1.3 Técnicas de análise em espectrometria de massas I m ediatam ente após a ionização da amostra, as moléculas ionizadas e no estado gasoso (ou plasm

1.3 Técnicas de análise em espectrometria de massas

I m ediat am ent e após a ionização da amostra, as molé-culas ionizadas e no est ado gasoso ( ou plasm a) ent r am no setor de análise do espect r ômetro de massas. Neste, os diferentes íons gerados na câmara de ionização (íon molecular + fragmentos) serão Separados de acordo com sua razão massa/carga ( m / z) . O set or de análise é que determina a acurância do aparelho e em qual faixa de intervalo de massas os compostos podem ser analisados. O setor de análise pode ser de 4 tipos:

- de campo magnético e elét r ico ( em cojunto ou não) - de quadrupolo

- de tempo de vôo (time of flight, TOF) - de captura de íons (ion t r ap)

1.3.1 Analisadores de setor magnético e

setor magnético- elétrico ( dupla focalização)

Os primeiros espectrômetros de massas desenvolvidos fizer am ( e ainda fazem ) uso da aplicação de um campo magnét ico par a a a separ ação dos íons. Na presença do campo magnético, os íons são acelerados em um

trajeto semi- circular. O raio de trajetória dos íons irá depender de sua razão m/z. O setor magnético irá separar os íons também em função do raio de sua trajetória (que por sua vez irá depender da razão m/z). Os íons capazes de viajar ao longo de toda a trajetória do setor de análise ir ão atingir a placa coletora de íons, onde serão detectados.

Em se utilizando somente um analisador magnético, os íons serão separados de acordo com sua massa nominal (ou seja, massa determinada por números inteiros), e por isso os espectrômetros de massas compostos apenas de um setor de análise m agnét ico são chamados de espectrômetros de

massas de baixa resolução. Já os espectrômetros de massas que são constituídos por um setor de análise form ado por um campo magnético acoplado a um setor elétrico pode separar os íons de acordo com suas massas exatas, e por isso são chamados de espectrômetros de massas de alta resolução.

Quando os íons atravessam o setor magnético, atravessam um campo magnético perpendicular ao seu movimento. Como o campo magnét ico prov oca a aceler ação dos íons, e a direção da aceleração é perpendicular ao seu movimento, a velocidade dos íons permanecerá constante, mas estes apresentarão uma trajetória circular. Consequentemente, a geometria do setor magnético é semi- circular, para que os íons possam atravessá- lo com uma velocidade constante. Como os íons viajam à velocidade constante, será possível separá- los de acordo com sua razão m/z.

V

B

Detector r

1.3.1.1 Princípio da separação de íons nos analisadores de setor magnético e setor magnético- elétrico

A energia cinética (E_k) de um íon de massa m se movendo a uma velocidade fixa v é dada por:

E

= m.v

1

2

Por outro lado, a energia potencial (Ep)de um íon de carga zsendo repelido de um campo eletrostático de voltagem Vé dada por:

E

= z.V

Quando o íon é repelido, a sua energia

potencial (Ep) é convertida em energia cinética (Ek). Logo,

E

_p

= E

_k

z.V = m.v

1

2

v

= 2.z.V

Quando os íons são “ capturados” no campo magnético do analisador, eles irão realizar uma trajetória circular. Para que os íons atinjam a placa coletora de íons no detector, os íons devem realizar uma trajetória de raio r que resulta do equilíbrio entre a força centrífuga do íon

e a força centrípeta exercida pelo ím ã que compõe o analisador magnético. F_cf = m.v2

r

F

= z.B.v

Logo, para que o íon possa percorrer a trajetór ia do set or m agnético, F_cf= F_cp Ou seja... z.B.v = m.v2 r

v = z.B.r

m

z

m

=

B.r

2.V

Por esta equação fica claro:

1. Porque o espectrômetro de massas não distingue sinais de íons m+ _{e 2m}2+

2. Que os parâmetros B, r e V é que determinam o trajeto dos íons no analisador.

Portanto, pode- se variar B ou V, de maneira a poder “ varrer” t oda a faix a de m assas ( ou de r azão m/z) desejada para se detectar todos os íons ( M+ _{e fragm} en-t os) ger ados na câmara de ionização. Usualmenen-te varia- se V muito mais rápido, e de maneira muito mais precisa, do que B. Ou seja, varia- se a tensão (V) aplicada no ím ã de int ensidade B fix a de maneira a fazer com que os íons percorram uma trajetória de raio r fix o ( 180o_{, 90}o _{ou 60}o_).

