ESTUDO DAS PROJEÇÕES NEUROANATÔMICAS
DOS NÚCLEOS CAUDAIS DA RAFE PARA A ÁREA
PRESSORA CAUDAL
Marcio Vinicius Moreira Vianna
Dissertação de Mestrado em Ciências Fisiológicas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas
Universidade Federal do Espírito Santo
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ESTUDO DAS PROJEÇÕES NEUROANATÔMICAS
DOS NÚCLEOS CAUDAIS DA RAFE PARA A ÁREA
PRESSORA CAUDAL
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Marcio Vinicius Moreira Vianna
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.
Aprovada em 18/09/2007 por:
___________________________________________________ Prof. Dr. Henrique de Azevedo Futuro Neto - Orientador, UFES.
_____________________________________________ Prof. Dr. Nyam Florencio da Silva – Co-orientador, UFES.
_______________________________________________
Profa. Dra. Maria das Graças Corrêa de Faria, EMESCAM.
Universidade Federal do Espírito Santo
Vianna, Marcio Vinicius Moreira, 1976.
Estudo das projeções neuroanatômicas dos núcleos caudais da rafe para a área pressora caudal. [Vitória] 2007
Viii, 71p., 29,7 cm (UFES, M. Sc., Ciências Fisiológicas, 2007)
Agradeço a Deus, por ser a fonte de minhas forças nos momentos mais difíceis. E dedico este trabalho a minha mãe Olga Moreira Vianna, a memória de meu pai Dirley Rody Vianna, minha irmã Márcia e minhas sobrinhas, que através do amor e carinho, me incentivaram e me apoiaram na busca do meu crescimento pessoal e profissional.
AGRADECIMENTOS
A Deus por sua proteção divina em cada momento de minha vida.
A minha mãe Olga Moreira Vianna, que sempre me apoiou e incentivou, e que sempre acreditou em mim, fazendo-me crer na minha capacidade e competência.
Agradeço minha irmã Márcia Moreira Vianna da Costa que, apesar da distância que nos separa, esteve presente nas decisões mais importantes da minha vida. Sempre com amizade e carinho com seu irmão que tanto te ama.
Ao Prof. Henrique de Azevedo Futuro Neto, ao qual admiro por sua competência e amizade, e pela oportunidade para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao Prof. José Guilherme Pinheiro Pires, pelo seu apoio e amizade, e pela atenção demonstrada sempre que sua ajuda era solicitada, sendo no desenvolvimento deste trabalho ou não.
Ao Prof. Nyam Florencio da Silva, companheiro de Laboratório, pela valiosa colaboração na realização deste trabalho e por superar minhas “teimosias” com paciência e respeito, sendo capaz de me orientar tanto nos assuntos profissionais quanto em questões pessoais que levarei comigo por toda a minha vida.
Aos amigos do laboratório de Neurofisiologia com os quais passei importantes momentos de alegria e descontração e, pela confiança e compreensão que recebi de cada um.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, pela orientação e incentivo dedicado aos alunos, determinando uma boa formação.
Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação, amigos, colaborando para o êxito deste trabalho.
SUMÁRIO
• FOLHA DE ROSTO i • FICHA CATALOGRÁFICA ii • DEDICATÓRIA iii • AGRADECIMENTOS iv • SUMÁRIO v • RESUMO vi • ABSTRACT viii • INTRODUÇÃO 10• 1.1 ÁREA ROSTROVENTROLATERAL BULBAR (RVLM) 11
• 1.2 ÁREA CAUDOVENTROLATERAL BULBAR (CVLM) 13
• 1.3 ÁREA PRESSORA CAUDAL (CPA) 14
• 1.4 NÚCLEOS DA RAFE 16
• 1.5 DESCRIÇÃO DA TÉCNICA DE MARCAÇÃO COM HORSERADISH PEROXIDASE (HRP) 25 • 2. OBJETIVOS 27 • 2.1. OBJETIVO GERAL 27 • 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 27 • 3. MATERIAL E MÉTODOS 28 • 4. RESULTADOS 32 • • • • 5. DISCUSSÃO 45 • • • • 6. CONCLUSÃO 51 • • • • 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFIAS 53
RESUMO
ESTUDO DAS PROJEÇÕES NEUROANATÔMICAS DOS NÚCLEOS CAUDAIS DA RAFE PARA A ÁREA PRESSORA CAUDAL BULBAR.
Objetivos: Estudos prévios demonstram que as respostas cardiovasculares induzidas por estimulação de núcleos caudais da rafe são em parte mediadas pela área pressora caudal (CPA). O presente estudo visa identificar a existência de projeções eferentes dos núcleos caudais da rafe; Magno (RMg), Pálido (RPa) e Obscuro (NRO), para a CPA.
Métodos: Seis ratos Wistar machos (270-300 g), anestesiados com cloral hidratado (0,4g/kg, i.p.), foram posicionados no aparelho estereotáxico para microinjeções unilaterais na CPA (1,0mm caudal e 1,7mm lateral ao óbex; 2,0mm da superfície encefálica) do traçador axonal retrogrado horseradish peroxidase (HRP; 20%; dissolvido em salina; 50nl). Os animais foram mantidos vivos durante dois a três dias, tempo necessário para permitir o deslocamento retrogrado intraneuronal do traçador. Em seguida os ratos foram profundamente anestesiados e perfundidos transcardiacamente com 500 ml de solução salina; 500 ml de paraformaldeido 1% e glutaraldeído 1,25% em tampão fosfato 0,1M (pH 7,6). O tronco cerebral foi retirado e seccionado (micrótomo de congelamento) com uma espessura de 40 µm e tratado com Diaminobenzidina a 0,05%. Esta reação promoveu uma coloração marrom no pericário dos neurônios marcados. As secções foram coradas com vermelho neutro e os neurônios marcados visualizados com o auxílio do microscópio óptico, sendo suas coordenadas analisadas de acordo com o atlas estereotáxico (Paxinos e Watson, Acadamic Press, 1986).
Resultados: Foram encontrados neurônios marcados em todos os três núcleos da rafe caudal. A distribuição dos neurônios marcados nos 6 ratos estudados foi a seguinte:
No RMg foram vistos neurônios marcados nos ratos 1, 2 e 3. Totalizando 10 neurônios marcados.
No RPa foram vistos neurônios marcados nos ratos 1, 3, 4 e 5. Totalizando 14 neurônios marcados nestes animais.
No NRO foram visto neurônios marcados nos ratos 2, 3, 4, 5 e 6. Totalizando 11 neurônios marcados.
No RMg, os neurônios marcados estavam situados de -11,30 mm a -11,60 mm caudal ao Bregma (10 neurônios), estando a maioria (7 neurônios) em -11,60 mm, com profundidade entre 10,4 mm e 10,7 mm da superfície externa do crânio. O RMg foi a região de menor dispersão dos neurônios marcados rostro-caudalmente, visto que num total de 10 neurônios marcados, 7 estavam a -11,60 mm caudais ao Bregma. No RPa os neurônios foram encontrados entre -11,30 mm e -12,80 mm caudal (14 neurônios), com profundidade de 10,8 mm a 11,1 mm, estando o maior numero a -11,60 do Bregma (5 neurônios). No NRO os neurônios foram marcados entre -11,60 mm a -12,72 mm caudal ao Bregma (11neurônios), 8 destes entre -11,60 mm e -11,80 mm, e profundidade variando entre 10,0 mm a 10,8 mm dorso-ventral. Apenas um neurônio foi encontrado na profundidade de 10,8 mm no NRO a -11,96 mm do Bregma.
Conclusão: O estudo demonstra a presença de projeções eferentes monossinapticas dos núcleos RMg, NRO e RPa para a CPA. E que a grande maioria destas projeções, possuem suas origens entre -11,60 mm a -11,80 mm do Bregma. Com base nestas evidencias é possível sugerir que estas projeções estejam relacionadas, pelo menos em parte, com o controle das atividades cardiovasculares em ratos.
ABSTRACT
NEUROANATOMICAL PROJECTIONS FROM THE CAUDAL RAPHE NUCLEI TO THE CAUDAL PRESSOR AREA IN THE RAT
Objective: Previous studies have shown that cardiovascular effects induced by stimulation of caudal raphe nuclei are partially mediated by the caudal pressor area (CPA). The present study demonstrates the existence of projections from the magnus (RMg), pallidus (RPa) and obscurus (ROb) raphe nuclei to the CPA.
