Maringá 2009
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca Central da UEM. Maringá PR
B672p Gioppo, Nereida Mello da Rosa
Produção de queratinases por fungos filamentosos/Nereida Mello da Rosa Gioppo. Maringá: UEM, 2009. 51 p
Orientadora: Dra. Rosane Marina Peralta. Tese (doutorado em Ciências Biológicas)
Departamento de Bioquímica. Universidade Estadual de Maringá, 2009 Tese apresentada na forma de artigos científicos (2)
1.Proteases. 2. Queratinases. 3. sp. 4.
. 5. Biotecnologia. 6. Degradação de resíduos. I. Universidade Estadual de Maringá. Departamento de Bioquímica
Maringá 2009
Orientadora
A Deus, Senhor da minha vida, em quem tudo posso.
A Jesus, que morreu por mim na cruz.
Ao Gioppo, meu marido há 26 anos, meu namorado há 29 anos, meu melhor amigo e meu amor para sempre.
Aos meus amados filhos, Felipe e Raquel, por vocês tudo vale a pena.
À minha mãe Dirce, um exemplo a seguir.
Ao meu pai Valdemar e ao meu sogro Júlio, saudades de vocês...
À minha sogra Olinda, testemunho vivo do amor de Cristo.
A minha orientadora Profa Dra Rosane Marina Peralta, por seus ensinamentos, paciência e carinho durante esses anos.
A minha co orientadora Profa Dra Marina Kimiko Kadowaki, que mais que discutir comigo os resultados e a planejar novos experimentos foi minha amiga em todos os momentos.
A Nadir, amiga de todas as horas.
Ao Professor Salah por suas explicações estatísticas.
A Graziela e ao Rafael por terem torcido por mim e por terem segurado a barra enquanto estive ausente das aulas.
Aos meus amados Jucelaine, Patrícia e Marcelo; agradeço a Deus por ter colocado vocês em minha vida.
A Akeila, Ângela, Daniele, Edison, Emily, Jussara, Leandro, Lílian, Marlos, Tiago, pela amizade, carinho e disponibilidade nos momentos em que precisei.
As minhas queridas irmãs Neréia e Nerilda que sempre estiveram do meu lado juntamente com meus cunhados e sobrinhos. Amo vocês.
Aos meus amigos do estudo bíblico e irmãos na fé, suas orações foram fundamentais para mim, obrigada.
Aos amigos do laboratório do HUOP, muito obrigada por tornarem os plantões mais suaves.
A Alvina e Maria (Pingo), pelo carinho e atenção a mim dispensada. A minha doce amiga Luzia, luz do dia.
A Maria, Dinho (Vô), Cris, Carlos, pela hospitalidade sempre carinhosa com que me receberam em suas casas em Maringá, Deus lhes abençoe muitíssimo.
A todos os meus amigos, muito obrigada, com vocês minha vida é mais colorida;
À Coopavel Cooperativa Agroindustrial e Globoaves pelo fornecimento das penas;
À Fundação Osvaldo Cruz, na pessoa da Dra Maria Inez Sarquis, pela cepa
de IOC 2048.
Esta tese de doutoramento está apresentada na forma de dois artigos científicos
1. )-+$ )* - ./ * 0 ) ) )'. ) " $ * " ) 1 .') "
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". . *$+.$ ", de autoria de Nereida Mello da Rosa Gioppo, Fabiana
G. Moreira Gasparin, Andréa M. Costa, Ana Maria Alexandrino, Cristina Giatti Marques de Souza e Rosane M. Peralta, aceito no periódico científico Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology (índice de impacto 2007 igual a 1,687).
