UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
INSTITUTO SUPERIOR DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGIAS
TANES IMAMURA DE LIMA
INFLUÊNCIA DO EXERCÍCIO FÍSICO NA
RESPOSTA TRANSCRICIONAL DO MÚSCULO
ESQUELÉTICO EM RATOS DIABÉTICOS
INDUZIDOS POR STZ
Fortaleza-CE
2013
TANES IMAMURA DE LIMA
INFLUÊNCIA DO EXERCÍCIO FÍSICO NA RESPOSTA
TRANSCRICIONAL DO MÚSCULO ESQUELÉTICO EM
RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR STZ
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-graduação em Ciências Fisiológicas do
Instituto Superior em Ciências Biomédicas
da Universidade Estadual do Ceará-UECE
como requisito parcial para a obtenção do
título de mestre em Ciências Fisiológicas.
Orientadora: Profª Dra. Vânia Marilande
Ceccatto
Fortaleza-CE
2012
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho
Bibliotecário(a) Responsável – Giordana Nascimento de Freitas CRB-3 / 1070
L732i Lima, Tanes Imamura de
Influência do exercício físico na resposta transcricional do músculo esquelético em ratos diabéticos induzidos por STZ / Tanes Imamura de Lima. – 2013.
CD-ROM. 148 f. : il. ; 4 ¾ pol.
“CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slin (19 x 14 cm x 7 mm)”.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual do Ceará, Centro de Ciências da Saúde, Curso de Mestrado acadêmico em Ciências Fisiológicas, Fortaleza, 2013.
Área de Concentração: Ciências Biológicas II. Orientação: Profa. Dra. Vânia Marilande Ceccatto.
1. Diabetes. 2. Estresse oxidativo. 3. Capacidade oxidativa. 4. Músculo esquelético. 5. Exercício físico. I. Título.
TANES IMAMURA DE LIMA
INFLUÊNCIA DO EXERCÍCIO FÍSICO NA RESPOSTA
TRANSCRICIONAL DO MÚSCULO ESQUELÉTICO EM
RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR STZ
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-graduação em Ciências Fisiológicas do
Instituto Superior em Ciências Biomédicas
da Universidade Estadual do Ceará-UECE
como requisito parcial para a obtenção do
título de mestre em Ciências Fisiológicas.
Agradecimentos
Eu gostaria primeiramente de expressar a minha sincera gratidão a minha orientadora Profª Dr. Vânia Marilande Ceccatto, principalmente por ter me guiado nos momentos duvidosos e me encorajado nos momentos difíceis neste trabalho. Por ter me dado todo o suporte sem o qual não seria possível a realização desta dissertação. Finalmente, por ter acreditado neste projeto e não ter medido esforços para que nós pudéssemos realizar todas as análises em tempo hábil.
Acredito que este estudo é fruto de todos os trabalhos anteriores envolvendo exercício físico experimental no laboratório de bioquímica e expressão gênica (LABIEX-UECE), portanto, agradeço a todos os atuais mestres e doutores que fizeram parte do LABIEX e inevitavelmente contribuíram para o amadurecimento da metodologia envolvida no treinamento de roedores em esteira motorizada. Destes, agradeço especialmente ao prof. Dr. Alex Marreiros Ferraz (UFPI) e ao doutorando Igor Cabral Coutinho do Rego Monteiro (UFRJ) por contribuírem diretamente nos aspectos metodológicos dessa dissertação.
Gostaria de expressar minha gratidão a todos os professores do Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas UECE, principalmente ao prof Dr. Henrique Leal Cardoso pela sua generosa colaboração com o LABIEX e suporte quanto alguns dos materiais, equipamentos e laboratório utilizados no presente estudo.
Agradeço ao prof Dr. Rodrigo Fortunato e profª Dr. Denise Carvalho da UFRJ pelas colaborações metodológicas e pelo interesse na investigação do envolvimento das NADPH oxidases nas adaptações musculares ao exercício físico. Agradeço também ao prof. Dr. Samuel Valença juntamente com o doutorando Emanuel Kennedy Feitosa, ambos da UFRJ, e a profª Cristiane Calado da UECE por terem viabilizado e me auxiliado nas análises de atividade das enzimas antioxidantes.
Gostaria de agradecer o prof. Dr. Ariclécio Cunha de Oliveira da UECE por sempre estar disponível para tirar minhas dúvidas a respeito da técnica de PCR em tempo real, principalmente por ter me apresentado o aplicativo GeNorm que foi essencial para normalização mais precisa dos dados de expressão gênica do presente estudo.
Agradeço a todas as pessoas que me ajudaram no “dia a dia” deste estudo. Tenho absoluta certeza que os cuidados diários com os animais, as análises sem hora pra
acabar, a rotina maçante de treinamento físico e longos períodos de sacrifício e dissecação foram essenciais para os resultados obtidos. Ainda, expresso minha sincera gratidão aos amigos e amigas que fiz durante o período de mestrado por terem, de alguma forma, tornado esta caminhada mais prazerosa, principalmente aqueles que participaram das longas conversas sobre fisiologia do exercício.
Esse trabalho não poderia ter sido realizado sem o amor e apoio incondicional da minha esposa Cybelle Janaina de Freitas de Souza Lima. Obrigado imensamente por ter entendido e apoiado a minha decisão em seguir a vida acadêmica e pela paciência em todas as dificuldades que esta decisão nos impôs. Agradeço ao meu pai Lutero Carmo de Lima por ser um exemplo de pesquisador e professor, o que indiretamente me incentivou a seguir nesta direção e a minha mãe Lucia Setsuko Imamura de Lima pelo apoio.
Este trabalho teve o apoio financeiro da coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ).
“A condição do exercício não é uma simples variante da condição de repouso, pois constitui a essência da máquina.”
RESUMO
O diabetes é uma doença metabólica crônica que continua ser uma das principais epidemias globais. Baseado em evidências atuais, é plausível sugerir que o exercício físico pode ter um impacto positivo no músculo esquelético em estado diabético pela regulação na transcrição de genes associados ao metabolismo energético e na defesa antioxidante. Ainda, essa modulação transcricional induzida pelo exercício pode agir de maneira fibra-dependente visto que o músculo esquelético é um órgão altamente heterogêneo em se tratando de capacidade oxidativa e turnover protéico. Dessa forma, o presente estudo objetivou investigar a resposta transricional ao diabetes e ao exercício físico em tecidos musculares com diferentes capacidades oxidativas em ratos diabéticos induzidos por STZ. Em resumo, nove semanas de treinamento físico em esteira motorizada reduziu a atrofia muscular, aumentou a capacidade física (tolerância ao exercício), estabilizou os níveis de glicose sérica basal e atenuou as alterações na transcrição de genes envolvidos na captação de glicose e na defesa antioxidante no músculo esquelético em ratos diabéticos induzidos por STZ. Ainda, o exercício físico atenuou os efeitos do diabetes na atividade de enzimas antioxidantes no músculo esquelético. A regulação na transcrição de genes associados a capacidade oxidativa e na transcrição e atividade de enzimas antioxidantes muscular ao exercício físico e ao diabetes parecem responder de maneira tipo de fibra dependente. Dessa forma, conclui-se que o exercício físico teve um impacto positivo nas alterações transcricionais promovidas pelo diabetes no músculo esquelético de ratos sendo preferencialmente em tecidos musculares com maior capacidade oxidativa. A mudança no perfil transcricional muscular mediado pelo exercício físico possivelmente resultou em importantes alterações fenotípicas para a atenuação do estresse oxidativo e para o aumento da capacidade metabólica no músculo esquelético. Os resultados do presente estudo sustentam a hipótese de outros pesquisadores que sugerem que o exercício físico pode ser considerado uma eficiente terapia antioxidante em condições patológicas onde há um aumento do estresse oxidativo
Palavras-chave: diabetes; estresse oxidativo; capacidade oxidativa; músculo esquelético; exercício
ABSTRACT
Diabetes is a chronic metabolic disease that continues to be one of the major global epidemics. Based on current findings, it is plausible to suggest that physical exercise can exert a positive impact on diabetic skeletal muscle through transcriptional regulation of metabolic and antioxidant associated genes. Moreover, exercise-induced transcriptional modulation might act in a fiber-type dependent manner since skeletal muscle is a highly heterogenic organ concerning its oxidative capacity and protein turnover. Thus, the present study sought to investigate the transcriptional response of diabetes and exercise training on skeletal muscle tissues with distinct oxidative capacities in diabetic STZ induced rats. Shortly, nine weeks of exercise training regimen reduced muscular atrophy, improved physical capacity (exercise tolerance), stabilized the basal serum glucose levels and attenuated the transcriptions alterations of genes involved in muscular glucose uptake and antioxidant defense in STZ diabetic rats. In addition, physical training attenuated the diabetes effects on skeletal muscle antioxidant activities. The regulation of skeletal muscle oxidative capacity genes together with the regulation of antioxidant enzymes transcription and activity by exercise training and diabetes appears to respond in a fiber-type dependent manner. Therefore, it is concluded that exercise training yield a positive impact on skeletal muscle transcriptional alterations induced by diabetes in rats being this effect more prominent in high oxidative capacity muscle tissue (red gastrocnemious). This positive adaptation on muscular transcriptional profile mediated by exercise training possibly resulted in important phenotypic alterations contributing to decreased oxidative stress an improved muscular metabolic capacity found in the skeletal muscle of diabetic exercise trained rats. These results support the hypothesis suggested by others indicating that physical activity can be an efficient antioxidant therapy in pathological conditions which an increased oxidative stress is a common feature.