Methods and Results: 6 Male Wistar rats (270-300 g), anesthetized with chloral hydrate (0.04 g/kg, i.p.), were put in the estereotaxic set for unilateral microinjections of horseradish peroxidase (HRP) into the CPA (1.0 mm caudal and 1.7 mm lateral to the Óbex; 2.0 mm from brain surface). HRP, an retrograde axonal tracer, was dissolved in saline to 20% and the microinjection volume was 50 nL. The animals were kept alive for 2-3 days, to allow the intraneuronal retrograde diffusion of the tracer. The rats were deeply anesthetized and perfused through the left ventricle with 500 mL saline + 500 mL paraformaldehyde 1% plus glutaraldehyde 1.25% in phosphate tampão 0.1 M (pH 7.6). The brainstem was taken out and sectioned (freezing microtome) with a thickness of 40 µm and treated with diaminobenzydine 0.05%. This reaction promoted a brown color in the pericarium of the marked neurons. The sections have been colored with neutral red and the marked neurons were visualized by optical microscopy. The coordinates were according to the estereotaxic atlas of Paxinos and Watson. Marked neurons have been found in all three studied raphe nuclei. In a total of 6 rats, 3 showed markings in the RMg, 4 in the RPa and 5 in the ROb. In the RMg, the marked neurons were allocated from -11.30 mm to -11.60 mm caudal to Bregma (10 neurons), being most (7 neurons) in -11.60 mm, with depth between 10.4 mm and 10.7 mm of the external brain surface. The RMg has been the region of smaller dispersion of the neurons rostro-caudally marked, once in a total of 10 neurons marked, 7 were -11.60 mm caudal to the Bregma. In the RPa the neurons have been found between -11.30 mm and -12.80 mm caudal (14 neurons), with profundity from 10.80 mm to 11.1 mm, being the biggest number -11.60 mm of the Bregma (5 neurons). In the ROb the neurons
(11 neurons), 8 of them between -11.60 mm and -11.80 mm and depth varying from 10.0 mm to 10.80 mm ventral-dorsally.
Conclusion: The study shows the presence of efferent projections from the nuclei RMg, ROb and RPa to the PCA. Based on these evidences it is possible to suggest that these projections were related to the cardiovascular effects elicited by stimulation of these caudal raphe nuclei in rats.
1. INTRODUÇÃO
A perfusão sanguínea apropriada é garantida pela manutenção da força motriz da circulação, ou seja, a pressão arterial em níveis adequados e razoavelmente constantes ao longo da vida. Desde o final do século XIX, busca-se demonstrar a localização da(s) estrutura(s) neurais responsáveis pelo controle cardiovascular e conseqüentemente a manutenção adequada da pressão arterial. Ao constatar que secção da porção cervical da medula espinhal promovia uma resposta depressora nos parâmetros cardiovasculares, Claude Bernard em 1863 (apud Gebber, 1990) relatou a importância do sistema nervoso central no controle cardiovascular.
Entretanto, somente dez anos depois, Dittmar em 1873 (apud Gebber, 1990) realizando experimentos com transecções coronais sucessivas do eixo neural, conseguiu demonstrar pela primeira vez, a participação do bulbo na manutenção da pressão arterial (PA). Realizando transecções do tronco cerebral em níveis sucessivamente mais caudais em coelhos curarizados, Dittmar observou que a integridade do bulbo era fundamental para manutenção PA. Além disso, demonstrou ainda que a destruição da região ventral bulbar era capaz de produzir hipotensão arterial, e que o mesmo não ocorria quando se destruía a região dorsal do bulbo. Estes achados sugeriam que as estruturas responsáveis pela manutenção da PA estavam localizadas na face ventral do bulbo introduzindo, na época, o conceito de centro vasomotor.
Em 1901, Bayliss, lançou a hipótese da existência de um centro vasomotor, constituído de áreas pressoras e depressoras que atuariam reciprocamente na manutenção da PA. Wang & Ranson (1939), com o advento da técnica estereotáxica, identificaram regiões pressoras e depressoras, esparsamente situadas em toda formação reticular bulbar, que se estendiam desde a região dorsal até a ventral do bulbo, resultado posteriormente confirmado por Alexander (1946).
Tais resultados, no entanto, foram obtidos através de estimulação elétrica, que interferem não somente em corpos celulares como também em fibras de passagem, não sendo possível, portanto, a afirmação que os neurônios responsáveis pela manutenção e regulação da PA estavam realmente localizados nas regiões onde a estimulação havia sido efetuada.
Schlaefhe & Loeschke em 1967, estudando o controle da respiração realizado através da participação do bulbo, observaram que o congelamento de áreas bastante restritas da superfície ventral bulbar produzia não somente alterações respiratórias, como também queda da PA. Entretanto, a utilização do congelamento nestes experimentos não permitiu ainda concluir se a hipotensão observada era resultante da inativação de células ou de fibras de passagem.
Graças aos experimentos pioneiros de Feldberg & Guertzenstein em 1972, onde, utilizando substâncias que atuam preferencialmente em corpos celulares neuronais (não interferem nas fibras de passagem), foi possível observar alterações da pressão arterial nas áreas descritas anteriormente por Schlaefke & Loeschke. Estes autores demonstraram que a aplicação de pentobarbital sódico, GABA (ácido gama-aminobutírico) e glicina, em uma região bastante delimitada da superfície ventrolateral do bulbo de gatos, produzia queda da PA a níveis semelhantes ao observados em animais espinais agudos. Tendo a glicina e o GABA uma ação pós-sináptica, a hipotensão observada durante a aplicação tópica desses aminoácidos na região rostroventrolateral do bulbo indicava que as células responsáveis pela manutenção da PA estavam situadas nesta região. Guertzenstein (1973) demonstrou também que a aplicação de drogas excitatórias como o leptazol e estricnina nos mesmos sítios produziam aumento da PA.
1.1 ÁREA ROSTROVENTROLATERAL BULBAR (RVLM):
Está região, atualmente conhecida como área rostroventrolateral bulbar (RVLM, rostroventrolateral medulla), foi caracterizada funcionalmente por Feldberg e Guertzenstein (1972) e Guertzenstein (1973), localiza-se em uma área restrita, caudal aos corpos trapezóides e bilaterais à linha média na superfície ventral do bulbo.
A partir destes estudos, diversos grupos de pesquisadores começaram a desenvolver pesquisas, buscando entender a participação do RVLM na geração e manutenção da atividade cardiovascular e as possíveis conexões desta área para outros centros moduladores da atividade autonômica em diversas espécies.
Posteriormente foi demonstrado que neurônios adrenérgicos do RVLM exerciam influência excitatória sobre as fibras simpáticas vasomotoras (Ross et al., 1984;
Schreihofer et al., 2000). Em ratos, a microinjeção de glutamato (L-Glu) nesta região, é capaz de evocar respostas pressoras e taquicárdicas (Willette et al., 1982).
A atividade tônica do RVLM foi ainda avaliada em estudos eletrofisiológicos, onde era possível registrar a atividade espontânea de neurônios do RVLM ou as modificações em sua atividade pela modificação dos níveis pressóricos (Brown & Guyenet, 1985; Campos Jr. & McAllen, 1999).
Outros pesquisadores relataram que a inibição do RVLM causava significativa queda na pressão arterial, demonstrando mais uma vez, como sugerido por Guertzenstein (1973), a participação desta estrutura no controle tônico da pressão arterial (Ross et al., 1983; Ruggiero et al., 1985; Guyenet, 1990; Dampney, 1994; Gordon & Sved, 2002).
Os axônios da maioria dos neurônios do RVLM projetam-se diretamente para a medula espinhal, em especial para a coluna IML, onde exercem importante influência tônica sobre os neurônios pré-ganglionares simpáticos (Amendt et al., 1978; Blessing et al., 1981; Ross et al., 1984; Milner et al., 1988; Jansen et al., 1995a). Acredita-se que a atividade tônica simpática seja dependente de neurônios glutamatérgicos. Tais conclusões provêm de estudos, que demonstraram que a reposta à estimulação elétrica ou química da RVLM era abolida quando se aplicava antagonista de receptores glutamatérgicos na medula espinhal (Mills et al., 1988; Bazil & Gordon, 1991, 1993).
