ESTIMULAÇÃO DIAFRAGMÁTICA ELÉTRICA TRANSCUTÂNEA (EDET) EM RATOS
Karina Maria Cancelliero
SÃO CARLOS 2007
Livros Grátis
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ESTIMULAÇÃO DIAFRAGMÁTICA ELÉTRICA TRANSCUTÂNEA (EDET) EM RATOS
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA
ESTIMULAÇÃO DIAFRAGMÁTICA ELÉTRICA TRANSCUTÂNEA (EDET) EM RATOS
Karina Maria Cancelliero
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisioterapia da Universidade Federal de São Carlos, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Doutora em Fisioterapia.
Orientador: Prof. Dr. Dirceu Costa
SÃO CARLOS 2007
Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitária/UFSCar
C215ed Cancelliero, Karina Maria. Estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET) em ratos / Karina Maria Cancelliero. -- São Carlos : UFSCar, 2008.
121 f.
Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de São Carlos, 2007.
1. EDET. 2. Diafragma. 3. Bleomicina. 4. Fibrose pulmonar. I. Título.
KARINA MARIA CANCELLIERO
"ESTIMULAÇÃO DIAFRAGMÁTICA ELÉTRICA TRANSCUTÂNEA (EDET) EM RATOS”
Tese apresentada à Universidade Federal de São Carlos, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Doutora em Fisioterapia.
BANCA EXAMINADORA
Presidente: Dirceu Costa (Orientador)
1o Examinador: Audrey Borghi e Silva (UFSCar)
2o Examinador: Fabio Viadanna Serrão (UFSCar)
3o Examinador: Fernanda Klein Marcondes (UNICAMP)
A Deus, pela minha vida e por guiar meu caminho, mostrando que todos os momentos ocorrem no
tempo certo, que é o traçado por Ele.
À Nossa Senhora, que me ajuda em todos os momentos, me dando força e me mostrando que a fé e a
esperança podem levar à realização de sonhos. Aos meus pais, pela educação, pelo incentivo constante e por me mostrarem que a fé em Deus é
primordial para a vida.
DEDICATÓRIA
Aos meus Pais, João Alberto Cancelliero e Zilda M. Mantelatto Cancelliero
O agradecimento a vocês é diário, pois todos os dias da minha vida eu recebo a ajuda de vocês.
Muito obrigada pela educação, pelo apoio, pelo incentivo constante e pela oportunidade de realizar muitos sonhos profissionais.
Sempre agradeço a Deus por eu poder ter pais como vocês, exemplos de amor e de fé.
Muito obrigada por estarem sempre ao meu lado, pois vocês me ajudaram a concluir mais uma etapa da minha vida profissional.
MEU ORIENTADR
Prof. Dr. Dirceu Costa
Primeiramente, muito obrigada por acreditar em mim e assim eu ter a oportunidade de realizar um sonho.
Muito obrigada pelos ensinamentos científicos, pelo apoio e pela dedicação.
Mas além desses, te agradeço pelos ensinamentos relacionados à vida profissional, que eram constantes, além daqueles relacionados à prática clínica da fisioterapia respiratória, que foram essenciais para a minha atuação profissional.
Muito obrigada também pelo incentivo relacionado à continuidade do caminho da pesquisa.
Prof. Dirceu, sempre serei grata a você por essa conquista, onde o centro da minha formação, nessa etapa, foi o desenvolvimento desse projeto, mas foi a união com as dificuldades, as oportunidades e as experiências encontradas nesses três anos que proporcionaram uma etapa de conhecimentos e uma experiência inesquecível.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao Prof. Dr. Carlos Alberto da Silva
É difícil encontrar palavras para te agradecer, pois foi com a sua ajuda que eu pude realizar meus sonhos profissionais.
Foram sete anos de pesquisa ao seu lado, onde posso dizer que minha formação profissional foi moldada por todas as oportunidades que você me proporcionou durante esses anos.
Eu sempre serei grata a você e saiba que você é um profissional ímpar, que eu sempre terei como exemplo na minha vida profissional.
Que Deus sempre esteja ao seu lado te iluminando, te orientando e te dando oportunidades para ajudar pessoas a realizarem sonhos!
A Deus
Aos Meus Pais Aos meus irmãos Ao Rafael
Ao meu orientador, prof. Dr. Dirceu Costa Ao meu amigo, prof. Dr. Carlos Alberto da Silva
Aos colegas da UFSCar: Daniela, Carol, Camila, Michel, Gabriel, João e Paula
Aos colegas da Unidade de Fisioterapia Respiratória da UFSCar: Bruna, Eloisa, prof. Mauricio Jamami e Profa. Valéria Amorim Pires Di Lorenzo
Aos colegas da UNIMEP: Theresa, Luciano, Cecília e Rommel. Ao meu grande colega de pesquisa João Luiz Quagliotti Durigan Ao meu tio Fernando Luis Medina Mantelatto
Laboratório de Fisiologia da UNIMEP
À Patrícia Carla Paulino Belotto e Melissa Victo
Aos professores: Dr. Rinaldo Roberto de Jesus Guirro, Dra. Maria Luiza Ozores Polacow, Dra. Fernanda Klein Marcondes, Dr. Gerson Eduardo Rocha Campos, Dra. Tania de Fátima Salvini, Dr. Miguel Arcanjo Areas, Dra. Vivian Cristine Calegari, Dr. Wilton Marlindo Santana Nunes e Dr. Ariovaldo Pereira da Cruz Neto.
Aos meus mestres da pós-graduação
À Universidade Federal de São Carlos (UFSCar)
LETRAS
Penso nas letras como cores
Penso na união das letras como frases a serem ditas
Penso na junção de frases como desejos contidos no íntimo do cérebro onde O racional cruza com o emocional e busca expressar o que ainda não se concretizou
Penso nos verbos como pontos de união
Penso nos adjetivos como hastes de apoio que suspendem as vontades contidas no subconsciente Penso nos substantivos como mestres de ensino que passeiam livres pelas frases sem se importar se são ou não excluídos por vírgulas jogadas ao acaso
Penso nos adjuntos adverbiais que como guias dão sentido a tudo
Penso nas vírgulas como sendo donos das frases, impondo onde o raciocínio tem que acabar Penso no ponto, não como sendo o final de tudo, mas o início de uma nova frase
Doutorar-se não significa o ponto final, mas o recomeço onde se escolhe a vírgula, se determina o adjetivo, se constrói a frase e se expõe o mais íntimo que viaja no inconsciente para explicar algo que até então outros cérebros ainda não conseguiram expressar
Tornar-se doutor é criar asas para alçar vôo por onde a imaginação fluir
É tornar-se ponto de referencia nas frases, sentido nos adjetivos e se eternizar nos conceitos que por muito tempo estão escondidos no sentido da vida
É perceber DEUS contando em seu ouvido um pouco do real significado que ele dimensionou para sua existência ou ainda revelar o porquê DEUS te escolheu para ser o mensageiro deste mistério.
RESUMO ... xx
ABSTRACT ... xxii
1. INTRODUÇÃO ... 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1. Estimulação Diafragmática Elétrica Transcutânea ... 2.2. Sulfato de Bleomicina ... 01 05 09 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo Geral ... 3.2. Objetivos específicos... 13 13 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Animais ... 15
4.2. Estimulação diafragmática elétrica transcutânea ... 15
4.3. Tratamento com bleomicina ... 16
4.4. Amostragem... 17
4.5. Conteúdo de glicogênio muscular ... 17
4.6. Conteúdo de proteínas totais e DNA... 17
4.7. TBARS ... 17
4.8. Determinação dos tipos de fibras musculares ... 18
4.9. Respirometria de fluxo aberto ... 18
4.10. Eletrocardiograma ... 19
4.11. Sensibilidade atrial às catecolaminas ... 19
4.12. Imunohistoquímica do nervo vago ... 20
4.13. Efluxo de 86Rb+ ... 21
4.14. Análise da população de receptores de insulina ... 22
4.15. Insulina plasmática ... 23
4.16. Secreção estática de insulina ... 23
4.17. GTT ... 24
4.19. Dosagem de Insulina, PKA, PKC e GLUT2 das ilhotas
pancreáticas... 25
4.20. Perfil hematológico ... 27
4.21. Fragilidade osmótica ... 28
4.22. Concentração plasmática de glicose, lactato, creatinina, fosfatase alcalina, uréia, AST e ALT... 29
4.23. Análise de úlcera gástrica ... 29
4.24. Perfil bioquímico durante uma sessão de EDET ... 29
4.25. Análise morfométrica do tecido pulmonar... 30
4.26. Análise das metaloproteases musculares... 30
4.27. Análise das citocinas plasmáticas ... 31
4.28. Análise estatística ... 31
5. RESULTADOS 5.1. Estimulação Diafragmática Elétrica Transcutânea ... 5.2. Tratamento com bleomicina e a associação com a EDET ... 34 47 6. DISCUSSÃO 6.1. Estimulação Diafragmática Elétrica Transcutânea ... 6.2. Tratamento com bleomicina e a associação com a EDET ... 60 74 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 93
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 96
9. ANEXOS 9.1. Aprovação do Comitê de ética em experimentação animal ... 116
9.2. Artigos publicados... 117
FIGURA 2. Administração do sulfato de bleomicina via intratraqueal com uma sonda... 16
FIGURA 3. Animal com quatro eletrodos posicionados bilateralmente nas patas
inferiores e superiores para a análise do registro eletrocardiográfico... 19
FIGURA 4. Curvas concentração-efeito à noradrenalina, antes (A) e após (B) a inibição dos sistemas de metabolização das catecolaminas, obtidas em átrios direitos isolados de ratos controle ou submetidos à estimulação diafragmática
elétrica transcutânea. n=6/grupo... 38
FIGURA 5. Corte transversal do esôfago de rato controle correspondente à região subdiafragmática. Observa-se a presença de imunoreatividade positiva para neurofilamentos nos troncos vagais anterior (va), posterior (vp) e os demais ramos. ABC peroxidase; contra coloração com hematoxilina de Meyer (aumento 40x)...