De maneira a aumentar sua resolução, passaram a ser construídos aparelhos de espectrometria de massas de dupla focalização. Nestes, o setor de análise apresent a um analisador de campo elét rico pós o analisador de campo magnético. O analisador elétrico atua como um filt ro de energia cinética, permitindo que apenas íons com uma energia cinét ica específica possam

atravessá- lo, a despeit o de suas r azões m/z. A

separação de íons no analisador eletrostático é explicada pela combinação de duas equações: de força centrífuga (1) e de energia potencial=cinética (2). F_cf = m.v2 = z.E r z.V = m.v1 2 2 (1) (2) r = 2V E E = intensidade do campo eletrostático

Assim, o trajeto radial de íons possuindo a mesma

velocidade (energia cinética) é independent e de sua razão m/z. Ou seja, o analisador eletrostático separa íons com diferentes velocidades, ou energia cinéticas.

Consequentemente, a adição do setor eletrostático aumenta a resolução de um fator de até 100.000. Este tipo de

aparelho é comumente utilizado com câmaras de ionização do tipo impacto de elétrons (EI), bombardeamento rápido de át om os ( FAB) ou ionização química (CI), mas não com

Vantagens

- Espectros de massas “tradicionais”, ou seja pode operar em baixa (1.000) ou alta resolução (até 60.000).

- Excelente reprodutibilidade

- Melhor desempenho quantitativo entre todos os aparelhos - Alta resolução

- Alta sensibilidade

- Alta precisão nas medidas de massas (5 ppm em alta resolução).

Desvantagens

- Inadequadas para técnicas de ionização pulsada - Aparelhos muito maiores e mais custosos

- Í ons precisam ser acelerados com alta energia cinética para compensar dispersão de energia na fonte (8 kV).

- Varreduras relativamente lentas (efeito de esteresse de campo).

Aplicações

- Para todos os compostos orgânicos - Para determinação de massa exata - Medidas de distribuição isotópica

BE ou EB

1.3.2 Analisadores de quadrupolo

Um analisador de quadrupolo consiste em quatro barras paralelas, arranjadas em dois pares opostos. Um dos pares apresenta um potencial elétrico aplicado de ( U+ Vcos( wt)) e o outro par apresenta um potencial elétrico aplicado de - ( U+ Vcos( wt)), aonde U é uma

voltagem de corrente contínua e o termo Vcos( wt) é uma voltagem de corrente alternada (ou de r adiofr equência. A aplicação destas duas voltagens afeta a trajetória centralizada dos íons. Em se fazendo variar estas voltagens, somente íons com uma razão m/z determinada irão atravessar no

centro do quadrupolo, enquanto que os outros íons serão desviados da trajetória central. O espectro de massas é obtido em se fazendo variar as voltagens do quadrupolo, de maneira a se realizar uma varredura em t oda a faix a de m / z desej ada. Pode- se ut ilizar 2 m étodos: variando- se w e mantendo- se U e V constantes, ou

variando- se U e V (U/V) e mantendo- se w constante.

y z x + + -Quadrupolos Lineares : Q / q Paul & Steinwedel 1953

A varredura é feita variando simultaneamente U (DC) e V₀(AC) mas mantendo constante a relação U/V₀.

Wolfgang Paul Prêmio Nobel 1989

Vantagens

- Espectros de massa “tradicionais” - Boa reprodutibilidade

- Aparelhos relativamente pequenos (20 cm), robustos, simples e baratos. - Podem ser utilizados para gerar espectros do tipo “dissociações induzidas

por colisões de baixa energia” (Low-energy collision-induced dissociation, CID MS/MS) em sistemas com quadrupolos triplos e espectrômetros de massa híbridos, nos quais se analisa as fragmentações dos fragmentos. -Varreduras rápidas

- Íons acelerados com baixas energias cinéticas (15 eV).

Desvantagens

- Resolução limitada

- Altura dos picos variável em função da massa, mas não função da abundância dos íons.