Desta forma, o RVLM pode ser considerado um importante centro gerador e uma estação sináptica para vias descendentes de diferentes respostas autonômicas (Guertzenstein & Silver, 1974), para respostas viscerais de alerta (Guertzenstein et al., 1977; McAllen, 1984), para o reflexo baroreceptor (McKitrick & Calaresu, 1996; Schreihofer & Guynet, 2002) e para a resposta pressora do núcleo fastigial (Chida et al., 1990). A RVLM é tida como via comum nos ajustes cardiovasculares, pois sua inibição bloqueia uma série de respostas cardiovasculares centralmente mediadas, como: as respostas cardiovasculares típicas do comportamento de alerta e a resposta pressora à estimulação elétrica de núcleos da rafe bulbares (Hilton et al., 1983; Chida et al., 1990; Campos Jr et al., 1993; Silva et al., 2002).
Diferentes tipos e subtipos de receptores são citados na literatura científica, atuando na modulação dos neurônios pré-ganglionares simpáticos no RVLM, dentre os quais vale citar os receptores de endotelina (Mosqueta-Garcia et al., 1995; Ouchi et al, 1989), aminoácidos excitatórios (Tingley et al., 1990; Hay et al., 1999; Sapru,
2002; Sved et al., 2002) e aminoácidos inibitórios (Willette et al., 1984; Araújo et al., 1999). Adicionalmente, receptores opióides podem ser encontrados em células pré e pós-sinápticas do RVLM, sendo ativados por hipotensão hemorrágica (Guyenet, 2000; Aicher, 2001; Guyenet et al., 2002) e modulando respostas cardiovasculares à estimulação muscular (Caringi et al., 1998; Ally et al., 2002).
1.2 ÁREA CAUDOVENTROLATERAL BULBAR (CVLM):
Estes autores, Feldberg & Guertzenstein em 1976, também demonstraram uma região da superfície ventral bulbar, localizada entre o núcleo ambíguo e o núcleo reticular lateral (Willette et al., 1983; Li & Blessing, 1990; Masuda et al., 1991), hoje conhecida como CVLM (Caudal ventrolateral medulla), que quando estimulada pela nicotina apresentava uma resposta hipotensora. O CVLM é, assim, considerado um centro simpatoinibitório que contribui para a manutenção da pressão arterial em níveis normais (Willette et al., 1983; Chalmers & Pilowsky, 1991; Blessing, 1991; Cravo & Morrison, 1993; Aicher et al., 2000; Schreihofer & Guyenet, 2002).
Estudos das vias neurais relacionadas com o CVLM, com a aplicação de marcadores anterógrados (biocitina) e retrógrados (horseradish peroxidase) confirmaram que as células A1 das conexões do CVLM para o RVLM, provenientes do NTS (Aicher et al., 1995), estão envolvidas no barorreflexo e, por conseguinte, na modulação do controle tônico da pressão arterial (Cravo et al., 1991; 1993). Projeções descendentes de diferentes áreas do hipotálamo (Saper et al., 1976; Badoer et al., 1993; Lovick, 1993), córtex (Ally, 1998) e diversas outras áreas (Ciriello et al., 1986; Krukoff et al., 1993; Ally et al., 2002) também podem modular a atividade dos neurônios do CVLM, responsáveis pelo controle tônico da pressão arterial, modificando a atividade simpática em situações de estresse, contração muscular e outros estímulos comportamentais.
Dentre as muitas funções fisiológicas atribuídas ao CVLM está a modulação do arco reflexo ativado pelos baroreceptores (Jeske et al., 1993; Dampney, 1994; Spyer, 1994; Aicher et al., 2000) e pelo reflexo de Bezold-Jarisch, estimulado por quimiorreceptores (Vardhan et al., 1993; Gireoba et al., 1995). Estes reflexos, quando ativados perifericamente, causam primeiramente a liberação de aminoácidos excitatórios em sinapses de neurônios no NTS (Vardhan et al., 1993; Sved &
Gordon, 1994; Ohta et al., 1996; Sapru, 2002), ativando neurônios glutamatérgicos que se projetam monossinapticamente para o CVLM (Urbanski & Sapru, 1988; Aicher et al., 1995; Gordon & Sved, 2002). Do CVLM, saem neurônios gabaérgicos responsáveis pela modulação da atividade das células pré-ganglionares simpáticas do RVLM (Willette et al., 1984; Sun & Guyenet, 1986; Blessing & Li, 1989; Sapru, 2002), sem, no entanto, projetar-se diretamente para a medula espinhal (Loewi & McKellar, S., 1981; Ross et al., 1984; Jansen et al., 1995; Gordon & Sved, 2002).
Adicionalmente, existem projeções diretas do CVLM para o núcleo ambíguo (McKitrick & Calaresu, 1997), que participam do controle da atividade parassimpática para o coração, demonstrando que as conexões do CVLM não se limitam ao RVLM.
Conexões da área cinzenta periaquedutal para o CVLM (Hilton, 1975; Chen & Aston-Jones, 1996), podem, por sua vez, estar envolvidas na modulação das respostas cardiorrespiratórias evocadas por alterações comportamentais de luta e fuga.
1.3 ÁREA PRESSORA CAUDAL (CPA):
Esta região situada caudal a CVLM na transição bulbo-espinal, com atividade pressora semelhante a RVLM foi descoberta em animais profundamente anestesiados após a aplicação tópica de leptazol na superfície ventral caudal bulbar de gatos (Feldberg & Guertzenstein, 1986). Estes autores propuseram uma relação funcional entre esta área, conhecida como área pressora caudal (CPA) e o RVLM, uma vez que as respostas hipertensoras produzidas após a aplicação tópica de leptazol na CPA não ocorriam durante a inibição com injeção de pentobarbital sódico previamente na RVLM.
Os primeiros a estudarem esta região mais caudal na superfície bulbar de ratos foram Gordon & McCam em 1988. Seus achados confirmaram o trabalho de Fedberg & Guertzestein 1986, pois em seus resultados estes autores encontraram uma resposta hipertensora após a aplicação de glutamato nesta mesma região caudal a CVLM, além de demonstrarem que esta resposta era abolida tanto pela inibição do RVLM quanto por bloqueio ganglionar, demonstrando que a elevação da pressão arterial era obtida via aumento da atividade simpática. Estas observações
foram confirmadas por Campos Jr. & McAllen (1999), com o registro unitário da atividade elétrica de células da RVLM, acompanhado da estimulação ou inibição da CPA. Neste trabalho, ficou comprovado que as variações da CPA alteram a freqüência de despolarização das células pré-ganglionares simpáticas responsáveis pela manutenção do tono vasomotor simpático. Recentemente foi proposto que as vias da CPA para o RVLM envolvem uma ativação de neurônios simpatoexcitatorios glutamatérgicos na vizinhança da CVLM (Natarajan & norrison, 2000).
Silva (2001) obteve respostas hipertensoras semelhantes às descritas acima com a aplicação tópica de glutamato na CPA, porem, seus experimentos foram realizados com animais acordados eliminando assim qualquer influencia que os anestésicos pudessem causar.
A localização da CPA foi relatada no trabalho de Sun & Panneton em 2002, através de um mapeamento com a utilização de microinjeções de glutamato na superfície ventral bulbar, na qual definiram que a CPA está situada em uma região lateral ao ponto mais caudal do núcleo reticular lateral e ventromedial ao corno dorsal bulbar no nível da ducussação das pirâmides. Estes autores confirmaram a existência das projeções da CPA tanto para o RVLM quanto para a CVLM. Horiuchi & Dampney (2002) propuseram a desinibição indireta dos neurônios simpatoexcitatórios do RVLM pela CPA, de acordo com o seguinte modelo: neurônios inibitórios da CPA fariam conexões com neurônios inibitórios da CVLM e interneuronios inibitórios no proprio RVLM. Desta forma, quando ativada, a CPA atuaria retirando os potenciais inibitórios sobre o RVLM, aumentando a atividade pré-ganglionar simpática (figura 1). Entretanto, ainda faltam informações a respeito de quais as regiões enviam suas eferências para CPA e participam de sua modulação no controle neural da pressão arterial.
Figura 1. RVLM, bulbo rostroventrolateral; CVLM, bulbo caudoventrolateral; CPA, área pressora caudal; IML, coluna intermediolateral; NTS, núcleo do trato solitário; NCR, Núcleos caudais da rafe. Figura modificada de Horiuchi & Dampney (2002).
Silva, 2002 demonstrou que o bloqueio dos receptores aminoácido excitatório feito pelo ácido quinurênico dentro da CPA reduz a pressão arterial e a freqüência cardíaca, além de praticamente abolir a resposta pressora gerada pela estimulação do núcleo da rafe obscuro, demonstrando uma suposta projeção eferente entre um dos importantes núcleos caudais da rafe com a CPA.
