ANIMAIS
No experimento foram utilizados ratos Wistar machos adultos (270 – 300 gramas), fornecidos pelo biotério do Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal do Espírito Santo os quais eram mantidos em gaiolas de polietileno e alimentados com ração comercial e água ad libitum. O controle de luminosidade era próximo às condições naturais, com ciclo de 12 horas.
ANESTESIA E PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS INICIAIS
Para a realização dos procedimentos cirúrgicos, os animais eram anestesiados com hidrato de cloral (0,4g/kg i.p.). A temperatura retal foi mantida a 37C utilizando para tanto uma manta aquecida. Foi necessário encontrar um ato cirúrgico adequado e pouco traumático que nos apresentasse um bom prognostico pós-operatório, permitindo assim a sobrevivência dos animais por dois a três dias após os procedimentos. Além do ato cirúrgico, as coordenadas para atingir precisamente a CPA também tiveram que ser adequadas. Após a anestesia os animais foram posicionados em decúbito ventral em um aparelho estereotáxico para pequenos animais (Stoelting), com a barra incisiva 11 mm abaixo da linha interaural.
O Óbex foi utilizado como ponto de referência para as coordenadas estereotáxicas, sua exposição foi realizada através de procedimento cirúrgico onde se fazia uma incisão na região posterior da cabeça do animal promovendo a visualização e o afastamento da musculatura que se sobrepunha a está região, permitindo assim uma visualização completa do óbex e acesso à CPA. Foram utilizados treze animais até que o melhor procedimento fosse encontrado.
As coordenadas foram confirmadas através de registros hemodinâmicos após a aplicação do aminoácido excitatório (Glutamato, 20nmol/50 nl), através de uma cânula de metal (agulha gengival tamanho 30G curta) conectada via cânula de polietileno PE-10 a uma microseringa Hamilton introduzida unilateral no bulbo.
Associado ao Glutamato foi utilizado um marcador (Pontamine Sky Blue, 2%) que permitiu uma visualização macro e microscópica da região aplicada.
REGISTROS HEMODINÂMICOS:
A pressão arterial foi registrada apenas com o objetivo de auxiliar na confirmação da localização exata da APC. Através de uma pequena incisão na região femoral ventral, dissecava-se a artéria femoral esquerda para inserção de cateteres de polietileno PE-50, preenchidos com solução salina-heparina (0,09%, 100:1UI, respectivamente) e tendo uma de suas extremidades obstruída com um pino de metal. A pressão arterial era monitorada pelo cateter, conectado a um transdutor de pressão (Statham-Spectramed, P23XL) e a um amplificador (Pressure Processor, Gould 20-4615), sendo registrada em um polígrafo (Gould RS3400), previamente calibrado. A freqüência cardíaca medida com um frequencímetro (Biotach, Gould 13- 64615) a partir da onda de pulso da pressão arterial. Os registros da pressão arterial pulsátil, pressão arterial média e frequência cardíaca eram digitalizados (Biopac MP100) e armazenados no disco rígido de um computador PC (Digital). A aplicação da droga (Glutamato) nas coordenadas adequadas permitia visualizar uma resposta pressora no momento de sua aplicação. Estas respostas associadas à análise histológica nos permitiram confirmar a exata localização da APC, que se assemelham às existentes na literatura científica e escolher o melhor sitio para a aplicação do HRP.
As coordenadas testadas variaram de 0,5 a 1,5 mm caudal ao Óbex e de 1,5 a 2,0 mm lateral à linha média, com uma profundidade de 2,0 mm da superfície dorsal do tronco cerebral do animal, sendo do escolhido como sitio de aplicação do HRP, aquele que demonstrou uma melhor resposta pressora (1,0 mm caudal ao Óbex e 1,7 mm lateral à linha média) como observado na figura 4.
Figura 4. Representação esquemática indicando o local da microinjeção do HRP dentro da CPA. O circulo em vermelho representado pela letra F representa o ponto de injeção do HRP, com 1,0 mm caudal ao Óbex, 1,7 mm lateral a linha medial e 2,0 mm da superfície dorsal do tronco cerebral do rato. Figura modificada de Sun W. and Panneton W. M.
