UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CURSO DE BIOMEDICINA
RAYANE KIMBERLLY DE PAULA ARAÚJO
ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DE CÉLULAS PULMONARES EXPOSTAS À FUMAÇA DE CIGARRO
Natal Maio, 2019
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ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DE CÉLULAS PULMONARES EXPOSTAS À FUMAÇA DE CIGARRO
por
Rayane Kimberlly de Paula Araújo
Monografia apresentada à Coordenação do Curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como Requisito Parcial à Obtenção do Título de Bacharel em Biomedicina
Orientadora: Profª. Drª. Viviane Souza do Amaral
Natal Maio, 2019
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CURSO DE BIOMEDICINA
A Monografia: Análise da expressão gênica de células pulmonares expostas à fumaça de cigarro
elaborada por Rayane Kimberlly de Paula Araújo
e aprovada por todos os membros da Banca examinadora foi aceita pelo Curso de Biomedicina e homologada pelos membros da banca, como requisito parcial à obtenção do título de
BACHAREL EM BIOMEDICINA
Natal, 31 de Maio de 2019
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Profª. Drª. Viviane Souza do Amaral
(Departamento de Biologia Celular e Genética – CB- UFRN)
_________________________________________ Doutorando Emmanuel Duarte Barbosa
(ppgBioinfo - UFRN)
______________________________________________ Doutorando Feliphe Lacerda Souza de Alencar
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Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Araújo, Rayane Kimberlly de Paula.
Análise da expressão gênica de células pulmonares expostas à fumaça de cigarro / Rayane Kimberlly de Paula Araujo. - 2019.
33 f.: il.
Monografia (graduação) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Biociências, Curso de
Biomedicina, Natal, RN, 2019.
Orientadora: Profa. Dra. Viviane Souza do Amaral. 1. Fumaça de cigarro - Monografia. 2. Expressão gênica - Monografia. 3. Bioinformática - Monografia. 4. Transcriptogramer - Monografia. I. Amaral, Viviane Souza do. II. Título.
RN/UF/BCZM CDU 004:577.2
Agradecimentos
Agradeço a Deus por durante todo o meu caminho Ele estar comigo e enviar pessoas tão incríveis para minha vida.
Agradeço a toda a minha família, pelas lições ensinadas mesmo sem perceberem, e pelos seus exemplos de força e superação. Agradeço principalmente aos meus pais Marcos e Iraneide por me apoiarem nesse percurso, e especialmente a minha mãe, por sempre me estimular a seguir meus sonhos e não me deixar vencer pelo medo.
Agradeço às amigas que a biomedicina me deu: Fernanda Tereza, Nayane Mirley, Raquel Caroline, Karine Aragão, Lidiane Silva, Maria Luiza, Glayce Coutinho, Mirella Cunha, Carla Myllena e Heloísa Vasconcelos por terem tornado esses anos mais leves e divertidos.
Agradeço à professora Drª. Viviane Amaral pela orientação e pela paciência, à doutoranda Luíza Xavier pelos ensinamentos e puxões de orelha, que me fizeram evoluir. Ao prof. Dr. Rodrigo Dalmolin pela prestatividade e ao doutorando Diego Morais pela solicitude durante este trabalho.
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Resumo
As células epiteliais das vias aéreas são as primeiras células dos pulmões a serem expostas aos agentes tóxicos contidos na fumaça do cigarro. Consequentemente, a resposta destas células à fumaça de cigarro é de considerável interesse visto que é um importante fator etiológico para diversas doenças, como o câncer de pulmão e Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC). Este trabalho utilizou o DataSet GSE30660, disponível na plataforma do NCBI para analisar a expressão gênica de células pulmonares expostas à fumaça de cigarro, fazendo uso do programa transcriptogramer, o qual permitiu a identificação de 4 grupos de genes diferencialmente expressos: 3 deles up regulados (mais expressos) e 1 grupo down regulado (menos expresso). Dentre os grupos gênicos mais expressos, as vias relacionadas ao metabolismo de xenobióticos, processo de glicuronidação, processo catabólico dependente de ubiquitina, vias de reparo e checkpoint, se destacaram, enquanto no grupo de genes menos expressos, as vias relacionadas à morte celular e resposta imune foram as mais evidenciadas. Por meio destes resultados é possível concluir que, assim como estudos já demonstraram anteriormente, a fumaça do cigarro é um importante agente indutor de danos.
Palavras chave: Fumaça de cigarro. Expressão gênica. Bioinformática. Transcriptogramer.
