UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
MATHEUS ANSELMO MEDEIROS
EFEITOS DA SUPLEMENTAÇÃO DE CREATINA NO ESTADO REDOX DO TECIDO RENAL DE RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR
ESTREPTOZOTOCINA
NATAL/RN
MATHEUS ANSELMO MEDEIROS
EFEITOS DA SUPLEMENTAÇÃO DE CREATINA NO ESTADO REDOX DO TECIDO RENAL DE RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR
ESTREPTOZOTOCINA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientador: João Paulo Matos Santos Lima.
NATAL/RN
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Medeiros, Matheus Anselmo.
Efeitos da suplementação de creatina no estado redox do tecido renal de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina /
Matheus Anselmo Medeiros. - 2019. 45 f.: il.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Biociências, Programa de Pós-Graduação em
Bioquímicas, Natal, RN, 2019.
Orientador: Prof. Dr. João Paulo Matos Santos Lima.
1. Diabetes - Dissertação. 2. Creatina - Dissertação. 3. Rim - Dissertação. I. Lima, João Paulo Matos Santos. II. Título.
RN/UF/BCZM CDU 616.379
Dedico esta dissertação aos meus pais que quando a questão era a educação dos filhos, nunca mediram esforços em oferecer o melhor.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à minha família pelo apoio, incentivo e compreensão pelos momentos em que não pude estar reunido com eles. Em especial e in memoriam ao meu avô Milton da Silva Medeiros, uma das melhores pessoas que tive o privilégio de conviver e admirar. Obrigado por tudo.
Ao professor Dr orientador João Paulo Matos Santos Lima que me proporcionou muito conhecimento e autonomia, os quais foram imprescindíveis no meu crescimento científico. Sua orientação foi a melhor que tive e que jamais imaginaria ter.
À minha namorada Licyanne Ingrid Carvalho de Lemos pela paciência, compreensão e auxílio do início ao fim, nos momentos bons e ruins.
Aos meus amigos: Matheus Mendes, Mikael, Richardson. Assim como, aos amigos de longa data: Arthur, Charlie, David, Dionísio, Elon, Gustavo, Igor, Lucas, Matheus Lago, Matheus Macêdo, Mateus Rodrigues e Rafael. Agradeço por todo apoio e companheirismo desde o início.
Ao grupo de pesquisa LABMEX que me ajudou durante o período experimental, em especial a Gizileide Nascimento e Thatyana Martins que colaboram grandiosamente durante e após o experimento. Além do professor Dr. Bento Abreu, pelos ensinamentos durante esses seis anos que trabalhamos juntos.
Aos integrantes do LASIS que me apoiaram e contribuíram com o trabalho. Em especial a Dáfiny, Diego, Érica, Ivanice, Meline e Ricardo pela atenção, preocupação comigo, além dos ensinamentos que me ajudaram a tornar esse trabalho possível academicamente e pessoalmente.
Aos professores Elizeu Antunes dos Santos e Hugo Alexandre de Oliveira Rocha e aos integrantes dos seus respectivos laboratórios pela paciência e contribuição no uso dos equipamentos.
Aos meus colegas de turma do mestrado pelo apoio e conhecimentos compartilhados.
Ao laboratório Tércio Rosado pela viabilização dos exames bioquímicos. E a todos e todas que acreditaram que eu chegaria lá. Meu muito obrigado!
AGRADECIMENTO INSTITUCIONAL
Agradeço à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de estudos durante todo o período do curso de mestrado, à Universidade Federal do Rio Grande do Norte e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) ao fomento da pesquisa.
RESUMO
Introdução: A creatina é um suplemento nutricional que vem sendo alvo de pesquisas
em várias patologias, com ampla possibilidade de aplicações clínicas. Estudos mostram o efeito da creatina em aumentar a captação de glicose por elevar a expressão de receptores GLUT-4 em desordens metabólicas como o Diabetes Mellitus tipo II, no entanto, não há estudos que relatem o efeito da creatina no metabolismo glicídico do Diabetes Mellitus tipo I. Sendo assim, este trabalho tem como objetivo avaliar o efeito da suplementação de creatina em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina. Métodos: Foram utilizados 32 ratos Wistar separados em 4 grupos: (C) animais sem diabetes e sem suplementação de creatina (n=8), (CCr) animais sem diabetes e com suplementação de creatina (n=8), (D) animais diabéticos induzidos com estreptozotocina sem suplementação (n=8), (DCr) animais diabéticos induzidos com estreptozotocina tratados com creatina (n=8). Os grupos D e DCr receberam dose única de estreptozotocina (40 mg/kg i.p.). Foram realizadas as seguintes avaliações: clínica, bioquímica, bem como a análise de parâmetros de estado redox no tecido renal dos animais. Resultados e
discussão: Na glicemia de jejum, os grupos diabéticos apresentaram hiperglicemia
significativa em comparação com os grupos controles, porém, o grupo DCr apresentou uma melhora significativa em relação ao grupo D. Esse resultado corrobora com estudos anteriores que verificaram o mesmo efeito positivo em condições patológicas que culminam na hiperglicemia. Na quantificação da ureia e alanina transaminase, os grupos diabéticos apresentaram um aumento significativo em comparação com os grupos controles, porém, o grupo DCr apresentou uma melhora significativa em relação ao grupo D em ambos parâmetros. Nossos resultados de ALT e ureia sérica no grupo D pode ser interpretado como um aumento da gliconeogênese a nível sistêmico, provavél lesão hepática e do catabolismo proteico, uma vez que a ureia é o principal produto do ciclo da ornitina. A atividade enzimática de catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase foi significativamente baixa no grupo D em comparação aos grupos controles, porém, o grupo DCr teve atividade restabilizada a nível semelhante aos grupos controles em todas as enzimas. Na quantificação do conteúdo de peróxido de hidrogênio, o grupo D apresentou níveis significativamente altos em comparação aos grupos controles, porém, o grupo DCr teve restabilização a nível semelhante aos grupos controles nesse parâmetro. Esses resultados convergem com estudos prévios que observaram que suplementação de creatina modula a atividade antioxidante enzimática e pode ser um agente antioxidante direto de espécies reativas de oxigênio. Conclusão: a creatina pode melhorar o perfil metabólico no DM e restabilizar parâmetros do estado redox nesta condição. Estes resultados sustentam a suplementação de creatina como um potencial agente terapêutico adjuvante.
