Caracterização molecular do processo de inativação da toxina tetânica

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Caracterização molecular do processo de inativação da toxina tetânica

Geovanna Moura Costa

Curso de Biomedicina da Universidade Bandeirante de São Paulo Rua Maria Cândida 1813, Vila Guilherme, São Paulo - SP

E- mail: geovanna.costa@yahoo.com.br Resumo

O tétano é causado pelo Clostridium tetani, que sintetiza a toxina tetânica responsável pelos sintomas da doença. A toxina (150 kDa) possui uma cadeia pesada de 100 kDa ligada à cadeia leve de 50 kDa através de ponte dissulfeto. As vacinas clássicas utilizam a toxina tetânica na sua forma inativada como componente. A inativação ocorre pela adição de formaldeído e incubação em estufa durante 30 dias. Este trabalho tem como objetivo caracterizar, através de eletroforese em gel de acrilamida (SDS- PAGE), os perfis dos complexos protéicos formados durante este processo de inativação. No ensaio com coletas a cada 24 horas durante 30 dias, é possível observar apenas um complexo entre 71 KDa e 146 KDa. No ensaio com coletas a cada 1 hora durante 6 horas, detecta-se um complexo principal de 138 KDa a 216 KDa e outras quatro bandas, a primeira superior a 250 KDa e as demais entre 30 KDa e 115 KDa. No ensaio com coletas a cada 15 minutos durante 45 minutos, verifica-se a formação de um complexo entre 124 KDa a 182 KDa e duas bandas principais, de 72 KDa e 100 KDa. A partir da coleta de 45 minutos é possível visualizar uma banda de alta massa molecular no gel de empilhamento, que será detectada em tempos posteriores. Com base nestes resultados conclui-se que as mudanças estruturais mais significativas do processo de inativação ocorrem entre o tempo 0 e a 1º hora. Palavras-chave: Toxina Tetânica. Inativação. Produção de Vacinas.

Introdução

O tétano é uma doença é caracterizada por contrações espásticas dos músculos esqueléticos, que podem levar o paciente a óbito devido à instabilidade cardiovascular e espasmos prolongados da musculatura respiratória e laríngea (Wassilak et al., 1999; Bhatia et al.,

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No fim do século XIX Kitasato isolou o microorganismo Clostridium tetani como o agente causador da moléstia. O Clostridium tetani é um bacilo gram positivo, estritamente anaeróbio, capaz de sintetizar a neurotoxina tetânica (TeNT) (Kitasato, 1889; Bhatia et al., 2002). A toxina tetânica é composta por uma cadeia leve de 50 KDa, ligada por ponte dissulfeto à cadeia pesada de 100 KDa. A ação principal é bloquear a liberação dos neurotransmissores inibitórios, glicina e ácido gama-aminobutírico (GABA), provocando os sintomas da doença (Schwab et al., 1979; Bergey et al., 1983; Vallee, Bloom, 1991; Montecucco, Schiavo, 1995; Wassilak et al., 2000; Lalli et al., 2003).

A toxina tetânica é responsável por todos os sintomas do tétano. Como conseqüência deste fato, esta doença pode ser completamente prevenida pelo uso de anticorpos específicos antitoxina tetânica, através do soro ou da vacina (Wassilak et al., 1999).

A vacina antitetânica passou a ser desenvolvida a partir de 1924, quando Ramon descreveu a inativação da toxina por formaldeído, e conseqüentemente, a obtenção do toxóide tetânico. Este processo é capaz de neutralizar a ação da toxina no organismo, sem afetar sua habilidade de induzir a produção de anticorpos (Ramon, 1924; Thaysen-Andersen et al., 2007).

No Brasil, a proteção contra o tétano teve início em 1911, no Instituto Butantan, através da produção do soro antitetânico. Após a descoberta da inativação da toxina tetânica, o mesmo instituto deu início aos trabalhos de desenvolver a produção da vacina, sendo que hoje em dia atende o cronograma para imunização nacional (Fonseca, 1954).