- Inadequada para técnicas de ionização pulsadas (MALDI e ESI). - Baixa sensibilidade

Aplicações

- Na maioria dos equipamentos de LC/MS e GC/MS - Sistemas de quadrupolo triplo MS/MS

Extrel Pentaquadrupole QqQqQ Mass Spectrometer (MS3₎

Eberlin, M. N. Mass Spectrom. Reviews 1997, 16, 113

Extrel Pentaquadrupole QqQqQ Mass Spectrometer (MS3₎

Eberlin, M. N. Mass Spectrom. Reviews 1997, 16, 113

Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det. M₁ M₂ Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det. M₁ M₂ Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det. M₁ M₂ Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det. M₁ M₂ Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det. M₁ M₂ Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det. M₁ M₂ Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det. M₁ M₂ Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det. M₁ M₂

1.3.3 Analisadores de captura de íons (ion trap) tridimensionais

Existem dois tipos de espectrômetros de massas de captura de íons: captura de íons por quadrupolos tridimensionais ( t am bém chamada de captura dinâmica), e de ressonância em cíclotron (captura estática). Ambas funcionam acumu-lando íons no seu interior, em se manipuacumu-lando correntes alternada e de radiofr equência simultaneamente. A captura permite a liberação controlada de íons, o que permite analisar sua separação controlada e com uma resolução muito grande. Além disso, é utilizada para experimentos m últi- acoplados (MSn_{), que permitem estudar mecanismo de} fragm ent ação de moléculas relativamente complexas, além de fornecerem espectros com alta sensibilidade. A possibili-dade de capturar íons por períodos que variam de

milissegundos a dias permite a análise de reações de fragm ent ação extremamente incomuns, dando origem a espectros de massas que não podem ser obtidos através de nenhuma outra técnica.

•"Bath gas": adiciona-se hélio a uma pressão típica de 10-3_{Torr para}

aumentar sensibilidade e resolução. A repulsão entre íons de mesma carga confinados no centro do trap tende a desestabilizar suas trajetórias por dispersão (efeito "space-charge"). Colisões com o "bath gas" resfriam os íons (energia cinética), mantendo-os aprisionados com refocalização para o centro do trap.

•Aprisionamento seletivo de íons: seqüência de eventos. Após o

aprisionamento de vários íons, um íon de m/z específico (ex: 100) pode ser mantido no trap, e os demais eliminados. Uma voltagem rf adicional é aplicada nos eletrodos end-cap com amplitude e freqüência ajustadas para eliminar os íons mais pesados (m/z > 100). A amplitude da voltagem rf (V) aplicada no ring electrode é então aumentada até um valor limite

(imediatamente inferior aquele necessário para a eliminação do íon de m/z 100), e durante a varredura de V tanto os íons pesados como os leves são sucessivamente eliminados.

QIT - Quadrupolos "I on Traps Lineares”

Vantagens: ~50 vezes mais sensíveis; maior capacidade de

armazenamento. Reduzem os problemas de “charge space” : repulsão íon-íon e assim minimizam “mass-shifts”. Sem problemas de self-CI e perda de 1/3 m/z em MS/MS !

Vantagens

- Alta sensibilidade: íons são pré-concentrados e sucessivamente analisados. - Permite a realização de EM em multi-etapas

- Baixo custo, simples, robusto e pequeno: ~ 5 x 5 x 5cm. - Permite experimentos MSn_{seqüenciais no tempo (ex: MS}13_).

Desantagens

- Ineficiente para se medir abundância relativa dos íons - Baixa dinâmica

- Sujeito à interferência por espécies carregadas e reações inter-moleculares - Energia de colisão entre partículas mal definida

- Deve-se otimizar vários parâmetros simultaneamente para a obtenção de dados de boa qualidade

- Baixa resolução: resolução "unitária". Pode trabalhar em alta resolução em varreduras lentas.

- Devido a possibilidade de ocorrer reações íon-molécula durante aprisionamento, espectros de EI podem ser "contaminados" por CI.

Applicações

- Sistemas GC/MS, LC/MS e MS/MS - Análise de íons específicos - Estudo da química de íons

1.3.4 Analisadores de tempo- de- vôo (time- of- flight)

O espectrômetro de massas com analisador de tempo de vôo faz uso da propriedade do tempo em que íons de diferentes m/z levam para cruzar o sistema de separação de íons. Opera em modo pulsado, de tal forma que os íons devem ser gerados repetidamente (em pulsos). Um campo elétrico acelera todos os íons formados (íon molecular e fragmentos) para uma região livre de efeitos externos (campo magnético, diferença de potencial, etc). Os íons são levados com uma energia cinética zV, na qual z = carga do íon e V é uma voltagem aplicada para que possam ser “ carregados” . Como a energia cinétiva é dada pelo termo 1/2mv2_{, íons mais leves} viajarão mais rápido do que os pesados, e alcançarão o detector no fim da região livre de efeitos externos. Logo, o t em po de v ôo de um íon dependerá de sua massa, carga e energia cinética.