ABSTRACT
Introduction: Creatine is a nutritional supplement that has been the subject of research
in several pathologies, with a wide possibility of clinical applications. Studies have shown the effect of creatine on increasing glucose uptake by elevating the expression of GLUT-4 receptors in metabolic disorders such as type II Diabetes Mellitus, however, there are no studies that report the effect of creatine on the glycemic metabolism of type I Diabetes Mellitus. Thus, this work aims to evaluate the effect of creatine supplementation in diabetic rats induced by streptozotocin. Methods: Thirty-two Wistar rats were divided into four groups: (C) animals without diabetes and without creatine supplementation (n = 8), (CCr) animals without diabetes and creatine supplementation (n = 8), (D) animals Streptozotocin-induced diabetics without supplementation (n = 8), (DCr) creatine-treated diabetic-induced diabetic animals (n = 8). Groups D and DCr received a single dose of streptozotocin (40 mg/kg i.p.). The following evaluations were performed: clinical, biochemical, as well as the analysis of redox state parameters in the renal tissue of the animals. Results and discussion: In fasting glycemia, diabetic groups presented significant hyperglycemia in comparison with the control groups, but the DCr group showed a significant improvement in relation to group D. This result corroborates previous studies that verified the same positive effect in pathological conditions that culminate in hyperglycemia. In the quantification of urea and alanine transaminase, the diabetic groups presented a significant increase in comparison with the control groups, however, the DCr group showed a significant improvement in relation to group D in both parameters. Our results of ALT and serum urea in group D can be interpreted as an increase in systemic gluconeogenesis, provable hepatic injury and protein catabolism, since urea is the main product of the ornithine cycle. The enzymatic activity of catalase, superoxide dismutase and glutathione peroxidase were significantly lower in group D compared to control groups, however, group DCr had restored activity at similar level to the control groups in all enzymes. In the quantification of the hydrogen peroxide content, group D had significantly higher levels in comparison to the control groups, however, group DCr had a similar level of restoration to the control groups in this parameter. These results converge with previous studies that observed that creatine supplementation modulates the enzymatic antioxidant activity and may be a direct antioxidant agent of reactive oxygen species. Conclusion: Creatine can improve metabolic profile in DM and restore redox state parameters in this condition. These results support creatine supplementation as a potential adjunctive therapeutic agent.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura química da estreptozotocina...10
Figura 2 - Reações da defesa antioxidante enzimática contra espécies reativas de
oxigênio...12
Figura 3 - Estrutura química da creatina...13
Figura 4 - Desenho experimental...17
Figura 5 - Quantificação da ingestão de água (A) e consumo de ração (B) por dia dos grupos C, CCr, D e DCr em 7 pontos de avaliação durante o protocolo experimental de 40 dias. Quantificação do ganho de peso (C) e peso relativo renal (D) ao final do período experimental de 40 dias...24
Figura 6 - Glicemia de jejum (A), creatinina sérica (B), ureia sérica (C), aspartato
aminotransferase sérica (D) e alanina aminotransferase sérica (E) dos grupos C, CCr, D e DCr ao final do protocolo experimental...25
Figura 7 - Atividade de catalase (A), superóxido dismutase (B) e glutationa peroxidase
(C) renal dos grupos C, CCr, D e DCr ao final do protocolo experimental...27
Figura 8 - Conteúdo de peróxido de hidrogênio (A), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (B), proteínas carboniladas (C) e tiol solúvel (D) renal dos grupos C, CCr, D e DCr ao final do protocolo experimental...27
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AGEs – Advanced glycation end-products (produtos finais de glicação avançada) ALT – Alanina transaminase
AST – Aspartato transaminase ATP – Adenosina-trifosfato CAT – Catalase
DM – Diabetes Mellitus DNPH – 2,4-dinitrofenilhidra
DTNB – 5,5’-ditiobis-(2-ácido nitrobenzóico) EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético ERNs – Espécies Reativas de Nitrogênio EROs – Espécies Reativas de Oxigênio GLUT-4 – Transportador de glicose tipo 4 H2O2 – Peróxido de hidrogênio
HCl – Ácido clorídrico
KH2PO4 – Fosfato monopotássio
KI – Iodeto de potássio
MAPK – Proteínas-quinases ativadas por mitógenos MDA – Malonaldeído
MF – Massa fresca N2 – Nitrogênio
NADPH - Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NaOH – Hidróxido de sódio
NBT – Nitroblue tetrazolium SEM – Erro padrão da média SOD – Superóxido dismutase
STZ – Estreptozotocina TBA – Ácido tiobarbitúrico TCA – Ácido tricloroacético
Sumário
1. INTRODUÇÃO ... 9
2. OBJETIVOS GERAL E ESPECÍFICOS ... 16
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 17
3.1ANIMAIS ... 17
3.2GRUPOSEXPERIMENTAIS: ... 17
3.3INDUÇÃODODIABETESMELLITUSPORESTREPTOZOTOCINA ... 18
3.4CONFECÇÃODARAÇÃOCOMCREATINA ... 18
3.5SINTOMATOLOGIADODIABETES ... 18
3.6EXAMESBIOQUÍMICOS ... 19
3.7EXTRAÇÃOPROTEÍCADOTECIDORENAL ... 19
3.8ATIVIDADEDASENZIMASANTIOXIDANTES ... 20
3.9EXTRAÇÃOÁCIDA ... 21
3.10DETERMINAÇÃODOCONTEÚDODEH2O2 ... 21
3.11QUANTIFICAÇÃODAPEROXIDAÇÃODELIPÍDEOS(TBARS) ... 21
3.12DETERMINAÇÃODOCONTEÚDODEPROTEINASCARBONILADAS .. 22
3.13DETERMINAÇÃODOCONTEÚDODETIOLSOLÚVEIS ... 22
3.14ANÁLISESESTATÍSTICAS ... 23
4. RESULTADOS ... 24
4.1SINTOMATOLOGIA DO DIABETES ... 24
4.2EXAMES BIOQUÍMICOS ... 25
4.3ATIVIDADE DAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES E PARÂMETROS REDOX ... 27
5. DISCUSSÃO ... 29
6. CONCLUSÃO ... 32
7. REFERÊNCIAS ... 33
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1. INTRODUÇÃO
O Diabetes Mellitus (DM) é uma doença metabólica crônica caracterizada pela presença de hiperglicemia secundária à redução dos níveis de insulina circulante ou a um déficit dos efeitos teciduais desse hormônio, ocasionando alterações no metabolismo de carboidratos, proteínas e lipídios (ADA, 2019). Atualmente, estima-se que a população mundial com diabetes é da ordem de 425 milhões de pessoas e que deverá atingir 629 milhões em 2045 (IDF, FEDERAÇÃO INTERNACIONAL DE DIABETES, 2017). Nas últimas décadas, sabe-se que a incidência de DM vem aumentando, particularmente na população infantil com menos de 5 anos de idade (SBD, 2017-2018).
O DM tipo I resulta da destruição das células beta, geralmente levando a absoluta insuficiência de insulina. O DM tipo II é caracterizado pelo déficit na secreção de insulina e/ou de resistência à insulina. Outros tipos específicos de DM ocorrem devido a outras causas, por exemplo, defeitos genéticos na função das células beta do pâncreas, defeitos genéticos na ação da insulina, doenças exócrina do pâncreas (tais como cística, fibrose), droga ou induzida quimicamente (tais como no tratamento do HIV/SIDA ou após algum transplante) e o DM gestacional, diabetes diagnosticado durante a gravidez que não é claramente o diabetes (ADA, 2019).
Em relação ao DM tipo I, na maioria dos casos, essa destruição das células beta é mediada por autoimunidade, porém existem casos em que não há evidências de processo autoimune, sendo, portanto, referidos como forma idiopática de DM tipo I (SBD, 2017-2018). Os marcadores de autoimunidade são os autoanticorpos anti-insulina, antidescarboxilase do ácido glutâmico (GAD 65), antitirosinafosfatases (IA2 e IA2B) e antitransportador de zinco (Znt) (1A). Esses anticorpos podem estar presentes meses ou anos antes do diagnóstico clínico, ou seja, na fase pré-clínica da doença, e em até 90% dos indivíduos quando se detecta hiperglicemia (SBD, 2017-2018).
A taxa de destruição das células beta é variável, sendo, em geral, mais rápida entre as crianças. A forma lentamente progressiva ocorre em adultos, sendo referida como diabetes autoimune latente do adulto. O DM tipo I idiopático é corresponde à minoria dos casos e caracteriza-se pela ausência de marcadores de autoimunidade contra as células beta e não associação aos haplótipos do sistema HLA. Os indivíduos com essa forma de DM podem desenvolver cetoacidose e apresentam graus variáveis de deficiência de insulina. Como a avaliação dos autoanticorpos não se encontra disponível em todos os
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centros, a classificação etiológica do DM tipo I nas subcategorias autoimune e idiopática não é sempre possível (SBD, 2017-2018).
A estreptozotocina (STZ) é considerada o composto mais utilizado para induzir diabetes experimental em modelos animais (KING, 2012). STZ é um derivado N-nitroso de glicosamina (figura 1) extraído de Streptomyces acromogenes. É uma toxina de células beta pancreática-seletivo que induz necrose aleatória, rápida e irreversível das células beta. Muitos relatos na literatura indicam que a STZ é capaz de produzir de leve a graves tipos de diabetes, que variam de acordo com a dose escolhida, idade dos animais, estado nutricional e via de administração, juntamente com outros fatores. Portanto, os pesquisadores desenham seus próprios protocolos de indução de diabetes com STZ, incluindo a mimetização do DM tipo I, de acordo com as necessidades de cada estudo (QINNA; BADWAN, 2015).
Figura 1: Estrutura química da estreptozotocina. Fonte: PubChem (CID: 29327)
Outros tipos específicos de DM ocorrem devido a defeitos genéticos na função das células β pancreáticas, na ação da insulina, doenças exócrinas do pâncreas (tais como cística, fibrose), droga ou induzida quimicamente (tais como no tratamento do HIV / SIDA ou após algum transplante). Há ainda o Diabetes mellitus gestacional (DMG), que é um tipo de diabetes diagnosticado durante a gravidez que não é claramente o diabetes (ADA, 2019).