1.4 NÚCLEOS DA RAFE:
Além dessas três áreas relevantes no controle cardiovascular, sabe-se que os núcleos da rafe são de extrema importância no controle da PA (Coote, 1990). Este termo “núcleos da rafe” indica grupos de neurônios localizados na região mediossagital do tronco encefálico, que possui um aspecto morfológico de linha ou sutura, e se estendem desde a parte caudal do bulbo até o mesencéfalo, passando pela ponte. Esses grupos de neurônios estão organizados de formas distintas em
Inibitório
Excitatório
dois blocos, o rostral (constituído pelos núcleos linear rostral, linear intermédio, dorsal, mediano e pontino) e o caudal, que se encontram situados na região bulbar (constituído pelos núcleos magno, obscuro e pálido) (Brodal et al., 1960a, b), (fig. 2).
Os núcleos da rafe contêm a maior densidade de neurônios serotonérgicos do sistema nervoso central (Jacobs et al., 2002), fato este que foi inicialmente observado por Dahlstrom e Fuxe em 1964. Foram descritos sete tipos de receptores para serotonina (HT1 - HT7) e seus subtipos HT1A-1F (exceto HT1C) e 5-HT1P, 5-HT2A-2C, 5-HT3A-3E, 5-HT4A-4D, 5-HT5A-5B (Côté et al., 2004), que podem ser encontrados em diversas regiões do sistema nervoso central (Siegel et al., 1999) ou em tecidos periféricos (Futuro-Neto et al., 1993). Apesar de a serotonina ser o principal neurotransmissor, existem outros tipos, tais como, as encefalinas (Bowker et al., 1983; Milhorn et al., 1989), GABA (McCall et al., 1988), catecolaminas, neuropeptídeos e acetilcolina (Bowker et al., 1983; Fort et al. 1989, 1990; Li et al., 1996; Parent, 1996), que podem ser expressos isoladamente ou em associação com a serotonina (Bowker et al., 1983; Kachidian et al., 1991; Stamp e Semba, 1995).
Essa gama de neurotransmissores, adicionada ao fato de que existem vários subtipos de receptores para serotonina, sugere a participação dos núcleos da rafe em diferentes atividades fisiológicas, tais como termorregulação (Arancibia et al., 1996), modulação do sistema digestivo (Ribeiro do Vale, 1997), respiração (Gilbey et al., 1995), regulação cardiovascular (Coote, 1990) e ciclo sono-vigília (Jacobs & Fornal, 1991). Como previamente dito, esses núcleos estão agrupados em dois blocos distintos: o rostral e o caudal. Essa não é simplesmente uma conveniência anatômica, mas uma classificação morfofuncional que deriva de projeções eferentes diferentes (Jacobs et al., 2002).
GRUPO ROSTRAL DOS NÚCLEOS DA RAFE:
O grupo rostral dos núcleos da rafe compreende o núcleo linear rostral, linear intermédio, dorsal, mediano ou central superior e núcleo pontino da rafe (Brodal et al., 1960 a, b). Os neurônios destes núcleos localizam-se principalmente na sua parte central, porém aqueles situados à margem, fundem-se com outros grupamentos nervosos, dificultando, a exata delimitação lateral (Taber et al., 1960).
Esses núcleos do grupo rostral são formados principalmente por neurônios de tamanho médio, fusiformes, com dendritos de orientação dorso-ventral (Zagon, 1993), que se projetam para áreas suprassegmentares (Brodal et al., 1960 a, b). Dentre suas projeções, podemos citar o hipotálamo e o núcleo amigdalóide (Sawchenko et al., 1983), projeções do núcleo pontino para o cerebelo (Taber et al., 1960), para o córtex frontal (Graeff et al., 1996), além de projeções para a substância cinzenta periaquedutal (PAG), hipocampo e gânglios da base (Compan et al. 1996).
Figura 2. Organização anatômica (esquema) dos núcleos da rafe e das projeções serotoninérgicas no cérebro de um rato (vista lateral). O maior número de projeções desses núcleos (em azul) parte: dos núcleos caudais (magno, pálido e obscuro) para a medula espinhal, do núcleo pontino para o cerebelo e dos núcleos rostrais (mediano, paramediano, dorsal e linear) para o prosencéfalo, e há um feixe dorsal específico (em vermelho) que vai dos núcleos mediano e dorsal para o prosencéfalo.
GRUPO CAUDAL DOS NÚCLEOS DA RAFE:
O grupo caudal é constituído pelos núcleos rafe magno (RMg), rafe obscuro (NRO) e rafe pálido (RPa) com disposição rostral, mediana e caudal no bulbo, respectivamente. Os neurônios dos núcleos bulbares da rafe são fusiformes, triangulares, quadripolares e às vezes piriformes, com dendritos uni, bi ou
multipolares, de orientação dorso-ventral (Zagon, 1993). Suas projeções evidenciam uma rede interneural complexa, com ligações tanto para a medula espinhal quanto para centros supramedulares (Jacobs et al., 2002). Brodal et al. (1960 a, b), através de secções obtidas na medula espinhal e tronco cerebral de gato, provocaram degeneração neuronais nos núcleos da rafe. Dähsltrom & Fluxe (1965), combinando a técnica de secção da medula com a de fluorescência em ratos, demonstraram a participação dos núcleos caudais nas eferências noradrenérgicas e serotonérgicas para a medula espinhal, confirmando assim os resultados de Brodal et al. (1960a, b) no gato. Demonstraram ainda que a maioria das eferências dos núcleos caudais é enviada para a medula espinhal, enquanto que os neurônios dos demais núcleos suprasegmentares projetam seus axônios principalmente para as regiões cerebrais superiores.
Outros pesquisadores também identificaram importantes projeções de neurônios serotonérgicos dos núcleos bulbares para o corno dorsal e para a coluna intermédio-lateral da medula espinhal (IML) (Loewy, 1981; Loewy & Mckella, 1981; Bacon et al., 1990; Gilbey et al., 1995), fazendo sinapse, respectivamente, com neurônios da lâmina I, II e V e com grupos de neurônios pré-ganglionares simpáticos (Amendt et al., 1978, 1979; Antal et al., 1996; Li et al., 1996). A conexão dos núcleos bulbares da rafe com grupos de neurônios pré-ganglionares simpáticos da medula espinhal, fornece a base anatômica de sua participação na regulação simpática (Loewy, 1981; Jones, 1996; Helke et al., 1997; Skinner et al., 1997). Por outro lado, a importância de cada um dos núcleos bulbares da rafe no controle e modulações de vários componentes fisiológicos também pode ser sugerida pelas conexões suprassegmentares. Sim & Joseph (1992); Lovick (1993a, b); Hudson & Lumb (1996), Lebars et al. (1980); Schenberg & Lovick (1995) observaram aferências e eferências para áreas da PAG, que possivelmente estariam envolvidas em mecanismos supraespinhais de modulação da nocicepção, analgesia e reação de defesa.
Outros centros cerebrais que também enviam eferências para os núcleos caudais da rafe são os núcleos paraventricular hipotalâmico, o núcleo pré-óptico (Nogueira et al., 1996), a área bulbar rostroventrolateral (Zagon, 1995), o núcleo amigdalóide e o hipotálamo posterior (Hermann et al., 1996). Estas e outras conexões confirmam a implicação dos núcleos da rafe em processos de modulação do sistema digestivo (Curzon, 1990; Krowicki & Hornby, 1996; Ribeiro do Valle,
1997), respiração (Hosogai et al., 1993; Gilbey et al., 1995; Al-Zubaid et al., 1996), termorregulação (Aracibia et al., 1996), regulação cardiovascular (Coote, 1990; Saxena & Villalón, 1990), ciclo sono-vigília (Jouvet, 1967; Dugovic et al., 1989), atividade da musculatura mastigatória (Ribeiro do Valle, 1997) e em ritmos circadianos (Morin et al., 1990).
NÚCLEO RAFE MAGNO (NRg):
Este grupo pode ser considerado como um prolongamento rostral da porção ventral do núcleo rafe obscuro, sua parte rostral estende-se para o nível do pólo rostral da oliva superior e a região ventral faz limite com a margem do corpo trapezóide, enquanto a região dorsal apresenta limitações arbitrárias com as bordas laterais do núcleo pontino da rafe. Em cortes sagitais, observa-se que dorsalmente o núcleo apresenta-se mais afilado em sua trajetória compreendida entre o corpo trapezóide e o teto do quarto ventrículo, o núcleo se torna bem mais desenvolvido a partir da metade ventral desta trajetória. Apesar de apresentar bordas laterais pouco definidas e citoarquitetura semelhante à formação reticular, a individualização do núcleo rafe magno pode ser determinada pela organização de suas células, seus neurônios apresentam-se em vários pontos densamente aglomerados (Taber et al., 1960).