39
FIGURA 6. Efeito da glicose sobre a dinâmica do efluxo de 86Rb+ em ilhotas pancreáticas
isoladas de ratos do grupo controle. Na linha A pode-se verificar a dinâmica do
efluxo do 86Rb de ilhotas perfundidas com solução de Krebs - bicarbonato
(5.6mM) durante 80 minutos. Em B, as linhas verticais interrompidas (42-60o
min) indicam o momento de introdução e retirada da glicose 16,7mM. Cada ponto representa a média de 3 experimentos, cada qual contendo 100 a 150 ilhotas...
41
FIGURA 7. Efeito da carbamilcolina (100µM) sobre a razão do efluxo de 86Rb+ em ilhotas
pancreáticas isoladas de ratos do grupo controle. A linha A mostra o efluxo de ilhotas perfundidas por solução de Krebs - bicarbonato contendo 5,6mM de
glicose, durante todo o período. Na figura B, as linhas interrompidas (42-60o
min) indicam o momento de introdução e de retirada da carbamilcolina. Cada ponto representa a média de 3 experimentos, cada qual contendo 100 a 150 ilhotas...
42
FIGURA 8. Efeito da glicose sobre a dinâmica do efluxo de 86Rb+ em ilhotas pancreáticas
isoladas de ratos submetidos à estimulação diafragmática elétrica transcutânea
de ilhotas perfundidas com solução de Krebs - bicarbonato (5.6mM) durante
80 minutos. Em B (42-60o min), as linhas verticais interrompidas indicam o
momento de introdução e retirada da glicose 16,7mM. Cada ponto representa a
média de 3 experimentos, cada qual contendo 100 a 150 ilhotas... 42
FIGURA 9. Efeito da carbamilcolina (100µM) sobre a razão do efluxo de 86Rb+ em ilhotas
pancreáticas isoladas de ratos submetidos à estimulação diafragmática elétrica transcutânea. A linha A mostra o efluxo de ilhotas perfundidas por solução de Krebs - bicarbonato contendo 5,6mM de glicose, durante todo o período de
perfusão. Na figura B, as linhas interrompidas (42-60o min) indicam o
momento de introdução e de retirada da carbamilcolina. Cada ponto representa a média de 3 experimentos, cada qual contendo 100 a 150 ilhotas...
43
FIGURA 10. Média±epm da concentração de insulina (ng/ilhota/hora) nas concentrações 2,8; 5,6; 8,3 e 16,7mM de glicose dos grupos controle (branco) e tratado
com EDET durante 7 dias (preto). n=6, p<0,05, * comparado ao controle... 44
FIGURA 11. Média±epm da concentração de insulina (ng/ilhota/hora) nas concentrações 2,8; 5,6; 8,3 e 16,7mM de glicose dos grupos controle (branco) e tratado com EDET durante 7 dias seguido de 7 dias sem tratamento (preto). n=6,
p<0,05, * comparado ao controle... 44
FIGURA 12. Comportamento da concentração de insulina plasmática (ng/mL; média) durante a sessão de estimulação elétrica (20 minutos, tempos 0 a 20) nos
tempos (minutos) 25, 30, 35 e 40 (após a sessão)... 46
FIGURA 13. Comportamento da concentração de glicemia e lactacidemia (mmol/L;
média) durante a sessão de estimulação elétrica (20 minutos, tempos 0 a 20)
nos tempos (minutos) 25, 30, 35 e 40 (após a sessão)... 46
FIGURA 14. Alvéolos e sacos alveolares dos pulmões dos grupos controle (A) e tratado
com bleomicina (B). Em B, no tecido intersticial, entre duas camadas de células epiteliais alveolares, o septo alveolar é maior e a área alveolar é
menor (100x, HE)... 47
FIGURA 15. Teste de fragilidade osmótica nos grupos controle e tratado com bleomicina
(n=6) ... 50
FIGURA 16. Teste de tolerância à glicose (GTT) aplicado nos grupos controle e tratado
com bleomicina, analisando a glicemia (mg/dL) nos tempos (em minutos) 0, 5, 10, 15, 20, 30 e 60, após a sobrecarga da glicose. n=6, p<0,05, sendo que o grupo tratado se apresentou diferente estatisticamente do controle...
FIGURA 18. Concentração de insulina (ng.ilh.h) dos grupos controle (C) e bleomicina
(Ble) submetidos ao teste de secreção estática de insulina nas concentrações 2,8mM, 8,3mM e 22,2mM de glicose. Os valores correspondem à média±epm. n=6, p<0,05, * comparado ao controle. Em A, representação gráfica em linhas e em B, em barras...
53
QUADRO 1. Desenho Experimental ... 32
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Concentração do glicogênio (mg/100mg) dos músculos diafragma, intercostal, peitoral e abdominal dos grupos controle e tratado com estimulação
diafragmática elétrica transcutânea (EDET)... 35
TABELA 2. Concentração de proteínas totais (mg/100mg) dos músculos diafragma, intercostal, peitoral e abdominal dos grupos controle e tratado com
estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET)... 35
TABELA 3. Frequência cardíaca (FC, batimentos/minuto), dos intervalos QR, QT, QTc, PR (mm) e do eixo elétrico cardíaco (graus) obtidos na avaliação eletrocardiográfica dos grupos controle (C) e tratado com a estimulação
diafragmática elétrica transcutânea (EDET)... 36
TABELA 4. Valores de freqüência inicial (FI, batimentos/minuto) e resposta máxima (RM, batimentos/minuto) à noradrenalina de átrios direitos isolados de ratos dos grupos controle e tratado com estimulação diafragmática elétrica transcutânea
(EDET) ... 37
TABELA 5. Valores pD2 da noradrenalina de átrios direitos isolados dos grupos controle e
tratado com estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET)... 37
TABELA 6. Conteúdo de TBARS (TBARS/mg tecido) do plasma e dos músculos
diafragma, intercostal, peitoral e abdominal dos grupos controle e tratado com
bleomicina... 48
TABELA 7. Concentração plasmática de glicose (mg/dL), lactato (mmol/L), uréia (mg/dL), creatinina (mg/dL), fosfatase alcalina (U/L), aspartato aminotransferase (AST, U/mL), alanina aminotransferase (ALT, U/mL), ácidos graxos livre (AGL,
mmol/L) dos grupos controle (C) e tratado com bleomicina... 48
TABELA 8. Perfil hematológico do grupo controle e tratado com bleomicina, constando-se
de eritrometria (células/mm3), hematócrito (%), hemoglobina (g/dL)...