O processo de produção inicia-se com a cultura do Clostridium tetani, seguida da extração da toxina por filtração tangencial e concentração do produto. Na próxima etapa (processo de destoxificação), o formaldeído, a glicina e o bicarbonato de sódio são adicionados à toxina tetânica concentrada, que permanece em estufa durante 30 dias. Após este período, o produto passa por testes do controle de qualidade interno, e quando liberado é denominado de anatoxina tetânica. Na etapa de purificação da anatoxina, esta é submetida aos processo de diafiltração, concentração e gel filtração. Posterior a filtração esterilizante e aos testes de controle de qualidade interna, o produto aprovado consiste no produto acabado. A anatoxina tetânica é então utilizada como vacina (TT), ou para compor as vacinas, tríplice DTP (difteria, tétano e pertussis), tetravalente DTP+Hib (Haemophilus influenza B), DT (dupla infantil- tétano e difteria) ou dT (dupla adulta- tétano e difteria).

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Objetivo

O objetivo deste trabalho é caracterizar o processo de inativação da toxina tetânica realizado no Instituto Butantan, a fim de obter conhecimento sobre as mudanças estruturais dos complexos protéicos formados durante este tratamento.

Material e métodos

Toxina Tetânica Concentrada

As amostras de Toxina Tetânica Concentrada foram gentilmente cedidas pela seção de Vacinas Anaeróbicas, Instituto Butantan. Estas foram armazenadas entre 4°C e 8°C até o momento dos ensaios.

Determinação da concentração de proteínas para amostras de Toxina Tetânica Concentrada A determinação de concentrações de proteínas das amostras de Toxina Tetânica Concentrada foi realizada pelo método de Bradford (1976), através do “Bio-Rad Protein Assay kit” (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA).

O protocolo dos ensaios foi executado de acordo com as instruções do fabricante. Destoxificação da Toxina Tetânica Concentrada

A destoxificação da Toxina Tetânica Concentrada foi simulada de acordo com o protocolo descrito pelo Manual de Procedimentos de Produção e Controle Produto: Anatoxina Tetânica a Granel, 2007.

Para os ensaios em gel de acrilamida (SDS-PAGE), a reação foi interrompida pela adição do tampão de amostra ou pelo congelamento à –20ºC.

Eletroforese em gel de acrilamida (SDS-PAGE)

A eletroforese em gel de acrilamida (SDS-PAGE) foi realizada basicamente como a descrito em Laemmli (1970).

Para os ensaios realizados com coletas a cada 24 horas durante 30 dias (ensaio 1), foi padronizado o gel a uma concentração de 5% de acrilamida para o gel de corrida e 5% para o gel

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de empilhamento. Já nos ensaios realizados com coletas a cada 1 hora, durante 6 horas (ensaio 2), e nos ensaios com coletas a cada 15 minutos, durante 45 minutos (ensaio 3), o gel de corrida teve sua concentração modificada para 7%, mantendo-se 5% para o gel de empilhamento.

As amostras de Toxina Tetânica Concentrada foram aplicadas numa concentração de 35 ug de proteínas por linha, para os ensaios 1 e 2, e no ensaio 3 essa concentração foi alterada para 25 ug por linha. Todas as amostras foram analisadas em condições não redutoras. Uma alíquota de padrão de massa molecular “HMW” também foi aplicada ao gel. Todos os géis foram corados com “Coomassie Brilliant Blue 250R”, método descrito em Sambrook et al. (1989).

Resultados e discussão

Os perfis de proteínas durante o processo de inativação da toxina tetânica foram analisados por meio de gel de acrilamida (SDS- PAGE).

No ensaio 1 pode-se observar a formação gradativa de um complexo principal, que no primeiro dia aparece entre 71 KDa e 146 KDa. A partir do 10° dia verifica-se a presença de um complexo similar entre 66 KDa e 285 KDa, que se mantém relativamente constante até o fim do processo (figuras 1, 2, 3 e 4).

No ensaio 2 nota-se, na primeira hora, um complexo principal entre 138 KDa e 216 KDa e outras quatro bandas. Um perfil semelhante é observado nas coletas posteriores, porém com uma baixa variação nas massas moleculares (figura 5).