LISTA DE FIGURAS
Figura 4.1: Curvas de intensidade (velocidade) e volume (duração) de treino durante o período experimental...56 Figura 4.2: Visualização das bandas de RNA ribossomal 28s, 18s e 5s extraído do gastrocnêmio vermelho dos grupos treinados e controles em gel de agarose...58 Figura 4.3: Visualização da curva de diluição seriada com volume final de 20 µL em qPCR em tempo real...59 Figura 4.4: Visualização da regressão linear da curva padrão com volume final de 20 µL em qPCR em tempo real...60 Figura 4.5: Curvas de amplificação de qPCR em tempo real...61 Figura 4.6: Curva de melting em qPCR em tempo real...61 Figura 5.1: Capacidade física durante 0, 3, 6 e 9 semanas expressa em minutos de corrida no teste de esforço máximo...67 Figura 5.2: Níveis de glicose sérica basal durante 0, 3, 6 e 9 semanas expressos em miligrama por decilitro (mg/dl)...68 Figura 5.3: Glicemia sérica antes e após o teste de esforço máximo nas semanas 0 (A), 3 (B), 6 (C) e 9 (D), expressa em miligrama por decilitro (mg/dL)...70
Figura 5.4: Expressão de mRNA de B-actina na porção vermelhae branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...72 Figura 5.5: Figura 5.5 Expressão de mRNA de GLUT 4 na porção vermelha do gastrocnêmio (A), na porção branca do gastrocnêmio (B) e expressão de mRNA de PEPCK no fígado (C)...73 Figura 5.6: Expressão de mRNA de PGC-1α na porção vermelha (A) e na porção branca do gastrocnêmio (B)...74 Figura 5.7: Expressão de mRNA de nNOS e eNOS respectivamente na porção vermelha do gastrocnêmio dos grupos experimentais...75 Figura 5.8: Expressão de mRNA de nNOS e eNOS respectivamente na porção branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...76
Figura 5.9: Expressão de mRNA de CS na porção vermelha e branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...77
Figura 5.10: Expressão de mRNA de UCP3 e UCP2 respectivamente na porção vermelha do gastrocnêmio dos grupos experimentais...78
Figura 5.11: Expressão de mRNA de UCP3 e UCP2 respectivamente na porção branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...78
Figura 5.12: Expressão de mRNA de XO na porção vermelha e branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...79
Figura 5.13: Expressão de mRNA de NOX 2 e NOX 4 na porção vermelha do gastrocnêmio dos grupos experimentais...80 Figura 5.14: Expressão de mRNA de NOX 2 e NOX 4 na porção branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...81 Figura 5.15: Expressão de mRNA de SOD 1 (A), SOD 2 (B) e atividade enzimática da SOD (C) na porção vermelha do gastrocnêmio...82 Figura 5.16: Expressão de mRNA da catalase (A) e atividade enzimática da catalase (B) na porção vermelha do gastrocnêmio...83 Figura 5.17: Expressão de mRNA de GPX 1 (A) e atividade enzimática da GPX (B) na porção vermelha do gastrocnêmio...84 Figura 5.18: Expressão de mRNA de SOD 1 (A), SOD 2 (B) e atividade enzimática da SOD (C) na porção branca do gastrocnêmio...85 Figura 5.19: Expressão de mRNA de catalase (A) e atividade enzimática da catalase (B) na porção branca do gastrocnêmio...86 Figura 5.20: Expressão de mRNA de GPX 1 (A) e atividade enzimática da GPX (B) na porção branca do gastrocnêmio...87 Figura 5.21: Comparação na expressão de mRNA de GLUT4, nNOS, PGC-1α, CS, UCP3, UCP3, XO, NOX2, NOX4, SOD1, SOD2, CAT e GPX1 entre a porção vermelha (GV) e branca (GB) do gastrocnêmio de ratos sadios...88 Figura 5.22: Comparação na expressão de mRNA de GLUT4, nNOS, PGC-1α, CS, UCP3, UCP3, XO, NOX2, NOX4, SOD1, SOD2, CAT e GPX1 entre a porção vermelha (GV) e branca (GB) do gastrocnêmio de ratos diabéticos...89 Figura 5.23: Comparação na expressão de mRNA de GLUT4, nNOS, PGC-1α, CS, UCP3, UCP3, XO, NOX2, NOX4, SOD1, SOD2, CAT e GPX1 entre a porção vermelha (GV) e branca (GB) do gastrocnêmio de ratos diabéticos treinados...90 Figura 5.24: Comparação entre a expressão de mRNA de SOD1 e SOD2 na porção vermelha (A) e porção branca (B) do gastrocnêmio de ratos sadios...91 Figura 5.25: Comparação entre a expressão de mRNA de CAT e GPX1 na porção vermelha (A) e porção branca (B) do gastrocnêmio de ratos sadios...91
Figura 5.26: Comparação da atividade enzimática da SOD (A), CAT (B) e GPX (C) entre a porção branca (GB) e a porção vermelha (GV) do gastrocnêmio...92
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Periodização do período de familiarização...53 Tabela 2. Periodização do treinamento físico dos grupos Treinados e Diabéticos Treinados...55 Tabela 3. Primers selecionados para análise de PCR em tempo real...63 Tabela 4. Parâmetros morfológicos e séricos antes e após o sacrifício...71
LISTA DE ABREVIATURAS
% GC – Percentual de Guanina e Citosina ˙OH – Radical hidroxila
AMPK – Adenosina Monofosfato Kinase ANOVA – Análise de Variância
ATF-2 – Fator-2 de transcrição ATP – Trifosfato de Adenosina B-atina – Beta actina
BLAST – Basic Local Alignment Search Tool CaMK – Cálcio Calmodulina Kinase
cAMP – Adenosina Monofosfato Cíclico
CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAT – Catalase
cDNA – DNA Complementar
CEUA – Comitê de Ética Para o Uso de Animais CFMV – Conselho Federal de Medicina Veterinária
CREB – Proteína de Ligação ao Elemento de Resposta ao cAMP Ct – Limiar de Quantificação
DNA – Ácido Desoxi-ribonúcleico DNA – Ácido Desoxirribonucléico EDL – Digitor longo dos dedos eNOs – Óxido Nítrico Sintase
ERN – Espécies Reativas de Nitrogênio ERO – Espécies Reativas de Oxigênio FKHR – Fator de Transcrição da Forquilha GCN5 – Acetilase Transferase 5
GLUT 4 – Transportador de Glicose 4 GLUTs – Transportadores de Glicose GPX - Glutiationa peroxidase
GPX 1 – Glutiationa Peroxidase 1 GSH – Glutiationa Reduzida GSSG – Glutiationa Oxidada H2O – Água
H2O2 – Peróxido de Hidrogênio
HPRT – Hipoxantina-guanina fosfo-ribosil-transferase IDT – Integrated DNA Technologies
kDa – Quilodalton
Km – Constante de Michaelis-Mentem
MAPKp38 – Proteína Mitogênica Ativada subunidade p38 MEF2 – Fator Ativador de Miócito
mRNA – Ácido Ribonucléico Mensageiro NAC – N-acetilcisteina
NADPH – Dinucleótido de Nicotinamida e aAdenina
NADPH oxidase - dinucleótido de nicotinamida e adenina oxidase NF-κB – Fator Nuclear kappa Beta
nNO – Oxido Nítrico Sintase Neuronal NO – Óxido Nítrico
NOS – Oxido Nítrico Sintase NOX 2 –NADPH oxidase 2 NOX 4 –NADPH oxidase 4 NRF -1 – Fator Nuclear 1 NRF -2 – Fator Nuclear 2 O2 – Oxigênio
O2 – Superóxido
OMS – Organização Mundial da Saúde ONOO – peroxinitrito
PCR – Reação em Cadeia da Plimerase PEPCK – Fosfoenol Piruvato Carboxiquinase