Abstract
Airway epithelial cells are the first cells of the lungs to be exposed to the toxic agents contained in cigarette smoke. Consequently, the response of these cells to cigarette smoke is of considerable interest since it is an important etiological factor for several diseases, such as lung cancer and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). This work utilized the DataSet GSE30660, available on the NCBI platform to analyze the gene expression of lung cells exposed to cigarette smoke, using the transcriptogramer package, which allowed the identification of 4 groups of differentially expressed genes: 3 of them up regulated (more expressed) and 1 down regulated group (less expressed). Among the most expressed gene groups, the pathways most related to the metabolism of xenobiotics, glucuronidation process, ubiquitin-dependent catabolic process, repair pathways and checkpoint were the ones that stood out, while in the group of less expressed genes, and the related pathways to cell death and immune response were the most evidenced. By means of these results it is possible to conclude that, as studies have shown previously, cigarette smoke is an important agent that induces damages.
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LISTA DE ABREVIATURAS
INCA - Instituto Nacional do Câncer PNS - Pesquisa Nacional de Saúde
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IARC - Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer ETS - Fumaça ambiental do tabaco
ROS - Espécies Reativas de Oxigenio RNS - Espécies reativas de Nitrogenio
PAH - hidrocarbonetos aromáticos policíclicos DNA - Ácido desoxirribonucleico
B[a]P - Benzo[a]Pireno RNA - Ácido ribonucleico
PPI - Interção Protéina-proteína GO - Gene Ontology
GEO - Gene Expression Omnibus
NCBI - National Center for Biotechnology Information
WHO - Organização Mundial da Saúde
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Imagem na qual é possível observar a fumaça principal, saindo da boca do
fumante e a fumaça secundária saindo da ponta acesa do cigarro. Fonte: site
Equalita <https://equalita.wordpress.com/2012/12/02/cigarro-bacterias/> ... 13
Figura 2. Nesta figura é possível observar os 4 clusters do transcriptoma. ... 21
Figura 3. Vias diferencialmente expressas no grupo 1. Notar que as vias mais
expressas foram as relacionadas ao metabolismo de xenobióticos e de lipídeos .... 22
Figura 4. Vias menos expressas. As vias relacionadas a resposta imune e a morte
celular se encontraram menos expressas ... 22
Figura 5. Vias diferencialmente expressas no grupo 3. Observar que as vias
relacionadas a pontos de checagem e progressão no ciclo celular se encontraram mais expressas ... 23
Figura 6. Vias diferencialmente expressas no grupo 4. As vias relacionadas ao
reparo de DNA, principalmente ao reparo de quebra de dupla fita se encontraram mais expressas ... 23
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Incidência de câncer em homens e mulheres no Brasil em 2018... 15
Tabela 2 - Mortalidade conforme a localização primária do tumor e sexo no Brasil em 2016 ... 15
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS ... VII LISTA DE FIGURAS ... VIII LISTA DE TABELAS ... IX
1. INTRODUÇÃO ... 11
1.1. Fumaça do cigarro ... 12
1.2 Tabaco e câncer de pulmão ... 13
1.3. Fisiopatologia do pulmão em consequência do uso do cigarro ... 16
1.3. Transcriptogramer ...17 2. OBJETIVO ... 18 2.1. Objetivo Geral ...18 2.2. Objetivos Específicos ...18 3. METODOLOGIA ... 19 4. RESULTADOS ... 21 5. DISCUSSÃO ... 25 6. CONCLUSÃO ... 29 REFERENCIAS ... 30
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1. INTRODUÇÃO
O hábito de fumar cigarro começa, na grande maioria, em indivíduos relativamente jovens, os quais possuem acesso ao cigarro com aditivos, responsáveis por atenuar o sabor amargo e áspero do tabaco, assim como também favorecem o uso contínuo do cigarro (PAUMGARTTEN; GOMES-CARNEIRO; OLIVEIRA, 2017). Em 2013, a Pesquisa Nacional de Saúde (PNS) do IBGE revelou que 21,9 milhões (15%) de brasileiros maiores de 18 anos eram usuários de produtos derivados do tabaco, sendo que o uso do cigarro industrializado era o mais frequente.
Fumar é considerada, atualmente, a principal causa de morte evitável no mundo. O uso do tabaco mata mais que tuberculose, HIV/AIDS e malária juntos (WHO 2012; WHO 2017). Sob essa perspectiva, as estatísticas ilustram bem o impacto. Uma a cada 10 pessoas morrem por causa do uso do tabaco ao redor do mundo (WHO 2017). Apenas no ano de 2010, o cigarro foi responsável por cerca de 6 milhões de mortes, seja fumante ativo ou passivo, dessas aproximadamente 147 mil correspondem ao Brasil (INCA, 2018). A expectativa é que os casos de morte provocados pelo uso do cigarro aumentem para 8,3 milhões até 2030 (RENTERÍA. et al. 2015), sendo que 80% dessas mortes ocorrem em países de baixa e média renda (WHO 2012).
