have been made. The results from analyzes are summarized in the table of Figure 6B. We observed in this table that three situations occur in the sulfur distribution: the first occurs in the crystals formed with CCB-F0.3 and CCB-F2.0, where there is twice the amount of sulfur in the region of the base than in the other portions; The second occurs with the crystals formed with CCB-F0.5, where there are almost ten times more sulfur at the base of these crystals than at the apex or face; The last situation is when there is a different distribution at the base, face and apex, with the amount of sulfur at the base being twice as large as the apex, as is the case with CCB-F1.0.. Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.

(41) 39 We found no other articles that have done this type of analysis; therefore, it was not possible to compare our results with those of other authors. However, some considerations have been made. Is it necessary for the SPs to be distributed differently throughout the crystal so that there is a greater stabilization of the COD crystals? It does not seem so, since CCBF1.0 has this type of distribution, but the COD:COM ratio obtained with this sample was only 2: 1 (Table 2). The other SPs were more concentrated on the base. However, there is a subtle relationship between the amount of sulfur that should be at the base, apex and face. If there is a lot of sulfur in the base (about ten times more) than in the other points, as occurred with the presence of CCB-F0.5, there is stabilization of COD, but with only a COD: COM ratio of 3: 1 (Table 2). The ideal distribution for COD stabilization seems to be that observed with CCB-F0.3, since the COD: COM ratio was 5:1. The CCB-F0.3 concentrates more on the base, but its amount is only twice of that observed in the other points; in addition, the amount of this SP at the apex and face are similar. This distribution profile was also observed with CCB-F2.0. However, we found that the crystals formed with this polysaccharide have twenty times less sulfur than the crystals formed with CCBF0.3.. 4. Conclusions Four sulfated polysaccharides were extracted from the seaweed Caulerpa cupressoides and were named CCB-F0.3; CCB-F0.5; CCB-F1.0; and CCB-F2.0. These SPs interact in vitro with calcium oxalate crystals, making their surface’s more negative. They also induce the decrease in the size and number of formed crystals. This effect did not depend on the amount of sulfate groups present in SPs. With the exception of CCBF2.0, SPs induce the formation of a greater amount of COD crystals compared to the control group, with CCB-F0.3 being the most efficient. This occurred because CCB-F0.3 was distributed in the base:apex:face of the crystal in a ratio of 2:1:1. We believe that this balance/proportion between SPs at the interaction points is crucial to avoid dehydration of the COD crystal to COM, which guarantees their stability.. Acknowledgements The authors wish to thank Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior Gomes, D.L.. PPGCSA/CCS.