MICROINJEÇÃO DO HORSERADISH PEROXIDASE (HRP):
Uma vez definido o melhor procedimento cirúrgico e as coordenadas adequadas para atingir a CPA o experimento com a utilização do HRP foi iniciado. Para a utilização do HRP como marcador neuronal retrogrado, desde sua aplicação até o ponto de ser revelado, corado e analisado no microscópio, nos levou a tentar adequar esta técnica aos materiais já existentes e utilizados rotineiramente em nosso laboratório, até chegar-mos à sua adequada utilização. Diferentes formas de perfusões, concentrações variadas de HRP, tentativa de utilização do formaldeido para fixação do tecido (freqüentemente utilizado em nosso laboratório), ou seja, vários experimentos tiveram que ser realizados com o objetivo de adequar a técnica de revelação do HRP com as drogas e os equipamentos já utilizados em nosso laboratório. Para estes experimentos foram necessários à utilização de onze animais até que a revelação do tecido com HRP pudesse ser realizada com sucesso, e consequentemente, boa visualização dos grânulos de HRP no pericário do neurônio pudesse ser observada como será descrito no decorrer do texto.
Com o mesmo procedimento utilizado na aplicação do glutamato e o marcador para confirmar as coordenadas estereotáxicas adequadas, era aplicado na CPA unilateral, um volume de 50nl de solução contendo o traçador horseradish peroxidase a 20% (SIGMA-ALDRICH, Switzerland), diluído em água destilada (Mesulam, 1978). Após a injeção do HRP a cânula permanecia no local alvo por 20 min para evitar perda do traçador no trajeto da cânula durante a retirada.
Realizado este procedimento a incisão cirúrgica era suturada e o animal mantido vivo durante dois a três dias no biotério da instituição, tempo necessários para permitir o deslocamento retrogrado intraneuronal do traçador. Após este período, o animal era profundamente anestesiado com cloral hidratado (0,4g/kg, i.p.), seguindo-se a uma abertura da região torácica para exposição do coração e perfusão via artéria aorta com 500ml de solução salina, seguida por 500ml de paraformaldeido a 1% e 1,25% de glutaraldeido em tampão fosfato 0,1M. O tronco cerebral era removido, fixado por 24h à 4oC em uma solução de sacarose a 10% e então seccionado coronalmente com espessura de 40 micrometros utilizando um micrótomo de congelamento.
As secções foram colocadas em uma solução com 250ml de tampão fosfato (pH 7,6) e tratadas com Diaminobenzidina a 0,05%. As secções permaneciam nesta solução sendo agitados por dez minutos, após este tempo, era adicionado à solução H2O2
numa concentração de 0,01% e agitado por mais dez minutos. O produto desta reação promove uma coloração escura no ponto de injeção da droga e no interior do corpo celular dos neurônios marcados retrogradamente. O local da microinjeção do HRP foi examinado microscopicamente para verificar a localização exata dentro da CPA. Em seguida as secções foram organizadas em lâminas histológicas e coradas com o corante vermelho neutro, permitindo assim uma melhor visualização do corpo celular dos neurônios marcados com o HRP dentro dos núcleos caudais da rafe. Estes neurônios foram visualizados com o auxílio do microscópio óptico, sendo suas coordenadas analisadas de acordo com o atlas estereotáxico (Paxinos e Watson, Acadamic Press, 1986).
Um total de seis ratos com marcações positivas de HRP dentro da CPA foram utilizados para determinar os objetivos deste trabalho.
As imagens dos neurônios marcados foram capturadas através de uma câmera de vídeo acoplada ao microscópio, digitalizadas e armazenadas no computador. Os dados dos animais em que não foi possível a visualização histológica positiva para a CPA foram desconsiderados e descartados.