PGC-1α – Coativador do Receptor Ativado do Proliferador de Peroxisoma Gama PI3K – fosfatidilinositol 3 kinase
PPAR-γ – Receptor Ativado do Proliferador de Peroxisoma Gama PRX – Peridoxinas
qPCR – PCR Quantitativo RNA – Ácido Ribonucléico ROH – Álcool
ROOH – Hidroperóxido Orgânico SDH – Sucinato Desidrogenase Sirt1 – Sirtuina 1
SOD – superóxido dismutase
SOD 1 – Superóxido dismutase citosólica SOD 2 – Superóxido dismutase mtocondrial SOD 3 – Superóxido dismutase extracelular SP 1 – Proteína Específica 1
STZ – Estreptozotocina
Tbp – Proteína de Ligação TATAbox Tm – Temperatura de Melting
UCP 2 – Proteína Desacopladora 2 UCP 3 – Proteína Desacopladora 3 UCP 3 – Proteína Desacopladora 3 UCPs – Proteínas Desacopladoras
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... 18 2. OBJETIVOS... 21 2.1 Geral... 21 2.2 Específicos... 21 3. REVISÃO DE LITERATURA... 223.1 Diabetes Mellitus: Uma Epidemia Global... 22
3.2 Diabetes e Atividade Física... 22
3.3 Diabetes, Exercício Físico e Glicose... 24
3.3.1 Diabetes e Exercício Físico na Homeostase de Glicose... 24
3.3.2 Exercício e Captação de Glicose no Músculo Esquelético... 25
3.3.3 Papel do Oxido Nítrico na Captação de Glicose no Músculo Esquelético.... 26
3.3.4 Captação de Glicose no Músculo Esquelético em Contração Mediada por Espécies Reativas de Oxigênio (ERO)... 27
3.4 Diabetes, Estresse Oxidativo e Exercício Físico... 28
3.4.1 Diabetes e Estresse Oxidativo no Músculo Esquelético... 28
3.4.2 Disfunção Mitocondrial no Diabetes... 31
3.4.3 Exercício Físico na Disfunção Mitocondrial Induzida pelo Diabetes... 33
3.4.4 Proteínas Desacopladoras (UCPs) na Disfunção Mitocondrial... 33
3.4.4 Exercício Físico, UCP3 e Estresse Oxidativo... 35
3.5 Exercício Físico e Estresse Oxidativo... 36
3.5.1 Exercício físico e Espécies Reativas de Oxigênio (ERO)... . 36
3.5.2 ERO como Moléculas Sinalizadoras para o Remodelamento Muscular... 38
3.5.3 Defesa Antioxidante em Resposta ao Exercício Crônico... . 39
3.5.3.1 Exercício Físico e Superoxido Dismutase (SOD)... 40
3.5.3.2 Exercício Físico e Glutiationa Peroxidase (GPX)... 42
3.5.3.3 Exercício físico e Catalase (CAT)... 44
3.5.6 Controle Redox do PGC-1α... 45
3.6 Diferenças Fenotípicas em Tecidos Musculares... 47
3.6.1 Propriedades Metabólicas e Funcionais de Tecidos Musculares... 47
3.6.2 Geração Mitocondrial de ERO no Músculo Esquelético... 49
4. METODOLOGIA ... 53
4.2 Procedimentos Experimentais ... 53
4.2.1 Familiarização dos Animas ao Ambiente de Estudo... 53
4.2.2 Indução do Diabetes Experimental... 54
4.2.3 Protocolo de Treinamento Físico... 54
4.2.4 Teste de Esforço Máximo... 56
4.3 Acompanhamento e Sacrifício... 57
4.4 Análise da Expressão Gênica por PCR Quantitativo em Tempo Real... 57
4.4.1 Extração de RNA... 57
4.4.2 Síntese do DNA complementar (cDNA)... 58
4.4.3 Determinação do Volume Final de Reação para Análise de qPCR em Tempo Real... 59
4.4.4 Análise Quantitativa da Expressão Gênica por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em Tempo Real... 60
4.4.5 Busca e Avaliação das Seqüências de Primers... 62
4.4.6 Avaliação dos Genes de Referência mais Estáveis pelo Aplicativo Genorm... 63
4.5 Avaliação da Atividade das Enzimas Antioxidantes... 64
4.5.1 Dosagem de Proteínas... 64
4.5.2 Superóxido Dismutase (SOD)... 65
4.5.3 Catalase (CAT)... 65
4.5.4 Glutiationa Peroxidase (GPX)... 65
4.6 Avaliação dos Níveis Séricos de Triglicérides... 66
4.6 Tratamento Estatístico ... 66
5. RESULTADOS... 67
5.1 Capacidade Física no Teste de Esforço Máximo... 67
5.2 Glicemia Sérica Basal... 68
5.3 Glicemia Sérica Antes e Após o Teste de Esforço Máximo... 68
5.4 Parâmetros morfológicos... 70
5.5 Análise da Expressão Gênica por qPCR em Tempo Real... 71
5.5.1 Expressão Gênica da B-actina... 71
5.5.2 Expressão Gênica de GLUT4 e PEPCK... 72
5.5.3 Expressão Gênica de PGC-1α... 73
5.5.4 Expressão Gênica da nNOS e eNOS no Gastrocnêmio Vermelho... 74
5.5.6 Expressão Gênica da Citrato Sintase... 76
5.5.7 Expressão Gênica de UCP 2 e UCP 3 na Porção Vermelha do Gastrocnêmio... 77
5.5.8 Expressão Gênica de UCP 2 e UCP 3 na Porção Branca do Gastrocnêmio... 78
5.5.9 Expressão Gênica da XO na Porção branca e Vermelha do Gastrocnêmio... 79
5.5.10 Expressão Gênica da NOX 2 e NOX 4 no Gastrocnêmio Vermelho... 79
5.5.11 Expressão Gênica da NOX 2 e NOX 4 no Gastrocnêmio Branco... . 80
5.6 Análise da Expressão Gênica e Atividade de Enzimas Antioxidantes... 81
5.6.1 Expressão Gênica da SOD 1, SOD 2 e Atividade Enzimática da SOD no Gastrocnêmio Vermelho... 81
5.6.2 Expressão Gênica e Atividade Enzimática da Catalase no Gastrocnêmio Vermelho ... . 82
5.6.3 Expressão Gênica e Atividade Enzimática da GPX no Gastrocnêmio Vermelho ... 83
5.6.4 Expressão Gênica da SOD 1, SOD 2 e Atividade Enzimática da SOD no Gastrocnêmio Branco... 84
5.6.5 Expressão Gênica e Atividade Enzimática da Catalase no Gastrocnêmio Branco ... 85
5.6.6 Expressão Gênica e Atividade Enzimática da GPX no Gastrocnêmio Branco ... 86
5.7 Comparação da Expressão Gênica entre Gastrocnêmio Branco e Vermelho.. 87
5.7.1 Comparação da Expressão Gênica entre Gastrocnêmio Branco e Vermelho em Ratos sadios... . 87
5.7.2 Comparação da Expressão Gênica entre Gastrocnêmio Branco e Vermelho em Ratos Diabéticos... . 88
5.7.3 Comparação da Expressão Gênica entre Gastrocnêmio Branco e Vermelho em ratos Diabéticos Treinados... . 89
5.8 Comparação da Expressão Gênica de Enzimas Antioxidantes... 90
5.8.1 Comparação da Expressão Gênica entre SOD 1 e SOD 2 na porção Vermelha e Branca do Gastrocnêmio... 90
5.8.2 Comparação da Expressão Gênica entre CAT e GPX1 na porção Vermelha e Branca do Gastrocnêmio... . 91
6. DISCUSSÃO... 93
6.1 Diabetes e Exercício Físico na Capacidade Oxidativa... 93
6.2 Diabetes e Exercício Físico na Homeostase da Glicose... .. 95
6.3 Diabetes e Exercício nos Sistemas Geradores de ERO... 100
6.4 Diabetes e Exercício na Defesa Antioxidante... 103
6.5 Uma Visão Integrada: Hipótese do Controle da PGC-1α... 109
7. CONCLUSÃO... 111
7.1 Futuras Perspectivas... 112
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TANES IMAMURA DE LIMA
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Orientadora: Profª Dra. Vânia Marilande
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“CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slin (19 x 14 cm x 7 mm)”.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual do Ceará, Centro de Ciências da Saúde, Curso de Mestrado acadêmico em Ciências Fisiológicas, Fortaleza, 2013.