Nesse contexto as principais causas de morte relacionadas ao uso do cigarro são: câncer de pulmão, Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC), câncer do trato aerodigestivo superior e doenças cardiovasculares. É importante ressaltar que a doença pulmonar obstrutiva crônica é, também, uma das principais causas mundiais de mortalidade e morbidade, e o câncer de pulmão é a principal causa de morte atribuída ao uso do cigarro (VAART et al, 2004). Demonstrando a íntima relação entre tabagismo e ocorrência do câncer pulmonar, o perfil epidemiológico regional dessa neoplasia varia em conformidade com o consumo de cigarro da região; segundo o INCA (2018), na maior parte das populações, os casos de câncer de pulmão relacionados ao uso do tabaco representam mais de 80% das neoplasias pulmonares. Com o objetivo de alertar os brasileiros sobre os riscos que esse hábito traz, além de afirmar o compromisso do Brasil contra o tabagismo, a lei nº 7488, de 11 de junho de 1986, decreta o dia 29 de agosto como o Dia Nacional de Combate ao Fumo. Em 2005, a Organização Mundial de Saúde implementou a Convenção Quadro para
o uso do tabaco, a qual foi ratificada por 177 países, incluindo o Brasil. Entre as diretrizes da convenção quadro estão a viabilização de ambientes livres de fumo de tabaco e a implantação de projetos que contribuam para a cessação da tabagismo. (KNORST, et al. 2014)
1.1. Fumaça do cigarro
Os indivíduos tornam-se viciados, principalmente, em virtude da presença de nicotina, a qual por sua vez, não é cancerígena. Porém ao inalar a fumaça de cigarro outros constituintes do fumo do tabaco também entram no organismo via sistema respiratório. Sendo que mais de 5.000 compostos foram identificados na fumaça do cigarro e destes incluindo 73 que são descritos, pela Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer (IARC), como carcinogênicos para animais de laboratório e humanos (HECHT, 2012).
Assim, conforme a fumaça do cigarro é inalada, uma complexa mistura de componentes passa pelo sistema respiratório. Dessa forma, a nuvem de fumaça inalada pelas vias aéreas ao fumar, promove a ocorrência de vários fenômenos de sobreposição química e fisiológicos (BORGERDING; KLUS, 2005).
Em consequência ao ato de fumar, dois tipos de fumaça são gerados: uma chamada mainstream (ou fumaça principal) e a outra chamada sidestream (ou fumaça secundária). A fumaça principal é a fumaça que sai da boca, após passar pelo sistema respiratório, durante a baforada do cigarro, já a fumaça secundária é a fumaça que sai da extremidade acesa do cigarro e vai para o ambiente. Ambas fumaças de cigarro, ao se difundir no ambiente tornam-se diluídas e começam a sofrer mudanças físicas e químicas e a interagir com outras substâncias que podem ou não estar presentes no cigarro, tornando-se Fumaça ambiental do tabaco (Envimonetal Tobacco Smoke - ETS) (BORGERDING; KLUS, 2005).
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Figura 1. Imagem na qual é possível observar a fumaça principal, saindo da boca do fumante
e a fumaça secundária saindo da ponta acesa do cigarro. Fonte: site Equalita <https://equalita.wordpress.com/2012/12/02/cigarro-bacterias/>
A fumaça do cigarro - seja ela a fumaça principal, secundária ou a ambiental - é um aerosol constituído por uma fase sólida/gotículas de líquido e uma fase gasosa (BORGERDING; KLUS, 2005). A fumaça principal, filtrada pelo trato respiratório, contribui entre 15% e 43% do material particulado de ETS e entre 1% e 13% da fase de vapor, o restante corresponde à fumaça secundária. A fase vapor compreende a mais de 90% do peso principal da fumaça e seus principais componentes são: nitrogênio, oxigênio e dióxido de carbono. Os principais carcinógenos da fase de vapor incluem óxido de nitrogênio, isopreno, butadieno, benzeno, styrene, furan, formaldeído, acetaldeído e acroleína os três últimos também estão associados a Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) e toxicidade pulmonar, segundo D.Thorne e J. Adamson, 2013. Já a fase particulada contém pelo menos 3500 componentes e muitos carcinógenos incluem hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH), N-nitrosaminas, aminas aromáticas e metais (como o arsenio e cadmio), associados a vários tipos de câncer (THORNE; ADAMSON, 2013; PFEIFER et. al, 2002).