4. RESULTADOS:
Dois a três dias após a microinjeção de HRP na CPA, foram observados neurônios marcados em todos os três núcleos caudais da rafe, estando distribuídos de forma dispersa em cada um deles. Ao ser aplicada, a solução contendo o HRP se espalha pelo tecido do sistema nervoso e, após ser revelado, produz uma coloração marrom por toda extensão em que se difundiu. O pequeno volume da solução de HRP aplicado (50nl) permitiu que apenas o núcleo estudado (CPA) fosse circundado com a droga, como demonstrado na fotomicrografia abaixo (figura 5). Com isto evitando encontrar corpos neuronais marcados retrogradamente cuja seus botões terminais não estejam presentes nesta região.
De uma maneira geral, os neurônios marcados com HRP nos núcleos caudais da rafe, nos seis ratos estudados, estavam distribuídos da seguinte maneira: Foram encontradas marcações com HRP dentro do núcleo RMg nos ratos 1, 2 e 3, somando um total dez neurônios marcados nestes animais. Para o núcleo RPa, foram vistas marcações nos ratos 1, 3, 4, e 5, totalizando quatorze neurônios marcados. E por ultimo, neurônios com HRP no núcleo NRO estavam presente nos ratos 2, 3, 4, 5 e 6, representando um somatório de onze neurônios marcados nestes animais.
Figura 5. A) fotomicrografia demonstra o local de aplicação do HRP dentro da CPA do rato, secção de 40 µm; objetiva 10x.
A
As coordenadas de acesso a CPA utilizadas para aplicação do HRP, demonstraram um aumento da pressão arterial e freqüência cardíaca quando estimuladas pela aplicação do glutamato. A figua seis representa os registros hemodinâmicos antes e após a microinjeção do L-glu.
Figura 6. Respostas cardiovasculares da microinjeção unilateral de L-glutamato (L-glu; 20 nmol/50nL) na área pressora caudal (CPA), (A) Registros de pressão arterial (PA), pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC); (B) cortes coronal e sagital representativos do sítio de microinjeção. O triângulo representa a microinjeção.
L-glu
A
900 950 1000 1050 1100 seconds 0 50 100 150 200 m m H g P A 0 50 100 150 200 m m H g P A M 0 100 200 300 400 b p m F CNa análise estatística dos registros de cinco animais, observou-se um aumento na PAM após a microinjeção de L-glu (102 ± 2,3 mmHg), significativamente maior que os registros controle (80 ± 3 mmHg; p< 0,01), como demonstrado na figura 7, nas coordenadas 1,0 mm caudal ao Óbex e 1,7 mm lateral à linha média, com uma profundidade de 2,0 mm da superfície dorsal do tronco cerebral do animal. Sendo este o sítio escolhido para a aplicação do HRP.
Variação da p ressão arterial m éd ia ap ó s a m icro injeção d e L -g lu na AP C Cont L-glu 0 25 50 75 100 125 C ont L-glu
**
P A M m m H gFigura 7. Efeitos da microinjeção unilateral de L-glutamato (L-glu; 20 nmol/50nL) na CPA, sobre as respostas de pressão arterial média (PAM) em ratos. Cont, controle antes da microinjeção do L-glu nos ratos *P<0,01 (teste t de Student; n = 5).
Neurônios marcados retrogradamente no RMg após microinjeção de HRP na CPA:
Neste núcleo observou-se a menor dispersão celular no sentido rostro-caudal dos neurônios marcados com HRP, estas células estavam situadas entre -11,30 mm e -11,60 mm caudais ao Bregma (fig. 8).
Figura 8. A) Fotomicrografia mostrando dois neurônios densamente marcados com HRP dentro do RMg a -11,30 mm do Bregma, com profundidade de 10,60 mm da superfície do crânio, objetiva 4x. B) Maior aumento da foto A mostrando os grânulos de HRP no neurônio, objetiva 10x.
Dos dez neurônios encontrados marcados no núcleo RMg, três estavam a exatamente -11,30 mm, e os outros sete neurônios a -11,60 mm caudais ao Bregma. Estes últimos neurônios estavam situados com profundidade variando apenas entre 10,4 mm a 10,7 mm em relação à superfície dorsal do crânio (fig. 9).