49
TABELA 9. Leucometria, linfócitos do timo, linfócitos dos linfonodos mesentéricos e
macrófagos torácicos dos grupos controle (C) e bleomicina (B)... 49
TABELA 10. Concentração de insulina (ng.ilh.h) dos grupos controle e bleomicina submetidos ao teste de secreção estática de insulina nas concentrações 2,8; 8,3
e 22,2mM de glicose... 52
TABELA 11. Tabela 11. Concentração (Ua) e immunoblotting de insulina, GLUT2
tratado com bleomicina + EDET (B+EDET)... 55
TABELA 13. Concentração (%) e immunoblotting de receptores de insulina do músculo
diafragma dos grupos controle (C), tratado com bleomicina (B) e tratado com
bleomicina + EDET (B+EDET). ... 55
TABELA 14. Concentração de insulina plasmática (ng/mL) dos grupos controle (C), tratado
com bleomicina (B) e tratado com bleomicina + EDET (B+EDET)... 56
TABELA 15. Peso (g) das glândulas supra-renais, timo e baço dos grupos controle (C),
tratado com bleomicina (B) e tratado com bleomicina + EDET (B+EDET)... 56
TABELA 16. Densitometria quantitativa das bandas de zimografia MMP-2 (pró-ativa, intermediária e ativa) em unidade arbitrária (%) em músculo diafragma dos grupos controle (C), tratado com bleomicina (B), EDET e tratado com
bleomicina + EDET (B+EDET) ... 57
TABELA 17. Citocinas plasmáticas IL-10, IL-6 e TNF-α dos grupos controle, EDET,
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
β = beta
ADP= difosfato de adenosina AGL = ácidos graxos livres ALT = alanina amino transferase AMP = monofosfato de adenosina
AMPK = proteína quinase ativada por AMP AST = aspartato amino transferase
ATP = trifosfato de adenosina bat/min = batimento por minuto CCE = curva concentração-efeito cDNA: DNA complementar CO2 = gás carbônico
dL = decilitro
DNA = ácido desoxiribonucléico
DPOC = doença pulmonar obstrutiva crônica ECG = eletrocardiograma
EDET = estimulação diafragmática elétrica transcutânea FiO2 = fração inspirada de oxigênio
g = grama
g = gravidade
GLUT2 = transportador de glicose 2 GTT = teste de tolerância à glicose Hz = Hertz
IL-10 = interleucina 10
IL-1ra = receptor antagonista de IL-1 IL-6 = interleucina 6
IR = receptor de insulina
ITT = teste de tolerância à insulina kg = quilograma
KOH = hidróxido de potássio mA = miliamper
mM (mmol) = milimolar MMPs = metaloproteases ms = milisegundo µl = microlitros µM = micromolar µm2 = micrômetro quadrado ng = nanograma
ng.ilh.h = nanograma por ilhota por hora nm = nanômetro
NOS = óxido nítrico sintetase
o C = grau Celsius
O2 = oxigênio
PKA = proteína quinase A PKC = proteína quinase C
PO2 = pressão arterial de oxigênio 86Rb+ = rubídio
RNA = ácido ribonucléico
ROS = espécies reativas de oxigênio rpm = rotações por minuto
TBARS = substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TGF-β = Fator de Crescimento de Transformação-β TIMPs = inibidores de metaloproteases
TNF-α = fator de necrose tumoral alfa VCO2 = consumo de gás carbônico
VO2 = consumo de oxigênio
VO
RESUMO
O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito da estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET) e da bleomicina tanto nos músculos respiratórios quanto em órgãos que poderiam ser influenciados pelos tratamentos. Ratos Wistar foram divididos em 6 grupos (n=6-8/grupo): controle, tratado com EDET, tratado com bleomicina, tratado com bleomicina + EDET, pós-EDET e tratado com pós-EDET durante 7 dias seguido de 7 dias sem tratamento. As análises realizadas foram: conteúdo de glicogênio, TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico), proteínas totais e DNA dos músculos diafragma (D), intercostal (I), peitoral (P) e abdominal (A), tipagem de fibra e população de receptores de insulina do diafragma, perfil bioquímico após uma sessão (glicemia, lactacidemia, insulina, ácido ascórbico e colesterol da supra-renal, glicogênio muscular), eletrocardiograma (ECG), sensibilidade atrial às catecolaminas, respirometria, imunohistoquímica do nervo vago, efluxo de 86Rb+, secreção estática de insulina, insulina plasmática, GTT, ITT, concentrações de PKA, PKC e GLUT2 das ilhotas pancreáticas, perfil hematológico, fragilidade osmótica, concentração plasmática de glicose, lactato, creatinina, uréia, fosfatase alcalina, TBARS, AST e ALT, além de ácidos graxos livres, presença de úlcera gástrica, peso das glândulas supra-renais, timo e baço, morfometria do tecido pulmonar, análise de metaloproteases musculares e citocinas plasmáticas. A análise estatística foi realizada pelo teste de normalidade Kolmogorov-Smirnov seguido do teste t ou da ANOVA e Tukey (α<0,05). Foi observado que a EDET promoveu alteração significativa no conteúdo de glicogênio dos músculos respiratórios, nos parâmetros bioquímicos avaliados durante uma sessão de EDET, na tipagem de fibra diafragmática, nos receptores de insulina, na insulinemia, além do efluxo de 86Rb+ e secreção estática de insulina. Com relação às proteínas totais e DNA musculares, respirometria, análise gástrica, parâmetros do ECG (freqüência cardíaca, intervalos QR, QT e QTc) e sensibilidade atrial não apresentaram diferença na presença da EDET. O tratamento com bleomicina promoveu redução na densidade da área alveolar, além de alteração no conteúdo de TBARS e glicogênio dos músculos respiratórios, nos parâmetros bioquímicos como AST, ALT, ácidos graxos livres e lactacidemia, além de parâmetros hematológicos como no hematócrito e hemoglobina. O grupo tratado também apresentou alterações relacionadas ao pâncreas, destacando os testes GTT, ITT, teste de secreção estática de insulina além das concentrações de GLUT2, PKC e PKA. O grupo tratado com bleomicina associado à EDET apresentou alteração significativa no conteúdo de glicogênio, nos receptores de insulina, insulinemia, lactacidemia, hematócrito e no peso das supra-renais e timo. Com relação às metaloproteases e às citocinas plasmáticas, não houve alteração significativa em nenhum dos grupos
pulmonar, mas também nos músculos respiratórios e outros sistemas, principalmente relacionado ao pâncreas, destacando que a EDET aplicada nessa condição mostrou-se eficaz à musculatura respiratória, promovendo aumento no conteúdo de glicogênio e de hemoglobina bem como na população dos receptores de insulina do diafragma.
Palavras-chave: diafragma - estimulação elétrica - bleomicina - fibrose pulmonar -
ABSTRACT
The objective of this study was to assess the effect of transcutaneous electrical diaphragmatic stimulation (TEDS) and of bleomycin as much in respiratory muscles as in organs that could be influenced by the treatments. Wistar male rats were divided into 6 groups (n=6-8/group): control, treated with TEDS, treated with bleomycin, treated with bleomycin + TEDS, after-TEDS and treated with after-TEDS for 7 days followed 7 days without treatment. The analyses realized were: glycogen content, TBARS (thiobarbituric acid-reactive substances), total proteins and DNA of diaphragm (D), intercostals (I), pectoral (P) and abdominal (A) muscles, fibers type and population of diaphragm insulin receptor, biochemical profile after one session (glycemia, lactacidemia, insulin, ascorbic acid and cholesterol of supra-renal, muscle glycogen), electrocardiogram (ECG), atrial sensibility to catecholamines, respirometry, imunohistochemic of vagus nerve, 86Rb+ efflux, static secretion of insulin, insulin plasmatic, GTT, ITT, concentrations of PKA, PKC and GLUT2 in pancreatic islets, hematological profile, osmotic fragility, plasmatic concentration of glucose, lactate, creatinine, urea, alkaline phosphatase, TBARS, AST and ALT, free fatty acid, gastric ulcer presence, weight of supra-renais glands, thymus, spleen, pulmonary tissue morphometry, muscle metalloproteases analysis and plasmatic cytokines. The statistical analysis was carried by the normality test Kolmogorov-Smirnov followed by Student t-test or ANOVA and Tukey (α<0.05). It was observed that TEDS promoted significant alteration in glycogen content of respiratory muscles, in biochemical parameters evaluated during one TEDS session, in diaphragmatic fiber type, in insulin receptors, in insulinemia, besides of 86Rb+ efflux and static secretion of insulin. With relation to muscle total proteins and DNA, respirometry, gastric analyses, ECG parameters (heart rate, QR, QT and QTc intervals) and atrial sensibility didn’t present difference in TEDS presence. The bleomycin treatment promoted decrease in alveolar area density besides of alteration in content of TBARS and respiratory muscles glycogen, in biochemical parameters as AST, ALT, free fatty acid and e lactacidemia besides hematological parameters as hematocrit and haemoglobin. The group treated also showed alterations related to pancreas, detaching GTT and ITT tests, static secretion of insulin besides GLUT2, PKC e PKA concentrations. The group treated with bleomycin associated TEDS showed significant alteration in glycogen content, insulin receptors, insulinemia, lactacidemia, hematocrit and weight of supra-renais and thymus. With relation to metalloproteases and plasmatic cytokines, did not have significant difference in none of the analyzed groups in acute period of treatment. Thus, the TEDS was efficient in improving the metabolic profile of respiratory muscles musculature and intervening in diaphragmatic fiber type without
respiratory muscles, promoting increase in content of glycogen and of hemoglobin and in population of diaphragm insulin receptors.