O DM tipo 2 é uma doença crônica metabólica poligênica, com grande contribuição de fatores ambientais, principalmente hábitos dietéticos e inatividade física, que contribuem para a obesidade, mas há um forte componente genético. O desenvolvimento e a cronicidade da hiperglicemia ocorrem em conjunto a resistência dos
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tecidos periféricos à ação da insulina, aumento da produção de glicose hepática, hiperglucagonemia, disfunção incretínica, aumento de lipólise e consequente aumento de ácidos graxos livres circulantes, aumento da reabsorção renal de glicose e graus variados de deficiência na síntese e na secreção de insulina pela célula β pancreática (DEFRONZO et al., 2009). Diferente do DM1, sua fisiopatologia não apresenta marcadores imunológicos específicos da doença e em pelo menos 80 a 90% dos casos, associa-se ao sobrepeso, obesidade e a outros elementos da síndrome metabólica (DEFRONZO et al., 2009).
Já na gestação, a placenta produz hormônios hiperglicemiantes e enzimas placentárias que degradam a insulina, consequente, há o aumento compensatório na síntese de insulina e na resistência à insulina, podendo evoluir para disfunção das células β pancreáticas, caracterizando o diabetes gestacional. Trata-se de uma intolerância glicídica de gravidade variável, que se iniciou durante a gestação, mesmo sem ter previamente preenchido os critérios diagnósticos de DM. Esta condição pode permanecer durante apenas a gestação ou persistir após o parto, sendo um fator de risco para desenvolvimento do DM tipo 2 (NEGRATO et al., 2016).
Outras condições que levam ao DM incluem defeitos genéticos na ação da insulina, decorrentes de mutações no gene do receptor de insulina, e doenças do pâncreas exócrino, como pancreatite, trauma, pancreatectomia e carcinoma pancreático. Além disso, a participação dos hormônios contrarreguladores da ação de insulina, tais como o hormônio de crescimento, cortisol e glucagon, podem levar ao desenvolvimento do DM. Medicamentos também são associados a alterações no metabolismo da glicose por meio de diminuição da secreção ou da ação da insulina e temos como exemplo os glicocorticoides, o ácido nicotínico e os antipsicóticos atípicos (ADA, 2019).
O DM tipo I, condição patológica alvo do nosso estudo, está associado a danos em longo prazo, com disfunção, e falha de vários órgãos e estruturas, especialmente pâncreas, rins, nervo, coração, vasos sanguíneos e pulmão. Também está associado a alterações no perfil de lipídeos plasmáticos e um aumento do risco de aterosclerose prematura, insuficiência coronária e infarto do miocárdio. (RAJAEI et al., 2015).
O principal impacto do DM sobre o sistema renal é angiopatia dos capilares nos glomérulos renais e alterações na microestrutura renal em si. Estes danos são induzidos pela hiperglicemia, espécies reativas de Oxigênio (EROs) e de Nitrogênio (ERNs). A baixa produção de insulina induz alterações nas vias glicolítica, polióis, das
pentose-12
fosfato e o aumento da gliconeogênese (ASMAT; ABAD; ISMAIL, 2016; CORTASSA et al., 2018). Além disso, resulta na hiperglicemia, que por sua vez, leva à formação de produtos finais de glicação avançada (AGEs), pela ligação covalente da glicose com proteínas por meio de uma reação não enzimática entre o grupo amino livre de um aminoácido e o grupo carbonila de açúcares nas formas cíclicas. A glicação, além de modificar a conformação molecular e alterar a função das proteínas, também leva à ativação de múltiplas vias de sinalização, como a via das proteínas-quinases ativadas por mitógenos (MAPK), que em resposta à interação dos AGES com receptores de superfície celular pode induzir a produção de EROs (SABERZADEH-ARDESTANI et al., 2018).
A atividade de enzimas antioxidantes, como a superóxido dismutase (SOD) que reduz o ânion superoxido em oxigênio e peróxido; catalase e glutationa peroxidase (GPx) que reduzem o peróxido de hidrogênio em água (sendo que a última utiliza a glutationa reduzida como substrato na reação) (figura 2) tendem a diminuir no diabetes. Essa diminuição na defesa antioxidante enzimática aliada ao aumento das espécies reativas provocam severas alterações na homeostase redox da célula, o que contribui para o desenvolvimento e progressão da diabetes e complicações relacionadas (HASKINS et al., 2003). O aumento na produção dos EROs pode contribuir para o aumento da peroxidação de lipídeos, o que prejudica a fluidez da membrana celular, altera a atividade das proteínas e enzimas a ela ligadas, assim como dos receptores celulares e proteínas de transporte. Isso resulta na produção do malonaldeído, utilizado como indicador de danos oxidativos em lipídeos (ANNADURAI et al., 2014) . Assim, amenizar o estresse oxidativo ou restabelecer a homeostase redox por meio do tratamento com antioxidantes pode ser uma estratégia eficaz para a redução das complicações diabéticas (OMODANISI; ABOUA; OGUNTIBEJU, 2017; SAMARGHANDIAN; AZIMI-NEZHAD; FARKHONDEH, 2017).
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Figura 2: Reações da defesa antioxidante enzimática contra espécies reativas de oxigênio. Fonte:
autoria própria do autor.
Muitos estudos vêm sendo realizados na tentativa de amenizar os malefícios desta enfermidade e, principalmente, aumentar a qualidade de vida dos pacientes. A insulina, como tratamento padrão do DM tipo I, pode parcialmente substituir uma deficiência celular, apenas resultando na manutenção da glicemia e não na cura da doença. Assim, variantes da insulina podem ser utilizados em uma combinação para um maior controle glicêmico, no entanto, o tratamento ainda é complicado e requer um acompanhamento atento e múltiplas injeções de insulina por dia. Além do fato da manutenção de glicose no sangue dentro da faixa fisiológica ser difícil de conseguir, especialmente em crianças e adolescentes (JOHANNESSON et al., 2015).
Os suplementos nutricionais vêm demonstrando potencial adjuvante no tratamento do DM por meio, principalmente, de suas propriedades na regulação de processos metabólicos dependentes de insulina. Diversos compostos suplementares têm sido utilizados para tratamento do diabetes, tais como zinco, luteína, citrato férrico, ômega 3, vitaminas A, E e C comumente encontrados no mercado, possuem propriedades benéficas no diabetes (TABEI et al., 2015; FATANI et al., 2015; MAREMANDA et al., 2016; SACAN et al., 2016; LIU et al., 2016).
A suplementação de creatina vem sendo pesquisada como uma possível terapia adjuvante do diabetes. Esta substância é um iminoácido (figura 3) naturalmente produzido por animais tendo como precursores três aminoácidos distintos: arginina, glicina e metionina. Na forma fosforilada, age na ressíntese de ATP, servindo como uma reserva energética essencial para a contração muscular (WILLIAMS et al., 2000; ARAÚJO et
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al., 2009;). OP’TEIJNDE et al., (2001) observaram que a creatina pode aumentar a expressão de receptores GLUT-4 e posteriormente, GUALANO et al., (2008) relataram uma maior captação de glicose com a suplementação de creatina possível por esta via. O aumento da concentração do glicogênio intramuscular após a suplementação com creatina (YOUNG et al., 2002) corrobora com o fato do aumento da captação de glicose.
Figura 3: Estrutura química da creatina. Fonte: PubChem (CID: 586)
A vasta possibilidade do uso terapêutico da creatina é bem documentada em diversas condições clínicas (GUALANO et al., 2012), por exemplo o DM tipo II, a qual ocorre desordens no metabolismo glicídico (GUALANO et al., 2011). Porém, o único estudo que avalia a suplementação de creatina no DM tipo I, não aprofunda na questão do metabolismo glicídico desta doença (RAHMANI et al., 2016).
Por último e não menos importante, um dos possíveis efeitos adversos mais discutidos no meio científico consiste na suspeita de que a suplementação de creatina poderia provocar um estresse ou até mesmo insuficiência renal. Alguns estudos de caso mostram que a suplementação de creatina provocou piora da função renal de pacientes com nefropatias (PRITCHARD; KALRA, 1998; BARISIC et al., 2002). Porém, Almada et al. (1996) verificaram que o uso agudo ou crônico (até 10 semanas) desse composto, em doses diárias de até 30 gramas não alterar a função renal de indivíduos saudáveis. Adicionalmente, com doses menores para manutenção (2 a 3 gramas), Robinson et al. (2000) mostraram que não houve mudanças clínicas da função renal de indivíduos saudáveis. Estes achados foram confirmados em estudos posteriores (CARVALHO et al., 2011).
Já em trabalhos que envolvem doenças renais pré-existentes e o uso da creatina, limitam-se ao modelo animal, além de serem escassos. Dentre estes, nota-se que mesmo os estudos controlados demonstram resultados contraditórios, sugerindo que cada doença
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deva ser investigada particularmente (EDMUNDS et al., 2001; TAES et al., 2003; FERREIRA et al., 2005; GENC et al., 2014).