Área de Concentração: Ciências Biológicas II. Orientação: Profa. Dra. Vânia Marilande Ceccatto.
1. Diabetes. 2. Estresse oxidativo. 3. Capacidade oxidativa. 4. Músculo esquelético. 5. Exercício físico. I. Título.
TANES IMAMURA DE LIMA
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como requisito parcial para a obtenção do
título de mestre em Ciências Fisiológicas.
Agradecimentos
Eu gostaria primeiramente de expressar a minha sincera gratidão a minha orientadora Profª Dr. Vânia Marilande Ceccatto, principalmente por ter me guiado nos momentos duvidosos e me encorajado nos momentos difíceis neste trabalho. Por ter me dado todo o suporte sem o qual não seria possível a realização desta dissertação. Finalmente, por ter acreditado neste projeto e não ter medido esforços para que nós pudéssemos realizar todas as análises em tempo hábil.
Acredito que este estudo é fruto de todos os trabalhos anteriores envolvendo exercício físico experimental no laboratório de bioquímica e expressão gênica (LABIEX-UECE), portanto, agradeço a todos os atuais mestres e doutores que fizeram parte do LABIEX e inevitavelmente contribuíram para o amadurecimento da metodologia envolvida no treinamento de roedores em esteira motorizada. Destes, agradeço especialmente ao prof. Dr. Alex Marreiros Ferraz (UFPI) e ao doutorando Igor Cabral Coutinho do Rego Monteiro (UFRJ) por contribuírem diretamente nos aspectos metodológicos dessa dissertação.
Gostaria de expressar minha gratidão a todos os professores do Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas UECE, principalmente ao prof Dr. Henrique Leal Cardoso pela sua generosa colaboração com o LABIEX e suporte quanto alguns dos materiais, equipamentos e laboratório utilizados no presente estudo.
Agradeço ao prof Dr. Rodrigo Fortunato e profª Dr. Denise Carvalho da UFRJ pelas colaborações metodológicas e pelo interesse na investigação do envolvimento das NADPH oxidases nas adaptações musculares ao exercício físico. Agradeço também ao prof. Dr. Samuel Valença juntamente com o doutorando Emanuel Kennedy Feitosa, ambos da UFRJ, e a profª Cristiane Calado da UECE por terem viabilizado e me auxiliado nas análises de atividade das enzimas antioxidantes.
Gostaria de agradecer o prof. Dr. Ariclécio Cunha de Oliveira da UECE por sempre estar disponível para tirar minhas dúvidas a respeito da técnica de PCR em tempo real, principalmente por ter me apresentado o aplicativo GeNorm que foi essencial para normalização mais precisa dos dados de expressão gênica do presente estudo.
Agradeço a todas as pessoas que me ajudaram no “dia a dia” deste estudo. Tenho absoluta certeza que os cuidados diários com os animais, as análises sem hora pra
acabar, a rotina maçante de treinamento físico e longos períodos de sacrifício e dissecação foram essenciais para os resultados obtidos. Ainda, expresso minha sincera gratidão aos amigos e amigas que fiz durante o período de mestrado por terem, de alguma forma, tornado esta caminhada mais prazerosa, principalmente aqueles que participaram das longas conversas sobre fisiologia do exercício.
Esse trabalho não poderia ter sido realizado sem o amor e apoio incondicional da minha esposa Cybelle Janaina de Freitas de Souza Lima. Obrigado imensamente por ter entendido e apoiado a minha decisão em seguir a vida acadêmica e pela paciência em todas as dificuldades que esta decisão nos impôs. Agradeço ao meu pai Lutero Carmo de Lima por ser um exemplo de pesquisador e professor, o que indiretamente me incentivou a seguir nesta direção e a minha mãe Lucia Setsuko Imamura de Lima pelo apoio.
Este trabalho teve o apoio financeiro da coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ).
“A condição do exercício não é uma simples variante da condição de repouso, pois constitui a essência da máquina.”
RESUMO
O diabetes é uma doença metabólica crônica que continua ser uma das principais epidemias globais. Baseado em evidências atuais, é plausível sugerir que o exercício físico pode ter um impacto positivo no músculo esquelético em estado diabético pela regulação na transcrição de genes associados ao metabolismo energético e na defesa antioxidante. Ainda, essa modulação transcricional induzida pelo exercício pode agir de maneira fibra-dependente visto que o músculo esquelético é um órgão altamente heterogêneo em se tratando de capacidade oxidativa e turnover protéico. Dessa forma, o presente estudo objetivou investigar a resposta transricional ao diabetes e ao exercício físico em tecidos musculares com diferentes capacidades oxidativas em ratos diabéticos induzidos por STZ. Em resumo, nove semanas de treinamento físico em esteira motorizada reduziu a atrofia muscular, aumentou a capacidade física (tolerância ao exercício), estabilizou os níveis de glicose sérica basal e atenuou as alterações na transcrição de genes envolvidos na captação de glicose e na defesa antioxidante no músculo esquelético em ratos diabéticos induzidos por STZ. Ainda, o exercício físico atenuou os efeitos do diabetes na atividade de enzimas antioxidantes no músculo esquelético. A regulação na transcrição de genes associados a capacidade oxidativa e na transcrição e atividade de enzimas antioxidantes muscular ao exercício físico e ao diabetes parecem responder de maneira tipo de fibra dependente. Dessa forma, conclui-se que o exercício físico teve um impacto positivo nas alterações transcricionais promovidas pelo diabetes no músculo esquelético de ratos sendo preferencialmente em tecidos musculares com maior capacidade oxidativa. A mudança no perfil transcricional muscular mediado pelo exercício físico possivelmente resultou em importantes alterações fenotípicas para a atenuação do estresse oxidativo e para o aumento da capacidade metabólica no músculo esquelético. Os resultados do presente estudo sustentam a hipótese de outros pesquisadores que sugerem que o exercício físico pode ser considerado uma eficiente terapia antioxidante em condições patológicas onde há um aumento do estresse oxidativo
Palavras-chave: diabetes; estresse oxidativo; capacidade oxidativa; músculo esquelético; exercício
ABSTRACT
Diabetes is a chronic metabolic disease that continues to be one of the major global epidemics. Based on current findings, it is plausible to suggest that physical exercise can exert a positive impact on diabetic skeletal muscle through transcriptional regulation of metabolic and antioxidant associated genes. Moreover, exercise-induced transcriptional modulation might act in a fiber-type dependent manner since skeletal muscle is a highly heterogenic organ concerning its oxidative capacity and protein turnover. Thus, the present study sought to investigate the transcriptional response of diabetes and exercise training on skeletal muscle tissues with distinct oxidative capacities in diabetic STZ induced rats. Shortly, nine weeks of exercise training regimen reduced muscular atrophy, improved physical capacity (exercise tolerance), stabilized the basal serum glucose levels and attenuated the transcriptions alterations of genes involved in muscular glucose uptake and antioxidant defense in STZ diabetic rats. In addition, physical training attenuated the diabetes effects on skeletal muscle antioxidant activities. The regulation of skeletal muscle oxidative capacity genes together with the regulation of antioxidant enzymes transcription and activity by exercise training and diabetes appears to respond in a fiber-type dependent manner. Therefore, it is concluded that exercise training yield a positive impact on skeletal muscle transcriptional alterations induced by diabetes in rats being this effect more prominent in high oxidative capacity muscle tissue (red gastrocnemious). This positive adaptation on muscular transcriptional profile mediated by exercise training possibly resulted in important phenotypic alterations contributing to decreased oxidative stress an improved muscular metabolic capacity found in the skeletal muscle of diabetic exercise trained rats. These results support the hypothesis suggested by others indicating that physical activity can be an efficient antioxidant therapy in pathological conditions which an increased oxidative stress is a common feature.