Figura 9. Rato 1, dois neurônios marcados com HRP dentro do núcleo RMg a -11,60 mm do Bregma, com 10,60 mm e 10,70 mm de profundidade; canto superior esquerdo (seta). A) Demonstra os dois neurônios com um aumento numa objetiva 4x. B) Maior aumento de A, objetiva 10x. Pode ser observado também um neurônio marcado no RPa, canto inferior direito.
A
RMg
B
RMg
A
RMgB
RMgA quantidade total de neurônios encontrados marcados com grânulos de HRP dentro do RMg e seus respectivos posicionamentos tanto rostro-caudais quanto a profundidade da superfície do crânio são demonstrados na tabela abaixo (tab. 1).
Tabela 1. Total de neurônios marcadas com HRP no RMg e suas respectivas localizações rostro- caudais e profundidades da superfície do crânio.
10,40 – 10,70 -11,30 / -11,60 10 Geral 10,40 – 10,70 -11,60 7 Marcações 10,60 -11,30 3 Marcações
Profundidade do
crânio (mm)
Rostro-caudal ao
Bregma (mm)
Número de
Neurônios
RMg
Neurônios marcados retrogradamente no RPa após microinjeção de HRP na CPA:
Os quatorze neurônios marcados dentro do núcleo RPa nos animais estudados estavam distribuídos rostro-caudalmente entre -11,30 mm a -12,80 mm caudais ao Bregma, com uma profundidade variando entre 10,80 mm a 11,10 mm em relação à superfície dorsal do crânio. No rato 1 foram encontrados três neurônios marcados a aproximadamente -11,30 mm do Bregma, dois deles com profundidades de 10,80 mm e um a 10,90 mm da superfície craniana (figura 10).
Figura 10: Rato1, neurônios marcados a aproximadamente -11,30 mm caudais ao Bregma. A) apresenta um neurônio marcado dentro do RPa com uma profundidade de 10,80 mm da superfície do crânio, objetiva 10x. B) outro neurônio marcado no RPa com 10,80 mm de profundidade (seta), além de outros dois no núcleo RMg, objetiva 10x. C) um único neurônio a 10,90 mm de profundidade no RPa, objetiva 10x.
A aproximadamente -11,60 mm do Bregma, mais cinco neurônios foram marcados com HRP no núcleo da RPa, dois deles são demonstrado na figura abaixo com profundidade de 10,80 mm e 11,00 mm da superfície dorsal. Puderam ser observados também na parte superior esquerda da figura, neurônios marcados no núcleo RMg (figura 11). Dos outros três neurônios encontrados no Núcleo RPa,
Núcleo RPa
A
RPaB
RPaC
RPaporém não visualizados aqui, dois estavam com profundidade igual a 11,00 mm e um com 10,90 mm da superfície dorsal.
Figura 11. Rato 1; Neurônio marcado com HRP no núcleo RPa a -11,60 mm do Bregma, objetiva 10x. A) A seta indica uma célula marcada com profundidade de 10,80 mm dorso-ventral no RPa. Duas células marcadas podem ser observadas no canto superior esquerdo, núcleo RMg. B) Um neurônio marcado a 11,00 mm de profundidade no núcleo RPa, a -11,60 mm do Bregma.
Quatro neurônios marcados com HRP foram encontrados a -11,80 mm do Bregma, com profundidade variando entre 10,80 mm e 11,00 mm dorso-ventral. O nível mais caudal do núcleo RPa onde foi encontrado neurônio marcado foi a -12,80 mm caudal ao Bregma, nesta região foram encontrados apenas dois neurônios marcados com HRP, estando estas células localizadas a 10,80 mm da superfície dorsal do crânio (figura 12).
Figura 12. Rato 5; A) neurônio marcado com HRP no núcleo RPa, a -12,80 mm do Bregma com 10,80 mm de profundidade da superfície craniana, objetiva 4x. B) Outro neurônio com HRP no núcleo RPa, a -12,80 mm do Bregma e 10,80 mm de profundidade, objetiva 10x.