Keywords: diaphragm - electrical stimulation – bleomycin – pulmonary fibrosis – physical
esse recurso fisioterapêutico é pouco abordado na literatura científica, mesmo sendo utilizado em pacientes, principalmente aqueles submetidos à ventilação mecânica, acamados ou mesmo com distrofia muscular. Além disso, os parâmetros da corrente elétrica aplicados na EDET são questionáveis, pois há aparelhos com protocolos prontos, o que não é interessante, uma vez que a condição muscular pode se alterar por vários fatores, destacando a mudança do tipo de fibra muscular, a qual leva à escolha de parâmetros próprios para cada tipo de condição clínica.
No Brasil, alguns pesquisadores se destacaram na aplicação da EDET na prática clínica, como por exemplo, Carlos Alberto Azeredo, utilizando esse recurso em Unidade de Terapia Intensiva e Maria Ignez Zanetti Feltrim que vem utilizando em pacientes que se submeteram à cirurgia cardíaca. Porém, esse recurso ainda precisa de mais estudos científicos, pois poucos são os trabalhos documentados tanto no Brasil como mundialmente.
A partir dessa lacuna, surgiu a idéia de se entender melhor esse recurso com relação aos seus efeitos fisiológicos no músculo esquelético, além de que um estudo já estava sendo desenvolvido, no mesmo grupo de pesquisa, porém com humanos e uma co-relação poderia ser feita nessa interface de pesquisa humano-animal. Com isso, surgiu a idéia e consequentemente a busca de estudos na literatura científica, porém, dentro da metodologia proposta, não foi encontrado trabalho abordando o efeito da EDET em ratos e em nenhum outro modelo experimental.
Com base nessa realidade, foi necessário adaptar a EDET para aplicação em ratos, desenvolvendo um protocolo similar ao utilizado no ser humano, mais especificamente com relação à frequência da corrente, pois na literatura constam trabalhos de estimulação elétrica em diafragma somente relacionados a eletrodos subcutâneos, sendo implantados no ponto motor ou mesmo no nervo frênico. Diante disso, optou-se pela estimulação elétrica por meio de eletrodo transcutâneo, comumente utilizada pela fisioterapia.
Sendo assim, apesar do estudo abranger uma análise mais sistêmica, houve a preocupação de se conhecer a EDET de forma mais ampla, invasivamente, para que o protocolo estabelecido pudesse futuramente ser reproduzido em humanos. Como a corrente elétrica é aplicada na região do tórax, isso requer segurança relacionada a outros sistemas do
organismo, de forma que o protocolo também exigiu garantia para a viabilidade da utilização do mesmo em estudos com animais.
Além do objetivo de se propor um protocolo da EDET aplicada em ratos, houve também a inserção de uma condição patológica pulmonar, especificamente a fibrose pulmonar, gerada por um quimioterápico, para avaliar a condição dos músculos respiratórios, que são alvos de ação da fisioterapia, a qual, dentro da área respiratória, também trabalha com treinamento de força e/ou de resistência, e por isso, o conhecimento muscular de forma mais invasiva é necessário para se entender melhor os mecanismos que levam o indivíduo pneumopata a ter fraqueza e/ou fadiga muscular. Assim, a EDET poderia ser um recurso complementar na área da fisioterapia respiratória para minimizar algum efeito deletério desencadeado pela bleomicina.
Nesse contexto, apesar desse trabalho avaliar fisiologicamente outros sistemas no decorrer do seu desenvolvimento, o que é essencial à visão ampla do profissional fisioterapeuta, o objetivo principal foi o desenvolvimento do protocolo da EDET em ratos, uma vez que não havia trabalhos na literatura científica de maneira invasiva, sendo somente abordado em humanos com métodos de avaliação relacionados a parâmetros funcionais.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2. 1. Estimulação Diafragmática Elétrica Transcutânea
O tecido muscular tem a característica de plasticidade funcional, ou seja, de se adaptar de acordo com o estímulo aplicado, como por exemplo, a inatividade, imobilização, diferentes tipos de exercício, estimulação elétrica, nutrição, inervação. Assim como a imobilização articular promove hipotrofia de músculos periféricos, o diafragma também pode passar por um estado de inatividade, como observado nos casos de ventilação mecânica, desencadeando o mesmo quadro ou, até mesmo, progredir para a atrofia.
Le Bourdelles et al. (1994) avaliaram a ventilação mecânica com pressão positiva em ratos e observaram que tão pouco quanto 48 horas já foram suficientes para promover atrofia do diafragma, além da redução das suas propriedades contráteis. Esta importante observação instiga outros estudos relacionados à utilização de períodos de estimulação elétrica no intuito de prevenir a atrofia muscular do diafragma em humanos. A fisioterapia é a área que possui a estimulação elétrica como um dos recursos utilizados na reabilitação neuromuscular, sendo este recurso considerado uma modalidade útil de assistência à contração muscular para indivíduos que apresentam dificuldade na realização do exercício voluntário (HAMADA et al., 2003). Uma especificidade dos recursos eletroterapêuticos é a estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET), utilizada para melhorar a função ventilatória, auxiliando pacientes com fraqueza dos músculos respiratórios ou submetidos à ventilação mecânica. Porém, além dos poucos estudos disponíveis na literatura abordando os parâmetros e benefícios desse recurso à musculatura respiratória, especialmente o músculo diafragma, esses são direcionados à abordagem em seres humanos, impossibilitando a obtenção de importantes informações fisiológicas, só possíveis em estudos invasivos.
A literatura mostra que pacientes submetidos a treinamento muscular profilático obtiveram melhora da força e função muscular respiratória, além da melhora da oxigenação, ventilação e diminuição no tempo de hospitalização (GREEN et al., 2001). Contudo, não foi possível informar se houve alterações estruturais nesses músculos, por exemplo.
Historicamente, há um grande interesse em estimular eletricamente o músculo diafragma, havendo relatos da aplicação de estímulos elétricos em vítima apnéica que apresentava asfixia tóxica por carvão (SARNOFF, MALONEY e SARNOFF, 1950). Assim,
do nervo frênico e conseqüente a estimulação do diafragma. Esta técnica foi estudada em humanos neonatos e portadores de poliomielite, com o objetivo de promover a contração muscular diafragmática (SARNOFF, SARNOFF e WHITTENBERGER, 1951; GOLDENTHAL, 1961), mas nessa época, faltaram maiores informações científicas e fisiológicas sobre a técnica.
Na década de 80, foi realizado um trabalho pioneiro com pacientes portadores de disfunções musculares diafragmáticas onde se implantou cirurgicamente um microestimulador elétrico nas proximidades do nervo frênico gerando um marcapasso frênico, cuja aplicação teve objetivo de induzir contrações diafragmáticas e melhorar a ventilação de pacientes que apresentavam diferentes estados patológicos, como por exemplo, disfunções neuromusculares ou portadores de traumatismo raquimedular alto (GLENN, GEE e SCHACHTER, 1978; GLENN e PHELPS, 1985). Resultados clinicamente bem sucedidos têm estimulado a realização de estudos mais aprofundados sobre a técnica EDET.
Concomitante à utilização do marcapasso frênico tornou-se necessário a investigação de diferentes parâmetros elétricos, os quais não provocassem degeneração neural. Foi neste contexto que experimentos foram realizados com cães monitorados eletroneuromiograficamente, sendo propostos três pontos motores para o nervo frênico, assim definidos: região do sexto, sétimo e oitavo espaços intercostais da linha média axilar, região paraxifóidea e a base do pescoço entre o escaleno e o esternocleidomástoideo de cada lado (GLENN et al., 1986). Deste experimento ficou o consenso de que impulsos de baixa intensidade de corrente estimulam o diafragma no ponto da região paraxifóidea e o nervo torácico longo na região do sexto, sétimo e oitavo espaços intercostais da linha média axilar, por outro lado, impulsos de alta intensidade estimulam os músculos abdominais no ponto paraxifóideo e o diafragma nos pontos do sexto, sétimo e oitavo espaços intercostais da linha média axilar.
Uma vez que se trata de corrente elétrica aplicada na caixa torácica, o procedimento não deve repercutir em alterações na hemodinâmica ou no ritmo cardíaco. Para dirimir esta dúvida foram realizados experimentos com cães, sendo determinado que o valor seguro da duração do pulso da corrente para contrair o diafragma deveria estar entre 0.1ms - 10ms (RISCILI, FOSTER e VOORHEES, 1988; RISCILI, HINDS e VOORHEES, 1989). O
passo seguinte foi avaliar sua aplicabilidade em humanos portadores de disfunção diafragmática variada utilizando-se análise via eletroneuromiografia respiratória e pressão transdiafragmática com balões intraesofágicos. Para tal, foram escolhidos os pontos situados na base lateral do pescoço esquerdo e direito e a freqüência utilizada foi de 1 Hertz (Hz) e a largura de pulso de 0,1 milisegundo (ms). O estudo revelou que o procedimento foi eficaz no condicionamento muscular diafragmático beneficiando 95% dos pacientes com disfunções diafragmáticas (MIER, BROPHY e MOSCHAM, 1987; BOLTON, 1992).