Palm et al. (2004) demonstraram que o modelo experimental de DM tipo I induzido por estreptozotocina gera danos renais. Com isso, este presente estudo é pioneiro na investigação do efeito da creatina no DM tipo I, verificando desde os parâmetros clínicos à parâmetros do estado redox renal. Sendo assim, este trabalho tem como objetivo avaliar o efeito da suplementação de creatina em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina.
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2. OBJETIVOS GERAL E ESPECÍFICOS
OBJETIVO GERAL:
Avaliar o efeito da suplementação de creatina no estado redox do tecido renal de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
- Avaliar alteração de parâmetros clínicos e bioquímicos pela suplementação de creatina em ratos com DM tipo I induzidos por estreptozotocina;
- Determinar parâmetros indicadores do estado redox como peroxidação lipídica (TBARS), conteúdo de peroxido de hidrogênio, tióis e proteínas carboniladas no tecido renal.
- Analisar a atividade das enzimas antioxidantes catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase em tecidos renais.
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3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS
Foram utilizados 32 ratos machos da linhagem Wistar,pesando cerca de 200-250 g, provenientes do Biotério do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Os animais permaneceram alojados em caixas de polipropileno providas de bebedouro e comedouro. Foram alocados 3 ou 4 animais por gaiola, mantidas em condições controladas de temperatura (24±2°C) e de iluminação (ciclo de 12 horas claro/ 12 horas escuro) e receberam ração e água ad libitum. O peso de cada animal foi aferido a cada 7 dias, e o consumo de água e ração por gaiola foi verificado todos os dias ao longo do experimento. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comissão de Ética no Uso Animal da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, parecer número 030.025/2017 (Anexo 1).
3.2 GRUPOS EXPERIMENTAIS:
Os animais foram separados em 4 grupos: (C) animais controles e sem suplementação de creatina (n=8), (CCr) animais controles e com suplementação de creatina (n=8), (D) animais diabéticos induzidos com estreptozotocina sem suplementação (n=8), (DCr) animais diabéticos induzidos com estreptozotocina tratados com creatina (n=8).
Os animais dos grupos CCr e DCr receberam a suplementação de creatina por meio da ração isocalórica em 2 fases, de acordo com Hultman et al. (1996) e Vandenberghe et al. (1997). A primeira fase consiste no consumo de uma ração enriquecida a 13% de creatina para promover a saturação deste nutriente no organismo, sendo o protocolo uma adaptação do previamente descrito por Deminice et al. (2009). Esta fase foi executada durante 5 dias antes da indução do diabetes.
A segunda fase consiste no consumo de uma ração enriquecida a 2% de creatina para promover a manutenção da concentração deste nutriente no organismo do animal, de acordo com Deminice et al. (2009). Esta fase foi executada durante 35 dias pós-indução do diabetes. Os animais pertencentes aos grupos C e D receberão a ração isocalórica sem adição de creatina. O desenho experimental do estudo está representado na figura 1.
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Figura 4: Desenho experimental. Estreptozotocina (STZ). Fonte: autoria própria do autor.
3.3 INDUÇÃO DO DIABETES MELLITUS POR ESTREPTOZOTOCINA
Após jejum prévio de 14 horas, os animais de todos os grupos, exceto os controles (C e CCr) receberam dose única de estreptozotocina (40 mg/kg de peso corporal) dissolvida em tampão citrato de sódio 10 mM, pH 4,5, por meio de injeção intraperitoneal (SUJITHRA et al., 2019). Após 7 dias, a glicemia foi mensurada por meio de amostra sanguínea retirada da veia caudal com glicosímetro portátil (ONETOUCH® ULTRA®) para confirmação do diabetes. Foi considerado diabético o animal que apresentasse glicemia superior a 250 mg/dL. A cada 7 dias, a glicemia foi mensurada e registrada em todos os grupos, e o consumo de água e ração por gaiola foi verificado todos os dias ao longo do experimento.
3.4 CONFECÇÃO DA RAÇÃO COM CREATINA
A ração comercial para ratos foi triturada até que a mesma ficasse em pó, prioritariamente o mais fino possível. Na fase de saturação (13% de creatina), foi adicionado a cada quilograma (kg) desse pó, 130 g de creatina monohidratada (Delaware, Porto Alegre - RS, Brasil). Na fase de manutenção (2% de creatina) foi adicionado a cada quilo, 20 g de creatina monohidratada. Em seguida, a mistura foi homogenizada e a ela adicionados 150 mL de água a cada quilograma da mistura, a fim que a mesma fique com textura um pouco pastosa, porém, ainda firme. Após esse processo, a massa foi prensada em fôrmas cilíndricas para que fique na forma da ração comercial. Ao final, a ração foi secada (em uma sala com baixa umidade), para que a massa adquirisse dureza semelhante à ração comercial (esse processo de secagem leva em média 4 dias).
3.5 SINTOMATOLOGIA DO DIABETES
Durante o experimento, foi avaliado o peso corporal de cada animal com o auxílio de uma balança de precisão. De acordo com Eleazu e Okafor (2015), o percentual de ganho de peso foi calculado com a seguinte fórmula:
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% ganho de peso = Peso final−Peso inicial
Peso final
X 100
Para o consumo de água, foi padronizado 1000 mL de água por gaiola por dia. Uma proveta foi utilizada tanto para auxiliar a reposição da água nos bebedouros, como para realizar a verificação do volume de água residual diariamente. Assim, a subtração do volume reposto e do volume restante resultará no volume consumido. O resultado obtido foi divido pelo número de animais da caixa.
Para o consumo de ração, foi padronizado 150 g de ração por gaiola por dia. Utilizando uma balança de precisão, foram aferidos o peso de ração ofertada e o peso da ração restante. A subtração destes dois valores resultará na quantidade de ração consumida. O resultado obtido foi divido pelo número de animais da caixa.
Ao final do período experimental, o peso do rim direito de cada animal foi aferido. A fim de verificar alterações do peso renal, este valor foi normalizado fazendo-se a razão pelo peso corporal final.
3.6 EXAMES BIOQUÍMICOS
A glicemia foi verificada semanalmente por meio da amostra sanguínea retirada da veia caudal utilizando o glicosímetro portátil (ONETOUCH® ULTRA®). Os níveis de glicose, creatinina e a ureia sérica, aspartato transaminase (AST) e aspartato aminotransferase (ALT) foram analisados ao final do experimento por meio da amostra sanguínea retirada da veia porta hepática. Essas amostras foram colocadas em tubos de ensaio e após 6h submetidos a centrifugação (5000 x g) durante 15 minutos. Em seguida o soro foi coletado destas amostras. Testes enzimáticos colorimétricos específicos de cada parâmetro a ser quantificado foram utilizados (Labtest, Lagoa Santa - MG, Brasil), seguindo o protocolo do fabricante e a absorbância foi medida em espectofotômetro.
3.7 EXTRAÇÃO PROTEÍCA DO TECIDO RENAL
Para a extração das proteínas solúveis, 100 mg de tecido renal foi macerado em almofariz com nitrogênio líquido. Em seguida, 1,0 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 7,0 contendo 1 mM de ácido L-ascórbico e 0,1 mM de EDTA foi adicionado, homogeneizado e transferido para microtubos (tipo Eppendorf®) de 2 mL. Estes foram
centrifugados a 13.000 x g (Centrífuga Hettich. Modelo MIKRO 200R. Tuttlingen, Alemanha) por 20 minutos, à temperatura de 4ºC. O sobrenadante foi filtrado e coletado sendo considerado a fração de proteínas solúveis totais. O mesmo foi armazenado à
20
temperatura de -20ºC, para determinação das atividades enzimáticas. A determinação da concentração de proteínas solúveis totais foi realizada por meio do método descrito por BRADFORD (1976).
3.8 ATIVIDADE DAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES
A determinação da atividade de catalase (CAT) (EC 1.11.1.6) foi determinada pela adição de 50 µL do extrato proteico (diluído 1:5) a 2,95 mL de uma solução tampão fosfato de potássio 50 mM pH 7,0 aquecida a 30ºC, contendo H2O2 20mM. A leitura foi
feita em espectrofotômetro (Amersham Biosciences. Modelo: Ultrospec 2100 pro. Cambridge, Inglaterra) na absorbância de 240 nm por 5 minutos, a cada 30 segundos. A atividade da enzima foi calculada a partir do consumo de H2O2, utilizando o coeficiente
de extinção molar, calculado nestas mesmas condições, de 40 mM-1. cm-1 (HAVIR; MCHALE, 1987).