2. , .'3 3 +$ .' ) - 1 .') " , $*.' ) 02
", *' " de autoria de Nereida Mello da Rosa Gioppo,
Nadir Rodrigues Marcondes. Salah Din Mahmud Hasan, Marina Kimiko Kadowaki e Rosane Marina Peralta a ser submetido ao periódico científico Canadian Jornal of Microbiology (índice de impacto 2007 igual a 1,286).
certain structural characteristics that make their hydrolysis more difficult. The structural protein keratin is resistant to the activity of a broad range of proteases, mainly due to its high content of disulfide bridges. Keratins are the most abundant proteins in epithelial cells of vertebrates and are the major constituents of skin and its appendages such as nail, hair, feather, and wool. The keratin chain of hair (hard keratin) is similar to that of the epidermis (soft keratin) because it is also tightly packed in an α helix, but it differs from the latter in that it contains a several fold higher amount of cystein. However, in feathers, the polypeptide assumes a
β
-keratin.
, which is more readily hydrolyzed compared with α keratin. The resistance to hydrolysis of the keratin is conferred primarily by its high content of dissulfeto bridges. Keratin can be degraded by some species of fungi and bacteria that secrete keratinolytic enzymes (keratinases, EC 3.4.99.11). These enzymes have the ability to degrade native keratin into smaller peptide entities that can be subsequently absorbed by cells. Poultry processing plants produce worldwide millions of tons of feathers as a waste product annually. The development of enzymatic and/or microbiological methods for the hydrolysis of feathers into soluble proteins and amino acids is extremely attractive, as they offer cheap and easy procedures for the production of valuable substances. They could be used to produce rare amino acids like serine, cystein and proline, or for the development of slow release nitrogen fertilizers, glues, and biodegradable films. Keratinase producing microorganisms have been described as able to degrade feathers, and one strategy for selecting potential new keratinolytic microorganisms is the use of poultry feathers as the only substrate in the cultures.biochemical characterization of the enzyme from a selected strain, (second article)
6 4 The fungi and
sp were cultivated under submerged and solid state conditions, using poultry feathers as substrate, supplemented or not with different carbon and nitrogen sources. At periodic intervals the submerged cultures were filtered to retain insoluble materials, and centrifuged. The supernatants were used as sources of keratinases. Under solid state conditions, the experiments were carried out in flasks containing poultry feathers as substrate and the cultures were carried out at 28°C. To extract the enzyme a volume of 25 ml of distilled water was added to flasks containing the fermented solids. The mixtures were then mechanically stirred at 130 rpm and at 10°C for 1 h. The mixtures were firstly filtered through gaze and the filtrates were centrifuged. The supernatants were used as sources of keratinases. The keratinase activity was quantified using keratin or keratin azure as substrate.
condition than solid state cultures to produce keratinase. Eight of 21 species tested showed to have considerable keratinolytic
activity: , ,
and A good correlation (r=0.832) between the keratinase activity and the poultry feather degradation was observed. Our data suggest that the genus may have an important role in natural feather degradation. This work is also the first description of the keratinolytic capability of Its crude keratinase presented maximal catalytic efficiency at pH 9.0 and at the temperature of 40o C. The enzyme was highly sensitive to PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) indicating that the enzyme belongs to the serine protease family.
4 The identification and characterization of new filamentous fungi able to degrade keratin may help us to understand the role of fungi in the degradation of complex keratinous substrates in nature. The ability of the to grow and to produce appreciable amounts of keratinase using feathers and cassava bagasse as substrates could be potentially useful for the development of biotechnological methods aiming to obtain useful hydrolysis products from poultry feathers.