Na literatura científica há publicação de um protocolo de estimulação diafragmática elétrica transcutânea aplicado a humanos, que consistia dos seguintes parâmetros: corrente modulável para ajuste do tempo de subida igual a 1 segundo, tempo de sustentação da contração igual a 1 segundo, e tempo de relaxamento igual a 2 segundos; a freqüência da corrente seria em torno de 25Hz-30Hz; a largura de pulso da corrente deveria estar entre 0,1ms-10ms; os eletrodos deveriam estar fixados em pontos paraxifóideos ou intercostais na linha média axilar; a intensidade deveria ser a mínima para obter contração; o tempo de estimulação de 20 minutos. Segundo alguns autores, a eletroneuromiografia pode ser um método efetivo para avaliar o procedimento, uma vez que somente seriam candidatos para estimulação, pacientes que possuíssem nervos frênicos íntegros (GEDDES, VOORHEES e BABBS, 1985; GEDDES, VOORHEES e BOULAND, 1990; GEDDES e SIMMONS, 1991).
No mesmo período, o protocolo foi utilizado enquanto recurso fisioterapêutico no tratamento de cinco pacientes, sendo quatro com lesão frênica de pós-cirurgia cardíaca e um com seqüelas respiratórias de poliomielite (CUELLO, MASCIANTONIO e MENDOZA, 1991; SAADEH, 1993). A estimulação foi realizada com eletrodos posicionados bilateralmente no sexto, sétimo e oitavo espaços intercostais da linha média axilar durante vinte minutos, quatro vezes ao dia sendo utilizado na avaliação radioscópica (antes e após o procedimento) e avaliação espirométrica (volume corrente, capacidade vital, ventilação máxima voluntária, capacidade pulmonar total e de força muscular (pressão inspiratória máxima)) e os resultados demonstraram ganho de excursão diafragmática na radioscopia, bem como incrementos nos valores espirométricos dos pacientes tratados (GEDDES, VOORHEES e LAGLER, 1988; HON e HULME, 1958).
A EDET também foi utilizada como recurso fisioterapêutico em paciente portador de paralisia de hemicúpula diafragmática esquerda na pós-cirurgia cardíaca por injúria frênica e em paciente portador de traumatismo raquimedular cervical, promovendo a contração diafragmática nessas situações (AQUIM, ABRY e MOTTER, 1992; WETZEL et
submetidos a treinamento muscular profilático obtiveram uma melhora de sua força e função muscular respiratória, além de outros benefícios como a melhora de sua oxigenação, de sua ventilação e diminuição no tempo de hospitalização (NOMORI et al., 1994; GREEN et al., 2001).
Nesse contexto, nos estágios atuais da evolução das ciências da saúde surgiu a necessidade de uma maior dedicação de cientistas em estudos relacionados à fisioterapia respiratória experimental, que na sua essência, busca aprimorar o conhecimento e a aplicabilidade dos métodos fisioterapêuticos, como é o caso desse tão importante método, a EDET. Nesta linha experimental, foram testados em ratos alguns protocolos obedecendo a uma ampla variação nos parâmetros funcionais da corrente elétrica como frequência e intensidade. A maior eficácia quimiometabólica (aumento do conteúdo muscular de glicogênio) foi conseguida com o seguinte protocolo: frequência de 50Hz (TON/TOFF= 2
segundos), largura de fase de 0,4ms, intensidade de 5mA e 20 minutos de aplicação. Este fato é importante ser destacado, pois houve a realização de um estudo piloto utilizando a frequência de 30Hz, porém o efeito metabólico foi menor, jutificando assim, a utilização do protocolo acima.
É bastante conhecido na literatura que a homeostasia energética do tecido muscular depende de inúmeros fatores como a integridade da junção neuromuscular, o estado funcional das fibras musculares, a sensibilidade à insulina e o suprimento adequado de substratos metabolizáveis (ZHENG et al., 2001). Recentemente, foi demonstrado que o músculo esquelético desnervado ou sob a condição de imobilização apresenta melhora significativa nas reservas energéticas quando submetido à estimulação elétrica neuromuscular de baixa freqüência (GUIRRO et al., 2004; CANCELLIERO, 2004), mostrando a importância da contração muscular no aporte energético.
Assim, tais estudos mostram a importância da utilização da estimulação elétrica diafragmática e sua evolução em diversas patologias e em situações nas quais há a disfunção ou o desuso muscular, permanecendo a lacuna nas informações morfofuncionais e, portanto, de caráter invasivo. Vale ressaltar, que na literatura os poucos estudos de estimulação diafragmática elétrica transcutânea existentes são relacionados a seres humanos e
suas análises se limitam, principalmente, à espirometria e força muscular respiratória, atendendo ao Comitê de Ética em humanos.
2.2. Sulfato de Bleomicina
Com relação ao sulfato de bleomicina, este é um antibiótico citotóxico utilizado por pacientes portadores de carcinoma localizado principalmente na cabeça e pescoço (boca, língua, amígdalas, nasofaringe, orofaringe, seios paranasais, palato, lábios, mucosa bucal, gengiva, epiglote e laringe) pele, pênis, colo uterino e vulva, além de carcinoma de testículo, linfomas (Doença de Hodgkin e linfoma não-Hodgkin) e derrame pleural maligno (BRISTOL-MYERS SQUIBB).
A toxicidade pulmonar, efeito colateral mais grave do sulfato de bleomicina, ocorre em 10% dos pacientes, sendo que em 1% a pneumonite não-específica induzida evolui para fibrose pulmonar e óbito. A toxicidade é mais frequente em pacientes com idade superior a 70 anos e aqueles que recebem doses totais maiores que 400 unidades (BRISTOL-MYERS SQUIBB). Segundo Sleijfer (2001) o sulfato de bleomicina é um agente antineoplásico que causa fibrose pulmonar como um efeito colateral durante o tratamento em humanos. Seu efeito tóxico tem sido utilizado em modelos experimentais em animais (LAZO et al., 1990), porém o mecanismo envolvido na indução dessa doença não tem sido completamente entendido (GOTO et al., 2004).
Devido à falta de especificidade da síndrome clínica, a identificação dos pacientes portadores de toxicidade pulmonar é extremamente difícil. O primeiro sintoma associado à toxicidade pulmonar é a dispnéia e os primeiros sinais são os estertores finos. Radiograficamente, a pneumonite produz opacidades não-específicas, geralmente dos campos pulmonares inferiores. As alterações mais comuns dos testes da função pulmonar são a diminuição do volume pulmonar total e diminuição da capacidade vital, sendo que não são fatores indicativos do desenvolvimento da fibrose pulmonar (BRISTOL-MYERS SQUIBB).
As alterações microscópicas dos tecidos decorrentes da toxicidade do sulfato de bleomicina incluem metaplasia escamosa bronquiolar, macrófagos reativos, células atípicas do epitélio alveolar, edema fibrinoso e fibrose intersticial (BRISTOL-MYERS SQUIBB). No estudo de Venkatesan et al. (2000) amostras histológicas mostraram inflamação mais evidente em 7 e 14 dias após a administração da bleomicina (1,5mg/kg peso, intratraquealmente), sendo que após 28 dias o processo inflamatório estava amenizado. Zhao
acordo com o período após a administração do sulfato de bleomicina. Já em 1984, Thrall e Barton observaram aumento significativo na porcentagem dos linfócitos B no tecido pulmonar dentro de 3 dias após a administração, sendo o pico observado no 7o dia, além de encontrarem população de linfócitos em fluido de lavado nos 3o, 7o e 14o dias, sem encontrar nos 30o e 120o dias após o tratamento com bleomicina.
Goto et al. (2004) observaram uma significativa diminuição na pressão parcial arterial de oxigênio, um significativo aumento na diferença de pressão de oxigênio alvéolo-arterial e um aumento no número de eritrócitos, sugerindo que este aumento eritrocitário pode ter sido causado pelo distúrbio de difusão e imbalanço na ventilação-perfusão devido à lesão pulmonar. O risco de desenvolver a toxicidade pulmonar aumenta quando o oxigênio é administrado na intervenção cirúrgica, portanto, recomenda-se manter o FiO2 (fração
inspirada de oxigênio) em concentrações próximas ao ar ambiente (25%) durante a cirurgia e no período pós-operatório (BRISTOL-MYERS SQUIBB).