1.2 Tabaco e câncer de pulmão
Antes do tabaco ser associado ao câncer de pulmão, ele já era utilizado há séculos, porém com o uso de máquinas no final do século XIX para a fabricação dos cigarros seu uso foi intensificado, de forma que entre os anos 20 e 40 médicos e pesquisadores começaram a associar o hábito de fumar cigarro ao câncer de pulmão, visto que, a maioria das pessoas que apresentavam a neoplasia eram fumantes (MILLER, 2005), mas apenas entre as décadas de 50 e 60 estudos epidemiológicos estabeleceram a relação causal entre o hábito de fumar e câncer de pulmão (UEHARA; JAMNIK; SANTORO, 1998).
Existem dois tipos de câncer de pulmão: o de pequenas células e o de não pequenas células. O tipo mais comum de câncer de pulmão é o de não pequenas células o qual é subdividido em 3 tipos: adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas e carcinoma indiferenciado de células grandes. Dentre os subtipos de câncer de pulmão de não pequenas células tanto o adenocarcinoma, quanto o carcinoma de células escamosas e o carcinoma indiferenciado de pequenas células estão intimamente relacionados com o tabagismo (ZAMBONI, 2002), no entanto o mais fortemente associado ao uso do cigarro é o carcinoma de células escamosas (SPEINA et al, 2003). Conforme demonstrado na tabela 1 o câncer de pulmão, traqueia e brônquios corresponde a neoplasia primária de segunda maior incidência em homens e quarta maior incidência em mulheres, no Brasil, em 2018, constituindo a principal causa de morte em homens em 2016 e segunda principal causa de morte em mulheres conforme visto na tabela 2.
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Tabela 1 - Incidência de câncer em homens e mulheres no Brasil em 2018 Incidência de Câncer no Brasil em 2018
Homens Mulheres
Localização Primária
Casos
Novos Localização Primária
Casos Novos
Próstata 68.220 Mama feminina 59.700
Traqueia, Brônquio e Pulmão 18.740 Cólon e Reto 18.980
Cólon e Reto 17.380 Colo do útero 16.370
Estômago 13.540 Traqueia, Brônquio e Pulmão 12.530
Cavidade Oral 11.200 Glândula Tireóide 8.040
Esôfago 8.240 Estômago 7.750
Outros neoplasias 162.820 Outras neoplasias 159.080
Todas as neoplasias 300.140 Todas as neoplasias 282.450
Fonte: INCA (2019). Adaptado pela Autora.
Tabela 2 - Mortalidade conforme a localização primária do tumor e sexo no Brasil em 2016
Mortalidade conforme a localização primária do tumor e sexo no Brasil em 2016
Homens Mulheres
Localização Primária Óbitos Localização Primária Óbitos
Traqueia, Brônquios e Pulmões 15.514 Mama 15.403
Próstata 14.484
Traqueia, Brônquios e
Pulmões 10.978
Estômago 9.132 Cólon, Reto e Ânus 8.533
Cólon e Reto 8.163 Colo do útero 5.727
Esôfago 6.525 Estômago 5.132
Fígado e vias biliares
intra-hepáticas 5.647 Pâncreas 4.808
Outras neoplasias 48.005 Outras neoplasias 39.647
Todas as neoplasias 107.470 Todas as neoplasias 90.228
1.3. Fisiopatologia do pulmão em consequência do uso do cigarro
A fumaça do cigarro possui diversos componentes que contribuem para os resultados adversos do fumo. Estes componentes incluem: a própria nicotina, a qual é convertida em carcinógenos e também causa desenvolvimento fetal anormal devido à ativação aberrante dos receptores de acetilcolina; partículas como os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH) que são bioativados para carcinógenos in vivo; e íons metais como o cádmio o qual é carcinogênico (JONES, et al 2016). Ademais, os xenobióticos presentes no cigarro (incluindo a acroleína, o qual é um forte irritante), tem a capacidade de estimular os nervos sensoriais das vias aéreas. (MORRIS, et al 2018)
Esse estímulo dos nervos sensoriais induz a liberação local de neuropeptídeos como a substância P, a neuroquinina A e o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina, os quais estão relacionados a vasodilatação, aumento do fluxo sanguíneo e aumento da permeabilidade capilar, resultando em edema localizado, denominado edema neurogênico. O qual em conjunto com a quimiotaxia aumentada, resulta em uma resposta inflamatória localizada, denominada inflamação neurogênica. Este tipo de resposta tem particular importância em relação ao desenvolvimento de edema pulmonar induzido por gás irritante e ao desenvolvimento de doença alérgica das vias aéreas. (MORRIS, et al 2018)
Toda via, os macrofagos de fumantes possuem fenótipo alterado e função prejudicada, incluindo a função de matar bactérias e efeitos inibitórios de linfócitos e células natural killer, favorecendo assim o desenvolvimento de doenças e inflamação localizada, de modo que a intensidade da inflamação está relacionada a história de tabagismo (KARIMI et al, 2012)
A fim de amenizar os sintomas das doenças relacionadas ao uso do cigarro o Ministério da Saúde do Brasil, em concordância com a convenção quadro da OMS, estruturou e difundiu na rede pública do Sistema Único de Saúde um programa de abordagem do tabagismo baseado em terapias cognitivo-comportamental e medicamentosa. (KNORST, et al. 2014)
Entretanto, estudos que investiguem os efeitos nocivos do tabagismo assim como os mecanismos envolvidos, são grandes aliados não apenas como instrumento de conscientização, mas também, entendendo os danos causados e dessa forma,
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abrir perspectivas para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas capazes de reverter ou estagnar quadros patológicos já instalados nas vítimas dessa adicção.