No ensaio 3, as coletas de 15 e 30 minutos revelam um perfil de proteínas muito semelhante, com um complexo de 133 KDa a 146 KDa e outras 3 bandas principais. Na coleta de 45 minutos, tais bandas continuam a ser detectadas e um complexo similar ao anterior pode ser observado, porém com massa molecular superior. A partir da coleta de 45 minutos é possível visualizar uma banda de alta massa molecular no gel de empilhamento, que será detectada em tempos posteriores (figura 6).

No ensaio 3, é possível observar que o perfil de 15 bandas apresentado pela amostra coletada imediatamente após a adição dos agentes químicos (Td0), não difere da Toxina Tetânica

Concentrada (figura 6, linhas 2 e 3). Este resultado comprova que as modificações estruturais induzidas pelo formaldeído não são tão rápidas que inviabilizem a detecção através de ensaios em gel de acrilamida (SDS-PAGE). No ensaio 2, as diferenças entre a TTC e o Td0 (figura 5, linhas 2

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e 3) são resultantes de um artefato técnico devido ao congelamento da amostra. Pode-se observar que o Td0 é semelhante à amostra da 1° hora (figura 5, linhas 3 e 4). Esta alteração é decorrente

do período até o completo congelamento da amostra Td0, no qual a reação de inativação continua

ocorrendo. No ensaio 3, a fim de cessar a reação do formaldeído, foi adicionado tampão de amostra à coleta Td0. 220 170 116 76 53 220 170 116 76 53 1 2 3 4 5 6 7 8 220 170 116 76 53 220 170 116 76 53 1 2 3 4 5 6 7 8

Figura 1. ENSAIO 1. Eletroforese em Gel de Acrilamida (SDS-PAGE) com concentração de 5%, condições não redutoras e coloração com “Coomassie Brilliant Blue 250R”. Amostra de Toxina Tetânica Concentrada durante o processo de destoxificação, aplicadas numa concentração de 35 ug por linha. Linha 1- Padrão de massa molecular HMW (Amersham Biosciences), linha 2- lote 01 1° dia, linha 3- lote 01 2° dia, linha 4- lote 01 3° dia, linha 5- lote 01 4° dia, linha 6- lote 01 5° dia, linha 7- lote 01 6° dia, linha 7- lote 01 7° dia.

220 170 116 76 53 1 2 3 4 5 6 7 8 220 170 116 76 53 1 2 3 4 5 6 7 8

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220 170 116 76 53 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 220 170 116 76 53 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 3. ENSAIO 1. Eletroforese em Gel de Acrilamida (SDS-PAGE) com concentração de 5%, condições não redutoras e coloração com “Coomassie Brilliant Blue 250R”. Amostra de Toxina Tetânica Concentrada durante o processo de destoxificação, aplicadas numa concentração de 35 ug por linha. Linha 1- Padrão de massa molecular HMW (Amersham Biosciences), linha 2- lote 01 15° dia, linha 3- lote 01 16° dia, linha 4- lote 01 17° dia, linha 5- lote 01 18° dia, linha 6- lote 01 19° dia, linha 7- lote 01 20° dia, linha 08- lote 01 21° dia, linha 09- lote 01 22° dia, linha 10- lote 01 23° dia.

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220 170 116 76 53 1 2 3 4 5 6 7 8 220 170 116 76 53 1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 220 170 116 76 53 1 2 3 4 5 6 7 8 9 220 170 116 76 53

Figura 5. ENSAIO 2. Eletroforese em Gel de Acrilamida (SDS-PAGE) com concentração de 7%, condições não redutoras e coloração com “Coomassie Brilliant Blue 250R”. Amostra de Toxina Tetânica Concentrada durante o processo de destoxificação, aplicadas numa concentração de 35 ug por linha. Linha 1- Padrão de massa molecular HMW (Amersham Biosciences), linha 2- lote 01 TTC, linha 3- lote 01 Td0, linha 4- lote 01 1° hora, linha 5- lote 01 2° hora, linha 6- lote 01 3°