Utilizando a técnica de traçado anterógrado, Bacon et. al. (1990) demonstraram que existe uma conexão monossináptica entre os núcleos magno e pálido da rafe e os neurônios pré-ganglionares simpáticos que irão formar a inervação da adrenal, demonstrando ainda que os neurônios do núcleo da rafe obscuro não se projetam para essa região. As vias serotonérgicas do núcleo rafe magno estão relacionadas com processo de transmissão e modulação dos estímulos nocioceptivos da medula espinhal (LeBars at al., 1980). A estimulação elétrica desta área produz analgesia que é parcialmente revertida por naloxone (Oliveras et al., 1975, 1977) e tal estimulação resulta na inibição de neurônios nocioceptivos no corno dorsal (Beall et al., 1979; Fields et al., 1977; Gerhart et al., 1981; Rivot et al., 1980). Injeção de opióides nesta região também produz antinociocepção que está envolvida com mecanismo serotonérgicos (Dickenson et al., 1979; Liu et al., 1988).
NÚCLEO DA RAFE PÁLIDO (RPa):
Ventralmente ao núcleo da rafe obscuro encontra-se um grupo de células do núcleo rafe pálido. A parte caudal deste núcleo é bem definida e inicia-se na porção mais medial do núcleo rafe obscuro, com um grupo de células entre as margens dorso mediais das pirâmides, que ao nível médio olivar, funde-se com grupos celulares dorsais formando uma massa única que se encaminha para a direção rostral, enquanto que sua porção mais rostral encontra-se pobremente definida (Taber et al. 1960). Segundo Taber (1960), na porção mais rostral, os núcleos reticulares gigantocelulares bulbares aproximam-se da borda dorso laterais do núcleo rafe pálido. Aproximadamente a um terço da porção rostral do núcleo ocorre fusão com o núcleo rafe magno. Em muitos pontos as bordas dos dois núcleos afastam-se, quando então suas células se apresentam densamente agrupadas, o que dá um contraste com as células bastante dispersa do núcleo rafe magno.
Luppi et. al. (1986) utilizando uma técnica onde combinava a imunohistoquímica com a técnica de traçado retrógrado, determinaram que o núcleo rafe pálido recebe aferentes hipotalâmicos que se originam na região peri e paraventricular das áreas hipotalâmicas anterior e posterior. Três grupos de células serotonérgicos da linha mediana do tronco cerebral foram identificados e denominados de B1, B2 e B3, que corresponde aos núcleos rafe pálido, obscuro e magno respectivamente Dahlstrom e Fuxe (1964). A demonstração de que estes núcleos pareciam ser os principais centros que continham neurônios serotonérgicos, levaram as intensas investigações na tentativa de determinar a ação fisiológica desses núcleos.
NÚCLEO DA RAFE OBSCURO (NRO):
A denominação obscuro decorre do fato de que em muitos níveis do núcleo, em especial em sua porção dorsal, apresenta uma densidade celular muito pequena conferindo-lhe um aspecto não muito visível (Taber et al., 1960). Ele ocupa a linha média da rafe bulbar, estendendo do pólo caudal da oliva inferior ao nível do núcleo do nervo hipoglosso até a porção cervical da medula espinhal (Brodal et al., 1960).
Apesar de o NRO fazer algumas projeções para a coluna dorsal da medula espinhal, nas lâminas I, II e V (Dahlstrom e Fuxe, 1964; Basbaum e Fields, 1976; Jacobs et al., 2002), a maioria de suas projeções vão para a coluna intermediolateral (Loewy, 1981; Gilbey et al., 1995) e para o corno ventral da medula (Brodal et al., 1960; Martín-Cora et al., 2000). As eferências para o corno ventral terminam principalmente em motoneurônios somáticos (Brodal et al., 1960; Martín-Cora et al., 2000) e respiratórios (Holtman et al., 1990). Essas projeções podem ser serotonérgicas e não-serotonérgicas (Skagerberg e Bjorklund, 1985; Martin et al., 1990).
Zagon (1995) descreveu importante interconexões entre NRO e o RVLM. Existem também projeções descritas para o núcleo motor dorsal do vago (Maneker et al., 1995; Hornby et al., 1990), para o núcleo do hipoglosso (Manaker et al., 1992), para o núcleo do trigêmio e facial (Fort et al., 1989, 1990) e para o colículo superior (Parent, 1996).
Outras áreas sensoriais do tronco cerebral, como o núcleo do trato solitário (Palkovits et al., 1986) e núcleo do trigêmio (Li et al., 1996) também recebem projeções do NRO.
Foi muito explorada a participação desse núcleo nas funções autonômicas, com especial interesse a modulação simpática, devido a extensas projeções para a coluna intermediolateral (Loewy, 1981; Coote et. al., 1985).
A atividade simpática pode ser distribuída de forma diferente para cada regiões especifica do corpo como foi demonstrado durante o período do sono desincronizado (Futuro-Neto e Coote, 1982 a, b). Neste trabalho pode-se observar que, durante este período a atividade simpática vasocostritora para o músculo esquelético estava aumentada, enquanto que, em outros leitos do sistema vascular estavam inibidas.
Além da possibilidade do NRO participar nas respostas autonômicas através de projeções espinhais, existem ainda importantes conexões em diversos centros do tronco cerebral que impedem uma análise simplória do envolvimento deste núcleo no controle de muitas funções. Existem evidências de que o NRO está envolvido na modulação central da analgesia, nocicepção e reação de defesa (Schenberg & Lovick, 1995; Lovick, 1996). Isso explicaria a importância das projeções para o corno dorsal (Basbaum et al., 1976) e as interconexões entre a substância cinzenta periaquedutal (Lovick, 1993a).
A grande maioria dos estudos de mapeamento dos núcleos da rafe, e sua participação na regulação cardiovascular foram realizados com a utilização de técnicas de estimulação elétrica. No gato, a estimulação elétrica promoveu principalmente respostas depressoras (Adair et al., 1977; Yen et al., 1983). No rato (Smits et al., 1978; Kuhn et al., 1980; Futuro Neto et al., 1990; Silva et al., 2002), no cobaio (Almada, 1995; Futuro-Neto et al., 1997) e no hamster (Faria, 1992; Faria et al., 1996) as respostas foram predominantemente pressoras, enquanto que no coelho ocorreu quase que um equilíbrio entre respostas pressoras e hipotensoras, com pequena predominância da primeira (Futuro Neto et al., 1990). Com a utilização de microinjeções de L-glutamato nos mesmos sítios do NRO, foram observadas respostas pressoras semelhantes, o que evidencia a ativação de corpos celulares no núcleo estudado (Dreteler et al., 1991; Faria et al., 1996). Damico et al. (1996) também observaram que a microinjeção de L-glutamato e agonistas de receptores glutamatérgicos ionotrópicos no NRO causava elevação da pressão arterial.
A intensa rede interneuronal do NRO para os demais núcleos bulbares poderia ser a justificativa dos resultados de trabalhos que demonstram o envolvimento deste núcleo na modulação tônica da atividade simpática (Adair et al., 1977; Có et al., 1990), na regulação central da respiração (Hotmam et al., 1990; Lalley et al., 1997) e cardiovascular (Futuro Neto et al., 1990; 1996; Dreteler et al., 1991, Campos Jr. et al., 1993, Silva et al., 2002). Outros autores partilham desta idéia onde a regulação cardiovascular e respiratória pode ser sugerida pelas projeções NRO para a superfície ventral bulbar (Chan et al., 1986; Van Bockstaele et al., 1989; Nicolas & Hancock, 1990; Zagon, 1993, 1995), onde existem importantes “centros” integradores das respostas cardiovasculares e respiratórias.