1.4 Transcriptogramer
Dada a conhecida toxicidade do cigarro, este trabalho analisou o transcriptograma - fornecido pelos responsáveis pelo DataSet, o qual está disponível no Gene Expression Omnibus (GEO) - por meio do pacote transcriptogramer. O transcriptogramer é uma nova abordagem da bioinformática, baseado em biologia de sistemas, o qual permite visualizar e interpretar o padrão de expressão gênica, por meio da análise transcricional, fornecendo informações sobre os processos biológicos diferencialmente expressos e identificação de grupos gênicos funcionalmente associados (MORAIS, 2018).
O pacote transcriptogramer compara o grupo caso e controle do DataSet e em seguida faz uso do pacote limma, o qual fornece informações sobre os genes diferencialmente expressos individualmente. Porém ao utilizar o pacote limma em conjunto com o pacote transcriptogramer torna-se possível analisar os grupos gênicos diferencialmente expressos (MORAIS 2018), visto que os genes interagem entre si e participam de diversas funções biológicas (LI, et al 2018), desta forma a análise torna-se mais substancial ao avaliar a expressão de grupos gênicos em comparação a expressão de genes individuais. Após identificar os grupos gênicos diferencialmente expressos o pacote transcriptogramer confronta o resultado, com o banco de dados do Gene Ontology (GO) o qual fornece informações sobre os processos biológicos com os quais os genes estão relacionados (MORAIS 2018). Essa abordagem permitiu a análise dos grupos gênicos diferencialmente expressos no DataSet escolhido para a realização deste trabalho, fornecendo informações sobre a resposta celular ao estímulo de xenobióticos em células pulmonares.
2. OBJETIVO
2.1 Objetivo Geral
O objetivo deste trabalho foi analisar por meio da bioinformática as vias de processos biológicos diferencialmente expressas em células expostas à fumaça de cigarro.
2.2 Objetivos Específicos
1- Utilizar o DataSet GSE30660 disponível no banco de dados Gene
Expression Omnibus (GEO)
2- Identificar os grupos gênicos diferencialmente expressos do DataSet por meio do pacote transcriptogramer
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3. METODOLOGIA
Este trabalho utilizou os dados de expressão gênica de células expostas à fumaça de cigarro, obtidos do DataSet GSE30660 - disponível no Gene Expression
Omnibus (GEO), pertencente ao repositório do National Center for Biotechnology Information (NCBI). O DataSet extraiu amostras do epitélio pulmonar de 4 indivíduos,
as quais foram submetidas à cultura de interface ar-líquido (ALI). Cada amostra foi submetida ao cultivo ALI, o que possibilitou a replicação das amostras para um total de 8 culturas. Dessas culturas, 4 foram expostas à fumaça de cigarro, por 30 minutos durante 4 dias diferentes, totalizando 2 horas de exposição, e 4 culturas não foram expostas, constituindo o grupo controle. A cultura de interface ar-líquido é o modelo mais usado para estudar vias aéreas humanas, em que o epitélio da via aérea humana pode ser obtido por biópsia, escovação, cirurgia ou transplante de pulmão, ou após a morte (DVORACK et. al, 2011). Uma limitação deste estudo é a ausência da descrição de como as amostras foram obtidas e como foi feito a cultura de interface ar-líquido, pois o DataSet não possui artigo publicado.