LISTA DE FIGURAS
Figura 4.1: Curvas de intensidade (velocidade) e volume (duração) de treino durante o período experimental...56 Figura 4.2: Visualização das bandas de RNA ribossomal 28s, 18s e 5s extraído do gastrocnêmio vermelho dos grupos treinados e controles em gel de agarose...58 Figura 4.3: Visualização da curva de diluição seriada com volume final de 20 µL em qPCR em tempo real...59 Figura 4.4: Visualização da regressão linear da curva padrão com volume final de 20 µL em qPCR em tempo real...60 Figura 4.5: Curvas de amplificação de qPCR em tempo real...61 Figura 4.6: Curva de melting em qPCR em tempo real...61 Figura 5.1: Capacidade física durante 0, 3, 6 e 9 semanas expressa em minutos de corrida no teste de esforço máximo...67 Figura 5.2: Níveis de glicose sérica basal durante 0, 3, 6 e 9 semanas expressos em miligrama por decilitro (mg/dl)...68 Figura 5.3: Glicemia sérica antes e após o teste de esforço máximo nas semanas 0 (A), 3 (B), 6 (C) e 9 (D), expressa em miligrama por decilitro (mg/dL)...70
Figura 5.4: Expressão de mRNA de B-actina na porção vermelhae branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...72 Figura 5.5: Figura 5.5 Expressão de mRNA de GLUT 4 na porção vermelha do gastrocnêmio (A), na porção branca do gastrocnêmio (B) e expressão de mRNA de PEPCK no fígado (C)...73 Figura 5.6: Expressão de mRNA de PGC-1α na porção vermelha (A) e na porção branca do gastrocnêmio (B)...74 Figura 5.7: Expressão de mRNA de nNOS e eNOS respectivamente na porção vermelha do gastrocnêmio dos grupos experimentais...75 Figura 5.8: Expressão de mRNA de nNOS e eNOS respectivamente na porção branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...76
Figura 5.9: Expressão de mRNA de CS na porção vermelha e branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...77
Figura 5.10: Expressão de mRNA de UCP3 e UCP2 respectivamente na porção vermelha do gastrocnêmio dos grupos experimentais...78
Figura 5.11: Expressão de mRNA de UCP3 e UCP2 respectivamente na porção branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...78
Figura 5.12: Expressão de mRNA de XO na porção vermelha e branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...79
Figura 5.13: Expressão de mRNA de NOX 2 e NOX 4 na porção vermelha do gastrocnêmio dos grupos experimentais...80 Figura 5.14: Expressão de mRNA de NOX 2 e NOX 4 na porção branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...81 Figura 5.15: Expressão de mRNA de SOD 1 (A), SOD 2 (B) e atividade enzimática da SOD (C) na porção vermelha do gastrocnêmio...82 Figura 5.16: Expressão de mRNA da catalase (A) e atividade enzimática da catalase (B) na porção vermelha do gastrocnêmio...83 Figura 5.17: Expressão de mRNA de GPX 1 (A) e atividade enzimática da GPX (B) na porção vermelha do gastrocnêmio...84 Figura 5.18: Expressão de mRNA de SOD 1 (A), SOD 2 (B) e atividade enzimática da SOD (C) na porção branca do gastrocnêmio...85 Figura 5.19: Expressão de mRNA de catalase (A) e atividade enzimática da catalase (B) na porção branca do gastrocnêmio...86 Figura 5.20: Expressão de mRNA de GPX 1 (A) e atividade enzimática da GPX (B) na porção branca do gastrocnêmio...87 Figura 5.21: Comparação na expressão de mRNA de GLUT4, nNOS, PGC-1α, CS, UCP3, UCP3, XO, NOX2, NOX4, SOD1, SOD2, CAT e GPX1 entre a porção vermelha (GV) e branca (GB) do gastrocnêmio de ratos sadios...88 Figura 5.22: Comparação na expressão de mRNA de GLUT4, nNOS, PGC-1α, CS, UCP3, UCP3, XO, NOX2, NOX4, SOD1, SOD2, CAT e GPX1 entre a porção vermelha (GV) e branca (GB) do gastrocnêmio de ratos diabéticos...89 Figura 5.23: Comparação na expressão de mRNA de GLUT4, nNOS, PGC-1α, CS, UCP3, UCP3, XO, NOX2, NOX4, SOD1, SOD2, CAT e GPX1 entre a porção vermelha (GV) e branca (GB) do gastrocnêmio de ratos diabéticos treinados...90 Figura 5.24: Comparação entre a expressão de mRNA de SOD1 e SOD2 na porção vermelha (A) e porção branca (B) do gastrocnêmio de ratos sadios...91 Figura 5.25: Comparação entre a expressão de mRNA de CAT e GPX1 na porção vermelha (A) e porção branca (B) do gastrocnêmio de ratos sadios...91
Figura 5.26: Comparação da atividade enzimática da SOD (A), CAT (B) e GPX (C) entre a porção branca (GB) e a porção vermelha (GV) do gastrocnêmio...92
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Periodização do período de familiarização...53 Tabela 2. Periodização do treinamento físico dos grupos Treinados e Diabéticos Treinados...55 Tabela 3. Primers selecionados para análise de PCR em tempo real...63 Tabela 4. Parâmetros morfológicos e séricos antes e após o sacrifício...71
LISTA DE ABREVIATURAS
% GC – Percentual de Guanina e Citosina ˙OH – Radical hidroxila
AMPK – Adenosina Monofosfato Kinase ANOVA – Análise de Variância
ATF-2 – Fator-2 de transcrição ATP – Trifosfato de Adenosina B-atina – Beta actina
BLAST – Basic Local Alignment Search Tool CaMK – Cálcio Calmodulina Kinase
cAMP – Adenosina Monofosfato Cíclico
CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAT – Catalase
cDNA – DNA Complementar
CEUA – Comitê de Ética Para o Uso de Animais CFMV – Conselho Federal de Medicina Veterinária
CREB – Proteína de Ligação ao Elemento de Resposta ao cAMP Ct – Limiar de Quantificação
DNA – Ácido Desoxi-ribonúcleico DNA – Ácido Desoxirribonucléico EDL – Digitor longo dos dedos eNOs – Óxido Nítrico Sintase
ERN – Espécies Reativas de Nitrogênio ERO – Espécies Reativas de Oxigênio FKHR – Fator de Transcrição da Forquilha GCN5 – Acetilase Transferase 5
GLUT 4 – Transportador de Glicose 4 GLUTs – Transportadores de Glicose GPX - Glutiationa peroxidase
GPX 1 – Glutiationa Peroxidase 1 GSH – Glutiationa Reduzida GSSG – Glutiationa Oxidada H2O – Água
H2O2 – Peróxido de Hidrogênio
HPRT – Hipoxantina-guanina fosfo-ribosil-transferase IDT – Integrated DNA Technologies
kDa – Quilodalton
Km – Constante de Michaelis-Mentem
MAPKp38 – Proteína Mitogênica Ativada subunidade p38 MEF2 – Fator Ativador de Miócito
mRNA – Ácido Ribonucléico Mensageiro NAC – N-acetilcisteina
NADPH – Dinucleótido de Nicotinamida e aAdenina
NADPH oxidase - dinucleótido de nicotinamida e adenina oxidase NF-κB – Fator Nuclear kappa Beta
nNO – Oxido Nítrico Sintase Neuronal NO – Óxido Nítrico
NOS – Oxido Nítrico Sintase NOX 2 –NADPH oxidase 2 NOX 4 –NADPH oxidase 4 NRF -1 – Fator Nuclear 1 NRF -2 – Fator Nuclear 2 O2 – Oxigênio
O2 – Superóxido
OMS – Organização Mundial da Saúde ONOO – peroxinitrito
PCR – Reação em Cadeia da Plimerase PEPCK – Fosfoenol Piruvato Carboxiquinase
PGC-1α – Coativador do Receptor Ativado do Proliferador de Peroxisoma Gama PI3K – fosfatidilinositol 3 kinase
PPAR-γ – Receptor Ativado do Proliferador de Peroxisoma Gama PRX – Peridoxinas
qPCR – PCR Quantitativo RNA – Ácido Ribonucléico ROH – Álcool
ROOH – Hidroperóxido Orgânico SDH – Sucinato Desidrogenase Sirt1 – Sirtuina 1
SOD – superóxido dismutase