7 8 9 4 Filamentous fungi, , sp,
4 Os fungos são microrganismos heterotróficos que utilizam
extracelulares têm um papel importante na nutrição. Algumas proteínas apresentam certas características estruturais que tornam mais difícil sua hidrólise. A queratina, uma proteína estrutural, é resistente a ação de várias proteases, devido principalmente ao seu alto conteúdo de pontes dissulfetos. As queratinas são encontradas em células epiteliais de vertebrados e representam os maiores constituintes da pele e seus apêndices tais como unhas, cabelos, penas e lã. A queratina do cabelo (queratina dura) é semelhante a encontrada na epiderme (queratina macia), visto possuir estrutura em α hélice, mas difere desta última por conter menor quantidade de cisteína. Nas penas, a queratina assume conformação β, que é mais facilmente hidrolisada quando comparada com a α queratina. A resistência à hidrólise da queratina é conferida principalmente pelo seu alto teor em pontes dissulfeto. Entretanto, ela pode ser degradada por algumas espécies de fungos e em menor extensão por bactérias que secretam as enzimas queratinolíticas (queratinases, EC 3.4.99.11), que tem a habilidade degradar queratina nativa em peptideos menores que são subseqüentemente absorvidos pelas células. Milhões de toneladas de penas de aves são produzidas anualmente como resíduos da criação de aves. O desenvolvimento de métodos enzimáticos e/ou microbiológicos para a hidrólise de queratina a proteínas solúveis e aminoácidos é extremamente atraente, visto que oferece uma condição barata e suave para a obtenção de produtos de alto valor. Este processo pode ser fonte de aminoácidos raros como cisteína, serina e prolina, ou pode ser usado no desenvolvimento de fertilizantes de lenta liberação de nitrogênio, colas e biofilmes. Diversos microrganismos produtores de queratinases tem sido descritos como hábeis em degradar penas de aves e uma estratégia simples de selecionar microrganismos com potencial queratinolítica é o uso de penas de aves como substrato único nos meios de cultivos.
de diferentes espécies de de crescer e produzir proteases hábeis em hidrolisar queratina de penas de aves em culturas submersas e em estado sólido utilizando penas de aves como substrato e relatar a caracterização bioquímica parcial da enzima de uma espécie selecionada,
(segundo artigo)
: 4 Os fungos e
sp foram cultivados em condições submersas e em estado sólido utilizando penas de aves como substrato. Às culturas foram adicionadas ou não diferentes fontes de carbono e nitrogênio. As culturas submersas foram filtradas em intervalos periódicos para reter o material insolúvel e os filtrados posteriormente centrifugados. Os sobrenadantes foram utilizados como fontes das queratinases. Os cultivos em estados sólidos foram conduzidos em frascos contendo penas de aves como substrato e mantidos 28°C. Para extrair as enzimas, um volume de 25 ml de água destilada foi adicionado aos frascos contendo os materiais fermentados. As misturas foram agitadas a 120 rpm e 10°C por 1 h. As misturas foram primeiramente filtradas em gaze e os filtrados foram centrifugados. Os sobrenadantes foram usados como fontes das queratinases. A atividade queratinase foi quantificada utilizando queratina ou queratina azure como susbtrato.
produção de queratinase tanto em condições submersas quanto em estado sólido. No segundo artigo, um estudo comparativo foi conduzido para avaliar a capacidade de diferentes espécies do gênero crescer e produzir queratinases em cultivos submersos e em estado sólido usando penas de aves com único substrato. Para todas as espécies, condições submersas foram mais eficientes que as em estado sólido para produzir queratinases. Oito das 21 espécies de testadas mostraram considerável atividade queratinolítica: , ,
e Uma boa
correlação (r=0.832) entre atividade queratinolítica e degradação da pena de aves foi observada. Nossos dados sugerem que o gênero
pode ter um papel importante na degradação natural de penas. Este trabalho também é a primeira descrição de atividade queratinolítica de
A enzima bruta apresentou máxima eficiência catalítica em pH 9.0 e temperatura de 45o C. A enzima de foi altamente sensível a PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonil) indicando tratar se de uma enzima da família das serina proteases.
4 A identificação e a caracterização de fungos filamentosos hábeis em degradar queratina pode ajudar na compreensão do papel dos fungos na degradação dos complexos queratinolíticos na natureza. A habilidade de crescer e produzir quantidades apreciáveis de queratinase utilizando penas e bagaço de mandioca como substratos pode ser potencialmente útil no desenvolvimento de métodos biotecnológicos para a obtenção de produtos hidrólise úteis a partir de penas de aves.
6 4 fungos filamentosos, ,