Para obter o transcriptoma celular os autores do Dataset utilizaram o HG-U133 Plus 2.0 array (Affymetrix, Santa Clara, CA), que consiste em uma técnica de microarray (ou microarranjo), que são lâminas de vidro de microscópio crivadas com uma grande quantidade de fragmentos de DNA, cada um contendo uma sequência de nucleotídeos que serve como sonda para um gene específico, de forma que a posição exata e sequência de cada sonda no chip é conhecida. Dessa maneira é possível identificar os padrões de expressão gênica (ALBERTS et al., 2010).
Já para analisar os grupos gênicos diferencialmente expressos no transcriptoma (a qual foi a atribuição deste trabalho), as análises foram feitas utilizando o programa transcriptogramer versão 1.4.1 por meio do R, o qual fundamenta-se em uma técnica analítica descrita por Rybarczyk-Filho et al. (2011) projetada para medições de expressão de genoma. O pacote transcriptogramer tem como objetivo avaliar os dados de interação proteína-proteína (PPI) e dessa forma identificar grupos gênicos alterados em estudos caso-controle. O programa calculou os valores de p de grupos de genes diferencialmente expressos, por meio dos dados de microarray fornecidos pelos autores do DataSet, e realizou a correção de taxas de descoberta falsas. Retornando informações sobre os processos biológicos
relacionadas a anotação GO (gene ontology) (MORAIS, 2018). Em suma, o programa analisou os dados de microarray para agrupar os genes pela probabilidade de seus produtos interagirem entre si, gerando uma lista de genes ordenados, a qual é usada para obter a expressão média de genes, com função associada, em uma determinada janela deslizante com raio (r ) configurável (MORAIS; ALMEIDA; DALMOLIN, 2019). O raio utilizado neste trabalho foi de 60, o qual é centrado em um gene (60+1). O objetivo da janela deslizante é medir a expressão média de genes funcionalmente associados, representados por genes vizinhos na lista de genes ordenados (MORAIS; ALMEIDA; DALMOLIN, 2019).
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4. RESULTADOS
O programa transcriptogramer retornou como resultado as vias diferencialmente expressas de processos biológicos - isto é, um objetivo biológico para o qual o gene ou produto gênico contribui e que geralmente envolvem uma transformação química ou física, no sentido de que algo entra em um processo e algo diferente sai dele (ASHBURNER et al, 2000). Por meio do transcriptogramer, foi possível observar que o conjunto de dados (o transcriptoma) apresentou 4 grupos, também designados como clusters, utilizando o raio de 60 (r=60+1) (figura 2), sendo que o primeiro (figura 3) o terceiro (figura 5) e o quarto grupos (figura 6) apresentaram expressão maior que o esperado (up-regulados) e o segundo grupo (figura 4) apresentou expressão menor que o esperado (down-regulado). Todas as vias de processos biológicos analisadas neste trabalho possuem significância maior que 0,01.
Figura 2. Nesta figura é possível observar os 4 clusters (ou grupos) do transcriptoma. Em vermelho o
Figura 3. Vias diferencialmente expressas no grupo 1. Notar que as vias mais expressas foram as
relacionadas ao metabolismo de xenobióticos e de lipídeos. Fonte: Elaborado pela autora.
Figura 4. Vias menos expressas. As vias relacionadas a resposta imune e a morte celular se
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Figura 5. Vias diferencialmente expressas no grupo 3. Observar que as vias relacionadas a pontos de
checagem e progressão no ciclo celular se encontraram mais expressas. Fonte: Elaborado pela autora.
Figura 6. Vias diferencialmente expressas no grupo 4. As vias relacionadas ao reparo de DNA,
principalmente ao reparo de quebra de dupla fita se encontraram mais expressas. Fonte: Elaborado pela autora.
Uma vez avaliando os resultados da transcrição é necessário ter em mente que os resultados estão sujeitos tanto ao tipo celular, em virtude de que quanto mais especializadas, maior a produção de RNAs específicos; quanto ao momento celular, haja vista que dependendo da fase em que a célula se encontra no ciclo celular proteínas específicas serão expressas (STRACHAN et al., 2013). Neste estudo foi usado células pulmonares, logo, a principal variável em que a análise está sujeita é ao momento celular. Pois neste tipo de experimento, tanto as células ainda em em divisão quanto células já especializadas são analisadas. Ou seja, a análise foi capaz de constatar células em momentos celulares variados.