Hagiwara, Ishii e Kitamura (2000) relataram que o modelo de fibrose pulmonar induzida pela bleomicina em ratos é uma ferramenta útil para avaliar os mecanismos gerais da fibrose, principalmente aqueles mediados por radicais livres de oxigênio. Em 1978, Sausville et al. observaram que o mecanismo do efeito antineoplásico da bleomicina é que o complexo ferro da bleomicina reduz o oxigênio molecular para radicais superóxido e hidroxil que podem atacar o DNA e causar strand cleavage. Haycock et al. (1996) destacaram que a produção das espécies reativas de oxigênio (ROS) em exercícios fisiológicos específicos ou em fisiopatologia, como distrofias, desnervação e miopatias é incerta.
O músculo esquelético, em mamíferos adultos, exibe uma capacidade extraordinária para se adaptar a diferentes demandas fisiológicas como o crescimento, treinamento e lesão, em grande parte com auxílio de células satélites (HAWKE e GARRY, 2001). Reid (2001) observou que as ROS têm efeito bifásico nas funções contráteis das miofibras esqueléticas, com baixas concentrações de ROS, essenciais para a produção da força normal, e o acúmulo excessivo de ROS, envolvido no desenvolvimento da fadiga muscular aguda.
O aprimoramento do conhecimento fisiológico da musculatura esquelética respiratória, incluindo parâmetros metabólicos, morfológicos e bioquímicos, é de fundamental
importância para o profissional da área da saúde, uma vez que, adquirir condições musculares adequadas, pode refletir na qualidade de vida de cada paciente. Segundo Pette e Vrbová (1999), o tecido muscular tem a característica de plasticidade funcional, ou seja, de se adaptar de acordo com o estímulo aplicado.
Uma vez que a fibrose pulmonar promove alterações na função pulmonar e na mecânica respiratória, o nosso estudo se preocupou não somente em analisar a condição clínica isolada, mas também o efeito da EDET associado, buscando um melhor conhecimento da condição da musculatura esquelética respiratória, além dos efeitos sistêmicos que as duas condições poderiam estar promovendo e possivelmente, alterando a homeostasia sistêmica do organismo.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
A partir do exposto, a proposta geral deste trabalho foi desenvolver um protocolo de EDET para animais e realizar uma avaliação ampla com a aplicação do recurso fisioterapêutico, testando a hipótese de que a corrente elétrica poderia afetar a homeostasia dos músculos respiratórios, componentes plasmáticos e funções de alguns órgãos, além de avaliar o efeito da bleomicina sobre o tecido pulmonar e muscular respiratório, associado a uma avaliação sistêmica, focalizando a homeostasia do organismo, uma vez que a indução da fibrose pulmonar é realizada por um fármaco quimioterápico, o qual pode trazer outros efeitos colaterais. Outro objetivo foi avaliar o efeito da EDET na condição de fibrose pulmonar sob alguns aspectos de análises.
3.2. Objetivos Específicos
Os objetivos específicos foram avaliar:
a) conteúdo de glicogênio, proteínas totais e DNA dos músculos diafragma, intercostal, peitoral e abdominal
b) tipagem de fibras musculares, receptor de insulina e metaloproteases do diafragma c) respirometria
d) eletrocardiograma e sensibilidade atrial às catecolaminas e) imunohistoquímica do nervo vago
f) efluxo de 86Rb+ e secreção estática de insulina
g) GTT (teste de tolerância à glicose) e ITT (teste de tolerância à insulina) h) insulina, PKA, PKC e GLUT2 das ilhotas pancreáticas
i) perfil hematológico e fragilidade osmótica
j) concentração plasmática de insulina, glicose, lactato, creatinina, uréia, fosfatase alcalina, TBARS, AST, ALT e citocinas (IL-6, IL-10 e TNF-α)
k) úlcera gástrica
l) perfil bioquímico (glicemia, lactacidemia, insulinemia) durante uma sessão de EDET, além do glicogênio dos músculos respiratórios, ácido ascórbico e colesterol da supra-renal pós-sessão.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Animais
Foram utilizados ratos albinos Wistar, com idade variando de 3 a 4 meses, os quais foram alimentados com ração e água ad libitum, sendo submetidos a ciclo fotoperiódico de 12 horas claro/escuro e divididos em seis grupos experimentais (n=6-8): controle, tratado com estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET), tratado com bleomicina, tratado com bleomicina associado à EDET, pós-EDET (após 1 sessão) e tratado com EDET durante 7 dias seguido de 7 dias sem tratamento. Houve também a realização do grupo Sham o qual foi tratado somente com o anestésico.
Os animais foram tratados segundo os princípios recomendados pelo COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal), sendo o trabalho aprovado pela comissão de ética na experimentação animal – CEEA-IB-UNICAMP sob o protocolo no 754-2. Ressalta-se que tanto os tratamentos quanto as coletas foram realizados no período da manhã.
4.2. Estimulação diafragmática elétrica transcutânea
Para a aplicação da estimulação diafragmática elétrica transcutânea, os animais foram anestesiados (Ketalar® e Rompum®) e a região anterior do tórax tricotomizada para garantir uma maior efetividade da estimulação e do posicionamento dos eletrodos. A estimulação elétrica foi realizada diariamente por 20 minutos durante 7 dias, sendo a frequência de 50 Hertz (ciclos por segundo), TON de 2 segundos (tempo de contração), TOFF de
2 segundos (tempo de relaxamento) e a largura de fase (duração do pulso) de 0,4 milisegundos (ms). A intensidade (amplitude do pulso) foi padronizada em 5.0 miliamperes (mA), a partir da visualização da contração muscular, sendo que a cada 3 minutos foi aplicado um acréscimo de 1.0mA à corrente minimizando a acomodação do diafragma.
O equipamento utilizado para a estimulação elétrica foi o Dualpex 961 (QUARK), além de dois eletrodos de silicone-carbono com área de 1,5x2,0 centímetros cada e gel de acoplamento. Os dois eletrodos foram posicionados bilateralmente na região lateral do tórax entre a 4a e a 6a costela, no ponto médio entre o cotovelo e a última costela do
animal, como mostra a figura 1. Essa região é próxima aos ramos laterais do nervo frênico, que terminam na região lateral do diafragma.
Figura 1. Estimulação elétrica realizada no animal através de dois eletrodos de superfície (1 e 2) acoplados com gel na região lateral do gradil costal, entre a 4a e a 6a costela.
4.3. Tratamento com bleomicina
O tratamento foi realizado por uma dose única de sulfato de bleomicina (Blenoxane - BRISTOL-MYERS SQUIBB) na concentração de 2,5mg/Kg de peso corporal segundo a proposta de Beller et al. (2004) pela via intratraqueal (figura 2) e depois do período de 7 dias os animais foram sacrificados e as análises experimentais foram realizadas.
Figura 2. Administração do sulfato de bleomicina via intratraqueal com uma sonda.
4.4. Amostragem
Após o período experimental, os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (40mg/kg peso), o sangue foi coletado com anticoagulante (heparina ou EDTA, conforme especificação de cada análise) pela veia renal, centrifugado 10 minutos a 2500rpm e o plasma armazenado em freezer para a realização das devidas análises.
Para as amostras musculares, o diafragma, o intercostal, o peitoral e o abdominal foram cuidadosamente isolados, retirados e encaminhados para as avaliações, além dos pulmões, coração, pâncreas, estômago, glândulas supra-renais, timo e baço para outras análises.
4.5. Conteúdo de glicogênio muscular
As amostras do músculo foram digeridas em KOH (hidróxido de potássio) 30% a quente e o glicogênio precipitado a partir da passagem por etanol a quente. Entre uma fase e outra da precipitação, a amostra foi centrifugada e o glicogênio precipitado foi submetido à hidrólise ácida na presença de fenol e posterior leitura em espectofotômetro a 490nm, segundo a proposta de Siu, Russeau e Taylor (1970). Os valores foram expressos em mg/100mg de peso úmido.
4.6. Conteúdo de proteínas totais e DNA
O conteúdo de proteínas dos músculos respiratórios foi determinado pelo método do folin-fenol segundo Lowry et al. (1951) em que as amostras passam pelo procedimento do hidrolizado e após pela colorimetria na presença de 3 soluções com leitura em espectofotômetro a 650nm.
O conteúdo de DNA foi analisado pelo método da difenilamina (GILES e MEYERS, 1965) que consiste do preparo do homogenato das amostras, da solução de difenilamina e de um reagente com posterior leitura em espectofotômetro a 595 nm.
4.7. TBARS
A análise dos TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico) foi realizada pelo método de Yagi (1987), no qual há o preparo do homogenato das amostras com solução tampão, que são submetidas a soluções reagentes, finalizando com banho maria
O fragmento muscular coletado foi imediatamente posicionado em bloco de madeira com Tragacanth gum e congelado em isopentano resfriado em nitrogênio líquido a -159o C, sendo posteriormente armazenado em biofreezer a -74 oC, para posterior microtomia.