SOD 1 – Superóxido dismutase citosólica SOD 2 – Superóxido dismutase mtocondrial SOD 3 – Superóxido dismutase extracelular SP 1 – Proteína Específica 1
STZ – Estreptozotocina
Tbp – Proteína de Ligação TATAbox Tm – Temperatura de Melting
UCP 2 – Proteína Desacopladora 2 UCP 3 – Proteína Desacopladora 3 UCP 3 – Proteína Desacopladora 3 UCPs – Proteínas Desacopladoras
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... 18 2. OBJETIVOS... 21 2.1 Geral... 21 2.2 Específicos... 21 3. REVISÃO DE LITERATURA... 22 3.1 Diabetes Mellitus: Uma Epidemia Global... 22 3.2 Diabetes e Atividade Física... 22 3.3 Diabetes, Exercício Físico e Glicose... 24 3.3.1 Diabetes e Exercício Físico na Homeostase de Glicose... 24 3.3.2 Exercício e Captação de Glicose no Músculo Esquelético... 25 3.3.3 Papel do Oxido Nítrico na Captação de Glicose no Músculo Esquelético.... 26 3.3.4 Captação de Glicose no Músculo Esquelético em Contração Mediadapor Espécies Reativas de Oxigênio (ERO)... 27 3.4 Diabetes, Estresse Oxidativo e Exercício Físico... 28
3.4.1 Diabetes e Estresse Oxidativo no Músculo Esquelético... 28 3.4.2 Disfunção Mitocondrial no Diabetes... 31 3.4.3 Exercício Físico na Disfunção Mitocondrial Induzida pelo Diabetes... 33 3.4.4 Proteínas Desacopladoras (UCPs) na Disfunção Mitocondrial... 33 3.4.4 Exercício Físico, UCP3 e Estresse Oxidativo... 35 3.5 Exercício Físico e Estresse Oxidativo... 36 3.5.1 Exercício físico e Espécies Reativas de Oxigênio (ERO)... . 36 3.5.2 ERO como Moléculas Sinalizadoras para o Remodelamento Muscular... 38 3.5.3 Defesa Antioxidante em Resposta ao Exercício Crônico... . 39
3.5.3.1 Exercício Físico e Superoxido Dismutase (SOD)... 40 3.5.3.2 Exercício Físico e Glutiationa Peroxidase (GPX)... 42 3.5.3.3 Exercício físico e Catalase (CAT)... 44 3.5.6 Controle Redox do PGC-1α... 45 3.6 Diferenças Fenotípicas em Tecidos Musculares... 47 3.6.1 Propriedades Metabólicas e Funcionais de Tecidos Musculares... 47 3.6.2 Geração Mitocondrial de ERO no Músculo Esquelético... 49 4. METODOLOGIA ... 53 4.1 Material Biológico ... 53
4.2 Procedimentos Experimentais ... 53 4.2.1 Familiarização dos Animas ao Ambiente de Estudo... 53 4.2.2 Indução do Diabetes Experimental... 54 4.2.3 Protocolo de Treinamento Físico... 54 4.2.4 Teste de Esforço Máximo... 56 4.3 Acompanhamento e Sacrifício... 57 4.4 Análise da Expressão Gênica por PCR Quantitativo em Tempo Real... 57 4.4.1 Extração de RNA... 57 4.4.2 Síntese do DNA complementar (cDNA)... 58 4.4.3 Determinação do Volume Final de Reação para Análise de
qPCR em Tempo Real... 59 4.4.4 Análise Quantitativa da Expressão Gênica por Reação
em Cadeia da Polimerase (PCR) em Tempo Real... 60 4.4.5 Busca e Avaliação das Seqüências de Primers... 62 4.4.6 Avaliação dos Genes de Referência mais Estáveis pelo
Aplicativo Genorm... 63 4.5 Avaliação da Atividade das Enzimas Antioxidantes... 64 4.5.1 Dosagem de Proteínas... 64 4.5.2 Superóxido Dismutase (SOD)... 65 4.5.3 Catalase (CAT)... 65 4.5.4 Glutiationa Peroxidase (GPX)... 65 4.6 Avaliação dos Níveis Séricos de Triglicérides... 66 4.6 Tratamento Estatístico ... 66 5. RESULTADOS... 67 5.1 Capacidade Física no Teste de Esforço Máximo... 67 5.2 Glicemia Sérica Basal... 68 5.3 Glicemia Sérica Antes e Após o Teste de Esforço Máximo... 68 5.4 Parâmetros morfológicos... 70 5.5 Análise da Expressão Gênica por qPCR em Tempo Real... 71 5.5.1 Expressão Gênica da B-actina... 71 5.5.2 Expressão Gênica de GLUT4 e PEPCK... 72 5.5.3 Expressão Gênica de PGC-1α... 73 5.5.4 Expressão Gênica da nNOS e eNOS no Gastrocnêmio Vermelho... 74 5.5.5 Expressão Gênica da nNOS e eNOS no Gastrocnêmio Branco... 75
5.5.6 Expressão Gênica da Citrato Sintase... 76 5.5.7 Expressão Gênica de UCP 2 e UCP 3 na Porção Vermelha do
Gastrocnêmio... 77 5.5.8 Expressão Gênica de UCP 2 e UCP 3 na Porção Branca do
Gastrocnêmio... 78 5.5.9 Expressão Gênica da XO na Porção branca e Vermelha do Gastrocnêmio... 79 5.5.10 Expressão Gênica da NOX 2 e NOX 4 no Gastrocnêmio Vermelho... 79 5.5.11 Expressão Gênica da NOX 2 e NOX 4 no Gastrocnêmio Branco... . 80 5.6 Análise da Expressão Gênica e Atividade de Enzimas Antioxidantes... 81
5.6.1 Expressão Gênica da SOD 1, SOD 2 e Atividade Enzimática da
SOD no Gastrocnêmio Vermelho... 81 5.6.2 Expressão Gênica e Atividade Enzimática da Catalase no
Gastrocnêmio Vermelho ... . 82 5.6.3 Expressão Gênica e Atividade Enzimática da GPX no
Gastrocnêmio Vermelho ... 83 5.6.4 Expressão Gênica da SOD 1, SOD 2 e Atividade Enzimática da
SOD no Gastrocnêmio Branco... 84 5.6.5 Expressão Gênica e Atividade Enzimática da Catalase no
Gastrocnêmio Branco ... 85 5.6.6 Expressão Gênica e Atividade Enzimática da GPX no
Gastrocnêmio Branco ... 86 5.7 Comparação da Expressão Gênica entre Gastrocnêmio Branco e Vermelho.. 87
5.7.1 Comparação da Expressão Gênica entre Gastrocnêmio Branco e
Vermelho em Ratos sadios... . 87 5.7.2 Comparação da Expressão Gênica entre Gastrocnêmio Branco e
Vermelho em Ratos Diabéticos... . 88 5.7.3 Comparação da Expressão Gênica entre Gastrocnêmio Branco e
Vermelho em ratos Diabéticos Treinados... . 89 5.8 Comparação da Expressão Gênica de Enzimas Antioxidantes... 90
5.8.1 Comparação da Expressão Gênica entre SOD 1 e SOD 2 na porção
Vermelha e Branca do Gastrocnêmio... 90 5.8.2 Comparação da Expressão Gênica entre CAT e GPX1 na porção
Vermelha e Branca do Gastrocnêmio... . 91 5.8 Comparação da Atividade de Enzimas Antioxidantes... 92
6. DISCUSSÃO... 93 6.1 Diabetes e Exercício Físico na Capacidade Oxidativa... 93 6.2 Diabetes e Exercício Físico na Homeostase da Glicose... .. 95 6.3 Diabetes e Exercício nos Sistemas Geradores de ERO... 100 6.4 Diabetes e Exercício na Defesa Antioxidante... 103 6.5 Uma Visão Integrada: Hipótese do Controle da PGC-1α... 109 7. CONCLUSÃO... 111 7.1 Futuras Perspectivas... 112 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 115
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
INSTITUTO SUPERIOR DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGIAS
TANES IMAMURA DE LIMA
INFLUÊNCIA DO EXERCÍCIO FÍSICO NA
RESPOSTA TRANSCRICIONAL DO MÚSCULO
ESQUELÉTICO EM RATOS DIABÉTICOS
INDUZIDOS POR STZ
Fortaleza-CE
2013
TANES IMAMURA DE LIMA
INFLUÊNCIA DO EXERCÍCIO FÍSICO NA RESPOSTA
TRANSCRICIONAL DO MÚSCULO ESQUELÉTICO EM
RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR STZ
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-graduação em Ciências Fisiológicas do
Instituto Superior em Ciências Biomédicas
da Universidade Estadual do Ceará-UECE
como requisito parcial para a obtenção do
título de mestre em Ciências Fisiológicas.
Orientadora: Profª Dra. Vânia Marilande
Ceccatto
Fortaleza-CE
2012
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho
Bibliotecário(a) Responsável – Giordana Nascimento de Freitas CRB-3 / 1070
L732i Lima, Tanes Imamura de
Influência do exercício físico na resposta transcricional do músculo esquelético em ratos diabéticos induzidos por STZ / Tanes Imamura de Lima. – 2013.
CD-ROM. 148 f. : il. ; 4 ¾ pol.
“CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slin (19 x 14 cm x 7 mm)”.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual do Ceará, Centro de Ciências da Saúde, Curso de Mestrado acadêmico em Ciências Fisiológicas, Fortaleza, 2013.
Área de Concentração: Ciências Biológicas II. Orientação: Profa. Dra. Vânia Marilande Ceccatto.
1. Diabetes. 2. Estresse oxidativo. 3. Capacidade oxidativa. 4. Músculo esquelético. 5. Exercício físico. I. Título.
TANES IMAMURA DE LIMA
INFLUÊNCIA DO EXERCÍCIO FÍSICO NA RESPOSTA
TRANSCRICIONAL DO MÚSCULO ESQUELÉTICO EM
RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR STZ
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-graduação em Ciências Fisiológicas do
Instituto Superior em Ciências Biomédicas
da Universidade Estadual do Ceará-UECE
como requisito parcial para a obtenção do
título de mestre em Ciências Fisiológicas.
Agradecimentos
Eu gostaria primeiramente de expressar a minha sincera gratidão a minha orientadora Profª Dr. Vânia Marilande Ceccatto, principalmente por ter me guiado nos momentos duvidosos e me encorajado nos momentos difíceis neste trabalho. Por ter me dado todo o suporte sem o qual não seria possível a realização desta dissertação. Finalmente, por ter acreditado neste projeto e não ter medido esforços para que nós pudéssemos realizar todas as análises em tempo hábil.
Acredito que este estudo é fruto de todos os trabalhos anteriores envolvendo exercício físico experimental no laboratório de bioquímica e expressão gênica (LABIEX-UECE), portanto, agradeço a todos os atuais mestres e doutores que fizeram parte do LABIEX e inevitavelmente contribuíram para o amadurecimento da metodologia envolvida no treinamento de roedores em esteira motorizada. Destes, agradeço especialmente ao prof. Dr. Alex Marreiros Ferraz (UFPI) e ao doutorando Igor Cabral Coutinho do Rego Monteiro (UFRJ) por contribuírem diretamente nos aspectos metodológicos dessa dissertação.
Gostaria de expressar minha gratidão a todos os professores do Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas UECE, principalmente ao prof Dr. Henrique Leal Cardoso pela sua generosa colaboração com o LABIEX e suporte quanto alguns dos materiais, equipamentos e laboratório utilizados no presente estudo.
Agradeço ao prof Dr. Rodrigo Fortunato e profª Dr. Denise Carvalho da UFRJ pelas colaborações metodológicas e pelo interesse na investigação do envolvimento das NADPH oxidases nas adaptações musculares ao exercício físico. Agradeço também ao prof. Dr. Samuel Valença juntamente com o doutorando Emanuel Kennedy Feitosa, ambos da UFRJ, e a profª Cristiane Calado da UECE por terem viabilizado e me auxiliado nas análises de atividade das enzimas antioxidantes.
Gostaria de agradecer o prof. Dr. Ariclécio Cunha de Oliveira da UECE por sempre estar disponível para tirar minhas dúvidas a respeito da técnica de PCR em tempo real, principalmente por ter me apresentado o aplicativo GeNorm que foi essencial para normalização mais precisa dos dados de expressão gênica do presente estudo.
Agradeço a todas as pessoas que me ajudaram no “dia a dia” deste estudo. Tenho absoluta certeza que os cuidados diários com os animais, as análises sem hora pra
acabar, a rotina maçante de treinamento físico e longos períodos de sacrifício e dissecação foram essenciais para os resultados obtidos. Ainda, expresso minha sincera gratidão aos amigos e amigas que fiz durante o período de mestrado por terem, de alguma forma, tornado esta caminhada mais prazerosa, principalmente aqueles que participaram das longas conversas sobre fisiologia do exercício.
Esse trabalho não poderia ter sido realizado sem o amor e apoio incondicional da minha esposa Cybelle Janaina de Freitas de Souza Lima. Obrigado imensamente por ter entendido e apoiado a minha decisão em seguir a vida acadêmica e pela paciência em todas as dificuldades que esta decisão nos impôs. Agradeço ao meu pai Lutero Carmo de Lima por ser um exemplo de pesquisador e professor, o que indiretamente me incentivou a seguir nesta direção e a minha mãe Lucia Setsuko Imamura de Lima pelo apoio.
Este trabalho teve o apoio financeiro da coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ).
“A condição do exercício não é uma simples variante da condição de repouso, pois constitui a essência da máquina.”
RESUMO
O diabetes é uma doença metabólica crônica que continua ser uma das principais epidemias globais. Baseado em evidências atuais, é plausível sugerir que o exercício físico pode ter um impacto positivo no músculo esquelético em estado diabético pela regulação na transcrição de genes associados ao metabolismo energético e na defesa antioxidante. Ainda, essa modulação transcricional induzida pelo exercício pode agir de maneira fibra-dependente visto que o músculo esquelético é um órgão altamente heterogêneo em se tratando de capacidade oxidativa e turnover protéico. Dessa forma, o presente estudo objetivou investigar a resposta transricional ao diabetes e ao exercício físico em tecidos musculares com diferentes capacidades oxidativas em ratos diabéticos induzidos por STZ. Em resumo, nove semanas de treinamento físico em esteira motorizada reduziu a atrofia muscular, aumentou a capacidade física (tolerância ao exercício), estabilizou os níveis de glicose sérica basal e atenuou as alterações na transcrição de genes envolvidos na captação de glicose e na defesa antioxidante no músculo esquelético em ratos diabéticos induzidos por STZ. Ainda, o exercício físico atenuou os efeitos do diabetes na atividade de enzimas antioxidantes no músculo esquelético. A regulação na transcrição de genes associados a capacidade oxidativa e na transcrição e atividade de enzimas antioxidantes muscular ao exercício físico e ao diabetes parecem responder de maneira tipo de fibra dependente. Dessa forma, conclui-se que o exercício físico teve um impacto positivo nas alterações transcricionais promovidas pelo diabetes no músculo esquelético de ratos sendo preferencialmente em tecidos musculares com maior capacidade oxidativa. A mudança no perfil transcricional muscular mediado pelo exercício físico possivelmente resultou em importantes alterações fenotípicas para a atenuação do estresse oxidativo e para o aumento da capacidade metabólica no músculo esquelético. Os resultados do presente estudo sustentam a hipótese de outros pesquisadores que sugerem que o exercício físico pode ser considerado uma eficiente terapia antioxidante em condições patológicas onde há um aumento do estresse oxidativo
Palavras-chave: diabetes; estresse oxidativo; capacidade oxidativa; músculo esquelético; exercício
ABSTRACT
Diabetes is a chronic metabolic disease that continues to be one of the major global epidemics. Based on current findings, it is plausible to suggest that physical exercise can exert a positive impact on diabetic skeletal muscle through transcriptional regulation of metabolic and antioxidant associated genes. Moreover, exercise-induced transcriptional modulation might act in a fiber-type dependent manner since skeletal muscle is a highly heterogenic organ concerning its oxidative capacity and protein turnover. Thus, the present study sought to investigate the transcriptional response of diabetes and exercise training on skeletal muscle tissues with distinct oxidative capacities in diabetic STZ induced rats. Shortly, nine weeks of exercise training regimen reduced muscular atrophy, improved physical capacity (exercise tolerance), stabilized the basal serum glucose levels and attenuated the transcriptions alterations of genes involved in muscular glucose uptake and antioxidant defense in STZ diabetic rats. In addition, physical training attenuated the diabetes effects on skeletal muscle antioxidant activities. The regulation of skeletal muscle oxidative capacity genes together with the regulation of antioxidant enzymes transcription and activity by exercise training and diabetes appears to respond in a fiber-type dependent manner. Therefore, it is concluded that exercise training yield a positive impact on skeletal muscle transcriptional alterations induced by diabetes in rats being this effect more prominent in high oxidative capacity muscle tissue (red gastrocnemious). This positive adaptation on muscular transcriptional profile mediated by exercise training possibly resulted in important phenotypic alterations contributing to decreased oxidative stress an improved muscular metabolic capacity found in the skeletal muscle of diabetic exercise trained rats. These results support the hypothesis suggested by others indicating that physical activity can be an efficient antioxidant therapy in pathological conditions which an increased oxidative stress is a common feature.