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5. DISCUSSÃO
A fumaça do cigarro possui muitos componentes tóxicos (como os PAH, acroleína, metais, etc), os quais ao entrar em contato com o pulmão causam danos. Apesar de haver mecanismos para proteção pulmonar que promovem a eliminação de substâncias tóxicas presentes no ar, a exposição em larga escala e contínua traz uma série de prejuízos ao organismo. O mecanismo protetor mencionado envolve tanto reflexos físicos, que incluem, mudança no padrão de respiração e indução de espirro ou tosse (MORRIS et. al 2018), quanto resposta celular à atividade genotóxica. Billatos et. al. (2018), relata que a expressão gênica associada ao tabagismo agudo
in vivo reflete a exposição in vitro, sugerindo que esse padrão de expressão
concordante seja consequência da exposição direta das células do epitélio das vias respiratórias à fumaça do cigarro.
A resposta celular ao dano pode acontecer tanto de modo indireto, quanto direto. O dano indireto ocorre através da formação de Espécies Reativas de Oxigênio e Nitrogênio (ROS e RNS) as quais podem causar dano oxidativo ao DNA, e consequente quebra de fita simples ou quebra de fita dupla, além de oxidar lipídios e proteínas e induzir inflamação. Já o dano direto, está relacionado a formação de adutos de DNA causados por carcinógenos presentes no fumo, por exemplo, o Benzo[a]Pireno e nitrosaminas (PHILLIPIS, VENITT 2012; SPEINA et. al. 2003).
A maior parte dos carcinógenos da fumaça do cigarro são substratos de enzimas que metabolizam drogas, como os citocromos P450, glutationa S-transferase e UDP-glucuronosiltransferase. Esses mecanismos de metabolização de xenobióticos se encontraram mais expressos neste estudo, conforme é possível ver na figura 3, principalmente a via relacionada a glicuronidação. O objetivo dessas vias de metabolização é converter os substratos em produtos hidrossolúveis, para assim facilitar a excreção das substâncias. Porém, durante esse processo, compostos eletrofílicos reativos são produzidos e podem reagir com bases de DNA formando adutos (HECHT, 2012).
Os adutos de DNA são formados em consequência da ligação covalente entre substâncias eletrofílicas reativas, dentres as quais, as mais amplamente estudadas presentes no cigarro são os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs). Os PAHs são um grande grupo de compostos orgânicos com dois ou mais anéis aromáticos
fundidos, formados por meio da combustão incompleta de matéria orgânica. O principal PAH descrito é o Benzo[a]Pireno (B[a]P), o qual se liga a nucleotídeo de guanina ou adenina (PATEL et al, 2016; EWA; DANUTA, 2017). Ao entrar na célula, esse xenóbiótico é metabolizado, sendo que durante esse processo espécies reativas de oxigênio (ROS) também podem ser formadas (EWA; DANUTA, 2017), as quais quando interagem com o DNA podem levar também à quebra de fita dupla.
O reparo de quebra de fita dupla de DNA, conforme é possível observar na figura 6, se encontra bastante expresso. Esse tipo de lesão é gerada naturalmente quando durante a replicação é encontrado lesões bloqueadoras, como as produzidas por ROS, que levam ao colapso da forquilha de replicação (SHRIVASTAV; HARO; NICKOLOFF, 2008). O reparo de dupla fita de DNA pode ser feito por junção não-homóloga ou por recombinação não-homóloga, as vias relacionadas a este último foram as mais expressas, indicando que danos ocorreram durante o ciclo celular e que o DNA foi reparado usando cromossomos que possuem em determinada região, sequência de DNA muito parecida ou idêntica, ou mesmo usando a cromátide-irmã como molde, durante o ciclo celular (ALBERTS et al., 2010). Para que a célula possa reparar o dano durante o ciclo celular, proteínas de checagem estimulam a interrupção do ciclo ou atrasam sua progressão até que o dano seja reparado (FEI et al, 2017).
Após o reparo a célula recebe estímulos de progressão do ciclo celular, os quais também foram mais expressos (figura 5) neste trabalho. Há relatos na literatura que determinadas substâncias presentes no cigarro, como o B[a]P, estimulam a proliferação celular - assim como induzem a apoptose e teratogênese (EWA; DANUTA, 2017). Dessa forma, o estímulo a mitose, encontrado neste estudo (figura 5), pode ser explicado tanto pela presença de componentes da fumaça do cigarro, como pode ser explicado pelo tipo de cultivo celular, pois já é descrito na literatura que o cultivo ALI possui células com expressão aumentada de vias envolvendo o ciclo celular (DVORAK et al, 2011). Em contrapartida, foi observado a diminuição da expressão de vias relacionadas à morte celular e apoptose (figura 4), a qual não é correlacionada na literatura à exposição ao cigarro, o que leva a duas possíveis inferências, a) que uma possível causa para a diminuição da morte celular pode ser o reparo bem sucedido do DNA danificado, e b) que essa diminuição seja resultado da sobreposição do estímulo da proliferação celular, sobre a morte celular.
