Recebido para publicação em 04/06/2007 Aceito para publicação em 06/11/2007
Carotenóides totais em Pothomorphe umbellata (L.) Miq. cultivadas in vitro
YEPEZ, C.C.B.1; LIMA, G.P.P.1*; PADILHA, P.M.1; CORRÊA, L.C.1; TEJADA, E.S.2
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Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”/UNESP, Departamento de Química e Bioquímica, IB, Caixa Postal 510 – CEP 18.618-000 – Distrito de Rubião Junior, Botucatu, SP.2Universidade de São Paulo/USP, Departamento de Bioquímica, Cx. Postal: 26.077, CEP 05513-970 , São Paulo, SP. *gpplima@ibb.unesp.br
RESUMO: O presente trabalho objetivou comparar o teor de carotenóides entre calos e plantas regeneradas de Pothomorphe umbellata. As sementes germinadas (40 dias) foram inoculadas em diferentes concentrações e combinações de BAP (benzilaminopurina) e NAA (ácido naftaleno acético) visando estimular a produção de calos. Após 60 dias do cultivo, os calos contendo algumas brotações, foram levados para meio de organogênese (GA30,1 mg L-1, BAP 0,5 mg L-1)
por um período de 40 dias, para logo serem transferidos para meio de desenvolvimento de plântulas (sem reguladores) por mais 40 dias. Calos (coletados aos 60 dias) e plântulas (coletadas aos 140 dias) foram congelados em nitrogênio líquido e mantidos em freezer a -80ºC para posterior análise de carotenóides. A maior concentração de carotenóides foi encontrada em plantas cultivadas em meio sem adição de reguladores, enquanto os calos não mostraram diferença em relação ao meio de cultivo, porém, mostraram menor teor em relação às plantas.
Palavras-chave: calos, plântulas, reguladores vegetais, plantas medicinais
ABSTRACT: Total carotenoids in Pothomorphe umbellata (L.) Miq. cultivated in vitro. The aim of the present work was to compare the content of carotenoids between callus and regenerated plants of Pothomorphe umbellate. Germinated seeds (40 days old) were inoculated in different concentrations and combinations of BAP (benzylaminopurine) and NAA (naphthalene acetic acid) in order to stimulate the callus’ production. After 60 days of culture, the callus containing some shoots were transferred to organogenesis medium (GA30.1 mg L-1, BAP 0.5 mg L-1) for 40 days.
Next, they were subcultivated in a medium for seedling growth (without regulators) for 40 days. Callus (collected after 60 days) and seedlings (collected after 140 days) were frozen in liquid nitrogen and kept under -80oC for future carotenoids‘ analysis. The highest concentration of
carotenoids was found in plants cultivated in medium without regulators. The callus did not showed difference concerning the culture medium; however,they presented lower content of carotenoids in relation to plants.
Key words: callus, seedlings, growth regulators, medicinal plants
INTRODUÇÃO
Os metabólitos secundários são essencialmente produzidos e extraídos a partir de plantas cultivadas no campo, sofrendo, portanto, a influência de variações sazonais, pragas, doenças e condições meteorológicas. Desse modo, a utilização de técnicas biotecnológicas é um importante recurso alternativo para o cultivo de espécies, atuando como fonte biológica contínua para a produção de fármacos (Viana et al., 2004).
A cultura de tecidos tem sido usada como
técnica para obtenção de diversos metabólitos primários (enzimas) e secundários (flavonóides) (Matsubara et al., 1989). Assim, o uso de plantas micropropagadas pode ser uma boa fonte de estudos para diversas substâncias, incluindo os carotenóides. Pothomorphe, como planta medicinal, tem grande importância no Brasil e no mundo por ser utilizada como tônico, vermífugo, para combater inflamações internas e externas (Berg, 1982), contra dor no fígado e baço, hepatite (Ming et al., 1997), dor
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de cabeça e infecções fúngicas da pele (Moraes, 1999), anti-sifilítica, colagoga e colerética (Di Stasi et al., 1989) e antioxidante (Barros et al., 1996).
Os carotenóides, substâncias antioxidantes, constituem um dos grupos mais importantes dos pigmentos naturais, pela ampla distribuição, diversidade estrutural e numerosas funções (Martínez, 2001). Sua função biológica está na proteção contra danos oxidativos e são geralmente usados no sistema de defesa da planta (Julsing et al., 2006).