A participação funcional da porção rostral da superfície ventrolateral bulbar na modulação das respostas pressoras evocadas pela estimulação no NRO foi demonstrada por Campos Jr. et al. (1993). Estes autores observaram que tanto a lesão eletrolítica quanto a aplicação tópica de glicina na RVLM, causava o bloqueio das respostas pressoras obtidas pela estimulação elétrica no NRO, concluindo que a integridade da RVLM era essencial para a manutenção daquelas respostas pressoras. Futuro Neto et al. (1996), obtiveram resultados semelhantes com a microinjeção de glicina na RVLM, mas não conseguiram bloquear as respostas cardiovasculares e simpáticas com a aplicação de antagonistas serotonérgicos, sugerindo que os receptores 5-HT1 (com seus subtipos), 5-HT2 e 5-HT3 da RVLM
não estariam envolvidos nestas respostas. Alguns estudos sugerem que a CPA pode estar envolvida no controle das respostas à estimulação elétrica no núcleo rafe obscuro, podendo-se, a partir daí, supor que a CPA poderia estar relacionada aos núcleos caudais da rafe no controle de diferentes respostas, comportamentais ou autonômicas. (Silva et al., 2002).
Os achados existentes até o momento colocam os núcleos caudais da rafe como importantes participantes dos processos centrais no controle das atividades autonômicas e somáticas. O esclarecimento sobre suas projeções eferentes, sendo ou não enviadas para a CPA, assume fundamental importância para o entendimento deste nível de modulação neural da pressão arterial. Ainda faltam informações a respeito da função da CPA, e o controle aferente exercido sobre ela por outras áreas envolvidas na regulação neural da PA como, por exemplo, os núcleos caudais da rafe. Esta hipótese complementaria as conexões das regiões bulbares sugerida por Horiuchi & Dampney (2002), nas quais as projeções aferentes para a CPA não foram demonstradas. Portanto, o mapeamento dos núcleos caudais da rafe no rato vem adicionar dados que poderão ser comparados aos já existentes e ajudar a compreender melhor suas participação na manutenção da pressão arterial.
1.5 DESCRIÇAO DA TÉCNICA DE MARCAÇÃO HISTOQUIMICA COM A UTILIZAÇÃO DO HORSERADISH PEROXIDASE (HRP):
A técnica Histoquímica com a utilização do Horseradish Peroxidase (HRP) foi introduzida por Straus, 1957 (apud Mesulan, 1978) e aplicada para o sistema nervoso periférico por Kristensson e Olsson, 1971 (apud Mesulan, 1978) e posteriormente para o sistema nervoso central por LaVail e LaVail, 1972. Desde então, a técnica neurohistoquimica tornou-se um dos mais frequentes métodos para tracejamento neuronal conectivo dentro do SNC.
Os estágios sucessivos da técnica neurohistoquimica consistem de: injeção intracerebral do HRP, endocitose neuronal (uptake neuronal), transporte axoplasmatico e visualização histoquímica da enzima. O Processo de visualização histoquímico é alcançado através da incubação e fixação do tecido em um meio contendo H2O2 e um cromogem amina aromática (percussor de um pigmento). Esse
cromogem polimeriza e assume uma coloração intensa quando oxidado. Portanto, no local do HRP ativado, ou seja, o complexo [HRP. H2O2], oxida o cromogem e
resulta na precipitação do produto dessa reação que, atua como um marcador, pela ativação da enzima HRP como demonstrada na fotomicrografia da figura 3 (mesulam, 1978; Mesulam, 1976).
O sucesso de um experimento histoquímico com HRP depende de um grande numero de variáveis. Essas podem ser classificadas em dois grandes grupos: Variáveis Dinâmicas e Variáveis histoquímicas. As dinâmicas incluem a endocitose e o transporte do HRP e a histoquímicas incluem parâmetros como o tipo de fixação, a escolha do cromogem e a composição do meio de incubação. Além disso, ao contrario da maioria das variáveis dinâmicas, que usualmente independem da manipulação, quase todos os parâmetros histoquímicos podem facilmente ser regulados pelo experimentador. Na verdade, este segundo grupo de variáveis determina não apenas a visibilidade do produto da reação, mas também, a sensibilidade que o transportador (HRP) pode ser detectado. Em outras palavras, uma conexão neural que é prontamente visualizada quando ótimos parâmetros histoquímicos estão envolvidos, pode ser perdida em experimentos que utilizam excessiva fixação, cromogem de inferior visibilidade (Mesulam & Rosene, 1977) ou parâmetros de incubação inapropriados (Mesulam, 1976).
A utilização do HRP no presente trabalho nos permite buscar uma conexão direta, para tentarmos esclarecer a existência ou não de projeções eferentes enviadas pelos núcleos caudais da rafe para a área pressora caudal.
Figura 3. As setas indicam as células marcadas. A) Três células marcadas na substância inonimata com o produto da reação do HRP, visível com uma objetiva 20x, após aplicação de HRP no córtex motor. B) Duas células marcadas com HRP no núcleo dorsolateral talâmico de macaco, seguido à aplicação prévia de HRP no hipocampo. Duas células não marcadas também são vistas no quanto superior direito da imagem, Objetiva 40x. C) uma célula marcada no lobo parietal inferior após uma injeção de HRP no lobo parietal inferior contralateral, objetiva 100x. D) Duas células marcadas na substância inonimada de um macaco após a injeção de HRP no córtex premotor. (Mesulam, 1976).
2. OBJETIVOS:
2.1. OBJETIVO GERAL
:
•
Investigar através da técnica histoquímica de transporte axonal retrogrado (horseradish peroxidase, HRP), a existência de projeções neuronais eferentes, formando uma via direta, entre os núcleos caudais da rafe e a área pressora caudal.2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
:
•
Além da existência destas vias dos núcleos caudais da rafe para a CPA, identificar a exata localização rostro-caudal dos neurônios marcados com HRP dentro dos núcleos caudais da rafe que estão se projetando para a CPA.• Avaliar em que profundidades da superfície do crânio encontram-se os neurônios dos núcleos caudais da rafe que se projetam para a CPA.
3. MATERIAIS E MÉTODOS:
ANIMAIS
No experimento foram utilizados ratos Wistar machos adultos (270 – 300 gramas), fornecidos pelo biotério do Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal do Espírito Santo os quais eram mantidos em gaiolas de polietileno e alimentados com ração comercial e água ad libitum. O controle de luminosidade era próximo às condições naturais, com ciclo de 12 horas.
ANESTESIA E PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS INICIAIS
Para a realização dos procedimentos cirúrgicos, os animais eram anestesiados com hidrato de cloral (0,4g/kg i.p.). A temperatura retal foi mantida a 37C utilizando para tanto uma manta aquecida. Foi necessário encontrar um ato cirúrgico adequado e pouco traumático que nos apresentasse um bom prognostico pós-operatório, permitindo assim a sobrevivência dos animais por dois a três dias após os procedimentos. Além do ato cirúrgico, as coordenadas para atingir precisamente a CPA também tiveram que ser adequadas. Após a anestesia os animais foram posicionados em decúbito ventral em um aparelho estereotáxico para pequenos animais (Stoelting), com a barra incisiva 11 mm abaixo da linha interaural.
O Óbex foi utilizado como ponto de referência para as coordenadas estereotáxicas, sua exposição foi realizada através de procedimento cirúrgico onde se fazia uma incisão na região posterior da cabeça do animal promovendo a visualização e o afastamento da musculatura que se sobrepunha a está região, permitindo assim uma visualização completa do óbex e acesso à CPA. Foram utilizados treze animais até que o melhor procedimento fosse encontrado.
As coordenadas foram confirmadas através de registros hemodinâmicos após a aplicação do aminoácido excitatório (Glutamato, 20nmol/50 nl), através de uma cânula de metal (agulha gengival tamanho 30G curta) conectada via cânula de polietileno PE-10 a uma microseringa Hamilton introduzida unilateral no bulbo.
Associado ao Glutamato foi utilizado um marcador (Pontamine Sky Blue, 2%) que permitiu uma visualização macro e microscópica da região aplicada.
REGISTROS HEMODINÂMICOS:
A pressão arterial foi registrada apenas com o objetivo de auxiliar na confirmação da localização exata da APC. Através de uma pequena incisão na região femoral ventral, dissecava-se a artéria femoral esquerda para inserção de cateteres de polietileno PE-50, preenchidos com solução salina-heparina (0,09%, 100:1UI, respectivamente) e tendo uma de suas extremidades obstruída com um pino de metal. A pressão arterial era monitorada pelo cateter, conectado a um transdutor de pressão (Statham-Spectramed, P23XL) e a um amplificador (Pressure Processor, Gould 20-4615), sendo registrada em um polígrafo (Gould RS3400), previamente calibrado. A freqüência cardíaca medida com um frequencímetro (Biotach, Gould 13-64615) a partir da onda de pulso da pressão arterial. Os registros da pressão arterial pulsátil, pressão arterial média e frequência cardíaca eram digitalizados (Biopac MP100) e armazenados no disco rígido de um computador PC (Digital). A aplicação da droga (Glutamato) nas coordenadas adequadas permitia visualizar uma resposta pressora no momento de sua aplicação. Estas respostas associadas à análise histológica nos permitiram confirmar a exata localização da APC, que se assemelham às existentes na literatura científica e escolher o melhor sitio para a aplicação do HRP.