A atividade da superóxido dismutase (SOD) (EC 1.15.1.1) foi determinada pela inibição da redução do NBT (Nitroblue tetrazolium) pelo extrato proteico, evitando assim a formação do cromóforo. Neste ensaio, uma unidade de atividade enzimática (UA) de SOD é considerada como a quantidade de enzima necessária para obter 50% de inibição da redução de NBT pela SOD contida no extrato. Alíquotas de 10 µL do extrato (diluído 1:2) foram transferidos para uma microplaca protegida da luz, contendo tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7,8, 0,1 mM de EDTA, 13 mM de L-metionina e 75 µM de NBT. A reação foi iniciada após a adição de 2 uL de riboflavina e a transferência dessa placa para uma câmara iluminada por uma lâmpada fluorescente, durante um período de 1 minuto. Em seguida, foi realizada a leitura da placa a 560 nM em espectrofotômetro (Espectrofotômetro Femto 700 plus – São Paulo/SP, Brasil) e a atividade determinada pelo cálculo da quantidade de extrato que inibiu 50% da redução de NBT e expresso em unidade de atividade (UA) g-1 MF min-1 (LONGO et al., 2008).
A atividade de glutationa peroxidase (GPx) (EC 1.11.1.9) foi determinada pela adição de 25 µL de glutationa redutase (GR) 10 U/mL, 100 µL de glutationa reduzida (GSH) 1 μM, 100 μL de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) 250 nM, 100 µL da amostra diluída 1:5 e 100 µL de H2O2 2,5% em 575 µL tampão fosfato de
potássio 50 mM, pH 7,0. A leitura foi feita em espectrofotômetro (Femto. Modelo: 800 XI. São Paulo/SP, Brasil) na absorbância de 340 nm a cada 30 segundos por 5 minutos.
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3.9 EXTRAÇÃO ÁCIDA
Amostras de rim pesando 100 mg foram trituradas em almofariz com N2 líquido
e ao extrato adicionado 1 mL de solução de ácido tricloroacético (TCA) 1% com carvão ativado 0,5%. Cada mistura foi transferida para microtubos tipo eppendorf de 1,5 mL e centrifugada a 13.000 x g a 4ºC por 25 minutos (Centrífuga Hettich. Modelo MIKRO 200R. Tuttlingen, Alemanha). O sobrenadante foi coletado e armazenado para ensaios posteriores (LIMA et al., 2015).
3.10 DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE H2O2
O conteúdo de H2O2 das amostras foi mensurado utilizando os extratos com TCA
1%, por meio da reação específica do H2O2 com o iodeto de potássio (KI) (JALEEL et
al., 2008). Para o ensaio foram utilizados 50 µL de extrato, 450 µL de TCA 1% (diluição 1:10) para todas as amostras e adicionados a estes 500 µL de tampão fosfato de potássio 10 mM, pH 7,0, e 1 mL de solução KI 1M. Os tubos utilizados foram colocados no escuro e após 1 hora, lidos a 390 nm em espectrofotômetro (Amersham Biosciences. Modelo: Ultrospec 2100 pro. Cambridge, Inglaterra) contra um branco de referência composto por TCA 1% e as soluções anteriormente utilizadas. O conteúdo de H2O2 foi calculado a partir
de uma curva padrão da solução reagente de iodeto de potássio (KI), realizada com soluções em diferentes concentrações de H2O2, preparadas em TCA 1%. Os resultados
foram expressos em μmol. g-1 MF.
3.11 QUANTIFICAÇÃO DA PEROXIDAÇÃO DE LIPÍDEOS (TBARS)
A peroxidação de lipídeos foi mensurada a partir da quantidade de malonildialdeído (MDA) do extrato de cada tecido, por meio de sua reação específica com o ácido tiobarbitúrico (TBA), reação na qual é gerado um cromóforo de cor avermelhada. No ensaio foi utilizado 500 µL dos extratos (diluído 1:5) obtidos com TCA 1% e adicionado a 2 mL da solução contendo TBA a 0,5% dissolvido em TCA a 20%. Os tubos foram fechados e a mistura ficou incubada em banho-maria a 100ºC, por 1h, e em seguida resfriados em banho de gelo por 15 minutos. Logo em seguida, os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 3.500 x g e lidos nos comprimentos de onda de 532 e 660 nm (Amersham Biosciences. Modelo: Ultrospec 2100 pro. Cambridge, Inglaterra). A quantidade do complexo MDA-TBA formada foi calculada por meio do coeficiente de
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extinção molar de 155 mM-1. cm-1. Os resultados foram expressos em nmol. g-1 MF. (HEATH; PACKER, 1968).
3.12 DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE PROTEINAS CARBONILADAS
Derivados carbonílicos podem ser mensurados por métodos sensíveis, particularmente aqueles que utilizam o 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH). Neste método, o DNPH reage com grupos carbonílicos gerando a hidrazona correspondente, a qual pode ser analisada espectrofotometricamente (LEVINE et al., 1994). Para realização da dosagem, 200 mg de tecido renal foram homogeneizados em 600 μL de tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7,0 (PBS) e em seguida o homogenato foi centrifugado a 3000 x g por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi retirado e transferido para um novo tubo. 1 mg de proteína de cada amostra foi ressuspendido para o volume de 200 μL de tampão PBS, foi adicionado 200 μL de TCA 20%, foram misturadas em vórtex e colocadas no gelo por 5 minutos. Em seguindo, foram centrifugadas a 4000 g por 5 minutos em temperatura ambiente e o sobrenadente foi descartado. A fração insolúvel foi ressuspendida em 100 µL de uma solução contendo NaOH 200 mM com uso do vórtex. Em seguida, 100 µL de HCl a 2 M foi adicionado no branco das amostras e 100 µL de DNPH 10 mM nas amostras em seguida, foram incubadas a 25 ºC durante 1 hora, sendo misturadas no vórtex a cada 15 minutos. No passo seguinte, foi adicionado 100 µL de TCA 20% em cada tubo e centrifugados a 16000 x g por 5 minutos. Os precipitados em dos tubos foram lavados com 500 µL da mistura etanol/acetato de etila, na proporção de 1:1 para remoção do excesso de DNPH, misturados no vórtex, novamente centrifugados e essa lavagem foi realizada 3 vezes. Ao final das lavagens, a fração insolúvel foi ressuspendida com 1 mL de ureia 8M pH 2,3. As absorbâncias dos sobrenadantes foram determinadas a 370 nm em espectrofotômetro (Femto. Modelo: 800 XI. São Paulo/SP, Brasil). Os resultados são expressos em nmol de proteína carbonilada por mg de proteína. O conteúdo de DNPH incorporado foi calculado utilizando o coeficiente de extinção molar do DNPH (22.000 M-1cm-1).
3.13 DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE TIOL SOLÚVEIS
O conteúdo de tióis solúveis foi determinado usando o método colorimétrico de Ellman (1959) e Riddles (1979). De acordo com este método, os grupos sulfidrila (SH)
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das proteínas reagem com o 5,5’-ditiobis-(2-ácido nitrobenzóico) (DTNB) originando um derivado de coloração amarela com um máximo de absorção a 412 nm, o qual pode ser quantificado por espectrofotometria. Amostras de tecido renal extraídas com TCA a 1% foram incubadas com DTNB a 3 mM. As misturas foram centrifugadas a 750 x g por 5 minutos, em seguidas transferidas para um novo tubo. Em simultâneo, foi preparado uma série de padrões de cisteína utilizando as mesmas condições das amostras. Após a incubação, as absorbâncias das amostras e dos padrões foram avaliadas em espectrofotômetro 412 nm. O conteúdo total de tióis de cada amostra foi determinado a partir da curva padrão de cisteína e expresso em equivalentes de cisteína µM/mg proteína.
3.14 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Todos os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (SEM) e analisados estatisticamente. Foi feito teste de normalidade dos dados das análises de medidas únicas pelo teste Kolmogorov-Smirnov. Para os dados de medidas únicas, foi utilizado o teste paramétrico ANOVA one-way, seguido do pós-teste de Bonferroni para comparações múltiplas. As análises de medidas repetidas foram feitas por meio da ANOVA two-way, seguido do pós-teste de Bonferroni. O nível de significância foi considerado p≤0,05.