Dentre as várias funções que lhes são atribuídas destaca-se, em termos nutricionais, o fato de alguns desses pigmentos atuarem como precursores de vitamina A, o que depende essencialmente de sua estrutura, que contém um anel ß-ionona não substituído, ligado a uma cadeia poliênica de pelo menos 11 átomos de carbono (Rodriguez-Amaya, 1985). Os carotenóides são considerados moléculas importantes para o sistema antioxidante e os vegetais verdes parecem ser fonte dessas substâncias.
A distribuição dos carotenóides no mundo vegetal é muito ampla, tendo-se estudado sua presença em plantas folhosas como espinafre (Tetragonia expanza Murray), couve chinesa (Brassica chinensis L.), couve flor (Brassica oleraceae L.), mostarda (Brassica juncea L.), agrião (Nasturtium officinale) e em frutos como tomate (Lycopersicum esculemtum) (Minazzi-Rodrigues & Penteado, 1989; Sant’anna & Penteado, 1996).
Segundo Moraes (1999), a partir de análises morfo-anatómicas e fitoquímicas, as plantas de Pothomorphe umbellata L. e Pothomorphe peltata L. apresentam abundantes carotenos nos idioblastos das folhas. Presume-se que em plantas micropropagadas, ocorram teores de carotenóides também, assim como nos calos.
Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi determinar o teor de carotenóides totais em calos e plântas obtidas via organogênese indireta de Pothomorphe umbelata.
MATERIAL E MÉTODO
Condição de crescimento da planta e calos Plântulas com 40 dias, obtidas a partir da germinação de sementes in vitro em meio MS/62 (Murashige & Skoog, 1962), foram cultivadas em meio nutritivo MS, solidificado com ágar, contendo 3% de sacarose e diferentes reguladores vegetais (Tabela 1) para a indução de calos (60 dias). Os calos formados foram subcultivados por mais 40 dias, em meio nutritivo MS/62 (Murashige & SKoog, 1962) similar, solidificado e acrescido de sacarose, contendo combinações e concentrações de reguladores vegetais (Tabela 2) para regeneração (organogênese
TABELA 1. Tratamentos utilizados na fase de produção de calos de Pothomorphe umbellata
Tabela 2. Tratamentos utilizados em Pothomorphe umbellata na fase da organogênese.
indireta). Tanto os calos, quanto as plantas regeneradas, foram analisadas quanto ao teor de carotenóides totais.
Determinação de Carotenóides
As amostras (plantas regeneradas e calos) foram congeladas em nitrogênio líquido para análise dos carotenóides. Todas as operações foram realizadas no escuro, para evitar a degradação.
Saponificação
A saponificação é uma etapa necessária para a remoção de lipídeos e clorofila, que são compostos que podem alterar a quantificação correta dos carotenóides (Davies, 1976). Assim, as amostras foram homogeneizadas em 30 mL de solução aquosa de KOH metanólico 10% (Sant’anna e Penteado, 1996), por aproximadamente 12 horas a temperatura ambiente (Minazzi-Rodrigues & Penteado, 1989).
Extração dos carotenóides
Para a extração dos carotenóides totais (Figura 1) foi utilizado o método descrito no Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemistry – AOAC (1995), adaptado às características do material vegetal.
Após a saponificação, a amostra foi filtrada a vácuo e o resíduo transferido para béquer, onde foi adicionado 20 mL de acetona, 30 mL de hexano e 50 mg de MgCO3. Num funil de separação, a solução foi
-FIGURA 1. Fluxograma da saponificação e extração dos carotenóides em plântulas de Pothomorphe umbellata.
A = absorbância obtida a 450 nm. V = volume final em hexano e1%
1cm = coeficiente de extinção = 2592
hexano foi separada e o precipitado (material vegetal e MgCO3) foi lavado tantas vezes quanto necessário
com acetona até obter o extrato incolor. Posteriormente, foram misturados os extratos e adicionados 12,5 mL de hexano. Finalmente, esta mistura foi lavada 5 vezes com água destilada, para garantiraremoçãocompletadaacetona(camadainferior). O extrato hexânico foi transferido para balão volumétrico de 50 mL, contendo 4,5 mL de acetona. O volume foi completado com hexano.
Quantificação de carotenóides
Por serem desconhecidos os carotenóides constituintes do extrato acetônico, realizou-se inicialmente o espectro de absorção, nos comprimentos de onda de 350 a 550 nanômetros (nm). A quantificação dos carotenóides totais foi feita pela modificação da fórmula de Ramos (1987), a partir da absorbância máxima verificada a partir de um espectro de absorção. Baseada na lei de Beer utilizou-se a seguinte fórmula:
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Cálculo do rendimento dos carotenóides Para o cálculo do rendimento foi feita a extração de carotenóides (Figura 1) a partir do padrão de -caroteno. Obtido o rendimento, calculou-se o fator de correção, para finalmente se obter a concentração real dos carotenóides.