A microtomia do fragmento muscular em criostato MICRON HM 505E, a -24 o C, permitiu a obtenção de cortes de 12 µm de espessura, que foram armazenados em cubetas especiais e mantidos em biofreezer a -74 o C. Em seguida, todos os cortes foram submetidos à reação histoquímica simultaneamente. Os principais tipos de fibras foram delineados utilizando-se a técnica de mATPase de acordo com Staron (1997), após pré-incubações em pH de 4.3, 4.55 e 10.5 (GUTH e SAMAHA, 1970). Foram feitas em microscópio trinocular OLYMPUS através do programa CAMEDIA MASTER, fotomontagens de todo corte nos diferentes pHs, permitindo a determinação do número e porcentagem de cada um dos tipos de fibras puras, incluindo I, IIA, IIB e IID.
4.9. Respirometria de fluxo aberto
As variáveis analisadas foram o VO2 (consumo de oxigênio) e VCO2 (consumo
de gás carbônico). Para isso, amostras de ar (10mL) foram colocadas com uma seringa hermética anexada ao respirômetro por uma torneira de três direções. Para assegurar que as amostras foram representativas da composição do ar interno do respirômetro, foi colocado ar várias vezes antes de coletar a amostra definitiva. Imediatamente após as amostras terem sido coletadas, essas foram injetadas num tubo contendo CO2 (gás carbônico)e absorventes de
vapor de água, dentro de um analisador de oxigênio (AMETEK S3A) numa taxa de fluxo de 150 mL/min. A taxa fracional de oxigênio das amostras de ar foi lida diretamente na potência digital do analisador de oxigênio. O respirômetro permaneceu fechado durante o experimento e, portanto, a taxa da captação de oxigênio foi calculada pela depleção do conteúdo de oxigênio ocorrido entre a coleta de duas amostras consecutivas de ar (VLECK, 1987).
A análise respirométrica também foi realizada em dois grupos, incluindo o Pós-EDET e o Sham (Anestésico).
4.10. Eletrocardiograma
Para a determinação do ECG (eletrocardiograma), foi utilizado um eletrocardiógrafo Heart Ware acoplado a um software adaptado para avaliação em roedores. Os eletrodos foram conectados por meio de agulhas hipodérmicas às patas do animal anestesiado (pentobarbital sódico, 40mg/kg de peso corporal) (figura 3). Os registros das ondas do ECG foram utilizados para as medidas da freqüência cardíaca, para mediar a intensidade e os intervalos entre as ondas (QR, QT, QTc, PR) e o estabelecimento do eixo cardíaco. O intervalo QT foi corrigido pela fórmula de Bazzet’s (SGOIFO et al., 1996).
Figura 3. Animal com quatro eletrodos posicionados bilateralmente nas patas anteriores e posteriores para a análise do registro eletrocardiográfico.
4.11. Sensibilidade atrial às catecolaminas
Para a avaliação da sensibilidade adrenérgica do marcapasso cardíaco, os animais foram anestesiados por inalação de halotano (TANNO et al., 2002), e em seguida o animal foi morto por parada respiratória (pneumotórax). O coração foi isolado, o átrio direito foi excisado e preparado para registro isométrico das contrações espontâneas, sob tensão diastólica de 0.5gf, em câmara para órgãos isolados contendo 20 mL de solução de Krebs-Henseleit, com a seguinte composição [mM]: NaCl 115,0; KCl 4,7; CaCl2.2H2O 2,5;
36,5±0,1ºC, com auxílio de uma bomba de perfusão. Para registro das contrações espontâneas foi utilizado um transdutor isométrico de tensão acoplado a um polígrafo (MARCONDES et al., 1996; TANNO et al., 2002).
Após a montagem do átrio, o líquido de incubação foi trocado a cada 15 min durante 45-60 min para estabilização da freqüência de batimentos. Esta foi determinada por variações de freqüência menores que 5 batimentos por minuto (bat/min), durante 15 min, com contagens sucessivas a cada 5 minutos. Átrios que apresentaram irregularidades rítmicas, ou que não estabilizaram sua freqüência após 60 minutos de incubação foram descartados (MARCONDES et al., 1996). Após o período de estabilização, foram obtidas as CCE à noradrenalina pelo método cumulativo, com incrementos sucessivos da concentração molar do agonista de 0,5 unidade logarítmica (VAN ROSSUM, 1963). A resposta máxima foi determinada quando três concentrações sucessivas e crescentes do agonista não alteraram a resposta obtida com a concentração imediatamente anterior (MARCONDES et al., 1996). Ao final da CCE à noradrenalina, o tecido foi lavado com solução de Krebs-Henseleit até que a freqüência retornasse ao nível obtido antes da realização da primeira curva (TANNO et al., 2002).
Em seguida, para avaliação da atividade dos sistemas de metabolização das catecolaminas, antes da segunda curva realizada à noradrenalina, o tecido foi tratado com 10µM de fenoxibenzamina (PBZ), a qual bloqueia o sistema de recaptação neuronal (TANNO et al., 2002). Após 30 min, a solução de incubação foi trocada a cada quinze minutos durante uma hora, para remover o excesso de PBZ. Ao compararmos CCE na presença e na ausência de inibidores dos mecanismos de metabolização, espera-se que a inibição de tais processos determine um desvio significativo à esquerda na curva na ausência dos inibidores (KENAKIN, 1993). Se isto não ocorrer, o sistema analisado provavelmente encontra-se inibido por outro fator, que não o tratamento in vitro (TANNO et al., 2002).
4.12. Imunohistoquímica do nervo vago
A identificação dos neurofilamentos nos cortes obtidos da região esofágica foi realizada através de imuno-histoquímica no grupo controle, empregando-se a técnica da
Estrepotavidina-biotina-peroxidase (ABC peroxidase) descritos por Hsu, Raine e Fanger (1981). Durante o procedimento de imuno-histoquímica foram utilizadas as seguintes soluções: Tampão Citrato (pH 6,0), Solução A (ácido cítrico anidro= 9,21g, ácido cítrico monohidratado=21,01 g e H2O destilada=1000mL); Solução B (fosfato dissódico
duodecahidratado= 71,64 g e H2Odestilada =1000mL), Solução de trabalho: Solução A - 36,8
mL + Solução B - 63,2 mL, Solução Tampão Fosfato (pH 7,4) : (Na2 HPO4 =1,4 g,
KH2PO4=0,43 g, NaCl=7,0 g e H2O= 1000mL) e Solução corante: (DAB=40 mg, Solução
Tampão Fosfato=100 mg e H2O2= 40 mL.
Para os anticorpos e reagentes da imunohistoquímica foram utilizados: 3-aminopropil-trietoxi-silano - (Sigma, St. Louis, Mo.), 3,3 tetra-hidrocloreto diamino-benzidina (Sigma- St.Louis, Mo), "Multi - Link" Swine immunoglobullins to goat, mouse, rabbit immunoglobulin (Dakopatts a/s, Denmark), StreptABComplex (Dako) (Carpinteria, CA, USA), Monoclonal Anti-Neurofilament 200 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA).
4.13. Efluxo de 86Rb+
Para a avaliação da secreção de insulina, de forma indireta, foi analisado o efluxo de 86Rb+ (rubídio) nas ilhotas de Langerhans, as quais foram isoladas de acordo com a técnica de Lacy e Kostianovsky (1967) modificada por Boschero, Delattre e Santos (1980). No isolamento das ilhotas, foi utilizada a solução elaborada por Hanks e Wallace (1949) e para a incubação e perfusão foi utilizada a solução de Krebs-Ringer bicarbonato. Na solução de incubação foram acrescentados glicose (2,8mM) e 10µl de 86Rb+. À solução perfusora da
condição experimental foi adicionada glicose (5,6mM ou 16,7mM) e/ou carbamilcolina 100µM (concentração escolhida por promover estímulo máximo no processo secretório da insulina, segundo Persaud et al. (1989)).
O 86Rb+ foi utilizado neste trabalho para a análise da permeabilidade ao K+ (potássio) como isótopo substituto desse íon. Tal procedimento justifica-se por motivos técnicos, uma vez que o 42K+, ideal como traçador do 39K+, apresenta meia vida muito curta (12,5 horas), o que dificulta sua utilização. O uso do 86Rb+ como substituto do K+ tem sido utilizado em laboratório experimental sendo a razão de efluxo e a permeabilidade de ambos muito semelhantes (PRECHTL e POWLEY, 1985).
As ilhotas foram incubadas durante 60 minutos e após este período, elas foram lavadas com solução de Krebs-Ringer e transferidas para uma câmara de perfusão, que foram conectadas a um sistema de perfusão que consiste de dois recipientes, sendo um deles preenchido
utilizando-se kit de aplicação laboratorial da CELM – Reactoclin.