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4. RESULTADOS
4.1 Sintomatologia do Diabetes
Ao final do experimento, dois animais morreram, um de cada grupo diabético. Em relação ao consumo de água (figura 5A), observou-se que os grupos diabéticos apresentaram polidipsia após a confirmação do diabetes (p<0,001).
Em relação ao consumo de ração (figura 5B), os grupos diabéticos apresentaram polifagia após a confirmação do diabetes (p<0,001). Porém, não houve diferença significativa com a suplementação de creatina.
No percentual de ganho de peso (figura 5C), os grupos controles ganharam peso ao longo do experimento e os grupos diabéticos perderam peso significativamente (p>0,001). Apesar de não ter apresentado diferença estatística entre os grupos diabéticos, observamos durante o experimento que os animais do grupo DCr estavam menos caquéticos e mais ativos fisicamente em relação aos animais do grupo D, além das caixas apresentarem menos excrementos.
No peso relativo renal (figura 5D), houve uma hipertrofia significativa (p<0,001) dos grupos diabéticos em comparação aos grupos controles. O grupo diabético que recebeu a suplementação de creatina (DCr) apresentou uma hipertrofia renal significativamente maior (p<0,001) em comparação ao grupo D.
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Figura 5. Quantificação da ingestão de água (A) e consumo de ração (B) por dia dos grupos C, CCr, D e
DCr em 7 pontos de avaliação durante o protocolo experimental de 40 dias. Quantificação do ganho de peso (C) e peso relativo renal (D) ao final do período experimental de 40 dias. O gráfico representa média
± EPM. * p<0,05 para C e CCr vs D e DCr. ** p<0,01 para C e CCr vs D e DCr. *** p<0,001 para C e CCr
vs D e DCr. C) Ganho de peso: b p<0,001. D) Peso relativo renal: b p<0,001 e c p<0,001.
4.2 Exames bioquímicos
Ao longo do experimento, a glicemia capilar foi verificada semanalmente e todos os animais dos grupos diabéticos permaneceram hiperglicêmicos (dados não mostrados). Na glicemia de jejum mensurada ao final do experimento (figura 6A), verificou-se que os grupos diabéticos apresentaram glicemia aumentada significativamente em relação aos controles (p<0,001). A suplementação com creatina diminuiu significativamente a hiperglicemia do diabetes no grupo DCr em relação ao grupo diabético não suplementado (p<0,05).
Ao final do período experimental, os níveis séricos de creatinina (figura 6B) e ureia (figura 8) foram também mensurados. Os quatro grupos experimentais não
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apresentaram alterações significativas nos níveis séricos de creatinina ao final do protocolo experimental. No entanto, quando se avaliou a ureia sérica (figura 6C), houve um aumento significativo (p<0,001) dos grupos diabéticos em comparação aos grupos controles. Assim como o observado para a glicemia em jejum, o grupo diabético que recebeu a suplementação de creatina (DCr) apresentou níveis séricos de ureia significativamente menores (p<0,001) em comparação ao grupo D.
Os níveis séricos de AST (figura 6D) e ALT (figura 6E) também foram quantificados ao final do experimento. Sobre os níveis séricos de AST, não foram observadas alterações significativas entre os grupos. Porém, os níveis séricos de ALT apresentaram um aumento significativo (p<0,001) dos grupos diabéticos em comparação aos grupos controles. E o grupo DCr apresentou níveis de ALT significativamente menores (p<0,01) em comparação ao grupo D.
Figura 6. Glicemia de jejum (A), creatinina sérica (B), ureia sérica (C), aspartato aminotransferase sérica
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O gráfico representa média ± EPM. A) Glicemia: b p<0,001 e c p<0,05. C) Ureia sérica: b p<0,001 e c
p<0,001. E) ALT: b p<0,001 e c p<0,01.
4.3 Atividade das enzimas antioxidantes e parâmetros redox
Ao final do experimento, secções do rim foram utilizadas para quantificação da atividade de enzimas antioxidantes. Na atividade de CAT (figura 7A), SOD (figura 7B) e GPx (figura 7C), o grupo D apresentou uma diminuição significativa (p<0,01) em comparação aos grupos controles e ao grupo DCr nas três enzimas. Não houve diferença estatística entre os grupos controles e o grupo DCr nas três enzimas.
Na quantificação do conteúdo de H2O2 (figura 8A), houve um aumento
significativo (p<0,01) do grupo diabético (D) não suplementado em comparação aos grupos controles (C e CCr). Esta mesma diferença não foi observada no grupo suplementado (DCr), o qual não apresentou diferenças significativas em relação aos grupos controles e apresentou conteúdo de H2O2 significativamente menor (p<0,001)
quando comparado ao grupo D.
Ao quantificar o conteúdo de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (figura 8B), foi observado que o grupo controle suplementado (CCr) apresentou um aumento significativo (p<0,001) em comparação ao grupo controle não suplementado (C) e ambos grupos diabéticos (D e DCr).
Na quantificação do conteúdo de proteínas carboniladas (figura 8C), o grupo D apresentou uma diminuição significativa (p<0,05) em comparação aos demais grupos. E não houve diferença estatística entre os grupos controles e o grupo DCr.
Já na quantificação do conteúdo de tióis solúveis (figura 8D), não houve diferença entre os grupos experimentais.
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Figura 7. Atividade de catalase (A), superóxido dismutase (B) e glutationa peroxidase (C) renal dos grupos
C, CCr, D e DCr ao final do protocolo experimental. O gráfico representa média ± EPM. A) Catalase: b
p<0,01. B) Superóxido dismutase: b p<0,01. C) Glutationa peroxidase: b p<0,001.
Figura 8. Conteúdo de peróxido de hidrogênio (A), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (B),
proteínas carboniladas (C) e tiol solúvel (D) renal dos grupos C, CCr, D e DCr ao final do protocolo experimental. O gráfico representa média ± EPM. A) Conteúdo de peróxido de hidrogênio: b p < 0,01. B)
Conteúdo de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico: b p<0,001. C) Conteúdo de proteínas carboniladas: b p<0,05.
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5. DISCUSSÃO
As características clássicas do DM1, como a perda de peso, polidipsia, poliúria e polifagia, além da hiperglicemia foram observadas durante todo o experimento nos animais induzidos ao diabetes pela STZ, corroborando com estudos de Lerco et al. (2003), Delfino et al. (2002) e Oliveira et al. (2012).
A redução de peso no DM caracteriza-se pelas alterações no metabolismo dos carboidratos, lipídeos e aumento do catabolismo proteico (RAJAEI et al., 2015). No presente estudo, apesar de não interferir na polifagia, o tratamento com creatina não foi capaz de atenuar a perda de peso nos ratos diabéticos durante o experimento.
A relação da creatina com o processo de desidratação é amplamente discutido na literatura, visto que esta é uma substância osmoticamente ativa (DALBO et al. 2008). Dessa forma, a maior quantidade de água retida intramuscularmente e a menor liberação de água para o meio extracelular levaria à desidratação (POWERS et al. 2003). Porém, em nosso estudo, a terapia com a creatina monohidratada não agravou o quadro de polidipsia. Assim, corroborando com os achados de Lopez et al. (2009), que por meio de revisão metanalítica confirmou que nenhum dos estudos que atenderam aos critérios de qualidade respalda a creatina como fator prejudicial do balanço hídrico.
Nosso estudo mostrou que o tratamento com creatina foi capaz de reduzir a glicemia do diabetes, corroborando, primeiramente, com Ferrante et al. (2000) que demonstraram que a creatina foi eficaz no retardo da hiperglicemia em modelo experimental de doença de Huntington. Em adição, nossos resultados convergem com os obtidos por Gualano et al. (2011), que também observaram redução da hiperglicemia utilizando a creatina em pacientes diabéticos tipo II. Como o diabetes tipo I se caracteriza pela produção ineficiente de insulina, é provável que este resultado tenha sido devido a um aumento da expressão e translocação do transportador de glicose GLUT-4 nas células do músculo estriado esquelético, como visto por outros autores (OP’TEIJNDE et al., 2001; GUALANO et al., 2011).
No contexto do DM, alguns exames laboratorias devem ser analisados para melhor entendemos as alterações sistêmicas observadas. Desta forma creatina, ureia e transaminases foram quantificadas.