Concentração real = Concentração obtida x Fator de Correção
RESULTADO E DISCUSSÃO
Foram realizados testes prévios com plântulas de P. umbellata, analisando amostras com tratamento de saponificação e sem saponificação. As amostras sem saponificação apresentaram valores não quantificáveis, mostrando uma tonalidade verde no extrato, provavelmente devido ao alto teor de clorofila, diferente ao tratamento com saponificação, cujo extrato mostrara uma cor levemente alaranjada.
A saponificação, tradicionalmente é realizada após a extração, mas parece provocar perdas de oxicarotenóides, durante o processo da lavagem do álcali (Bertoli, 1998). Além disso, quando a saponificação é feita na primeira etapa, o processo da extração passa por tantos passos e lavagens, que seria impossível que restasse algum resíduo do alcali que possa provocar perdas ou possa interferir na determinação final dos carotenóides. Desta maneira, neste trabalho, a saponificação foi realizada anteriormente à extração.
Um dos motivos pelos quais os resultados foram apresentados como µg g-1de carotenóides totais
e não como µg g-1de ß-caroteno, foi devido à grande
variedade de carotenóides da cadeia biosintética que são identificados a 450 nm no espectro de absorção, ou seja, seria muito arriscado afirmar que só ß-caroteno estaria presente, sendo que existe muita proximidade entre os carotenóides nesta faixa.
A importância da utilização do MgCO3na
determinação dos carotenóides é seu poder neutralizante e antioxidante. Segundo Rodriguez-Amaya (1992), é recomendável analisar as amostras imediatamente depois de obtidas, neste caso não é necessário o uso destes antioxidantes. Porém, o armazenamento dos extratos ou frações, produz alteração nos carotenóides, os quais devem permanecer o tempo mínimo necessário em acetona, e logo devem ser transferidos para hexano ou éter de petróleo.
Segundo os resultados, o MgCO3
aparentemente não alterou a determinação de carotenóides, provavelmente porque as amostras foram analisadas imediatamente depois de descongeladas.
O resultado dos carotenóides totais nas plântulas de Pothomorphe umbellata (Tabela 3) no tratamento T0 (testemunha) foi de 65,05 µg g-1de
carotenóides totais g-1matéria fresca.Adiferença entre
os tratamentos T1/MS, T1-MS/4 e T2-MS/4 não mostrou significância (p<0,05), sendo a testemunha aquele tratamento onde obteve-se os maiores valores. Os calos de Pothomorphe umbellata não apresentaram problemas para determinação de carotenos, pois não mostraram presença de clorofila. Nota-se que os reguladores vegetais usados não induziram diferenças entre os tratamentos. Os resultados oscilaram entre 9,52 - 14,39 µg de carotenóides totais g-1matéria fresca (Tabela 3).
De acordo com Salisbury & Ross (1992), em teste feitos em plântulas estioladas germinadas no escuro, foi detectada a presença de alguns carotenóides dentro de etioplastos, que são as cavidades que contêm os carotenóides, mas não clorofila. Os autores afirmam que as plântulas estioladas têm uma coloração amarela, porque não podem sintetizar a maioria das enzimas e as proteínas estruturais requeridas para a formação do sistema tilacoidal e a maquinaria fotossintética. Em calos de Pothomorphe umbellata, também observou-se uma coloração amarelada e a ausência de cor verde (verificada visualmente).
TABELA 3. Avaliação do teor de carotenóides (µg g-1
de carotenóides totais g-1mat. fresca.) em plântulas
e calos de Pothomorphe umbellata, aos 40 dias.
As médias seguidas da mesma letra na vertical não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao 5% de probabilidade.
Pelos resultados observados em várias pesquisas, a probabilidade de se obter metabólitos secundários em calos (Ravishankar & Grewal, 1991), suspensões celulares (Scragg et al., 1990), cultivo de raízes (Pradel et al., 1997) e brotos (Srividya et al., 1998) é muito alta. Provavelmente, esse maior teor de carotenóides encontrado nas plantas seja devido à presença de cloroplastos, que pode conter carotenóides, fato não evidenciado nos calos.
CONCLUSÃO
Plântulas de Pothomorphe umbellata desenvolvidas em meio MS desprovido de reguladores vegetais apresentaram maiores teores de carotenóides quando comparados com calos.
Diferentes tratamentos com reguladores vegetais (BAP, NAA e GA3) em plantas e em calos
resultaram em baixos teores de carotenóides.
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