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220 116 76 53 176 1 2 3 4 5 6 220 116 76 53 176 1 2 3 4 5 6

Figura 6. ENSAIO 3. Eletroforese em Gel de Acrilamida (SDS-PAGE) com concentração de 7%, condições não redutoras e coloração com “Coomassie Brilliant Blue 250R”. Amostra de Toxina Tetânica Concentrada durante o processo de destoxificação, aplicadas numa concentração de 25 ug por linha. Linha 1- Padrão de massa molecular HMW (Amersham Biosciences), linha 2- lote 01 TTC, linha 3- lote 01 Td0, linha 4- lote 01 15 minutos, linha 5- lote 01 30 minutos, linha 6-

lote 01 45 minutos.

O controle de qualidade aplicado à anatoxina tetânica visa garantir a segurança e eficácia do produto final, que é extensivamente testado através de ensaios “in vivo” e “in vitro” .

Atualmente, o controle de qualidade vem ganhando um novo conceito, no qual passa a servir de instrumento para o monitoramento das etapas mais importantes do processo de produção. Entretanto, testes “in vivo” são inadequados para este fim, devido a resultados pouco consistentes, com alto custo e demanda excessiva de tempo. O ideal seria a aplicação de testes “in vitro”, que associados pudessem assegurar a qualidade dos produtos intermediários do processo de produção.

Este novo conceito é recomendado por agências regulatórias internacionais, como a World Health Organization (WHO), Food and Drugs Administration (FDA) e a Farmacopéia Européia. Técnicas imunoquímicas e fisicoquímicas têm sido empregadas no estudo das características das vacinas, como identidade, massa molecular, estrutura, pureza, modificações

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nos aminoácidos e antigenicidade. Estas caracterizações poderão servir de base para o desenvolvimento de novos testes de controle de qualidade.

A caracterização do processo de inativação da toxina tetânica se enquadra neste novo conceito, uma vez que a qualidade da anatoxina tetânica depende principalmente da etapa de destoxificação.

É possível observar com o decorrer do tempo, que algumas bandas deixam de ser detectadas e que complexos protéicos passam a se formar. Tais resultados são esperados para o processo de destoxificação. Estas modificações são induzidas pelo formaldeído, que promove ligações intra e intermoleculares, como metilações e dimetilações, levando a um aumento na massa molecular das proteínas e a formação de agregados protéicos.

As análises intermediárias do processo de inativação, ou seja, entre o Td0 e o 29º dia, são dados

inéditos, já que não há nenhum estudo na literatura detalhando as modificações ocorridas neste período. Os estudos sobre destoxificação por formaldeído ou desenvolvimento de testes “in vitro” existentes na literatura, tanto com toxina tetânica quanto com toxina diftérica, visam comprovar a consistência do processo comparando lotes distintos, toxóides de diferentes produtores, anatoxinas inativadas com concentrações variadas de formaldeido ou por processo experimentais de destoxificação. Entretanto, os dados de toxina e toxóide tetânico ao fim de processo de destoxificação podem ser comparados aos apresentados neste estudo (TTC e 30º dia), havendo divergências sob alguns aspectos, principalmente devido às condições estabelecidas para os ensaios, como a pureza da toxina tetânica, concentração de acrilamida e condições de eletroforese.

Numa revisão de 2002, Metz et al., discutem as possibilidades existentes no desenvolvimento de ensaios “in vitro”, que associados fossem capazes de predizer a qualidade do produto em diversas etapas de produção, além de reduzir o uso de animais nos controles de qualidade aplicados às vacinas humanas. Dentre os métodos citados, o gel de acrilamida (SDS-PAGE) é apontado como uma opção para a caracterização do toxóide tetânico, quanto à identidade, pureza, modificações protéicas e estabilidade.

Dentre os ensaios realizados neste estudo, é possível concluir que as alterações estruturais mais significativas ocorrem em até uma hora após a adição dos agentes químicos. Estes resultados, embora preliminares, representam a primeira tentativa de caracterizar

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molecularmente, não o produto final, mas sim o processo de inativação, etapa crucial para a produção da anatoxina tetânica.

Referências

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