As coordenadas testadas variaram de 0,5 a 1,5 mm caudal ao Óbex e de 1,5 a 2,0 mm lateral à linha média, com uma profundidade de 2,0 mm da superfície dorsal do tronco cerebral do animal, sendo do escolhido como sitio de aplicação do HRP, aquele que demonstrou uma melhor resposta pressora (1,0 mm caudal ao Óbex e 1,7 mm lateral à linha média) como observado na figura 4.
Figura 4. Representação esquemática indicando o local da microinjeção do HRP dentro da CPA. O circulo em vermelho representado pela letra F representa o ponto de injeção do HRP, com 1,0 mm caudal ao Óbex, 1,7 mm lateral a linha medial e 2,0 mm da superfície dorsal do tronco cerebral do rato. Figura modificada de Sun W. and Panneton W. M.
MICROINJEÇÃO DO HORSERADISH PEROXIDASE (HRP):
Uma vez definido o melhor procedimento cirúrgico e as coordenadas adequadas para atingir a CPA o experimento com a utilização do HRP foi iniciado. Para a utilização do HRP como marcador neuronal retrogrado, desde sua aplicação até o ponto de ser revelado, corado e analisado no microscópio, nos levou a tentar adequar esta técnica aos materiais já existentes e utilizados rotineiramente em nosso laboratório, até chegar-mos à sua adequada utilização. Diferentes formas de perfusões, concentrações variadas de HRP, tentativa de utilização do formaldeido para fixação do tecido (freqüentemente utilizado em nosso laboratório), ou seja, vários experimentos tiveram que ser realizados com o objetivo de adequar a técnica de revelação do HRP com as drogas e os equipamentos já utilizados em nosso laboratório. Para estes experimentos foram necessários à utilização de onze animais até que a revelação do tecido com HRP pudesse ser realizada com sucesso, e consequentemente, boa visualização dos grânulos de HRP no pericário do neurônio pudesse ser observada como será descrito no decorrer do texto.
Com o mesmo procedimento utilizado na aplicação do glutamato e o marcador para confirmar as coordenadas estereotáxicas adequadas, era aplicado na CPA unilateral, um volume de 50nl de solução contendo o traçador horseradish peroxidase a 20% (SIGMA-ALDRICH, Switzerland), diluído em água destilada (Mesulam, 1978). Após a injeção do HRP a cânula permanecia no local alvo por 20 min para evitar perda do traçador no trajeto da cânula durante a retirada.
Realizado este procedimento a incisão cirúrgica era suturada e o animal mantido vivo durante dois a três dias no biotério da instituição, tempo necessários para permitir o deslocamento retrogrado intraneuronal do traçador. Após este período, o animal era profundamente anestesiado com cloral hidratado (0,4g/kg, i.p.), seguindo-se a uma abertura da região torácica para exposição do coração e perfusão via artéria aorta com 500ml de solução salina, seguida por 500ml de paraformaldeido a 1% e 1,25% de glutaraldeido em tampão fosfato 0,1M. O tronco cerebral era removido, fixado por 24h à 4oC em uma solução de sacarose a 10% e então seccionado coronalmente com espessura de 40 micrometros utilizando um micrótomo de congelamento.
As secções foram colocadas em uma solução com 250ml de tampão fosfato (pH 7,6) e tratadas com Diaminobenzidina a 0,05%. As secções permaneciam nesta solução sendo agitados por dez minutos, após este tempo, era adicionado à solução H2O2
numa concentração de 0,01% e agitado por mais dez minutos. O produto desta reação promove uma coloração escura no ponto de injeção da droga e no interior do corpo celular dos neurônios marcados retrogradamente. O local da microinjeção do HRP foi examinado microscopicamente para verificar a localização exata dentro da CPA. Em seguida as secções foram organizadas em lâminas histológicas e coradas com o corante vermelho neutro, permitindo assim uma melhor visualização do corpo celular dos neurônios marcados com o HRP dentro dos núcleos caudais da rafe. Estes neurônios foram visualizados com o auxílio do microscópio óptico, sendo suas coordenadas analisadas de acordo com o atlas estereotáxico (Paxinos e Watson, Acadamic Press, 1986).
Um total de seis ratos com marcações positivas de HRP dentro da CPA foram utilizados para determinar os objetivos deste trabalho.
As imagens dos neurônios marcados foram capturadas através de uma câmera de vídeo acoplada ao microscópio, digitalizadas e armazenadas no computador. Os dados dos animais em que não foi possível a visualização histológica positiva para a CPA foram desconsiderados e descartados.
4. RESULTADOS:
Dois a três dias após a microinjeção de HRP na CPA, foram observados neurônios marcados em todos os três núcleos caudais da rafe, estando distribuídos de forma dispersa em cada um deles. Ao ser aplicada, a solução contendo o HRP se espalha pelo tecido do sistema nervoso e, após ser revelado, produz uma coloração marrom por toda extensão em que se difundiu. O pequeno volume da solução de HRP aplicado (50nl) permitiu que apenas o núcleo estudado (CPA) fosse circundado com a droga, como demonstrado na fotomicrografia abaixo (figura 5). Com isto evitando encontrar corpos neuronais marcados retrogradamente cuja seus botões terminais não estejam presentes nesta região.
De uma maneira geral, os neurônios marcados com HRP nos núcleos caudais da rafe, nos seis ratos estudados, estavam distribuídos da seguinte maneira: Foram encontradas marcações com HRP dentro do núcleo RMg nos ratos 1, 2 e 3, somando um total dez neurônios marcados nestes animais. Para o núcleo RPa, foram vistas marcações nos ratos 1, 3, 4, e 5, totalizando quatorze neurônios marcados. E por ultimo, neurônios com HRP no núcleo NRO estavam presente nos ratos 2, 3, 4, 5 e 6, representando um somatório de onze neurônios marcados nestes animais.
Figura 5. A) fotomicrografia demonstra o local de aplicação do HRP dentro da CPA do rato, secção de 40 µm; objetiva 10x.
A
As coordenadas de acesso a CPA utilizadas para aplicação do HRP, demonstraram um aumento da pressão arterial e freqüência cardíaca quando estimuladas pela aplicação do glutamato. A figua seis representa os registros hemodinâmicos antes e após a microinjeção do L-glu.
Figura 6. Respostas cardiovasculares da microinjeção unilateral de L-glutamato (L-glu; 20 nmol/50nL) na área pressora caudal (CPA), (A) Registros de pressão arterial (PA), pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC); (B) cortes coronal e sagital representativos do sítio de microinjeção. O triângulo representa a microinjeção.
L-glu
A
900 950 1000 1050 1100 seconds 0 50 100 150 200 m m H g P A 0 50 100 150 200 m m H g P A M 0 100 200 300 400 b p m F CNa análise estatística dos registros de cinco animais, observou-se um aumento na PAM após a microinjeção de L-glu (102 ± 2,3 mmHg), significativamente maior que os registros controle (80 ± 3 mmHg; p< 0,01), como demonstrado na figura 7, nas coordenadas 1,0 mm caudal ao Óbex e 1,7 mm lateral à linha média, com uma profundidade de 2,0 mm da superfície dorsal do tronco cerebral do animal. Sendo este o sítio escolhido para a aplicação do HRP.
Variação da p ressão arterial m éd ia ap ó s a m icro injeção d e L -g lu na AP C Cont L-glu 0 25 50 75 100 125 C ont L-glu
**
P A M m m H gFigura 7. Efeitos da microinjeção unilateral de L-glutamato (L-glu; 20 nmol/50nL) na CPA, sobre as respostas de pressão arterial média (PAM) em ratos. Cont, controle antes da microinjeção do L-glu nos ratos *P<0,01 (teste t de Student; n = 5).
Neurônios marcados retrogradamente no RMg após microinjeção de HRP na CPA:
Neste núcleo observou-se a menor dispersão celular no sentido rostro-caudal dos neurônios marcados com HRP, estas células estavam situadas entre -11,30 mm e -11,60 mm caudais ao Bregma (fig. 8).