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Em nosso estudo observamos um aumento da ureia sérica no grupo D e o tratamento com creatina foi capaz diminuir significativamente este parâmetro. A ureia sérica pode ser considerado um indicador, quando aumentada, para desidratação, perda ponderal, disfunção renal e hepática (STEVENS; LEVEY, 2005). Este fato reforça nossos resultados de ingestão hídrica e peso no grupo D. Apesar do grupo DCr teve uma ingestão hídrica sem diferença significativa comparado ao grupo D, o tratamento com a creatina induziu uma redução significativa nos níveis de ureia sérica. Esse resultado no grupo DCr pode estar mais relacionado a outros fatores (atenuação da perda de peso, função renal e/ou hepática preservada) do que a ingestão hídrica por si.
Adicionalmente, a ureia também se relaciona com degradação proteica muscular, e subsequentemente, a perda de peso (STEVENS; LEVEY, 2005), os resultados do presente estudo monstram que o grupo DCr teve uma perda de peso visualmente menor comparado ao grupo D, o que corrobora com a redução significativa nos níveis de ureia sérica. A própria ureia pode ser considerada um biomarcador de lesão hepática, assim como o nível sérico de ALT (STEVENS; LEVEY, 2005). Neste contexto, nossos resultados de ureia e ALT atestam-se entre si, visto que em ambos os casos, o grupo tratado com creatina obteve níveis séricos destes marcadores significativamente menores comparados ao grupo D.
Em adição, a ALT é uma enzima essencial na gliconeogênese, via metabólica fundamental no diabetes e realizada no tecido hepatico e renal, respectivamente de acordo com a escala de contribuição para tal processo (ALSAHLI; GERICH, 2017; GERICH, 2010). Nossos resultados de ALT e ureia sérica no grupo D pode ser interpretado como um aumento da gliconeogênese a nível sistêmico e do catabolismo proteico, uma vez que a ureia é o principal produto do ciclo da ornitina. Nossa hipótese sobre os resultados desses parâmetros no grupo DCr é que a suplementação de creatina pode exercer um efeito anticatabólico proteico e/ou confere um efeito protetor ao tecido hepático e/ou renal.
A suplementação da creatina monohidratada em modelo experimental de DM1 foi capaz de melhorar o quadro de hiperglicemia e uremia, além de diminuir os níveis de ALT e atenuar os efeitos do diabetes na atividade das enzimas CAT e SOD.
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A creatina possui notória ação antioxidante, atestado por LAWLER et al. (2002) e SESTILI et al. (2006) em que demonstraram a creatina como um sequestrador direto de espécies reativas em um ambiente in vitro. Este fato aliado a nossos resultados da creatina sobre a CAT, SOD e GPx, corrobora com os achados de STEFANI et al. (2014) em que a creatina modulou a atividade antioxidante enzimática em ratos submetidos ao treinamento resistido.
Apesar da creatina não ter melhorado o conteúdo de TBARS no diabetes e assim, apresenta resultado diferente desse marcador de peroxidação lipídica em relação a estudos anteriores em condições de estresse metabólico (DEMINICE et al., 2013; STEFANI et al. 2014), observamos a melhora com a suplementação de creatina no diabetes sobre o conteúdo de H2O2. Isto reforça o fato da creatina ser um agente antioxidante direto de
espécies reativas de oxigênio.
Não houve diferença estatística entre os grupos do nosso estudo no conteúdo de tiol solúvel, divergindo com os resultados encontrados por WIEDENMANN et al., (2018). Foram encontradas diferenças significativas entre os níveis de carbonilação proteica entre os grupos controles e DCr em relação ao grupo D. Esse parâmetro é um indicativo utilizado para quantificar alterações oxidativas em resíduos de aminoácidos de proteínas (BEAL et al., 2002). O baixo nível de danos oxidativos nas proteínas em grupo D e a não alteração desse parâmetro no grupo DCr podem ser explicados pela alta taxa de renovação proteica do rim, além de que o próprio diabetes induz a remodelação molecular por meio de proteases, o que poderia modular os níveis desse marcador (SINGH et al., 2018). Portero-Otín (1999) sugeriu que a diminuição ou não alteração de proteínas carboniladas em ratos diabéticos pode ser decorrente do aumento na atividade de proteases em proteínas alteradas oxidativamente. Além disso, a degradação de proteínas modificadas oxidativamente, em geral, é feita prioritariamente em relação a proteínas nativas (SAMARDZIC; RODGERS, 2017). Fato que reforça nossas hipóteses citadas.
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6. CONCLUSÃO
O presente estudo demonstrou que o uso da creatina em animais diabéticos foi eficaz em melhorar o quadro de alguns exames laboratoriais clássicos no DM tipo I (especificamente, glicemia, ureia e ALT), bem como em restabilizar parâmetro de estado redox renal (conteúdo de H2O2) e normalização da atividade de enzimas
antioxidantes (CAT, SOD e GPx). Desta forma, sugerimos que a creatina possa ser um produto promissor para futuras aplicações clínicas no DM associadas com outras terapias.
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7. REFERÊNCIAS
ALMADA, A. et al. Impact of chronic creatine supplementation on serum enzyme concentrations. FEDERATION AMER SOC EXP, 1996.
AMERICAN DIABETES ASSOCIATION. Standards of Medical Care in Diabetes— 2019. Diabetes Care, 42 (suppl. 1): S13-S98, 2019.
ANNADURAI, T. et al. Variations in erythrocyte antioxidant levels and lipid peroxidation status and in serum lipid profile parameters in relation to blood haemoglobin A1c values in individuals with type 2 diabetes mellitus. Diabetes Research and Clinical
Practice, [s. l.], v. 105, n. 1, p. 58–69, 2014.
ALSAHLI, Mazen; GERICH, John E. Renal glucose metabolism in normal physiological conditions and in diabetes. Diabetes Research and Clinical Practice, v. 133, p. 1–9, 2017.
ARAÚJO, M; MELLO, M. A. Exercício, estresse oxidativo e suplementação com creatina. Revista Brasileira de Nutrição Esportiva, v. 3, n. 15, 2012.
ASMAT, Ullah; ABAD, Khan; ISMAIL, Khan. Diabetes mellitus and oxidative stress-A concise review. Saudi pharmaceutical journal: SPJ: the official publication of the
Saudi Pharmaceutical Society, v. 24, n. 5, p. 547–553, 2016.
BARISIC, N. et al. Effects of Oral Creatine Supplementation in a Patient with MELAS Phenotype and Associated Nephropathy. Neuropediatrics, v. 33, n. 3, p. 157–161, 2002. BEAL, M.Flint. Oxidatively modified proteins in aging and disease. Free radical biology
& medicine, v. 32, n. 9, p. 797–803, 2002.
BRADFORD, Marion M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.
ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, v. 72, p. 248–254, 1976.
CARVALHO, Ana Paula Perillo Ferreira; MOLINA, Guilherme Eckhardt; FONTANA, Keila Elizabeth. Suplementação com creatina associada ao treinamento resistido não
34
altera as funções renal e hepática. Revista Brasileira de Medicina do Esporte, v. 17, n. 4, p. 237–241, 2011.
CORTASSA, Sonia et al. Metabolic remodelling of glucose, fatty acid and redox pathways in the heart of type 2 diabetic mice. The Journal of Physiology, 2018.
DALBO et al. Putting to rest the myth of creatine supplementation leading to muscle cramps and dehydration. Br J Sports Med., v.42, n.7, p.567-573, 2008.
DEFRONZO, R. A. Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes, v. 58, n. 4, p. 773–95, 2009.
DELFINO, V. D. A. et al. Diabetes mellitus induzido por estreptozotocina: comparação em longo prazo entre duas vias de administração. J. Bras. Nefrol., v. 24, n. 1, p. 31-36, 2002.
DEMINICE, Rafael et al. Effects of creatine supplementation on homocysteine levels and lipid peroxidation in rats. British Journal of Nutrition, v. 102, n. 1, p. 110, 2009. DEMINICE, Rafael et al. Effects of creatine supplementation on oxidative stress and inflammatory markers after repeated-sprint exercise in humans. Nutrition, v. 29, n. 9, p. 1127–1132, 2013.
EDMUNDS, J. W. et al. Creatine supplementation increases renal disease progression in Han:SPRD-cy rats. American journal of kidney diseases: the official journal of the
National Kidney Foundation, v. 37, n. 1, p. 73–78, 2001.
ELEAZU, Chinedum O.; OKAFOR, Polycarp. Use of unripe plantain (Musa paradisiaca) in the management of diabetes and hepatic dysfunction in streptozotocin induced diabetes in rats. Interventional Medicine & Applied Science, v. 7, n. 1, p. 9, 2015.
ELLMAN, G. L. Tissue sulfhydryl groups. Archives of biochemistry and biophysics, v. 82, n. 1, p. 70–7, 1959.