B
RPaA
RPaB
RPaA
RPaO total de neurônios encontrados com grânulos de HRP dentro do RPa e seus respectivos posicionamentos, tanto rostro-caudais quanto a profundidade da superfície do crânio, são demonstrados na tabela abaixo (tab. 2).
Tabela 2. Total de neurônios marcadas com HRP no RPa e suas respectivas localizações rostro- caudais e profundidades da superfície do crânio.
10,80 a 11,10 -11,30 a -12,80 14 Geral 10,80 -12,80 2 Marcações 10,80 - 10,90 -11,80 4 Marcações 10,80 - 11,00 -11,60 5 Marcações 10,80 - 10,90 -11,30 3 Marcações
Profundidade do
crânio (mm)
Rostro-caudal
ao Bregma(mm)
Número de
neurônios
RPa
Neurônios marcados retrogradamente no NRO após microinjeção de HRP na CPA:
Quatro dos onze neurônios contendo grânulos de HRP encontrados nos NRO nos animais estudados, estavam a uma distancia de -11,60 mm do Bregma (figura 13) e outros quatro a -11,80 mm do Bregma, com a profundidade destes oito neurônios em relação à superfície do crânio variando apenas entre 10,00 mm a 10,60 mm. Apenas um único neurônio foi encontrado com distancia dorso-caudal do Bregma de -11,96 mm. Porém, sua profundidade foi a maior encontrada de todos os neurônios marcados com HRP dentro do NRO, sendo ela de 10,80 mm da superfície craniana.
D
Figura 13. Fotomicrografias demonstram a presença de neurônios marcados com HRP dentro do NRO à -11,60 mm do Bregma. A) Dois neurônios marcados situados a -11,60 mm caudais ao Bregma no rato 2, com 10,00 mm e 10,10 mm da superfície do crânio; objetiva 4x. B) Maior aumento da foto A mostrando os grânulos de HRP dentro do neurônio; objetiva 10x. C) Marcação com HRP em dois neurônios no NRO a -11,60 mm do Bregma com profundidade de 10,10 mm e 10,20 mm do crânio; objetiva 4x. D) Maior aumento de C mostrando densos grânulos de HRP no interior dos neurônios; objetiva de 10x.
Nesta mesma região, ou seja, a -11,96 mm caudal ao Bregma, pode-se observar a presença de dois outros neurônios marcados dentro do núcleo reticular
D
NROA
NROB
NROC
NROgigantocelular ventral (GiV), com profundidade semelhante à do neurônio encontrado no NRO (figura 14), ambos com 10,80 mm da superfície craniana.
Figura 14. A) Neurônio impregnado com grânulos de HRP no NRO a -11,96 mm do Bregma com 10,80 mm de profundidade dois dias após ser injetado na CPA, (seta preta). Alem do neurônio marcado no NRO podem-se observar outros dois neurônios (seta azul) sitiados no GiV a 10,70 mm de profundidade, com presença do marcador HRP; objetiva 4x. B) Maior aumento do neurônio no NRO da foto A; objetiva 10x.
B
NRO
A
NRO
A região mais caudal do NRO que pôde ser observado a presença de neurônios marcados após a aplicação do HRP na área pressora caudal foi a -12,72 mm do Bregma, neste nível foi encontrado um neurônio marcado no rato 3 e um neurônio marcado no rato 5 com profundidades de 10,40 mm e 10,50 mm respectivamente da superfície do crânio (figura 15).
Figura 15. A) Neurônio marcado no NRO a -12,72 mm do Bregma e 10,40 mm de profundidade; objetiva 4x. B) Fotomicrografia de um neurônio marcado com HRP dentro do NRO a -12,75 mm do Bregma com 10,50 mm de profundidade, objetiva 4x.
A
NRO
B
A quantidade total de neurônios encontrados marcados com grânulos de HRP dentro do NRO e seus respectivos posicionamentos, tanto rostro-caudais quanto à profundidade da superfície do crânio, são demonstrados na tabela abaixo (tab. 3).
Tabela 3. Total de neurônios marcadas com HRP no NRO e suas respectivas localizações rostro- caudais e profundidades da superfície do crânio.