Para analisar a magnitude da variação do efluxo do 86Rb+ foram calculados valores teóricos a partir dos valores obtidos e realizada uma extrapolação da curva de regressão exponencial a fim de calcular os valores esperados para o intervalo.
4.14. Análise da população de receptores de insulina Homogeneização e Determinação do conteúdo de proteínas totais
O material extraído (músculo diafragma) foi submetido à homogeneização em tampão de extração, a 4ºC, utilizando-se um homogeneizador tipo Polytron PTA 20S (modelo PT 10/35; Brinkmann Instruments, Westbury, NY) operado em velocidade máxima por 30 segundos. Os fragmentos celulares foram então centrifugados (15.500g, 20 minutos, 4ºC) para remoção do material insolúvel e o sobrenadante foi utilizado para o ensaio. Parte deste foi utilizado para determinação do conteúdo das proteínas totais através do método fotocolorimétrico de Biureto (BRADFORD, 1976), enquanto que a outra parte foi submetida à imunoprecipitação e immunoblotting com anticorpos específicos.
Imunoprecipitação
Após determinação do conteúdo de proteínas totais, o sobrenadante foi utilizado para imunoprecipitação overnight, a 4 ºC, com anticorpos específicos. O imunoprecipitado foi separado após incubação com proteína A sepharose 6 MB por 2 horas a 4 ºC.
Após isso, as amostras foram centrifugadas (15.500g, 20 minutos, 4ºC) e submetidas à lavagem com tampão de lavagem por 3 vezes de 5 minutos cada (15.500g, 4ºC). Em seguida, as proteínas precipitadas foram tratadas com tampão de Laemmli (LAEMMLI, 1970) contendo 100 mmol/l de DTT e aquecidas em água fervente por 5-10 minutos. A seguir, quantidades iguais de proteína (5mg) foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida - SDS-PAGE em aparelho de eletroforese BIO-RAD miniature slab gel
apparatus (Mini-Protean, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). A eletrotransferência das
proteínas do gel para a membrana foi realizada em 120 minutos a 120V em aparelho miniaturizado de transferência da BIO-RAD, como descrito (TOWBIN, STAEHELIN e GORDON, 1979). A ligação dos anticorpos a proteínas não-específicas foi reduzida por pré-incubação da membrana por 120 minutos com tampão de bloqueio à temperatura ambiente. A membrana de nitrocelulose foi incubada overnight com anticorpos específicos diluídos em solução para anticorpo, e então, lavada por 15 minutos com solução basal. Após, a membrana foi incubada com 5 µCi de [125I] Proteína A (30 µCi/ µg) em solução de iodo por 120 minutos à temperatura ambiente e lavada novamente por 15 minutos, como descrito anteriormente. A proteína A [125I] ligada aos anticorpos específicos foi detectada e quantificada por autoradiografia em filmes Kodak XAR® (Eastman Kodak, Rochester, NY). Para isso, o cassete contendo a membrana e o filme foi mantido à temperatura de -80 °C e, após 12 - 120 horas, o filme foi revelado de maneira convencional. As bandas identificadas na autoradiografia foram quantificadas nas suas áreas utilizando-se densitometria óptica. Para tal, foi utilizado um scanner de mesa ColorPage HR6X (Genius®) e o programa Scion Image (Scioncorp®).
Immunoblotting
Após a determinação do conteúdo de proteínas totais, ao sobrenadante foi acrescentado tampão de Laemmli (LAEMMLI, 1970) contendo 100mM de DTT, e então aquecido por 5-10 minutos. Em seguida, quantidades iguais de proteínas (200 µg) foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE conforme descrito anteriormente.
4.15. Insulina plasmática
Amostras do plasma, obtidas após a centrifugação do sangue, foram encaminhadas para a análise da insulinemia (ng/mL), realizada por meio de radioimunoensaio.
4.16. Secreção estática de insulina
As ilhotas de Langerhans foram isoladas segundo a técnica descrita por Moskalewski (1965), aplicada a pâncreas murino por Lacy e Kostianovsky (1967), com as
foram injetados via cânula, provocando, por fluxo retrógrado, a divulsão do tecido acinoso. Procedeu-se, então, a ablação do pâncreas, que foi transferido para os tubos de ensaio de vidro (12x12cm) e incubado por 18 minutos a 37°C.
Em seguida, ainda a 37°C, o conteúdo foi agitado vigorosamente por um minuto e vertido em becker. Após mistura com Hanks, o conteúdo foi lentamente agitado, ejetado com seringa e decantado durante 3 minutos. O sobrenadante foi então descartado, e o sedimento ressuspenso em Hanks. Após repetir esse procedimento por quatro vezes, o produto final foi transferido para placa de Petri, de onde, sob lupa, as ilhotas foram coletadas por aspiração com auxílio de pipeta de vidro de ponta afilada. As ilhotas isoladas de ratos foram coletadas em placa de polietileno com 24 poços contendo em cada poço, 05mL da solução-tampão Krebs-Ringer suplementada com albumina bovina, a qual se adicionou glicose (5,6mM). Após incubação (pré-incubação), a 37°C, em atmosfera de carbogênio (pH 7,4), sendo que a solução de Krebs foi substituída por 1,0mL do mesmo tampão, contendo diferentes concentrações de glicose: 2,8; 5,6; 8,3; 16,7 mmol/L. Procedeu-se a nova incubação, por 90 minutos, nas condições referidas acima. Após esse período, as placas foram colocadas em freezer (-20°C) por 10 minutos e, o sobrenadante, de cada poço, transferido para tubos de polietileno e conservado a -20°C, até o momento da dosagem da insulina secretada.
A insulina plasmática e a secretada durante o período de incubação por ilhotas foram avaliadas de acordo com o método descrito por Herbert (1965), modificado por Scott, Atwater e Rojas (1981).
Essa análise, primeiramente foi realizada no grupo tratado com EDET durante 7 dias e, posteriormente, foi realizada em um grupo que recebeu as 7 sessões de EDET, porém avaliado somente 7 dias após a última sessão, devido às alterações ocorridas no primeiro grupo, suspeitando que a ativação vagal gerada pela corrente elétrica pudesse estar interferindo na atividade pancreática.
4.17. Teste de tolerância à glicose (GTT)
Para o GTT, os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (40 mg/Kg de peso) e após 40 minutos foi feita uma incisão próxima à veia femural por onde foi coletada amostra de sangue. Após a primeira coleta foi injetado glicose (1g/Kg de peso) e novas amostras coletadas nos tempos 5, 10, 15, 20, 30 e 60 minutos e a glicemia avaliada por glicosímetro (Accu Check).
4.18. Teste de tolerância à insulina (ITT)
Para o ITT, os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (40 mg/Kg de peso) e após 40 minutos foi feita uma incisão próximo à veia femural por onde foi coletada amostra de sangue. Após a primeira coleta foi injetado insulina regular Biobrás 1U/Kg de peso (1U/mL) e novas amostras coletadas nos tempos 0, 2,5, 5, 10 e 20 minutos e a glicemia avaliada por glicosímetro (Accu Check).
4.19. Dosagem de Insulina, PKA, PKC e GLUT2 das ilhotas pancreáticas
Para detectar o nível de expressão celular do Receptor de Insulina (IR), das proteínas de extrusão e movimentação de grânulos de insulina PKC e PKA e do GLUT2, foi empregada a metodologia de Western Blot. Grupos de 500 ilhotas recém-isoladas e incubadas por 2,5 horas em Krebs contendo 8.3 mM de glicose foram centrifugados rapidamente e o sobrenadante desprezado. A seguir, foram adicionados 200µL de tampão específico para imunoprecipitado. As ilhotas foram então politronizadas nesta solução, por aproximadamente 10 segundos, e o homogeneizado centrifugado a 3000g por 10 minutos.
O precipitado foi desprezado e foi feita a dosagem protéica no sobrenadante obtido, utilizando-se o reagente para ensaio de proteína da “BioRad Protein Assay-Dye Reagent Concentrate” (Melville, NY). Foi utilizado como referencial uma curva padrão de albumina. As amostras foram então incubadas a 37oC por 1h em 20% do volume de Tampão de Laemmli 5X (Azul de bromofenol 0,1%, fosfato de sódio 1M, glicerol 50%, SDS 10%).
Para corrida eletroforética foi utilizado gel bifásico: gel de empilhamento (EDTA 4mM, SDS 2%, Trisma base 750mM, pH 6.7) e gel de resolução (EDTA 4mM, SDS 2%, Trisma base 50mM, pH 6.7). A corrida foi efetuada à 200V por aproximadamente 30min com tampão de corrida (Trisma base 200mM, glicina 1.52M, EDTA 7.18mM e SDS 0.4%), diluído 1:4. As amostras foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (BioRad). A