Figura 8. A) Fotomicrografia mostrando dois neurônios densamente marcados com HRP dentro do RMg a -11,30 mm do Bregma, com profundidade de 10,60 mm da superfície do crânio, objetiva 4x. B) Maior aumento da foto A mostrando os grânulos de HRP no neurônio, objetiva 10x.
Dos dez neurônios encontrados marcados no núcleo RMg, três estavam a exatamente -11,30 mm, e os outros sete neurônios a -11,60 mm caudais ao Bregma. Estes últimos neurônios estavam situados com profundidade variando apenas entre 10,4 mm a 10,7 mm em relação à superfície dorsal do crânio (fig. 9).
Figura 9. Rato 1, dois neurônios marcados com HRP dentro do núcleo RMg a -11,60 mm do Bregma, com 10,60 mm e 10,70 mm de profundidade; canto superior esquerdo (seta). A) Demonstra os dois neurônios com um aumento numa objetiva 4x. B) Maior aumento de A, objetiva 10x. Pode ser observado também um neurônio marcado no RPa, canto inferior direito.
A
RMg
B
RMg
A
RMgB
RMgA quantidade total de neurônios encontrados marcados com grânulos de HRP dentro do RMg e seus respectivos posicionamentos tanto rostro-caudais quanto a profundidade da superfície do crânio são demonstrados na tabela abaixo (tab. 1).
Tabela 1. Total de neurônios marcadas com HRP no RMg e suas respectivas localizações rostro-caudais e profundidades da superfície do crânio.
10,40 – 10,70 -11,30 / -11,60 10 Geral 10,40 – 10,70 -11,60 7 Marcações 10,60 -11,30 3 Marcações
Profundidade do
crânio (mm)
Rostro-caudal ao
Bregma (mm)
Número de
Neurônios
RMg
Neurônios marcados retrogradamente no RPa após microinjeção de HRP na CPA:
Os quatorze neurônios marcados dentro do núcleo RPa nos animais estudados estavam distribuídos rostro-caudalmente entre -11,30 mm a -12,80 mm caudais ao Bregma, com uma profundidade variando entre 10,80 mm a 11,10 mm em relação à superfície dorsal do crânio. No rato 1 foram encontrados três neurônios marcados a aproximadamente -11,30 mm do Bregma, dois deles com profundidades de 10,80 mm e um a 10,90 mm da superfície craniana (figura 10).
Figura 10: Rato1, neurônios marcados a aproximadamente -11,30 mm caudais ao Bregma. A) apresenta um neurônio marcado dentro do RPa com uma profundidade de 10,80 mm da superfície do crânio, objetiva 10x. B) outro neurônio marcado no RPa com 10,80 mm de profundidade (seta), além de outros dois no núcleo RMg, objetiva 10x. C) um único neurônio a 10,90 mm de profundidade no RPa, objetiva 10x.
A aproximadamente -11,60 mm do Bregma, mais cinco neurônios foram marcados com HRP no núcleo da RPa, dois deles são demonstrado na figura abaixo com profundidade de 10,80 mm e 11,00 mm da superfície dorsal. Puderam ser observados também na parte superior esquerda da figura, neurônios marcados no núcleo RMg (figura 11). Dos outros três neurônios encontrados no Núcleo RPa,
Núcleo RPa
A
RPaB
RPaC
RPaporém não visualizados aqui, dois estavam com profundidade igual a 11,00 mm e um com 10,90 mm da superfície dorsal.
Figura 11. Rato 1; Neurônio marcado com HRP no núcleo RPa a -11,60 mm do Bregma, objetiva 10x. A) A seta indica uma célula marcada com profundidade de 10,80 mm dorso-ventral no RPa. Duas células marcadas podem ser observadas no canto superior esquerdo, núcleo RMg. B) Um neurônio marcado a 11,00 mm de profundidade no núcleo RPa, a -11,60 mm do Bregma.
Quatro neurônios marcados com HRP foram encontrados a -11,80 mm do Bregma, com profundidade variando entre 10,80 mm e 11,00 mm dorso-ventral. O nível mais caudal do núcleo RPa onde foi encontrado neurônio marcado foi a -12,80 mm caudal ao Bregma, nesta região foram encontrados apenas dois neurônios marcados com HRP, estando estas células localizadas a 10,80 mm da superfície dorsal do crânio (figura 12).
Figura 12. Rato 5; A) neurônio marcado com HRP no núcleo RPa, a -12,80 mm do Bregma com 10,80 mm de profundidade da superfície craniana, objetiva 4x. B) Outro neurônio com HRP no núcleo RPa, a -12,80 mm do Bregma e 10,80 mm de profundidade, objetiva 10x.
B
RPaA
RPaB
RPaA
RPaO total de neurônios encontrados com grânulos de HRP dentro do RPa e seus respectivos posicionamentos, tanto rostro-caudais quanto a profundidade da superfície do crânio, são demonstrados na tabela abaixo (tab. 2).
Tabela 2. Total de neurônios marcadas com HRP no RPa e suas respectivas localizações rostro-caudais e profundidades da superfície do crânio.
10,80 a 11,10 -11,30 a -12,80 14 Geral 10,80 -12,80 2 Marcações 10,80 - 10,90 -11,80 4 Marcações 10,80 - 11,00 -11,60 5 Marcações 10,80 - 10,90 -11,30 3 Marcações
Profundidade do
crânio (mm)
Rostro-caudal
ao Bregma(mm)
Número de
neurônios
RPa
Neurônios marcados retrogradamente no NRO após microinjeção de HRP na CPA:
Quatro dos onze neurônios contendo grânulos de HRP encontrados nos NRO nos animais estudados, estavam a uma distancia de -11,60 mm do Bregma (figura 13) e outros quatro a -11,80 mm do Bregma, com a profundidade destes oito neurônios em relação à superfície do crânio variando apenas entre 10,00 mm a 10,60 mm. Apenas um único neurônio foi encontrado com distancia dorso-caudal do Bregma de -11,96 mm. Porém, sua profundidade foi a maior encontrada de todos os neurônios marcados com HRP dentro do NRO, sendo ela de 10,80 mm da superfície craniana.
D
Figura 13. Fotomicrografias demonstram a presença de neurônios marcados com HRP dentro do NRO à -11,60 mm do Bregma. A) Dois neurônios marcados situados a -11,60 mm caudais ao Bregma no rato 2, com 10,00 mm e 10,10 mm da superfície do crânio; objetiva 4x. B) Maior aumento da foto A mostrando os grânulos de HRP dentro do neurônio; objetiva 10x. C) Marcação com HRP em dois neurônios no NRO a -11,60 mm do Bregma com profundidade de 10,10 mm e 10,20 mm do crânio; objetiva 4x. D) Maior aumento de C mostrando densos grânulos de HRP no interior dos neurônios; objetiva de 10x.
Nesta mesma região, ou seja, a -11,96 mm caudal ao Bregma, pode-se observar a presença de dois outros neurônios marcados dentro do núcleo reticular
D
NROA
NROB
NROC
NROgigantocelular ventral (GiV), com profundidade semelhante à do neurônio encontrado no NRO (figura 14), ambos com 10,80 mm da superfície craniana.
Figura 14. A) Neurônio impregnado com grânulos de HRP no NRO a -11,96 mm do Bregma com 10,80 mm de profundidade dois dias após ser injetado na CPA, (seta preta). Alem do neurônio marcado no NRO podem-se observar outros dois neurônios (seta azul) sitiados no GiV a 10,70 mm de profundidade, com presença do marcador HRP; objetiva 4x. B) Maior aumento do neurônio no NRO da foto A; objetiva 10x.
B
NRO
A
NRO
A região mais caudal do NRO que pôde ser observado a presença de neurônios marcados após a aplicação do HRP na área pressora caudal foi a -12,72 mm do Bregma, neste nível foi encontrado um neurônio marcado no rato 3 e um neurônio marcado no rato 5 com profundidades de 10,40 mm e 10,50 mm respectivamente da superfície do crânio (figura 15).
Figura 15. A) Neurônio marcado no NRO a -12,72 mm do Bregma e 10,40 mm de profundidade; objetiva 4x. B) Fotomicrografia de um neurônio marcado com HRP dentro do NRO a -12,75 mm do Bregma com 10,50 mm de profundidade, objetiva 4x.
A
NRO