Aumento da Resolução em TOF

TOF's lineares apresentam baixa resolução devido a duração do pulso de ionização e dispersão de energia cinética dos íons na fonte. Solução paliativa: Aumento de L ou técnicas de aceleração "pós-ionização".

Reflectors(Espelhos Eletrostáticos): Uma série de grades ou eletrodos onde se aplica um potencial repulsivo crescente. Os íons penetram angularmente no reflector, são desacelerados por repulsão eletrostática, fazem uma curva, e assim retornam para o tubo de vôo. Considere dois íons de mesma m/z mas com diferentes velocidades, dispersos no tempo. O íon de maior energia cinética, a frente em tempo de vôo, penetra mais profundamente no reflector e ali permanece por mais tempo. O outro penetra menos profundamente, e ali permanece por um tempo menor. A dispersão é corrigida, e os íons são refocalizados em tempo de vôo, com conseqüente aumento da resolução (largura do pico) ou poder de separação.

Aceleração ortogonal. o-TOF: Í ons são produzidos de forma contínua na

fonte de ionização, e acelerados. O feixe de íons é focalizado com o auxílio de lentes e quadrupolos/octapolos "rf-only". Uma aceleração pulsada e ortogonal ao movimento do feixe de íons é aplicada. Í ons então adquirem velocidades "ortogonais" que não são influenciadas pelas suas velocidades divergentes adquiridas pela aceleração na fonte.

Vantagens

- É o espectrômetro de massas mais rápido

- Desenhado para técnicas de ionização pulsada (MALDI) - Alta transmissão de íons

- Informação sobre MS/MS após fragmentação

- Permite a detecção de íons com a maior faixa (de pequena a altíssima). - Alta sensibilidade

- Baixo custo, fácil manutenção. - Varreduras extremamente rápidas.

- Ampla faixa de varredura > 106_{u. Único analisador acoplável a MALDI de}

macromoléculas.

- Hoje, uma das melhores relações custo/benefício.

Desantagens

- Requer técnica de ionização pulsada

- Requer detecção muito rápida, e digitalização dos sinais. - Baixa seletividade na geração de precursores iônicos em MS/MS - TOF's lineares: baixa resolução. TOF's com reflector: média resolução.

o-TOF's com reflector: alta resolução e alta precisão ( 5 ppm).

Applicações

- Todos os sistemas MALDI

1.3.5 Espectrometria de Massas com Ressonância Ciclotrônica de Í ons (ICR) e Transformada de Fourier ( FT- MS)

Uma cela cúbica é posicionada no centro de um íma supercondutor

(~ 3-7 Tesla). Os íons formados dentro da cela (ou ali injetados) se movem em uma trajetória circular perpendicular ao eixo do campo magnético, de frequência angular (frequência de ressonância ciclotrônica) w_cproporcional ao campo magnético B e as suas m/z's:

w_c= zeB/m

Para evitar que íons escapem da cela, uma baixa voltagem dc é aplicada aos eletrodos de aprisionamento gerando um campo elétrico E perpendicular ao campo magnético B.

Uma voltagem rf é aplicada aos eletrodos transmissores (laterais). Varre-se então rapidamente a frequência da voltagem rf (pulso) mantendo-se B constante. Quando a frequência de rf (w_rf) se iguala a frequência angular de oscilação de algum íon: w_c, este absorve energia com aumento de velocidade e do raio de sua orbita mas sem alterar a frequência de sua oscilação. Após poucas rotações, os íons que absorveram energia estarão se movendo sincronizadamente. Esta oscilação ciclotrônica é sentida pelos eletrodos receptores (superior e inferior), produzindo uma corrente com frequência iqual a w_c. Rápida variação de w_rfpode ser realizada, sendo o espectro de massas obtido pela aplicação de FT.

Princípio básico: Aprisionamento de íons em uma campo magnético/elétrico, seguido da medida de suas frequências de ressonância ciclotrônica.

FTMS

Princípios de operacão do ICR (FTMS)

Partículas carregadas irão apresentar um movimento circular em um campo magnético com uma frequência ciclotrônica relacionada ao seu valor de m/z ! F F= = zz((vvx Bx B)) r zvB₌mv2 r m c = v=zB F = massa . aceleração r F ₌ mv2 2 2 m c = c = zB z 2 _c m₌ B

Espectrômetro de massas FT-ICR ( 9.4 Tesla )

FTMS Detector plate Trapping plate Magnetic field, B Excitation plate

Excitation on, one frequency (RF) excites one m/z

Detection on frequency spectrum

I llustration of how the image current is obtained. As the ion(s) in a circular orbit approach the top plate, electrons are attracted to this plate from ground. Then as the ion(s) circulate towards the bottom plate, the electrons travel back dow n to the bottom plate. This motion of electrons moving back and forth between the two

plates produces a detectable current.