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Além da capacidade das ROS de causarem danos ao DNA, como já mencionado, elas também são capazes de alterar outros diversos componentes celulares, como os lipídios. O que pode explicar a ocorrência da superexpressão da via de metabolização lipídica neste estudo, conforme observado na figura 3, é justamente a presença de ROS e RNS presentes no cigarro, que interagem primeiramente com lipídios da membrana, assim como as ROS formadas durante o metabolismo de substâncias presentes no cigarro como o PAH, como já mencionado anteriormente. A peroxidação lipídica, por sua vez, pode alterar a estrutura e função de proteínas, levando à disfunção celular e dano tecidual (OGA; CAMARGO; BATISTUZZO, 2014). Apesar de diversos estudos mostrarem que a produção excessiva de produtos de peroxidação lipídica (como o malondialdeído) serem a principal causa de complicação em diversas doenças, os mecanismos pelos quais esses produtos regulam as respostas oxidativas, imunes e inflamatórias permanecem incertos (RAMANA; SRIVASTAVA; SINGHAL, 2017). No entanto, é importante ressaltar que a resposta individual aos compostos contidos na fumaça do tabaco é um importante determinante do risco, pois apenas 10 a 15% dos fumantes desenvolvem câncer de pulmão (SPEINA et al, 2003).
Além disso, assim como no estudo descrito por Wrigth et. al (2012), neste trabalho também se encontrou aumentado o processo catabólico de proteína dependente de ubiquitina, sugerindo que houve danos ou modificações proteicas irreparáveis levando à quebra da proteína por hidrólise de suas ligações peptídicas. Esse processo metabólico pode ter sido estimulado pela presença de Espécies Reativas de Oxigênio e Nitrogênio, os quais, como já mencionado, também podem causar oxidação de proteínas (SPEINA et al 2003), sejam elas codificantes ou não codificantes de RNA, pode potencialmente causar erros na síntese de proteínas ou na desregulação da expressão gênica. (KLAUNIG; KAMENDULIS; HOCEVAR, 2009).
Embora Zieba et al. (2000) e Sopori (2002) tenham descrito a exposição à fumaça de cigarro como estímulo à resposta imune. Paradoxalmente, o objeto desse estudo apresentou redução de expressão nas vias relacionadas a esse processo. Uma possível explicação reside no tempo de exposição utilizado, o qual foi 30 minutos por quatro dias, totalizando 2 horas; similar a Birrell et al. (2007), o qual relata expressão diminuída de citocinas, as quais são produzidas por células do sistema imunológico, nas 2 primeiras horas de exposição.
Considerando o propósito deste estudo, uso do transcriptograma tornou possível a identificação de grupos gênicos com expressão diferencial significativa nas células expostas à fumaça do cigarro, e a partir destes grupos, constatar os processos biológicos diferencialmente expressos. De forma que, cada produto gênico apresenta-se agrupado de acordo com suas interações permitindo a constatação de grupos gênicos funcionalmente associados (MORAIS, 2018).
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6. CONCLUSÃO
O cigarro é um agente causador de diversas doenças, tendo em vista a elevada quantidade de substâncias tóxicas presentes em sua composição, que podem levar a danos diretos ao DNA e a danos celulares indiretos, pela formação de Espécies Reativas de Oxigênio e Nitrogênio os quais por sua vez, podem levar a danos em lipídeos e proteínas celulares. Contudo, a célula possui vias de proteção contra agentes genotóxicos, de forma que a investigação da expressão gênica das células pulmonares expostas à fumaça de cigarro foi proposto por este trabalho.
A partir dos grupos gênicos diferencialmente expressos fornecidos pelo transcriptogramer, foi possível observar que os processos biológicos envolvendo metabolismo de xenobiótico e lipídeos, checkpoint, reparo de DNA, e progressão no ciclo celular, foram mais expressos e os processos que envolvem resposta imune e morte celular foram menos expressos. Ou seja, as células tentaram reparar os danos causados pelos xenobióticos presentes no cigarro e progredir no ciclo celular. Levando a inferência de que as células expostas à fumaça de cigarro neste experimento apresentaram resposta a xenobióticos e a danos oxidativos, possivelmente devido ao pouco tempo de exposição à fumaça de cigarro.
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