LISTA DE FIGURAS
Figura 4.1: Curvas de intensidade (velocidade) e volume (duração) de treino durante o período experimental...56 Figura 4.2: Visualização das bandas de RNA ribossomal 28s, 18s e 5s extraído do gastrocnêmio vermelho dos grupos treinados e controles em gel de agarose...58 Figura 4.3: Visualização da curva de diluição seriada com volume final de 20 µL em qPCR em tempo real...59 Figura 4.4: Visualização da regressão linear da curva padrão com volume final de 20 µL em qPCR em tempo real...60 Figura 4.5: Curvas de amplificação de qPCR em tempo real...61 Figura 4.6: Curva de melting em qPCR em tempo real...61 Figura 5.1: Capacidade física durante 0, 3, 6 e 9 semanas expressa em minutos de corrida no teste de esforço máximo...67 Figura 5.2: Níveis de glicose sérica basal durante 0, 3, 6 e 9 semanas expressos em miligrama por decilitro (mg/dl)...68 Figura 5.3: Glicemia sérica antes e após o teste de esforço máximo nas semanas 0 (A), 3 (B), 6 (C) e 9 (D), expressa em miligrama por decilitro (mg/dL)...70
Figura 5.4: Expressão de mRNA de B-actina na porção vermelhae branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...72 Figura 5.5: Figura 5.5 Expressão de mRNA de GLUT 4 na porção vermelha do gastrocnêmio (A), na porção branca do gastrocnêmio (B) e expressão de mRNA de PEPCK no fígado (C)...73 Figura 5.6: Expressão de mRNA de PGC-1α na porção vermelha (A) e na porção branca do gastrocnêmio (B)...74 Figura 5.7: Expressão de mRNA de nNOS e eNOS respectivamente na porção vermelha do gastrocnêmio dos grupos experimentais...75 Figura 5.8: Expressão de mRNA de nNOS e eNOS respectivamente na porção branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...76
Figura 5.9: Expressão de mRNA de CS na porção vermelha e branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...77
Figura 5.10: Expressão de mRNA de UCP3 e UCP2 respectivamente na porção vermelha do gastrocnêmio dos grupos experimentais...78
Figura 5.11: Expressão de mRNA de UCP3 e UCP2 respectivamente na porção branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...78
Figura 5.12: Expressão de mRNA de XO na porção vermelha e branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...79
Figura 5.13: Expressão de mRNA de NOX 2 e NOX 4 na porção vermelha do gastrocnêmio dos grupos experimentais...80 Figura 5.14: Expressão de mRNA de NOX 2 e NOX 4 na porção branca do gastrocnêmio dos grupos experimentais...81 Figura 5.15: Expressão de mRNA de SOD 1 (A), SOD 2 (B) e atividade enzimática da SOD (C) na porção vermelha do gastrocnêmio...82 Figura 5.16: Expressão de mRNA da catalase (A) e atividade enzimática da catalase (B) na porção vermelha do gastrocnêmio...83 Figura 5.17: Expressão de mRNA de GPX 1 (A) e atividade enzimática da GPX (B) na porção vermelha do gastrocnêmio...84 Figura 5.18: Expressão de mRNA de SOD 1 (A), SOD 2 (B) e atividade enzimática da SOD (C) na porção branca do gastrocnêmio...85 Figura 5.19: Expressão de mRNA de catalase (A) e atividade enzimática da catalase (B) na porção branca do gastrocnêmio...86 Figura 5.20: Expressão de mRNA de GPX 1 (A) e atividade enzimática da GPX (B) na porção branca do gastrocnêmio...87 Figura 5.21: Comparação na expressão de mRNA de GLUT4, nNOS, PGC-1α, CS, UCP3, UCP3, XO, NOX2, NOX4, SOD1, SOD2, CAT e GPX1 entre a porção vermelha (GV) e branca (GB) do gastrocnêmio de ratos sadios...88 Figura 5.22: Comparação na expressão de mRNA de GLUT4, nNOS, PGC-1α, CS, UCP3, UCP3, XO, NOX2, NOX4, SOD1, SOD2, CAT e GPX1 entre a porção vermelha (GV) e branca (GB) do gastrocnêmio de ratos diabéticos...89 Figura 5.23: Comparação na expressão de mRNA de GLUT4, nNOS, PGC-1α, CS, UCP3, UCP3, XO, NOX2, NOX4, SOD1, SOD2, CAT e GPX1 entre a porção vermelha (GV) e branca (GB) do gastrocnêmio de ratos diabéticos treinados...90 Figura 5.24: Comparação entre a expressão de mRNA de SOD1 e SOD2 na porção vermelha (A) e porção branca (B) do gastrocnêmio de ratos sadios...91 Figura 5.25: Comparação entre a expressão de mRNA de CAT e GPX1 na porção vermelha (A) e porção branca (B) do gastrocnêmio de ratos sadios...91
Figura 5.26: Comparação da atividade enzimática da SOD (A), CAT (B) e GPX (C) entre a porção branca (GB) e a porção vermelha (GV) do gastrocnêmio...92
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Periodização do período de familiarização...53 Tabela 2. Periodização do treinamento físico dos grupos Treinados e Diabéticos Treinados...55 Tabela 3. Primers selecionados para análise de PCR em tempo real...63 Tabela 4. Parâmetros morfológicos e séricos antes e após o sacrifício...71
LISTA DE ABREVIATURAS
% GC – Percentual de Guanina e Citosina ˙OH – Radical hidroxila
AMPK – Adenosina Monofosfato Kinase ANOVA – Análise de Variância
ATF-2 – Fator-2 de transcrição ATP – Trifosfato de Adenosina B-atina – Beta actina
BLAST – Basic Local Alignment Search Tool CaMK – Cálcio Calmodulina Kinase
cAMP – Adenosina Monofosfato Cíclico
CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAT – Catalase
cDNA – DNA Complementar
CEUA – Comitê de Ética Para o Uso de Animais CFMV – Conselho Federal de Medicina Veterinária
CREB – Proteína de Ligação ao Elemento de Resposta ao cAMP Ct – Limiar de Quantificação
DNA – Ácido Desoxi-ribonúcleico DNA – Ácido Desoxirribonucléico EDL – Digitor longo dos dedos eNOs – Óxido Nítrico Sintase
ERN – Espécies Reativas de Nitrogênio ERO – Espécies Reativas de Oxigênio FKHR – Fator de Transcrição da Forquilha GCN5 – Acetilase Transferase 5
GLUT 4 – Transportador de Glicose 4 GLUTs – Transportadores de Glicose GPX - Glutiationa peroxidase
GPX 1 – Glutiationa Peroxidase 1 GSH – Glutiationa Reduzida GSSG – Glutiationa Oxidada H2O – Água
H2O2 – Peróxido de Hidrogênio
HPRT – Hipoxantina-guanina fosfo-ribosil-transferase IDT – Integrated DNA Technologies
kDa – Quilodalton
Km – Constante de Michaelis-Mentem
MAPKp38 – Proteína Mitogênica Ativada subunidade p38 MEF2 – Fator Ativador de Miócito
mRNA – Ácido Ribonucléico Mensageiro NAC – N-acetilcisteina
NADPH – Dinucleótido de Nicotinamida e aAdenina
NADPH oxidase - dinucleótido de nicotinamida e adenina oxidase NF-κB – Fator Nuclear kappa Beta
nNO – Oxido Nítrico Sintase Neuronal NO – Óxido Nítrico
NOS – Oxido Nítrico Sintase NOX 2 –NADPH oxidase 2 NOX 4 –NADPH oxidase 4 NRF -1 – Fator Nuclear 1 NRF -2 – Fator Nuclear 2 O2 – Oxigênio
O2 – Superóxido
OMS – Organização Mundial da Saúde ONOO – peroxinitrito
PCR – Reação em Cadeia da Plimerase PEPCK – Fosfoenol Piruvato Carboxiquinase
PGC-1α – Coativador do Receptor Ativado do Proliferador de Peroxisoma Gama PI3K – fosfatidilinositol 3 kinase
PPAR-γ – Receptor Ativado do Proliferador de Peroxisoma Gama PRX – Peridoxinas
qPCR – PCR Quantitativo RNA – Ácido Ribonucléico ROH – Álcool
ROOH – Hidroperóxido Orgânico SDH – Sucinato Desidrogenase Sirt1 – Sirtuina 1
SOD – superóxido dismutase
SOD 1 – Superóxido dismutase citosólica SOD 2 – Superóxido dismutase mtocondrial SOD 3 – Superóxido dismutase extracelular SP 1 – Proteína Específica 1
STZ – Estreptozotocina
Tbp – Proteína de Ligação TATAbox Tm – Temperatura de Melting
UCP 2 – Proteína Desacopladora 2 UCP 3 – Proteína Desacopladora 3 UCP 3 – Proteína Desacopladora 3 UCPs – Proteínas Desacopladoras