Características principais FT- MS

•Altíssima resolução (função de B como em RMN) que diminui com o aumento de m/z.

•Análise não- discriminatória ( e não destrutiva) . Alta

sensibilidade. 10- 100 íons precisam normalmente oscilar para serem sentidos pelos eletrodos receptores.

•Alto custo (supercondutores), difícil manutenção. • MSn_{. Operação semelhante aos “ion- traps”.}

•Trabalham sob altíssimo vácuo (< 10- 8_{Torr) enquanto a} quantidade de íons aprisionados na cela é pequena ("charge-spacing").

•Muito utilizados em estudos de reações íon- molécula ( estudos cinéticos) e em análise de altíssima resolução-precisão.

1.3.6 Espectrometria de massas em sequência (MS/MS, ou Tandem Mass Spectrometry)

Nesta técnica, também chamada de Tandem mass spectro-metry permite a indução de fragmentação e a análise da fragm ent ação de fragmentos. Em geral, se induz a colisão de determinados íons com um gás (em geral He), em seguida analisando- se o espectro de massas dos

fragm ent os form ados. A fragm ent ação é induzida at rav és de um processo denominado “ dissociação induzida por colisão [collision- induced dissociat ion (CID)], na qual um íon é int roduzido em um a célula de colisão. O íon selecio-nado colide com um gás (He ou Ar), o que resulta em fragm ent ação Os fragmentos gerados são separados em um setor de análise, gerando um “ espectro de fragmento” . Assim, pode- se gerar um espectro de fragmento de frag-mento de fragfrag-mento (MS/MS/MS), quantas vezes se quiser ( MSn_{). Esta técnica é utilizada para se estudar a fragm} en-t ação de moléculas grandes (pepen-tídeos)..

MS/MS em determinação estrutural

1.4 Detectores de íons

Uma vez que os íons são separados no setor de análise e separação, devem ser detectados. O detector permite gerar uma corrente elétrica gerada pelo choque dos íons no seu int erior. Est e sinal é amplificado, e transformado em um sinal que será registrado ou acumulado em computador.

1.4.1 “Copo” de Faraday

O copo de Faraday opera no princípio de que uma mudança da carga em uma placa de metal resulta em um fluxo de elétrons, e, consequentemente, é gerada uma corrente elétrica. Um íon que atinja a superfície da placa, formada por BeO, GaP, ou CsSb, induz a ej eção de vários elétrons. Esta emissão temporária de elétrons induz uma corrente no copo e cria uma pequena amplificação da corrente gerada pela colisão do íon no copo. Este detector é de baixa

1.4.1 Multiplicadora de elétrons

Uma multiplicadora de elétrons é um dos meios mais simples para se detectar íons, apresentando grande sensibilidade

fazendo uso do princípio do copo de Paraday. Na multiplicadora se utiliza uma série de placas coletoras de íons em série,

mantidos em potencial crescente. Os íons atingem a súperfície da primeira placa, resultando na transmissão de elétrons. Estes elét rons são atraídos pela segunda placa aonde são gerados novos elétrons, resultando em uma cascata de elétrons. O ganho típico da amplificação da corrente gerada pela cascata de elétrons é da ordem de 1.000.000 de vezes.

1.4.1 Placa de conversão fotomultiplicadora

A placa de conversão fotomultiplicadora é similar a uma multiplicadora de elétrona aonde inicialmente os íons atingem uma placa, resultando na emissão de elétrons. Todavia, os elétrons gerados atingem uma tela de fósforo. A tela de fósforo, como uma tela de televisão, ejeta fótons uma vez atingida por elétrons. Estes fót ons são detectados por uma fotomultiplicadora, que opera em cascada como uma multiplicadora de elétrons. A vantagem é que os fótons gerados estã dentro de um sistema isolado do resto do equipamento, o que evita a presença de outras partículas int erferindo na det ecção dos elétrons gerados pelo choque de íons na placa coletora. Consequentemente, o tempo de vida da placa coletora é muito maior, apresentando uma grande sensibilidade.

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