35
FATANI, Amal J. et al. Lutein Dietary Supplementation Attenuates Streptozotocin-induced testicular damage and oxidative stress in diabetic rats. BMC Complementary
and Alternative Medicine, v. 15, n. 1, p. 204, 2015.
FERRANTE, R.J; et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic model of Huntington disease. J Neurosci., v.20, n.12, p. 4389-4397, 2000.
FERREIRA, Larissa Gorayb et al. Effects of creatine supplementation on body composition and renal function in rats. Medicine and science in sports and exercise, v. 37, n. 9, p. 1525–9, 2005.
GENC, Gurkan et al. Effect of free creatine therapy on cisplatin-induced renal damage.
Renal Failure, v. 36, n. 7, p. 1108–1113, 2014.
GERICH, J. E. Role of the kidney in normal glucose homeostasis and in the hyperglycaemia of diabetes mellitus: therapeutic implications. Diabetic Medicine, v. 27, n. 2, p. 136, 2010.
GUALANO, B. et al. Effects of creatine supplementation on glucose tolerance and insulin sensitivity in sedentary healthy males undergoing aerobic training. Amino Acids, v. 34, n. 2, p. 245–250, 2008.
GUALANO, BRUNO et al. Creatine in type 2 diabetes: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Medicine & Science in Sports & Exercise, v. 43, n. 5, p. 770– 778, 2011.
GUALANO, Bruno et al. In sickness and in health: the widespread application of creatine supplementation. Amino Acids, v. 43, n. 2, p. 519–529, 2012.
HASKINS, Kathryn et al. Oxidative stress in type 1 diabetes. Annals of the New York
Academy of Sciences, v. 1005, p. 43–54, 2003.
HAVIR, E. A.; MCHALE, N. A. Biochemical and developmental characterization of multiple forms of catalase in tobacco leaves. Plant physiology, v. 84, n. 2, p. 450–5, 1987.
36
HEATH, Robert L.; PACKER, Lester. Photoperoxidation in isolated chloroplasts: I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Archives of Biochemistry and
Biophysics, v. 125, n. 1, p. 189–198, 1968.
HULTMAN, E. et al. Muscle creatine loading in men. Journal of Applied Physiology, v. 81, n. 1, p. 232–237, 1996.
IDF DIABETES ATLAS. 8th- Edition, 2017.
JALEEL, C.Abdul et al. Exogenous application of triadimefon affects the antioxidant defense system of Withania somnifera Dunal. Pesticide Biochemistry and Physiology, v. 91, n. 3, p. 170–174, 2008.
JOHANNESSON, B. et al. Toward beta cell replacement for diabetes. The EMBO
Journal, v. 34, n. 7, p. 841–855, 2015.
KING, Aileen J. F. The use of animal models in diabetes research. British journal of
pharmacology, v. 166, n. 3, p. 877–94, 2012.
LERCO, M. M. et al. Caracterização de um modelo experimental de Diabetes Mellitus, induzido pela aloxana em ratos: estudo clínico e laboratorial. Acta Cir. Bras, v.18, n.2, p. 132-142, 2003.
LEVINE, R. L. et al. Carbonyl assays for determination of oxidatively modified proteins.
Methods in enzymology, v. 233, p. 346–57, 1994.
LIMA, Tanes I. et al. Effect of exercise training on liver antioxidant enzymes in STZ-diabetic rats. Life Sciences, v. 128, p. 64–71, 2015.
LIU, Kai-Li et al. Dose-related effects of ferric citrate supplementation on endoplasmic reticular stress responses and insulin signalling pathways in streptozotocin-nicotinamide-induced diabetes. Food & function, v. 7, n. 1, p. 194–201, 2016.
LONGO, Umile Giuseppe et al. Oxygen species and overuse tendinopathy in athletes.
37
LOPEZ, Rebecca M. et al. Does creatine supplementation hinder exercise heat tolerance or hydration status? A systematic review with meta-analyses. Journal of athletic
training, v. 44, n. 2, p. 215–23, 2009.
MAREMANDA, Krishna Prahlad; KHAN, Sabbir; JENA, G. B. Role of Zinc Supplementation in Testicular and Epididymal Damages in Diabetic Rat: Involvement of Nrf2, SOD1, and GPX5. Biological Trace Element Research, v. 173, n. 2, p. 452–464, 2016.
NEGRATO, C.A; ZAJDENVERG, L; MONTENEGRO JÚNIOR, R.M. Diabetes melito e gestação. In: Vilar L, editor. Endocrinologia clínica. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. 716-29, 2016.
OLIVEIRA, G.; VOJCIECHOVISK, I. Monitoramento da Diabetes Mellitus em ratos
wistar induzidos com aloxana em diferentes doses. Dissertação de mestrado em
ciências animal, Presidente Prudente, 2012.
OMODANISI, Elizabeth I.; ABOUA, Yapo G.; OGUNTIBEJU, Oluwafemi O. Assessment of the Anti-Hyperglycaemic, Anti-Inflammatory and Antioxidant Activities of the Methanol Extract of Moringa Oleifera in Diabetes-Induced Nephrotoxic Male Wistar Rats. Molecules (Basel, Switzerland), v. 22, n. 4, 2017.
OP ’T EIJNDE, B. et al. Effect of oral creatine supplementation on human muscle GLUT4 protein content after immobilization. Diabetes, v. 50, n. 1, p. 18–23, 2001.
PALM, Fredrik et al. Differentiating between effects of streptozotocin per se and subsequent hyperglycemia on renal function and metabolism in the streptozotocin-diabetic rat model. Diabetes/Metabolism Research and Reviews, v. 20, n. 6, p. 452– 459, 2004.
PORTERO-OTÍN, M. et al. Diabetes induces an impairment in the proteolytic activity against oxidized proteins and a heterogeneous effect in nonenzymatic protein modifications in the cytosol of rat liver and kidney. Diabetes, v. 48, n. 11, p. 2215–20, 1999.
POWERS et al. Creatine supplementation increases total body water without altering fluid distribution. J Athl Train. v.38, n. 1, p. 44-50, 2003.
38
PRITCHARD, N. R.; KALRA, P. A. Renal dysfunction accompanying oral creatine supplements. Lancet (London, England), v. 351, n. 9111, p. 1252–3, 1998.
QINNA, Nidal; BADWAN, Adnan. Impact of streptozotocin on altering normal glucose homeostasis during insulin testing in diabetic rats compared to normoglycemic rats. Drug
Design, Development and Therapy, v. 9, p. 2515, 2015.
RAHMANI, Asghar et al. The Effects of Creatine Monohydrate on Permeability of Coronary Artery Endothelium and Level of Blood Lipoprotein in Diabetic Rats. Annals
of clinical and laboratory science, v. 46, n. 5, p. 495–501, 2016.
RAJAEI, Ziba et al. Antihyperglycemic and antihyperlipidemic effects of hydroalcoholic extract of Securigera securidaca seeds in streptozotocin-induced diabetic rats. Advanced
biomedical research, v. 4, p. 33, 2015.
RIDDLES, P. W.; BLAKELEY, R. L.; ZERNER, B. Ellman’s reagent: 5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid): a reexamination. Analytical biochemistry, v. 94, n. 1, p. 75–81, 1979. ROBINSON, Tristan M. et al. Dietary creatine supplementation does not aVect some haematological indices, or indices of muscle damage and hepatic and renal function. Br
J Sports Med, v. 34, p. 284–288, 2000.
SABERZADEH-ARDESTANI, Bahar et al. Type 1 Diabetes Mellitus: Cellular and Molecular Pathophysiology at A Glance. Cell journal, v. 20, n. 3, p. 294–301, 2018. SACAN, Ozlem et al. Zinc supplementation ameliorates glycoprotein components and oxidative stress changes in the lung of streptozotocin diabetic rats. Biometals : an
international journal on the role of metal ions in biology, biochemistry, and medicine, v. 29, n. 2, p. 239–48, 2016.
SAMARDZIC, Kate; RODGERS, Kenneth J. Oxidised protein metabolism: recent insights. Biological Chemistry, v. 398, n. 11, 2017.
SAMARGHANDIAN, Saeed; AZIMI-NEZHAD, Mohsen; FARKHONDEH, Tahereh. Immunomodulatory and antioxidant effects of saffron aqueous extract (Crocus sativus L.) on streptozotocin-induced diabetes in rats. Indian heart journal, v. 69, n. 2, p. 151–159, 2017.
